microRNAの発現と機能解析手法

microRNAの発現と機能解析手法
アプライドバイオシステムズジャパン株式会社
分子生物・細胞生物事業部
リアルタイムＰＣＲでの解析は年々増加。
ここ数年はRNAi、microRNA、DNAアレイ、解析等での報告が多い。
10000
9000
8027
Real Time PCR
microRNA
8000
7901
7000
6535
6000
5000
4000
3002
3000
1841
2000
1023
年
年
年
年
年
1
00
2
0
00
2
年
年
9
99
1
年
8
99
1
年
7
99
1
年
6
99
1
5
99
1
年
（各年間におけるPubMedでのキーワードサーチの結果）
37
6
585
536
292
116
︶
月
0
︵1
年
2
0
2
00
2
178
3
00
2
72
4
00
2
52
5
00
2
16
46
502
6
00
2
1000
© 2006 Applied Biosystems
microRNAとは・・・
• microRNAはゲノムから転写され、 precursor microRNA(前駆体)が
いくつかのプロセスを経て、mature microRNA(完成型）となる。
• mature microRNA(完成型） は21-23nt程度の一本鎖RNAとなり、
mRNAと相互作用する。
• Sanger InstituteのmiRBaseデータベースにmicroRNA情報が登録。
Human：462種、Mouse：358種、Rat：234種 （2006年10月2日現在）
現在まで機能の解明されているmicroRNAは限られている。
microRNA
想定されている機能や疾患との関係
予測されている標的遺伝子
miR-375
すい臓でのインシュリン分泌 (Poy, Nature, 2004)
Mtpn
miR-143
脂肪細胞分化促進 (Esau, JBC, 2004)
Erk5
miR-196
四肢の形成 (Hornstein, Nature, 2005)
HoxB8
miR-1
心臓の分化、心筋の増殖 (Zhao, Nature, 2005)
Hand2
Let-7a
肺がん、癌細胞増殖 (Johnson, Cell, 2005)
ras
miR-134
脳での樹状突起形成 (Schratt, Nature, 2006)
Limk1
miR-372, 373
癌遺伝子として機能 (Voorhoeve, Cell, 2006)
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核内
細胞質
ゲノムDNA
microRNAはゲノムから転写された後に、複数
の酵素類の作用により、短い完成型になる。 ターゲットとなるmRNAと結合することにより、
mRNA分解やタンパク質翻訳阻害にかかわる
事が示唆されている。
mRNAの切断・分解
翻訳抑制
Pri-microRNA
mRNAとmiRNAの
不完全な相補性
mRNAとmiRNAの
完全な相補性
Drosha
Exportin 5
Pre-microRNA
Dicer
Pre-microRNA
Mature microRNA
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microRNAとｍRNA, タンパク質の新しい関係モデルの例
教科書的な「セントラル ドグマ」と異なる新しい考え方
発現量
mRNA発現により、タンパク質翻訳
microRNA
ｍRNA
タンパク質
↓
microRNA発現増加により、
mRNAからのタンパク質翻訳抑制
↓
タンパク質発現レベルが低下する。
時間経過
microRNA発現解析は・・・
• mRNA研究(Transcriptome）とタンパク質研究（Proteome)の関係だけでは説明できな
かった生命現象の解明が可能になる。
• 腫瘍形成や発生分化の程度をmicroRNA発現のクラスター解析で知ることができる。
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臨床研究においてmicroRNA発現解析手法で重要となるポイント
• 微量のサンプルからでも発現解析ができること。
• 検出や解析が短時間でできること。
• 前駆体と完成型の区別ができること。
• microRNAの類似配列を区別できること。
ノーザン
マイクロアレイ
リアルタイムPCR
ハイブリダイゼーション
必要となるTotalRNA量
10μg程度/well
10μg程度/Array
10ng程度/microRNA
検出までの時間
2日間程度
2日間程度
4時間程度
前駆体と成熟体の区別
可能
困難
可能
類似配列の区別
困難
困難
可能
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microRNA解析で検討が必要な項目
出
ム
抽
ラ
カ A
常 F N
iR
通 F
G m
a
n
a
V
ir
m
小さいRNA分画を効率よく回収する必要があるので、
適切な抽出方法の選択が重要
Ambion mirVana miRNA Isolation Kit
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MicroRNAをリアルタイムPCRで定量できる
新しいメカニズム
Specific
Looped RT primer
miRNA
Step1：逆転写
アニーリングと伸張反応
Oligo
Specific RT primer
miRNA
Specific forward primer
Step2：リアルタイムPCR
Oligo
Specific forward primer
Specific reverse primer
Specific TaqMan® probe
(tailed primer)
Q
F
Specific TaqMan® probe
Specific reverse primer
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microRNA発現解析の検出感度領域
低発現から高発現まで幅広い領域を同一の系で検出が可能
- Amplification plot and standard curve: 7-logs
Estimated synthetic miRNA input (lin-4) based on A260:
7, 70, 700, 7,000, 70,000, 700,000, 7M, and 70M copies in PCR
40
10
1
B
A
35
30
1
Normalized
FAM signal
(DRn)
70M
copies
10-1
7
copies
Threshold
Cycle 25
(CT)
Slope = -3.4
R2
= 0.999
20
15
10
-2
10
0
5
10
15
20
25
PCR cycle
30
35
40
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Copy number (log10)
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miRNA Assayダイナミクスレンジ（測定に必要となるRNA量）
Detection sensitivity: 25 pg total RNA
Dynamic range: ³ 104 using mouse lung total RNA
miR-2
40
miR-7
2
R = 0.994
35
miR-10a
t 30
C
miR-10b
miR-16
2
25
R = 0.999
miR-20
miR-21
20
miR-22
15
250
25
2.5
0.25
0.025
Total RNA Input (ng) in RT
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miRNA Assayダイナミクスレンジ（測定に必要となるRNA量）
Detection sensitivity: up to single cells
Dynamic range: ³ 103 using OP9 cell lysate
miR-2
40
miR-7
35
miR-10a
2
R = 0.998
miR-10b
T 30
C
miR-16
25
2
R = 0.999
miR-20
miR-21
20
miR-22
15
2500.0
250.0
25.0
2.5
No. of cells
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各miRNAの組織における分布
Mouse miRNA Body Map
miRNA ID
Brain
Heart
Copy number per cell
Liver
Lung Thymus Ovary Embryo Average
let-7a
miR-16
miR-20
miR-21
miR-22
miR-26a
miR-29a
miR-30a
miR-34a
miR-200b
miR-323
miR-324-5p
Average
2010
10240
70
670
290
7470
4410
120
1240
20
80
270
2240
1420
13520
300
2540
1020
4360
1040
160
140
1
0
30
2040
700
3890
130
4450
310
3240
730
70
90
10
0
10
1140
2390
22080
580
7970
590
10680
7740
370
430
210
0
100
4430
1420
32090
1990
3550
130
2160
790
20
200
40
0
50
3540
3120
11100
420
5310
560
6880
2950
130
490
130
0
80
2600
1050
5210
620
390
40
1390
20
40
60
30
30
150
750
1730
14020
590
3550
420
5170
2530
130
380
60
20
100
2400
Foldchange
5
6
28
20
26
8
387
19
21
233
2377
27
263
• Copy number per cell is estimated based on standard curve of lin-4 synthetic miRNA assuming 15 pg/cell
• A total of 10 ng RNA (or equivalent ~667 cells) used in PCR
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前駆体（Precursor miRNA）と完成型(Mature miRNA)の区別
Assays Are Specific for Mature miRNAs
Synthetic target input (No. copies)
ID
miR-26b
let-7a
Mature miRNA
1.5×108
0
0
1.5×108
0
0
Precursor
0
1.5×108
0
0
1.5×108
0
TaqMan miRNA
Assay (CT)
16.5
27.4
ND
16.5
29.5
ND
Δ=10.9サイクル
210.9=1910倍
Δ=13サイクル
213=8192倍
前駆体（Precursor miRNA）と完成型(Mature miRNA)は構造が異なる。
TaqMan microRNA KitではPrecursorをごく一部しか検出しない。
let-7aの場合は前駆体（Precursor miRNA）と完成型(Mature miRNA)が
同量で混在している場合、検出量の1/8192が前駆体の可能性があるが、
その検出のほとんどは完成型を見てることになる。
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特異性の確認（１塩基違う際の区別） Single-base Discrimination
Synthetic miRNA target
let-7a
let-7b
let-7c
let-7d
let-7e
0.3
3.7
0.0
0.0
0.0
100.0
0.3
0.0
0.0
0.0
2.5
100.0
0.1
0.0
0.1
0.0
0.0
100.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
100.0
let-7a 100.0
y
a let-7b
s
s
a
A let-7c
N
R
i let-7d
m
let-7e
let-7a
let-7b
let-7c
let-7d
let-7e
n
o
it
c
e
t
e )
d %
e (
v
it
a
l
e
R
ugagguaguagguuguauaguu
2
ugagguaguagguugugugguu
1
1
ugagguaguagguuguaugguu
5
3
agagguaguagguugcauagu
4 3
2
ugagguaggagguuguauagu
Relative detection
(%) calculated
based on CT
difference
between perfectly
matched and
mismatched
assays
Number of base
differences between
miRNAs
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特異性の確認（ノザンとの比較）
Poor Discrimination of miRNA: Northern Blot
Assay
for
Northern data
generated using
mirVana™ miRNA
detection kit
Synthetic miRNA Target
let-7a
let-7b
let-7c
let-7d
let-7a
let-7a
let-7b
let-7c
let-7d
ugagguaguagguuguauaguu
ugagguaguagguugugugguu
ugagguaguagguuguaugguu
agagguaguagguugcauagu
2
1
3
１塩基違う際の区別が出来ない。
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miRNA Assay Flowchart
Step 1
RNAの回収
0.5hr
Step 2
Stem-loop RT(逆転写）
1hr
Step 3
リアルタイムPCR
1.5hr
microRNA含む
Total RNA
(1-10ng/well)
例）Hela細胞 １ｘ106個から
10μg程度のmicroRNAを含むTotal RNAを抽出
（Ambion mirVana miRNA Isolation Kitの場合）
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MicroRNAをリアルタイムPCRで定量できる
新しいメカニズム
Specific
Looped RT primer
miRNA
Step1：逆転写
アニーリングと伸張反応
Oligo
Specific RT primer
miRNA
Specific forward primer
Step2：リアルタイムPCR
Oligo
Specific forward primer
Specific reverse primer
Specific TaqMan® probe
(tailed primer)
Q
F
Specific TaqMan® probe
Specific reverse primer
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単体のレポーター色素
青色光により励起エネルギーを蓄え、
発光する特徴をもつ。
R
TaqMan® Probeの特徴
蛍光共鳴エネルギー
転移現象
Q
R
5’
レポーター色素
Fluorescein系の蛍光色素
（FAM もしくは VIC）
3’
MGB
クェンチャー
レポーター色素の
蛍光エネルギーを消去
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理想的なPCR反応は１回のサイクルで ターゲットのDNAが２倍に増幅する
（n回PCR反応終了時の）PCR産物量
＝テンプレートの初期濃度 ｘ ２ｎ
↑
増
幅
産
物
量
増幅回数（サイクル数n）→
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︶
示
表
g
o
︵L
実際のPCR反応では１回のサイクルで DNAが２倍に増幅する領域は限られる
 PCR反応の初期は検出限界以下である
 PCR反応の後期はプラトー状態になる
プラトー
↑
検
出
量
︶
示
表
g
o
︵L
増幅回数（サイクル数n）→
プラトーを引き起こす原因
•PCR産物の基質（dNTPやﾌﾟﾗｲﾏｰ）の枯渇
•酵素の失活
•PCR阻害物の蓄積
など
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PCRの各サイクルで蛍光強度から目的遺伝子の検出を行う。
初期濃度が2倍違うと、１サイクルずれて増幅曲線が立ち上がる。
↑
検
出
量
サイクル数→
PCR終了後にゲル電気泳動を行っても
定量することはできない ！
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︶
示
表
g
o
︵L
各サイクル毎に蛍光を検出すると増幅曲線を作成することができる。
1サイクルの「差」が2倍の濃度の差に相当する。
↑
検
出
量
サイクル数→
交点（Ct値）
21
22
23
24 25
補助線（Threshold Line）と増幅曲線の交点（Ct値）をみると、
2倍の初期濃度の差は、１サイクルの差になる
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︶
示
表
g
o
︵L
例）ガン細胞と正常細胞の比較の場合
↑
検
出
量
サイクル数→
︶
示
表
g
o
︵L
Ct=21
（ガン細胞由来ｃDNA検体）
Ct=23
（正常細胞由来ｃDNA検体）
検体における遺伝子の発現量の違いを
サイクル数（Ct値）で示す事が出来る。
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例）ガン細胞と正常細胞の比較の場合
サイクル数（Ct値）
25
24
正常細胞由来ｃDNA 23
22
ガン細胞由来cDNA 21
1
2
4
8
16
（相対値）
以上の検量線の比較から、目的遺伝子は
ガン細胞の相対値： 16, 正常細胞の相対値: 4となり、
ガン細胞では4倍の発現量がある事がわかる。
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リアルタイムPCRによる定量法の例
（内在性コントロールで相対値で比較）
希釈率で検量線を作成して比較する方法
サンプル
ターゲット遺伝子
内在性コントロール
標準化
比較結果
発現量（p53）
遺伝子発現量（GAPDH）
(p53/GAPDH)
（０ｈｒｓを１として）
0 hrs
0.2
0.1
２
１
12 hrs
1.0
0.25
４
２
24 hrs
2.4
0.3
８
４
36 hrs
3.0
0.3
10
5
p53の発現量
6
5
4
3
p53の発現量
2
1
0
0 hrs
12 hrs
24 hrs
36 hrs
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リアルタイムPCRによる定量法の例
比較Ct定量法（Comparative Ct Method, ⊿⊿Ct法）
検量線を作成せずに比較定量する方法
Comparative CT法
1サイクルの検出の違いで、
2倍量の差であるという理論を活用
２-⊿⊿ＣT ＊検量線作成が不要なので、多サンプルを処理できる＊
⊿⊿CT法の成立する条件
１、 ターゲット遺伝子と内在性コントロール遺伝子のPCR効率がほぼ等しい
希釈によって∆CT 値が変動しない=検量線を描いた時の傾きが同じ
２、 PCR効率が１に近い
設計のガイドラインに基づくとPCR効率の良い
短いPCR産物のサイズで設計ができる
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比較Ct定量法（Comparative Ct Method, ⊿⊿Ct法）
Brainでのｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現量を１とした場合、
各臓器におけるｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現量を比較。（内在性コントロール：GAPDH遺伝子）
ターゲット
内在性
遺伝子
コントロール
c-mycの
平均Ｃｔ値
⊿⊿Ｃｔ
ＧＡＰＤＨの
Ct値(c-myc)
（各臓器の⊿Ct値）
平均Ｃｔ値
-
- Ct値(GAPDH)
（Brainの ⊿ Ct値）
組織
Ｂｒａｉｎ
30.49
23.63
（脳）
Ｋｉｄｎｅｙ
27.03
22.66
（腎臓）
Ｌｉｖｅｒ
26.25
24.60
（肝臓）
Ｌｕｎｇ
（肺）
25.83
2-⊿⊿Ｃｔ
⊿Ｃｔ値
23.01
30.49-23.63
6.86-6.86
=6.86
=0
27.03-22.66
4.37-6.86
=4.37
= -2.5
26.25-24.60
1.60-6.86
=1.60
= -5.21
25.83-23.01
=2.81
相対比
c-mycの
２の乗数項に代入
発現量比較
（GAPDHで補正）
2-(0)=1
1
2-(-2.5)=5.6
5.6
2-(-5.21)=37
37
2.81-6.86 2-(-4.05)=16.5
16.5
= -4.05
* Ct値は一定の蛍光強度に達したサイクル数/ ** 指数の割り算は乗数項の引き算
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Brainでのｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現量を１とした場合、
Kidneyでは5.6倍、Liverでは37倍、Lungでは16.5倍の発現量があった。
組織
相対比
Ｂｒａｉｎ
１
5.6
37
（肺）
20
cmycの発現量
15
（肝臓）
Ｌｕｎｇ
30
25
（腎臓）
Ｌｉｖｅｒ
40
35
（脳）
Ｋｉｄｎｅｙ
cmycの発現量
16.5
10
5
0
Ｂｒａｉｎ
Ｋｉｄｎｅｙ
Ｌｉｖｅｒ
Ｌｕｎｇ
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RNU6Bで補正をかけたサンプル間での発現比較
Let-7a
miR-126
miR-16
Hela細胞
Jurkat細胞
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RNU6Bで補正をかけたサンプル間での発現比較
miR-26a
miR-93
miR-96
Hela細胞
Jurkat細胞
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RNU6Bで補正をかけたサンプル間での発現比較
Let-7a
miR-155
miR-96
Hela細胞
Jurkat細胞
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内在性コントロール遺伝子とは？
組織や細胞の個数をそろえ、
反応系へのcDNA持込量やRT効率の差を補正
刺激などに対して発現量が変化せず、
常に一定量発現している遺伝子が望ましい。
歴史的には
ハウスキーピング遺伝子(GAPDH,β-actin,etc)
18s rRNA・・などが利用されてきた
しかし・・・
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microRNA解析で検討が必要な項目
• 内在性コントロールの選定
• Ｌet-7a, miR-16などの発現量の高い遺伝子
• 癌細胞やアポトーシスでの発現変動の報告有。
– Let-7: Jing, Cell, 2005
• U6, 5ｓなどのSmall RNAを用いる方法
• 存在量が多い？ microRNAとの構造的な違い
– 5s rRNA: Giraldez, Science, 2005
– U6: Sun, Nucleic Acids Research, 2004,
– ｒRNA： Schmittgen, Nucleic Acids Research, 2004,
• 通常のｍRNA解析と同様にGAPDHや18sｒRNAなどを用いる方法
• 抽出手法による低分子RNA回収効率
– GAPDH: Lee, JBC, 2005
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microRNA検出定量のデータ
miRNA profiles classify ES cells, differentiated embryoid bodies (EBs) and tissues
1
Tissues
ES
EB
85
Tissues
ES
EB
169
Tissues
ES
EB
Highly expressed
Intermediately expressed
Nearly unexpressed
Total RNA input was normalized based on the CT values of 18S rRNA. The fold-change was
calculated based on CT changes of mean medium CT minus individual CT.
Chen, Applied Biosystems & Strauss, University of Colorado
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microRNA検出定量のデータ
miRNA profiles classify ES cells, differentiated embryoid bodies (EBs) and tissues
一定量発現しているmicroRNA
（ Ct値=35未満）は
ES、EC、各組織で100種類以上ある
Chen, Applied Biosystems & Strauss, University of Colorado
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microRNA検出定量のデータ
miRNA Expression signature in Human Glioblastoma multiforme (GBM) tumors
Ridzon, Applied Biosystems
Ambros, Dartmouth Medical School and the Norris Cotton Cancer Center
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弊社ラボにての解析データ（microRNA：157種類 & サンプル：組織2種類）
• 実験データ
•
1 microRNAあたり、10ng/well相当のTotal RNA（microRNA分画を含む）で逆転写
•
組織：Human Brain vs Human Heart
• 組織特異的な発現が見られた遺伝子
•
Brain特異的：miR-26a、miR-30c、miR-95
•
Heart特異的：miR-126
(Brainでの特異的発現miRNA, Heart および let-7a遺伝で補正)
組織
miR
Ct値 組織
miR
Brain abm000175_hsa-let-7a
21.25 Heart abm000175_hsa-let-7a
Brain abm000181_cel-lin-4
38.27 Heart abm000181_cel-lin-4
Brain abm000002_hsa-miR-9
20.79 Heart abm000002_hsa-miR-9
Brain abm000003_hsa-miR-9*
23.18 Heart abm000003_hsa-miR-9*
Brain abm000004_hsa-miR-10a
32.77 Heart abm000004_hsa-miR-10a
Brain abm000006_hsa-miR-15a
25.62 Heart abm000006_hsa-miR-15a
Brain abm000007_hsa-miR-15b
26.36 Heart abm000007_hsa-miR-15b
Brain abm000008_hsa-miR-16
22.14 Heart abm000008_hsa-miR-16
Brain abm000009_hsa-miR-17-3p
30.43 Heart abm000009_hsa-miR-17-3p
Brain abm000010_hsa-miR-17-5p
26.56 Heart abm000010_hsa-miR-17-5p
Brain abm000270_ath-miR159a
UD Heart abm000270_ath-miR159a
Brain abm000011_hsa-miR-19a
25.66 Heart abm000011_hsa-miR-19a
Brain abm000013_hsa-miR-20
25.55 Heart abm000013_hsa-miR-20
Brain abm000014_hsa-miR-21
24.57 Heart abm000014_hsa-miR-21
Brain abm000016_hsa-miR-23a
26.39 Heart abm000016_hsa-miR-23a
Brain abm000017_hsa-miR-23b
23.94 Heart abm000017_hsa-miR-23b
Brain abm000019_hsa-miR-25
26.16 Heart abm000019_hsa-miR-25
Brain abm000020_hsa-miR-26a
23.58 Heart abm000020_hsa-miR-26a
Brain abm000021_hsa-miR-26b
23.65 Heart abm000021_hsa-miR-26b
Brain abm000022_hsa-miR-27a
28.53 Heart abm000022_hsa-miR-27a
Very Low
Low
（---）
（--）
∼0.01 0.01∼0.1
mid Low
（-）
0.1∼0.5
Ct値 ⊿Ct（B-H） ⊿⊿Ct（⊿Ct-⊿Ct）
22.08
-0.83
0.00
UD #VALUE!
#VALUE!
30.30
-9.51
-8.68
32.32
-9.14
-8.31
29.41
3.36
4.19
26.11
-0.49
0.34
26.11
0.25
1.08
22.96
-0.82
0.01
31.18
-0.75
0.08
26.52
0.04
0.87
UD #VALUE!
#VALUE!
25.50
0.16
0.99
26.18
-0.63
0.20
22.48
2.09
2.92
23.49
2.90
3.73
22.00
1.94
2.77
26.54
-0.38
0.45
UD #VALUE!
#VALUE!
23.45
0.20
1.03
25.83
2.70
3.53
Middle
（±）
0.5∼1.5
mid High
（+）
1.5∼10
High
Very High
（++）
（+++）
10∼100
100∼
Relative
Level
Class
1.00E+00 Middle
#VALUE!
#VALUE!
4.10E+02 Very High
3.17E+02 Very High
5.48E-02 Low
7.90E-01 Middle
4.73E-01 mid Low
9.93E-01 Middle
9.46E-01 Middle
5.47E-01 Middle
#VALUE!
#VALUE!
5.03E-01 Middle
8.71E-01 Middle
1.32E-01 mid Low
7.54E-02 Low
1.47E-01 mid Low
7.32E-01 Middle
#VALUE! Ver High *
4.90E-01 mid Low
8.66E-02
Low
© 2006 Applied
Biosystems
弊社ラボにての解析データ（microRNA：157種類 & サンプル：組織2種類）
• Brainでの強い発現が見られたmicroRNA
Brain>>> Heart, up >100x
Very High Expression Level micro RNA Genes in Brain (With let-7a normalization)
7000
6000
n
io
ss 5000
e
rp 4000
x
E
e
ivt 3000
lae
R2000
1000
5
0
1
iR
m
b
8
2
1
iR
m
3
2
3
iR
m
*
9
iR
m
9
1
2
iR
m
1
3
iR
m
9
iR
m
b
4
2
1
iR
m
7
3
1
iR
m
9
2
1
iR
m
a
4
2
1
iR
m
0
micro RNAs
© 2006 Applied Biosystems
弊社ラボにての解析データ（microRNA：157種類 & サンプル：組織2種類）
• Brainでの強い発現が見られたmicroRNA
Brain>> Heart, up 10-100x
High Expression Level micro RNA Genes in Barin (with let-7a normalization)
90
80
no 70
is
se 60
rp
x 50
E
ev 40
it
al 30
e
R
20
10
32
-1
iR
m
49
-1
iR
m
11
-2
iR
m
*
54
-1
iR
m
04
-2
iR
m
84
-1
iR
m
30
-3
iR
m
70
-3
iR
m
38
-1
iR
m
a
28
-1
iR
m
0
micro RNAs
© 2006 Applied Biosystems
弊社ラボにての解析データ（microRNA：157種類 & サンプル：組織2種類）
• Brainでの発現が下がったmicroRNA
Brain < Heart, down 100x
low Expression Level micro RNA genes in Brain (with let-7a normalization)
3a
13
iR
m
7
36
iR
m
3
19
iR
m
9b
19
iR
m
2d
30
iR
m
2a
30
iR
m
2b
30
iR
m
2c
30
iR
m
*
2b
30
iR
m
s
919
iR
m
4
21
iR
m
*
9a
19
iR
m
9a
19
iR
m
2
37
iR
m
a
10
iR
m
4
22
iR
m
a
23
iR
m
a
27
iR
m
0.1
0.09
n 0.08
io
ss 0.07
er
px 0.06
E 0.05
ev
it 0.04
al
e 0.03
R
0.02
0.01
0
micro RNAs
© 2006 Applied Biosystems
多数のmicroRNAがターゲットの場合
各microRNAの平均Ct値とターゲットmicroRNAのCt値の差分で計算 • 多数のmicroRNAがある場合は全体のCt値との比較で、目的microRNAの
発現レベルを相対的に比較することができる。
（平均Ct値） - （目的microRNAのCt値） ＝ 相対的な発現比較
相対的な発現比較の値が大きい場合は「相対発現量」が高い。
相対的な発現比較の値が小さい場合は「相対発現量」が低い。
例）
低い
↑
「相対発現量」
↓
高い
1
2
3
4
5
6
7
-8.00
-5.00
-2.00
1.00
4.00
7.00
-8.00
-5.00
-2.00
1.00
4.00
7.00
© 2006 Applied Biosystems
1
2
3
4
5
6
7
多数のmicroRNAがターゲットの場合
各microRNAの平均Ct値と
ターゲットmicroRNAのCt値の差分で計算 miR
Brain Heart
miR
Brain Heart
miR
hsa-miR-122a
1
1
hsa-miR-105
3
1
hsa-miR-338
hsa-miR-125b
1
1
hsa-miR-184
3
2
hsa-miR-339
hsa-miR-127
1
1
hsa-miR-200a
3
2
hsa-miR-133b
hsa-miR-144
1
1
hsa-miR-200b
3
2
hsa-miR-148a
hsa-miR-147
1
1
hsa-miR-34b
3
2
hsa-miR-199a
hsa-miR-183
1
1
hsa-miR-34c
3
2
hsa-miR-210
hsa-miR-220
1
1
hsa-miR-182
3
3
hsa-miR-27a
hsa-miR-325
1
1
hsa-miR-200c
3
3
hsa-miR-28
hsa-miR-373*
1
1
hsa-miR-215
3
3
hsa-miR-296
hsa-miR-96
1
1
hsa-miR-10a
3
4
hsa-miR-374
hsa-miR-104
1
2
hsa-miR-155
3
4
hsa-miR-199-s
hsa-miR-182*
1
2
hsa-miR-189
3
4
hsa-miR-214
hsa-miR-216
1
2
hsa-miR-224
3
4
hsa-miR-133a
hsa-miR-302b*
1
2
hsa-miR-193
3
5
hsa-miR-129
hsa-miR-302c*
1
2
hsa-miR-199b
3
5
hsa-miR-30c
hsa-miR-371
1
2
hsa-miR-138
4
2
hsa-miR-95
hsa-miR-372
1
2
hsa-miR-134
4
3
hsa-miR-219
hsa-miR-367
1
3
hsa-miR-135b
4
3
hsa-miR-31
hsa-miR-126
1
7
hsa-miR-211
4
3
hsa-miR-128a
hsa-miR-205
2
1
hsa-miR-213
4
3
hsa-miR-128b
hsa-miR-141
2
2
hsa-miR-326
4
3
hsa-miR-323
hsa-miR-198
2
2
hsa-miR-330
4
3
hsa-miR-370
hsa-miR-337
2
2
hsa-miR-107
4
4
hsa-miR-154*
hsa-miR-373
2
2
hsa-miR-142-5p
4
4
hsa-miR-181c
hsa-miR-368
2
3
hsa-miR-154
4
4
hsa-miR-299
hsa-miR-302a
2
4
hsa-miR-17-3p
4
4
hsa-miR-340
hsa-miR-302b
2
4
hsa-miR-185
4
4
hsa-let-7e
hsa-miR-302c
2
4
hsa-miR-187
4
4
hsa-miR-106a
hsa-miR-302d
2
4
hsa-miR-190
4
4
hsa-miR-130b
hsa-miR-194
4
4
hsa-miR-135a
hsa-miR-203
4
4
hsa-miR-139
hsa-miR-301
4
4
hsa-miR-140
Brain Heart
4
4
4
4
4
5
4
5
4
5
4
5
4
5
4
5
4
5
4
5
4
6
4
6
4
7
5
1
5
1
5
1
5
2
5
2
5
3
5
3
5
3
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3
5
4
5
4
5
4
5
4
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
miR
hsa-miR-142-3p
hsa-miR-146
hsa-miR-150
hsa-miR-151
hsa-miR-152
hsa-miR-15a
hsa-miR-15b
hsa-miR-17-5p
hsa-miR-20
hsa-miR-25
hsa-miR-324-5p
hsa-miR-331
hsa-miR-335
hsa-miR-34a
hsa-miR-98
hsa-miR-130a
hsa-miR-186
hsa-miR-197
hsa-miR-19a
hsa-miR-223
hsa-miR-23a
hsa-miR-29c
hsa-miR-30e
hsa-miR-199a*
hsa-miR-26a
hsa-miR-137
hsa-miR-124b
hsa-miR-9*
hsa-miR-132
hsa-miR-149
hsa-miR-204
hsa-miR-218
Brain Heart
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
6
5
6
5
6
5
6
5
6
5
6
5
6
5
6
5
7
6
1
6
2
6
3
6
3
6
5
6
5
6
5
6
5
-8.00
-8.00 -5.00
-5.00 -2.00
-2.00 1.00
1.00 4.00
4.00 7.00
7.00
miR
Brain Heart
hsa-miR-222
6
5
hsa-miR-328
6
5
hsa-let-7d
6
6
hsa-let-7g
6
6
hsa-let-7i
6
6
hsa-miR-100
6
6
hsa-miR-103
6
6
hsa-miR-125a
6
6
hsa-miR-16
6
6
hsa-miR-181a
6
6
hsa-miR-181b
6
6
hsa-miR-191
6
6
hsa-miR-195
6
6
hsa-miR-221
6
6
hsa-miR-26b
6
6
hsa-miR-29b
6
6
hsa-miR-320
6
6
hsa-miR-342
6
6
hsa-miR-92
6
6
hsa-miR-99a
6
6
hsa-miR-145
6
7
hsa-miR-21
6
7
hsa-miR-23b
6
7
hsa-miR-27b
6
7
hsa-miR-29a
6
7
hsa-miR-29b
6
7
hsa-miR-30a-3p
6
7
hsa-miR-30b
6
7
hsa-miR-124a
7
3
hsa-miR-9
7
4
hsa-let-7a
7
7
hsa-let-7b
7
7
© 2006 Applied Biosystems
microRNA解析のツール
microRNAの発現解析
 microRNA解析可能なリアルタイムPCR用の試薬
Human: 260種類、Mouse: 184種類、Rat:154種類
 TaqMan microRNA Assay
microRNAの機能解析
 Gain-of-Function：
特定のmicroRNAを発現できる人工の前駆体。
発現の低い/無い細胞でmicroRNAの機能を検証できる。
 Ambion, Pre-miR™ miRNA Precursor Molecules
 Ambion, pSilencer™ 4.1-CMV Expression Vectors
 Loss-of-Function：
特定のmicroRNAと結合しmicroRNAの働きをストップ。
タンパク質への翻訳が再び起こる。
 Ambion, Anti-miR™ miRNA Inhibitors
© 2006 Applied Biosystems
microRNAの機能解析:
Gain-of-Function
Ambion, pSilencer™ 4.1-CMV
Expression Vectors
CMVにmiR-16, miR-124発現させ,
miR-124発現の無いHela細胞で発現。
© 2006 Applied Biosystems
microRNAの機能解析:
Gain-of-Function
Confirmation of let-7 Target Genes
miRNA Addition Experiment
Precursor
miRNAs
HepG2 cells (low let7)
Negative Control
Introduce
let-7 miRNA
let-7 pre-miR
RAS
Block target
mRNA translation
protein
expression
MYC
Measure target
protein
protein
expression
© 2006 Applied Biosystems
microRNAの機能解析:
Loss-of-Function
Confirmation of let-7 Target Genes
miRNA Subtraction Experiment
HeLa cells (high let-7)
Negative Control
Introduce
let-7 inhibitors
let-7 anti miR
RAS
Block miRNA and
induce target
mRNA translation
protein
expression
MYC
Measure target
protein
protein
expression
© 2006 Applied Biosystems
© 2006 Applied Biosystems
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
TaqMan® MicroRNA Assay:
NOTICE TO PURCHASER: LIMITED LICENSE
A license to perform the 5' nuclease process for research requires the use of a Licensed 5' Nuclease Kit (containing Licensed Probe), or the combination of an Authorized
5' Nuclease Core Kit plus Licensed Probe, or license rights that may be purchased from Applied Biosystems. This product contains Licensed Probe. Its purchase price
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process solely for the purchaser’s own internal research. This product is also a Licensed Probe for use with service sublicenses available from Applied Biosystems. This
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processes, or under U.S. Patents Nos. 5,476,774 and 5,219,727, or corresponding patent claims outside the United States, which claim quantification methodology,
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