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siRNA - Sigma
biosilencing MISSION RNAi ® 総合カタログ 製品ラインナップ ・siRNA ・esiRNA (endoribonuclease prepared siRNA) ・shRNA ・microRNA ・Long Non-Coding RNA ・トランスフェクション試薬 SAJ1873 Release Your Screening Potential with Our Powerful Range of RNAi Screening Tools: – siRNA, shRNA, miRNA and non-coding RNA Long doublestranded RNA – Libraries, panels and custom cloning – Complete product offerings from screening to validation siRNA esiRNA siRNA siRNA assembles with RISC Activated RISC mRNA degredation siRNAmediated target recognition mRNA cleavage MISSION® Target ID Library Transfection Zeocin selection (Positive Selection) microRNA transfection microRNA/Target ID Library Ganciclovir selection (Negative Selection) PCR and Sequencing siRNA siRNA ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ in vivo 用 siRNA ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ カスタム siRNA ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 遺伝子機能別 siRNA ライブラリー ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 小容量 siRNA ヒト キナーゼ / フォスファターゼ用 ‥‥‥‥ shRNA Processing by Dicer siRNA siRNA assembles with RISC Activated RISC mRNA degredation siRNAmediated target recognition mRNA cleavage luciferase promoter miRNA mimic or non-targeting control 3’UTR MISSION 3’UTR Lenti GoClone Vector pLSG_UTR_RenSP Lenti GoClone viral particle transfect transduce RISC complex express inhibit integrate Hybrid LUC-3’UTR Transcript Light output with miRNA mimic Light output with control Specific activity of miRNA mimic on target UTR microRNA/3’UTR Lenti GoClone 04 06 07 08 09 esiRNA esiRNA： プール型 siRNA ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 10 esiRNA カスタム / 全ゲノムライブラリー ‥‥‥‥‥‥‥ 11 shRNA shRNA 概要説明 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 12 shRNA フォーマット選択ガイド / プロトコール ‥‥‥‥‥‥ 16 抗生物質濃度の最適化方法‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 18 tGFP 発現コントロールを用いた感染効率評価方法 ‥‥‥ 19 shRNA 価格 / 納期 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 20 shRNA ご注文方法 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 21 shRNA 専用注文用紙 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 22 shRNA コントロール ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 23 パッケージングプラスミド / 関連製品 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 24 導入効率を向上させる磁気ビーズ ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 25 カスタム shRNA 作製サービス ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 26 発現誘導用 shRNA ベクター（IPTG inducible） ‥‥‥‥ 27 カスタム shRNA 見積り用紙 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 28 ゲノムの特異的領域に shRNA を挿入するキット ‥‥‥‥‥ 29 shRNA ライブラリー 概要説明 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 30 遺伝子機能別 shRNA ライブラリー ‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 31 プール型 全ゲノム shRNA ライブラリー ‥‥‥‥‥‥‥‥ 32 カスタム shRNA ライブラリー作製サービス ‥‥‥‥‥‥ 33 ヒト キナーゼ用 shRNA ライブラリー ‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 34 ncRNA microRNA qPCR 発現定量試薬 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ 36 38 microRNA インヒビター： 合成 RNA タイプ ‥‥‥‥‥ 39 microRNA インヒビター： レンチウイルスタイプ ‥‥‥ 40 microRNA ターゲット 3'UTR 網羅的探索用ライブラリー ‥ 42 microRNA ターゲット 同定用 3'UTR クローン ‥‥‥‥‥ 43 Long Non-Coding RNA ノックダウン用 esiRNA ‥‥‥ 44 ヒト 成熟 microRNA mimic ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ トランスフェクション試薬 ペプチドベースのトランスフェクション試薬 ‥‥‥‥‥‥‥ 幅広い細胞に適応し、操作が簡便なトランスフェクション試薬 ‥‥ 46 47 siRNA 4 Scientific Support 0133-71-2471 [email protected] MISSION® siRNA 最新の研究から、RNAi 実験を成功させるには siRNA のデザインがき わめて重要なファクターであることが示唆されています。これを踏まえ 弊社では、高度な siRNA 研究のリーディングカンパニーである Rosetta Inpharmatics と専属提携し、特許技術である Rosetta siRNA デザイン アルゴリズムを用いて、MISSION siRNA の製品ラインをデザインしてい ます。 Rosetta siRNA デザインアルゴリズムは、位置特異的スコアマト リックスと siRNA の Seed Region に関するあらゆる重要な知見を利用し て、ターゲット遺伝子に対して最も効果的かつ特異的な siRNA の配列を 予測します。さらにそのアルゴリズムは、実際の遺伝子サイレンシング実 験からのフィードバックを繰り返して最適化され、その理論は実際の実験 結果により実証されています。最高のアルゴリズムによりデザインされた MISSION siRNA を使用することで、時間と予算を節約でき、siRNA のデ ザインや確認といった準備作業を軽減し、その先の実験に注力していた だけます。 特長 • Seed Region 最適化方式によるターゲット特異性の増大 • 微量な mRNA を効率的にノックダウン • 遺伝子サイレンシングを保証 • 高品質 siRNA を ISO 9001：2008 認定拠点で生産 • 研究用途に限り自由に利用可能 References Gilot, D. et al. RNAi-Based Screening Identifies Kinases Interfering with Dioxin-Mediated Up-Regulation of CYP1A1 Activity. PLoS ONE 2011, 6(3): e18261 Meng, W. et al. Anchorage of microtubule minus ends to adherens junctions regulates epithelial cell-cell contacts. Cell 2008 Nov 28, 135(5), 948-59. Zhou, H. et al. Genome-Scale RNAi Screen for Host Factors Required for HIV Replication. Cell Host Microbe 2008 Oct 29. [Epub ahead of print]. Matsubara, T. et al. BMP2 regulates Osterix through Msx2 and Runx2 during osteoblast differentiation. J. Biol. Chem. Oct 2008, 283(43), 29119-25. Epub 2008 Aug 14. Marine, S. et al. Activity profile-based siRNA screen to explore the functional genomics of Alzheimer’s disease. BioTechniques Dec 2007, 43, Supplement, Large-Scale Genomic Analysis: S22–S27. Cho, HS. et al. Demethylation of RB regulator MYPT1 by histone demethylase LSD1 promotes cell cycle progression in cancer cells. Cancer Res 2011 Feb 1;71(3):655-60. Nishita M. et al. Ror2/Frizzled complex mediates Wnt5a-induced AP-1 activation by regulating Dishevelled polymerization. Mol Cell Biol 2010 Jul;30(14):3610-9. MISSION Predesigned siRNA provide best-in-class gene silencing Gene Specific siRNA HeLa cells transfected at a concentration of 30 nM siRNA. Percentage remaining gene expression levels measured via quantitative real-time PCR 48 hours after transfection (relative to mock). Data represents the mean of four biological replicates. MISSION siRNA はオンデマンド合成です。弊社トップページ (sigma. com/japan) にて、Gene Symbol、RefSeq ID、または Gene ID から、 ご希望の遺伝子に対する siRNA を検索可能です。 • 1duplex からご注文可能！ ヒト・マウス・ラットの pre-designed siRNA を 1duplex からご注文可能。 まずは弊社トップページより検索してください。 • ノックダウン保証します！ 1 ターゲット遺伝子に対して、3duplex ご注文いただいた場合そのうち 少なくとも 1duplex が 75% 以上のノックダウン効率を示すことを保証 いたします。 • 納期が早い！ 国内の合成拠点からご希望の MISSION siRNA をお届けいたします。 sigma.com/missionsirna-jp Scientific Support 0133-71-2471 [email protected] siRNA Control ■ MISSION® siRNA 価格表 ※ 1 ターゲット遺伝子に対して、3duplex 以上ご注文いただいた場合、ノックダ MISSION siRNA Positive Control ウン保証の対象となります。 保証収量※1 （概算収量※2） 濃度 (µM) 価格 納期※3 2 OD (10 nmol) 50 ¥20,000/duplex 6日※4 5 OD (25 nmol) 100 ¥32,000/duplex 6日※4 10 OD (50 nmol) 300 ¥45,000/duplex 6日※4 50 OD (250 nmol) 1500 ¥82,000/duplex 7日※5 siRNA Order Information • Rosetta siRNA デザインアルゴリズムを使用 • 特異遺伝子をターゲットとした siRNA • qRT-PCR にてノックダウンを確認済み Validated cell line Gene symbol ■ Validated MISSION siRNA 価格表 ※ Validated MISSION siRNA の一覧は弊社ホームページからご確認いただけ Human HeLa GAPDH MAPK1 Lamin A/C Cyclophilin B (PPIB) TP53 KIF11 Rat 9L/lacZ GAPDH MAPK1 Lamin A/C Cyclophilin B (PPIB) TP53 ます。 保証収量※1 （概算収量※2） 濃度 (µM) 価格 納期※3 2 OD (10 nmol) 50 ¥36,000/duplex 6日※4 5 OD (25 nmol) 100 ¥57,000/duplex 6日※4 10 OD (50 nmol) 300 ¥80,000/duplex 6日※4 50 OD (250 nmol) 1500 ¥156,000/duplex 7日※5 ※ 1：Single strand RNA の状態における値です。各保証 OD 値の Single strand RNA を duplex にしております。 ※ 2：概算収量は配列によって変動いたします。 ※ 3：土日祝日・弊社休業日は納期に含まれておりませんのでご了承ください。また、地域により若 干前後する場合がございます。 ※ 4：4duplex 追加ごとに＋ 1 日となります。 （例：5 ∼ 8duplex：＋ 1 日 9 ∼ 12duplex：＋ 2 日 13 ∼ 16duplex：＋ 3 日） ※ 5：2duplex 追加ごとに＋ 1 日となります。 （例：3 ∼ 4duplex：＋ 1 日 5 ∼ 6duplex：＋ 2 日 7 ∼ 8duplex：＋ 3 日 9 ∼ 10duplex： ＋ 4 日） 各ターゲットに対する製品情報は、弊社トップページを用いて検索してください。 MISSION siRNA Universal Negative Control 特長 • ヒト・マウス・ラット細胞用にデザイン • Mature および Predicted の RefSeq mRNA シーケンスと一切相同性 を示さないデザイン • 免疫反応モチーフを含まないデザイン • Agilent® 社 40K Human Gene Arrays を用いて、オフターゲット効果 を示さないことを確認済み • qRT-PCR にて、免疫反応が起こらないことを確認済み 価格・仕様 全て 50µM に濃度調整し、5nmol/tube に小分けされた状態でお届けし ます。 製品名 容量 MISSION siRNA Universal Negative Control #1 ターゲット遺伝子に関連する全ての製品を閲覧することが可能です sigma.com/japan Use The Search Box トランスフェクション試薬（p46-47）もご利用ください。 MISSION siRNA Universal Negative Control #2 1OD/5nmol 2OD/10nmol 5OD/25nmol 10OD/50nmol 1OD/5nmol 2OD/10nmol 5OD/25nmol 10OD/50nmol 5 CAT. NO. SIC-001-5 SIC-001-10 SIC-001-25 SIC-001-50 SIC-002-5 SIC-002-10 SIC-002-25 SIC-002-50 価格 ¥12,000 ¥19,000 ¥30,000 ¥42,000 ¥12,000 ¥19,000 ¥30,000 ¥42,000 ご注文方法 Universal Negative Control は通常のカスタム製品とご注文方法が異な ります。上記製品名と CAT.NO. を担当代理店様へお伝えください。ご不 明な点は、弊社カスタマーサービス ([email protected]) までお問い 合わせください。（納期は在庫状況によりますが、通常 2-3 日でお届けが 可能です ) sigma.com/sirnanegacon-jp References 1. Judge, A.D., Sood, V., Shaw, J.R., Fang, D., McClintock, K., and MacLachlan, I. (2005) Sequence-dependent stimulation of the mammalian innate immune response by synthetic siRNA. Nat Biotechnol. 23, 457. 2. Hornung, V. et al. (2005) Sequence-specific potent induction of IFN-alpha by short interfering RNA in plasmacytoid dendritic cells through TLR7. Nat Med. 11, 263. Scientific Support 0133-71-2471 [email protected] in vivo 用 siRNA MISSION® In Vivo Quality and iScale Oligos™ siRNA MISSION In Vivo Quality siRNA and iScale Oligos は動物個体で RNAi 研究をするために適した高品質な siRNA です。 iScale siRNA は大容量（∼グ ラム単位）の納品や修飾など、さまざまなご要望に対してフレキシブルに対応いたします。 基本製品仕様 • HPLC 精製（≧ 90% 純度） • アニーリング後に透析済 • ろ過滅菌済（0.22µm フィルター） • エンドトキシンテスト済 必要に応じた収量オプション • 3mg • 50mg • 100mg 収量のご希望はご相談ください トレーサビリティ / 安定性向上のための修飾オプション • 5' 6-FAM • 5' Phosphate • 5' Cy5 ™ • 5' Cy3 ™ • 5' Amino • 5' or 3' Cholesterol • Phosphorothioate linkages など Demonstrated use in vivo NOD/SCID マウスに H1155luc 細胞を移植し、腫瘍が形成された後、ルシフェラーゼ特異的またはコントロール（non-target）iScale siRNA を LANCErII を用いてインジェクションを行った。２４時間後、D-luciferin 溶液をインジェクションし、Night OWL in vivo イメージングシステムを用いて画 像解析を行った結果、ルシフェラーゼ特異的 iScale siRNA 処理した個体では有意にルシフェラーゼ活性が減少していた。 1 2 1 2 100 90 80 % LucProtein Expression siRNA 6 70 60 50 40 30 20 10 1：ルシフェラーゼ特異的 siRNA を導入した動物、2：non-targeting siRNA を 導入 (control)。 0 Luciferase siRNA treated Replicate 1 Luciferase siRNA treated Replicate 2 Luciferase siRNA treated Replicate 3 Negative treated Sample インジェクション後７２時間で腫瘍を摘出し、タンパク質を抽出した。 ルシフェラーゼ活性はコントロールと比較すると約 1/2 に減少していた。 References Brahmamdam, P. et al. Nov 2008. Targeted delivery of siRNA to cell death proteins in sepsis. Shock 32(2):131-9. Watabe, M. et al. 2008. A dominant role of GTRAP3-18 in neuronal glutathione synthesis. J. Neurosci. 28:9404-13. Kleinman, M. E. et al. 2008. Sequence- and target-independent angiogenesis suppression by siRNA via TLR3. Nature 452:591-7. Yang, Z. et al. Aug 2008. Toll-like Receptor 3 and Geographic Atrophy in Age- Related Macular Degeneration. N. Engl. J. Med. 2;359(14):1456-63. Robbins, M. et al. Aug 2008. Misinterpreting the therapeutic effects of small interfering RNA caused by immune stimulation. Hum. Gene Ther. 19(10):991-9. sigma.com/invivosirna-jp Scientific Support 0133-71-2471 [email protected] siRNA カスタム siRNA 1duplex ¥20,000 ~ ( 保証収量 2 OD / 脱塩 ) 弊社では、効果的なノックダウンに必要な siRNA 合成に関する重要なファクターを特定しており、常に高品質な siRNA を提供可能な RNA 合成プラット フォームを開発しています。 弊社の RNA 合成は、2’位 tert- ブチルジメチルシリル（TBDMS）基に、3’位ホスホルアミダイトによって保護された高速脱保護リボヌクレオシドホス ホルアミダイトを使用しています。 この独自のプラットフォームを元に最適化された特許取得済みプロセスにより、高いカップリング効率と迅速な脱保護を実現し、高品質な siRNA を短期 間で合成することが可能です。 siRNA カスタム合成サービスの特徴 ■ 高品質で対費用効果の高い siRNA 合成 ■ 短い納期 ■ 脱塩でも十分なノックダウン効果が得られます ■ 大規模プロジェクト向けのハイスループット能力 保証収量 / 価格 / 納期 保証収量（概算収量※1） 2 OD （ 10 nmol） 5 OD （ 25 nmol ) 10 OD （ 50 nmol ) 50 OD（ 250 nmol ) 1 OD （ 5 nmol ) 5 OD （ 25 nmol ) 10 OD （ 50 nmol ) トランスフェクション 24-well plate フォーマット （概算） 150 wells 375 wells 750 wells 3750 wells 75 wells 375 wells 750 wells 7 濃度（µM） 50 100 300 1500 30 100 300 精製 価格 納期※2 脱塩 ¥20,000/duplex ¥32,000/duplex ¥45,000/duplex ¥82,000/duplex ¥41,000/duplex ¥61,000/duplex ¥76,000/duplex 6日 6日 6日 7日 7日 8日 9日 脱塩 脱塩 脱塩 PAGE HPLC HPLC ※ 1 概算収量は配列によって変動いたします。 ※ 2 土日祝日・弊社休業日は納期に含んでおりませんのでご了承ください。 また、地域およびご注文本数により若干前後することがございます。 修飾 siRNA 未修飾 siRNA だけでなく、リン酸化などの化学修飾、 Cy5 ™ などの蛍光修飾も可能です。 修飾の一例 2 -O-Me RNA、2 -F-RNA、ENA、リン酸化、アミノ化 (NH2)、Biotin、チオール化 (SH)、Cholesterol、Fluorescein 、6-FAM 、TET、 HEX、Cy3™、Cy5、Cy5.5™、TAMRA、BHQ-1 、BHQ-3 、DNP 、DIG このほかにも多数の合成実績がございます。 様々なご要望にお応えします カスタムデザイン、一本鎖 RNA、大量スケール、ミックス、 in vivo 仕様も承ります。是非一度ご相談ください！ 各種修飾、オプションの詳細は下記 URL をご確認ください sigma.com/customsirna-jp siRNA 8 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] 遺伝子機能別 siRNA ライブラリー MISSION® siRNA Library panel MISSION siRNAライブラリーパネルは、大手製薬企業からの情報提供により創薬に有用な遺伝子群のハイスループットスクリーニング用として、非常に魅 力的なsiRNAコレクションです。 MISSION siRNAライブラリーの特徴： ■ siRNAは、遺伝子ノックダウン効率とターゲット特異性を高めるため、Rosetta siRNAデザインアルゴリズムを用いて設計 ■ 遺伝子ごとにsiRNAが3duplex含まれており、siRNAをプールして使用することも可能 ■ 複数回のスクリーニングが可能な十分量のsiRNAを提供 ■ 大手製薬企業と共同で遺伝子を選抜 製品仕様 21mer の siRNA duplex；3’dTdT Overhang を持つターゲット配列 19 bp 1 ターゲット遺伝子につき、siRNA duplex 3 本 全 siRNA duplex は 96 ウェルマイクロプレートにプレーティング、1 プレートにつき 80duplex、 全てのプレートに Positive Control siRNA が含まれています。 Ordering Information MISSION siRNA Human Libraries CAT. NO. 製品名 MISSION siRNA Rat Libraries Targets 容量 SI00100-1SET MISSION siRNA Human Druggable 6650 1 nmol Genome Library SI01100-1SET MISSION siRNA Human Ligase Panel 949 1 nmol SI02100-1SET MISSION siRNA Human Kinase Panel 719 0.25 nmol SI03200-1SET MISSION siRNA Human Phosphatase 303 0.25 nmol Panel SI04100-1SET MISSION siRNA Human Growth 375 1 nmol Factors and Receptors Panel SI05100-1SET MISSION siRNA Human Cell 496 1 nmol Adhesion and Cytoskeleton Panel SI06100-1SET MISSION siRNA Human Ion Channel 639 1 nmol and Transporters Panel SI07100-1SET MISSION siRNA Human Assorted 228 1 nmol Function Panel SI08100-1SET MISSION siRNA Human GPCR Panel 304 1 nmol SI09100-1SET MISSION siRNA Human Hydrolase 204 1 nmol Panel SI10100-1SET MISSION siRNA Human Metabolism 217 1 nmol and Cell Traffic Panel SI11100-1SET MISSION siRNA Human Nucleic Acid 310 1 nmol Binding Panel SI12100-1SET MISSION siRNA Human 338 1 nmol Oxidoreductase Panel SI13100-1SET MISSION siRNA Human Protease 379 1 nmol Panel SI14100-1SET MISSION siRNA Human Cell Surface 722 1 nmol and Nuclear Receptors Panel SI15100-1SET MISSION siRNA Human Cell 227 1 nmol Regulation Panel SI16100-1SET MISSION siRNA Human Transfer and 71 1 nmol Carrier Proteins Panel SI17100-1SET MISSION siRNA Human Transferase 184 1 nmol Panel CAT. NO. 製品名 SI20100-1SET MISSION siRNA Rat Druggable Genome Library SI21100-1SET MISSION siRNA Rat Ligase Panel SI22100-1SET MISSION siRNA Rat Kinase Panel SI23100-1SET MISSION siRNA Rat Phosphatase Panel SI24100-1SET MISSION siRNA Rat Growth Factors and Receptors Panel SI25100-1SET MISSION siRNA Rat Cell Adhesion and Cytoskeleton Panel SI26100-1SET MISSION siRNA Rat Ion Channel and Transporters Panel SI27100-1SET MISSION siRNA Rat Assorted Function Panel SI28100-1SET MISSION siRNA Rat GPCR Panel SI29100-1SET MISSION siRNA Rat Hydrolase Panel SI30100-1SET MISSION siRNA Rat Metabolism and Cell Traffic Panel SI31100-1SET MISSION siRNA Rat Nucleic Acid Binding Panel SI32100-1SET MISSION siRNA Rat Oxidoreductase Panel SI33100-1SET MISSION siRNA Rat Protease Panel SI34100-1SET MISSION siRNA Rat Cell Surface and Nuclear Receptors Panel SI35100-1SET MISSION siRNA Rat Cell Regulation Panel SI36100-1SET MISSION siRNA Rat Transfer and Carrier Proteins Panel SI37100-1SET MISSION siRNA Rat Transferase Panel Targets 容量 6016 1 nmol 816 667 266 1 nmol 1 nmol 1 nmol 341 1 nmol 433 1 nmol 593 1 nmol 210 1 nmol 273 188 200 1 nmol 1 nmol 1 nmol 286 1 nmol 302 1 nmol 341 646 1 nmol 1 nmol 214 1 nmol 66 1 nmol 174 1 nmol MISSION siRNA Mouse Libraries CAT. NO. 製品名 SI42050-1SET MISSION siRNA Mouse Kinase Panel Targets 623 sigma.com/missionsirna 容量 0.5 nmol Technical Support 03-5796-7330 [email protected] MISSION siRNA の小容量パッケージ製品です。小容量のためコスト効率が高く、数回程度の実験をされる方に最適です。 human kinase panel（CAT. NO. SI02100, 約 2,500 duplex）と human phosphatase panel（CAT.NO. SI03200, 約 1,100 duplex）に含まれている siRNA を個別にご注文いた だくことが可能です。 製品特徴 • MISSION siRNA human kinase panel (CAT.NO. SI02100) および human phosphatase panel（CAT.NO. SI03200）に含まれる MISSION siRNA • 0.25 nmol 価格 製品名 Human Kinase Nano Scale Human Phosphatase Nano Scale 製品番号 （X は数字） 容量 価格 SIHKXXXX SIHPXXXX 0.25 nmol ¥5,000 製品リストから選択 Kinase siRNA: sigma.com/sirnakinase-jp Phosphatase siRNA: sigma.com/sirnaphosphatase-jp 遺伝子情報から選択 各ターゲットに対する製品情報は、弊社トップページを用いて検索してください。 ターゲット遺伝子に関連する全ての製品を閲覧することが可能です sigma.com/japan Use The Search Box 製品プロトコールはウェブサイトからご取得いただけます As part of Sigma’s commitment to enviromental sustainability, we have eliminated paper copies of this product’s technical bulletin. To download a copy, visit: www.sigmaaldrich.com and type in your products catalog number to find your technical bulletin. Sigma-Aldrich では、環境保護の観点（Go Green プロジェクト）から、 製品添付資料の見直しを行っています。 製品の詳細およびプロトコールは、弊社ウェブサイトで各製品ページの製 品名の下にある POPULAR DOCUMENTS 項目（Bulletin 、Product Information Sheet、Datasheet など各種）からご確認いただけます。 どうぞ、弊社ウェブサイトをご活用ください。 siRNA 小容量 siRNA キナーゼ / フォスファターゼ用 MISSION® siRNA Nano scale 9 10 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] プール型 siRNA MISSION®esiRNA (endoribonuclease prepared siRNA) esiRNA esiRNAは、1つのmRNAターゲットに対する複数（数百種類）の異なるsiRNAがミックスされたプール型のsiRNAであり、RNAi スクリーニングにおいて、シ ンプル、経済的で、確実な方法です。Human16,000 以上、 Mouse14,000 以上の遺伝子を対象としたライブラリーであり、個別の遺伝子以外にホールゲノ ムライブラリー、 カスタムライブラリーとしても提供可能です。 特長 ・低いオフターゲット： 同一のmRNA に対するsiRNA が多数含まれています (200-300 duplex)。 複数のsiRNAが低濃度で同時に作用するため、オフターゲット効果が低減されます。 ・経済的： アッセイが１つのmRNAターゲットにつき１つのesiRNA で済むため、 コストパフォーマンスの高いRNAi スクリーニングツールです。 導入には通常のトランスフェクション試薬をご利用いただけます（p46-47)。 ・ 豊富なプレデザイン： Human: 16,741クローン、Mouse: 14,068クローン Increased specificity of esiRNA siRNA Target 5’ esiRNA 3’ 5’ 3’ target mRNA target mRNA Design Synthesis 300-600bp: 21bp: target region target region Apply Off-target effect Off-target: A B C Off-target: A siRNA (20 nM each trigger) High risk for off-target effects B C A B C A B C esiRNA (~50 pM each trigger) Low risk for off-target effects Silencing specificity of esiRNAs compared to siRNA KIAA1387( 矢印）に対する siRNA または esiRNA を細 胞に導入した後、遺伝子発現量の変化をマイクロアレ イを用いて解析した。発現量が優位 (p<0.01) に変動し た遺伝子は赤（発現上昇）と青（発現低下）で示した。 siRNA を導入した場合、ターゲット以外の多くの遺伝子 が変動していることがわかった（黄色）。各 siRNA また は esiRNA のノックダウン効率は右側に示した。 sigma.com/esiRNA Technical Support 03-5796-7330 [email protected] 11 Validation of knockdown by two-color Western blotting 個別 esiRNA 製品番号 各ターゲットに対する製品情報は、弊社トップページを用いて検索してください。 生物種 （X は数字） EHUXXXXXX EMUXXXXXX ターゲット遺伝子に関連する全ての製品を閲覧することが可能です 個別 esiRNA Human 16,000 種以上 Mouse 14,000 種以上 各クローンのバリデーション情報については別途お問い合わせください。 容量 sigma.com/japan Use The Search Box 価格 20µg ¥28,000 ¥50,000 50µg esiFlex/ ホールゲノムライブラリーについてはお問合せください。 esiRNA Makes Phenotypic Screening Easy Controls 製品番号 製品名 容量 Negative Controls EHUEGFP esiRNA targeting EGFP 20 µg, 50 µg EHUFLUC esiRNA targeting FLUC 20 µg, 50 µg EHURLUC esiRNA targeting RLUC 20 µg, 50 µg Positive Control EHU019931 esiRNA targeting human KIF11 20 µg, 50 µg EMU017691 esiRNA targeting mouse KIF11 20 µg, 50 µg KIF11 以外にも LAMIN A、PLK4 や AURKB など多数の遺伝子が、mRNA また はタンパクレベルでバリデーションされています。詳細はお問い合わせください。 右はモータータンパク質である EG5(KIF11) に対する esiRNA、 左は RLUC( コントロール）に対する esiRNA(30 ng) を Hela 細 胞に導入した。 EG5 遺伝子がノックダウンされると紡錘体の形成 不全となり、有糸分裂が停止する（矢印）。イメージは esiRNA 導入 48 時間後。 MISSION® esiRNA製品フォーマット ラインナップ 生物種 個別esiRNA プレートesiRNA ヒト マウス ヒト マウス カスタムesiRNA (esiFlex) ホールゲノム ライブラリー ヒト マウス ヒト マウス 容量 20 µg(2 nmol) 50 µg(5 nmol) 20 µg(2 nmol) 50 µg(5 nmol) 1.0 µg(0.1 nmol) 2.5 µg(0.25 nmol) 5.0 µg(0.5 nmol) フォーマット 2 ml チューブ 96well プレート 96well プレート 1.0 µg(0.1 nmol) 2.5 µg(0.25 nmol) 5.0 µg(0.5 nmol) 384well プレート ※プレート esiRNA は 20 本以上、esiFlex は 50 本以上からご注文が可能です。 References Lin, Z. et al. Reduced Level of Ribonucleotide Reductase R2 Subunits Increases Dependence on Homologous Recombination Repair of Cisplatin-Induced DNA Damage. Mol Pharmacol. 80,1000-12(2011) Krastev, D.B. et al. A systematic RNAi synthetic interaction screen reveals a link between p53 and snoRNP assembly. Nat Cell Biol 13, 809-18 (2011). Nitzsche, A. et al. RAD21 cooperates with pluripotency transcription factors in the maintenance of embryonic stem cell identity. PLoS One 6, e19470 (2011). esiRNA Hela 細胞へ各ターゲット mRNA に対す る esiRNA を導入した 72 時間後にウェ スタンブロットにより発現量を測定した。 各シグナルデータは Odyssey imaging system(Li-COR) によって取得し、コン ト ロ ー ル (GAPDH or tubulin) に よっ てノーマライズした。 緑がターゲット mRNA を示す。 12 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] MISSION® shRNA Discover the Sigma® TRC Advantage for RNA Interference! トランスフェクションが困難な細胞や非分裂細胞での RNAi 実験、または効果的で高品質のノックダウンシステムが欲しいと思いませんか？ The RNAi Consortium (TRC) と Sigma がその解決法をお届けします。 TRC は、Broad Institute of MIT and Harvard に拠点を置く世界的に有名な学術機関とライフサイエンス研究組織からなるグループで、研究団体に RNAi ツールを提供するためのコンソーシアムです。 Sigma では、TRC のメンバーおよび協力パートナーとして、ヒトおよびマウスのゲノムを標的とす る TRC shRNA レンチウイルスライブラリーを構築にするにあたって比類ないインフラとサービスをご提供できるよう努めております。 Discover the Advantages: shRNA ■ 網羅的な shRNA コレクション ・約 25 万のクローニング済み shRNA コンストラクト ・ヒト約 2 万以上、マウス約 2 万１千以上の標的遺伝子を網羅 ■ RNAi に最適なレンチウイルスをベースとしたシステム ・一過性ノックダウン / 安定的ノックダウンのどちらにも応用可能 ・導入用のウイルス粒子もラインアップ ・ゲノムへの組み込みによる長期的ノックダウン ・非分裂細胞を含むほぼ全ての細胞種に導入可能 ・インターフェロン応答を回避するデザイン ・組み換えによる導入配列の変異は認められておりません ・106 ∼ 107 TU/mL の高力価 ■ 高効率なノックダウン効果が得られる shRNA デザイン ・Broad Institute のアルゴリズムによる配列、特異性および設計位置 に基づいたスコアリング ・1 遺伝子あたり約 5 クローンで標的遺伝子を広範囲にカバー ・表現型レスキュー実験用の 3'UTR 領域にデザインした shRNA も提供 可能 ■ 様々なオプションを選択可能 ・ベクターの変更（15 種類） マーカー遺伝子詳細（26ページ参照） ・タイターの変更（106-109 TU/mL） ・ボリューム変更（0.1-10mL） ■ ハイスループット（HT）に最適のシステム ・HT のウイルス作製 ・ハイスループットスクリーニングおよびハイコンテントスクリーニング の実績あり ■ 信頼性の高い製造システム ・最先端のロボット ・バーコードおよび LIMS による追跡 ・管理文書の使用 ・研究開発、製造、品質管理および品質保証の専門家からなる熟練の スタッフ ■ 豊富な製品フォーマット ・プールドタイプのウイルス全ライブラリー（LentiPlex®） ・遺伝子ファミリーセット ・ターゲットセットおよび、単一クローン ・大腸菌グリセロール、プラスミド DNA、レンチウイルスパーティクル の 3 種類のフォーマット ■ レンチウイルス shRNA 製品のリーダー ・市場をリードする製品とサービス ・広範囲にわたるウェブベースのリソース ・技術および研究開発の専門家による充実したサポート ■ TRC2 クローンは Sigma の独占販売です ・約 5 万クローン以上の新規クローン ・数千遺伝子の新規ターゲット遺伝子 ・3 万以上のバリデート済みクローン The RNAi Consortium RNAi が哺乳動物の細胞で起こることが発見され、この遺伝子操作法が 基礎生物学的研究や創薬のための革新的な方法として認められるように なってきました。 RNAi は、ヒトの疾患の基礎をなすメカニズムを解明す る手がかりとなり、癌、エイズおよび他の多くの疾患に対する治療法の 開発を促進することが期待されています。 The RNAi Consortium (TRC) は、Broad Institute of MIT and Harvard に拠点を置き、世界中の科学コミュニティーが RNAi を使用して、多くの ヒトおよびマウスの遺伝子機能を解明するためのツールや方法を開発・検 証しています。 TRC の shRNA ライブラリーは、レンチウイルスベクターに組み込まれた ショートヘアピン RNA (shRNA) 配列からなり、さまざまな細胞や動物を 用いた研究に使用可能で、生理機能や疾患状態の基礎をなす重要な遺 伝子の発見が期待できます。 Broad Institute の他にも、TRC のパートナーとして Harvard Medical School（HMS）、the Massachusetts Institute of Technology（MIT）、 Dana-Farber Cancer Institute（DFCI）、the Whitehead Institute for Biomedical Research（WIBR） お よ び Novartis 社、 Eli Lilly 社、 Bristol-Myers Squibb 社、台湾にある研究機関 Academia Sinica など と共に Sigma-Aldrich が参画しています。 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] ウイルスデリバリーシステム 13 Table 1. ウイルスシステムの比較 ウイルスは、様々な細胞株に感染するよう独自に進化を遂げ てきました。その特徴を利用して、ここ数十年間、興味のあ る遺伝子を安全に標的細胞にデリバリーするためのベクター 開発に向け、種々のウイルスの遺伝子操作が行なわれてき ました。それぞれのウイルスシステム（Table 1）はそれぞ れ利点と欠点を持ちますが、レンチウイルスシステムではす べての用途で望ましいウイルスベクターとなる非常に多くの 特徴を持ちます。現在のレンチウイルスシステムは、複数世 代の組換えと修飾により得られた、レトロウイルスシステム の一種です。 Adeno- AAV* virus Feature 非分裂細胞への感染 ○ シュードタイプ作製 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ インターフェロン応答の回避 ゲノム内に転写サイレンシングに関する 問題がない Lentivirus ○ 宿主ゲノムへの安定的な組み込み 長いフラグメントの挿入 Retrovirus ○ N/A *Adeno-Associated Virus レンチウイルスシステム概要 Figure 1. 野生型レンチウイルスの生活環 shRNA レンチウイルスシステムには、遺伝子のデリバリーに特に有用となる多くの特 徴（広範な親和性、安定的な組み込みなど）があります。 Figure 1 は、野生型 レンチウイルスのライフサイクルを示しています。野生型ウイルスが細胞に侵入 し、組み込み、ウイルス遺伝子を発現させることにより、新しいビリオンを形成 することが可能となります。安全性を確保し、導入遺伝子を挿入する十分な領域 を確保するために、今日のシステムでは、ウイルス粒子の産生に必要なウイルス 遺伝子を複数のプラスミド上に分けて組み込んでいます（Figure 2）。トランス ファーベクターは、改変 Long Terminal Repeat（LTR）領域の間にシグナル配 列とシス作用性配列を持ちます。 shRNA、選択マーカーなどの導入遺伝子はト ランスファーベクターの非ウイルスプロモーターの後方へクローニングされます。 ウイルスの構造および複製に必要なすべての遺伝子は別のパッケージングベク ター（通常 1 ∼ 2 個）に搭載します。これらの遺伝子には、さまざまなバージョ ンのウイルス gag オペロンおよび pol オペロンがあります。通常さらに安全性 を高めるため、すべての野生型アクセサリー遺伝子を除去します。最後に、エン ベロープベクターにより、ウイルス粒子の親和性を決定するエンベロープタンパ クが供給され、多彩な可能性を示す様々なシュードタイプウイルスが得られます。 Sigma-Aldrich では、広範な親和性を確保し、非分裂細胞および最終分化細胞 を含むほぼすべての細胞型に導入するために主に VSV-G（水疱性口内炎ウイル スの糖タンパク）を持つシュードタイプウイルス粒子としております。 Wild-Type Lentiviral Particles Attachment Maturation Entry Synthesis of viral Proteins Release of Viral RNA Assembly & Budding RNA Transcript Export Reverse Transcription Transcription Integration of Viral cDNA Viral cDNA Figure 3. MISSION TRC shRNAレンチウイルス粒子による標的細胞への導入 Figure 2. 組み換えレンチウイルスのパッケージング過程 MISSION® Lentiviral Packaging Mix（24ページ参照） Packaging Vector Recombinant Lentiviral Particles MISSION Transfer Vector Packaging Plasmids MISSION Lentiviral Particle Attachment Envelope Vector Entry Co-Transfection of HEK 293T Cells Maturation NO Virion Production Release of Viral RNA Synthesis of Viral Proteins Reverse Transcription Assembly & Budding Packaging Vector Envelope Vector Transfer Vector Transcription Recombinant RNA Transcript Export Exported shRNA Enter RNAi Pathway Viral cDNA Transcription Integration of Viral cDNA 14 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] MISSION® TRC shRNA コレクション レンチウイルスシステム概要 (cont’d) shRNA レンチウイルス粒子は、HEK293T 細胞などの産生細胞株内でパッケージ パッケー ングされます（Figure 2）。プラスミド（トランスファーベクター、 ジングベクターおよびエンベロープベクター）を同時に導入させることに より、すべての必要な配列を使用して興味のある導入遺伝子を含むウイ ルス粒子を作製しパッケージングすることができます。トランスファーベク ターのウイルス LTR の間の領域のみがウイルスのカプシド内にパッケージ ングされます。得られたシュードウイルス粒子は、力価を測定し、標的細 胞への導入に使用します（Figure 3）。導入の際、ウイルス LTR の間の 領域は、標的細胞のゲノムに組み込まれます。このシュードウイルス粒子 には野生型ウイルスの遺伝子がないため、野生型ウイルスのライフサイ クルのように増殖することはおろか（Figure 1）、複製もできません。導 入遺伝子の配列のみが細胞内で発現します（Figure 3）。 Loop Sense Strand Antisense Strand CCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNT T T T T GGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAGCTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAAA U6 cPPT hPGK Design MISSION TRC ライブラリーは、約 2 万のヒト遺伝子と約 2 万 1 千のマウ ス遺伝子を標的とした合計 25 万を超えるクローン（各生物種約 12 万ク ローン）からなります。 shRNA 配列は、Broad Institute のアルゴリズム を使ってデザインされています。本アルゴリズムでは、配列、特異性お よび標的遺伝子内の位置に基づき候補配列をスコアリングします。候補 配列は、ノックダウンの最適化とオフターゲット効果の最小化のバランス が取れていなければなりません。転写産物の変異体の構造と配列がまだ 十分に理解されていない等の理由もあり、 1 遺伝子あたり約 5 ∼ 20 クロー ンをデザインし構築しています。そのうち少なくとも 1 ∼ 2 クローンでは、 非常に高いレベルのノックダウン効果が得られると予測されます。 The Transfer Vector 候補配列は pLKO.1-puro レンチウイルスベクターにクローニングされて います（Figure 4）。 pLKO.1 ベクターの骨格により、大腸菌内での増殖 や選択、哺乳動物細胞での（一時的なまたは長期間の）発現が可能にな ります。また、プラスミド DNA を用いることにより、shRNA の配列を持 つウイルス粒子を産生することができます（Figure 2）。 TRC2 では、候補配列は、TRC2-pLKO-puro レンチウイルスベクターに クローニングされています（Figure 5）。このベクターには shRNA の発 現を安定化させる WPRE を導入しています。 RRE puroR SIN/3’ LTR pLKO.1-puro Psi 7,086 bp RSV/5' LTR f1 ori TRC shRNA Vector Map and Key Features pUC ori ampR 3' - UU Loop Sense Strand 5' - Antisense Strand Figure 4. TRC1 and TRC1.5 Vector Map (pLKO.1-puro) Sense Strand Loop Chimeric LTR involved in replication and integration, U3 substitution for safety Psi (ψ) Packaging dimerization signal RRE Involved in nuclear export of viral genome transcript during packaging U6 Robust pol III promoter with precise initiation and termination of shRNA transcription at high levels cPPT Role in cDNA synthesis and nuclear import in target cell hPGK Promoter driving expression of puromycin resistance gene, hPGK is weaker than U6 for assurance of high shRNA expression levels in stable selected cells puroR Allows stable selection with puromycin SIN/3’ LTR LTR involved in replication and integration, U3 deletion for safety WPRE Woodchuck Hepatitis Post-Transcriptional Regulatory Element Antisense Strand CCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNT T T T T GGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAGCTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAAA U6 RSV/5’ LTR cPPT hPGK RRE puroR Psi RSV/5' LTR TRC2-pLKO-puro WPRE 7,518 bp pUC ori SIN/3’ LTR f1 ori ampR 3' - UU Sense Strand Loop 5' - Antisense Strand Figure 5. TRC2 Vector Map (TRC2-pLKO-puro) その他のMISSION ベクターコレクション （カスタム品） に関して （26ページ参照） Technical Support 03-5796-7330 [email protected] 15 Screen with the Largest and Most Validated shRNA Collection MISSION® shRNA Library Powered by The RNAi Consortium Total Validated 3500 3000 2500 2000 1500 1000 Total Validated Human Genes 20,018 8,897 16,019 7,405 Mouse Genes 21,171 8,345 15,960 6,506 Total Genes 41,189 17,242 31,979 13,911 Validated 4000 Clone Total Total Human Clones 129,695 43,470 82,017 24,550 Mouse Clones 118,062 36,654 77,819 20,564 Total Clones 247,757 80,124 159,836 45,114 500 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17+ 15 16+ Number of Clones Per Gene MISSION Mouse shRNA Library Coverage 9000 Validated 8000 Number of Genes Gene TRC1 Library MISSION Human shRNA Library Coverage 4500 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Number of Clones Per Gene sigma.com/shrnalibrary バリデートデータと保証の範囲 ■ 保証の範囲 MISSION shRNA は Broad Institute によって開発された独自のアルゴ リズムに基づいて、 クローンセット中、1 クローン以上が 70% 以上のノッ クダウンレベルを示す事を保証します。 ■ 保証の条件 保証は下記条件を全て満たした場合のみ適用となります。 ・クローンセットをご購入いただいた場合。 ・適切なコントロールにてノックダウンを検証済みの場合。 ・実験系で、ノックダウンが確認されなかった場合は、導入された shRNA が十分に発現している事を確認した場合。 クローンセット：20 ページ参照 ■ ノックダウンが確認されなかったら？ 下記、何れかの方法で対応させていただきます。 ・別のクローンを 1 つ無償提供 ・別の製品によって、金額相当の無償提供 ・金額相当のご返金 弊社営業、またはテクニカルサポートまでご連絡ください。 ■ バリデートデータとは？ バリデートデータは、Broad Instituteにて50％以上のノックダウン効果を 示したものを表示しております。これらのデータは、表示の手法、表示の細 胞において検証されたノックダウンレベルとなります。お客様の実験系に おけるノックダウンレベルを保証したものではありません。予めご了承くだ さい。 shRNA MISSION shRNA Library Extensive Clone Coverage Number of Genes MISSION shRNA Library は Sigma-Aldrich が独占的販売権を有してお り、 8 万以上の検証済み shRNA クローンを含む約 25 万の shRNA クロー ンを保有しています。MISSION shRNA Library には信頼性の高い TRC1 Library だけでなく、新たに約 8 万 8 千クローンが加えられています。 この中には 5 千以上のヒト遺伝子、4 千以上のマウス遺伝子が新たなター ゲットとして含まれています。 16 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] shRNA フォーマット選択ガイド / プロトコール shRNA のレンチウイルスパーティクルを用いたプロトコ−ルと各種フォーマット（レンチウイルスパーティクル、プラスミド DNA、大腸菌グリセロール ストック）の選択ガイドを掲載しています。 各種フォーマットの選択ガイド ■ 大腸菌グリセロールストック（製品番号 SHCLNG） ■ レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV） 一度ご購入いただき、正しく保管いただければ、何度でもご利用にな れます。レンチウイルスパーティクルの作製などの手間がかかります。 Ready-to-use の製品で、ご購入後、直ちにトランスフェクションが可 能です。ただし、ウイルスパーティクルの再産生はできません。 ■ プラスミド DNA（製品番号 SHCLND） レンチウイルスパーティクルの作製、もしくは目的の細胞へのトランス フェクションが必要です。 shRNA 大腸菌グリセロールストック （製品番号 SHCLNG） プラスミド DNA （製品番号 SHCLND） 目的の細胞に トランスフェクション プラスミド DNA 抽出・精製 レンチウイルスにパッケージング 24 ページ参照 （製品番号 SHP001） 力価（titer）測定 レンチウイルスパーティクル （製品番号 SHCLNV） ■ 大腸菌グリセロールストック （製品番号 SHCLNG） プロトコール 大腸菌の培養 1. 50 ∼ 100 µl のストックを取り出します。 滅菌した 0.5 ml の LB（抗生物質不含）に入れます。 2. 37℃で 15 ∼ 30 分間振とう培養します。 3. Carbenicillin (C3416, 100 µg/ml) を含む寒天培地に大腸菌培養液 25 ∼ 50µl をストリーク（画線培養）。 4. 37℃で 15 ∼ 20 時間インキュベート。 5. シングルコロニーをピックしてプラスミド DNA の抽出を行います。 目的の細胞に トランスフェクション ■ プラスミド DNA（製品番号 SHCLND）プロトコール 適当なトランスフェクション方法で行います。トランスフェクションの方 法は、用いる試薬に適したプロトコールで行ってください。 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] ■ レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV） プロトコール MISSION® shRNA レンチウイルスを感染させる基本的なプロトコール を記載しています。 1 日目 1. トランスフェクションの 24 時間前に哺乳動物細胞をプレートに撒い て培養 2. トランスフェクションは 50 ∼ 80％コンフルエントで行う 2 日目 1. ウイルスパーティクルストックを氷上に出してゆっくり解凍 2. Hexadimethrine bromide ※を細胞に添加（最終濃度 8 µg/ml） 3 日目 1. ウイルスパーティクルを含む培地を除去 2. 新しい培地に置換 4 日目 a. トランジェント（一過性発現）で実験する場合 細胞を回収して qRT-PCR などでノックダウン効率を検証する b. ステーブル ( 安定発現 ) で実験する場合 培地を適当量のピューロマイシンを含む培地に交換（方法は下記 に記載） 細胞により至適濃度は異なるが、1 ∼ 10 µg/ml が標準的 5 日目以降（ステーブルの場合のみ） 3 ∼ 4 日ごとに培地を適当量のピューロマイシンを含む培地に 置換（一般的に 10 ∼ 12 日後くらいでクローンが確立できる） 5 クローン以上をピックしてノックダウン効果を検証する ピューロマイシンによるセレクション 1. 96 穴プレート各ウェルに 1.6x104 細胞 と 120µl の培地を用意す る。 2. 次の日に 1 ∼ 10µg/ml となるようピューロマイシンを分注する。 3. 2 日後に生細胞を調べる。 4. 3 日間ごとにピューロマイシン入りの培地に交換し、3 ∼ 14 日間 培養し、最適な選択期間を検討する。 各トランスフェクションは ExpressMag® レンチウイルスデリバリーシステムを用 いて、1 日ずつ短縮することも可能です。また、導入しにくい細胞系などをご利 用の際にも ExpressMag をご利用ください。 ExpressMag（25ページ） その他実験に関する情報URL shRNA TOP sigma.com/shrna-jp 各種製品添付資料 sigma.com/shrnatechbull-jp 各種技術資料、 FAQ など sigma.com/shrnatechinfo-jp 細胞実施例 sigma.com/shtable shRNA して振とう ※ トランスフェクション効率を高める（ただし、神経細胞の初代培 養などには不適） 3. 適した量（MOI）のウイルスパーティクルを添加※して振とう ※ 初めての場合は、幾つかの multiplicity of infection（MOI） を試す（0.5 - 20 など） ※ MOI：細胞に対するウイルス粒子の個数 (1 ウェル中の全細胞数 ) x ( 目的の MOI)= ( 必要な TU) ( 必要な TU) / (CoA に書かれている TU/ml) = (1 ウェルに添加するレンチウイルス粒子の容量 ) 4. 37℃で一晩インキュベート ※ 一晩のインキュベートで細胞毒性が生じる場合は、4 時間イン キュベーションを行った後に培地交換。 17 18 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] 抗生物質（ピューロマイシン）濃度の最適化 使用する細胞により最適な抗生物質の濃度は異なります。初めて使用する細胞などで適切な抗生物質濃度がわからない場合は、本実験前にタイトレー ションによる検討を行い、細胞ストレスを低減するためにできる限り低濃度で、且つ効率の高い抗生物質濃度を決定しておく必要があります。多くの場合、 shRNA ベクターが導入されていない細胞は 1-10 µg/mL の濃度で死滅します。 必要な試薬と機器 ピューロマイシン溶液（製品番号：P9620） 培養液 各々の細胞に適したもの（DMEM + 10%FCS など） 培養用インキュベーター shRNA 6 ウェルプレート プロトコール Day 0 1. プレートの各ウェルへ、50% の細胞密度となるよう細胞を播種。（ex. 2 x 105 cell/well） 2. 一晩インキュベート。 Day 1 3. 培地を温めておく。 4. ピューロマイシンの希釈系列（ex. 0, 1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0 µg/ml) を、培地を用いて調整。 5. 培地をピューロマイシンを含む選択培地に交換。 6. それぞれのウェルの生細胞数を測定。 Day 3-10 7. ２日毎に選択培地に交換し、死細胞を除去。 8. ２日毎に生細胞数を測定。 Day 10 9. 細胞の死滅曲線を描き、選択培地で培養した７ー１０日の間に細胞が１００％死滅したピューロマイシン濃度を決 定する。 備考 ピューロマイシンの凍結融解は最小限にとどめ、選択培地は用事調製する。 10 µg/mL 以上のピューロマイシン濃度が必要であった場合、ピューロマイシンの使用期限を確認する。 参考ピューロマイシン濃度 Hela : HEK293 : B16 : PC1.0 : A431 : Jurkat : 3 µg/mL 3 µg/mL 1-3 µg/mL 10 µg/mL 1 µg/mL 4 µg/mL その他プロトコール sigma.com/shrnaprotocol-jp Technical Support 03-5796-7330 [email protected] 19 レンチウイルスの感染効率評価方法 使用する細胞によりレンチウイルスの感染効率は異なります。初めて使用する細胞などで適切な条件がわからない場合は、本実験前にタイトレーション による条件検討を行い、最適な Multiplicity Of Infection(MOI) を決定しておく必要があります。 MISSION TurboGFP ™ コントロール（SHC003V) を 用いることで、簡便に最適な MOI を決定することが可能です。 TurboGFP コントロール（SHC003V) で用いられている CMV プロモーターは、幹細胞、リンパ球、初代神経細胞などで、その発現活性があまり高く ないことが知られており、 これら細胞から得られる GFP シグナルが減少するため、感染効率を実際よりも低く見積もってしまう場合があります。この場合、 限外希釈法を用いる必要があります。 sigma.com/shrnalimitingtitration 必要な試薬と機器 TurboGFP コントロール（製品番号：SHC003V） Hexadimethrine bromide（製品番号：H9268）または Protamine sulfate（製品番号：P3369） shRNA 培地 培養用インキュベーター 蛍光顕微鏡および GFP 用フィルター プロトコール Day 0 1. プレートの各ウェルへ、24 時間後に細胞密度が 50％となるよう細胞を播種。 2. 一晩インキュベート。 Day 1 3. レンチウイルスコントロール（SHC003V) を室温にて溶解。 4. チューブを指で軽く弾き撹拌し、氷上で保存する。 5. コントロールの段階希釈系列（10 倍希釈）を調整し、各ウェルへ添加し振とう。 6. Hexadimethrine bromide または Protamine sulfate を終濃度 8 µg/mL となるように添加し振とう。 7. 18-20 時間インキュベート。 Day 2 8. 培地交換し、ウイルスを含む培地を除去。 9. さらに 24-48 時間インキュベートし、GFP を十分発現させる。多くの場合、TurboGFP は感染後 72 時間後に 強い発現を示す。 Day 3-5 10. 蛍光顕微鏡下で観察し、TurboGFP 発現細胞の割合が最も高い条件を決定する。 Multiplicity Of Infection (MOI) 算出式 MOI = ウイルスタイター（TU/mL）x 容量（mL） 細胞数 その他プロトコール sigma.com/shrnaprotocol-jp 20 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] shRNA 価格 / 納期 本製品はカルタヘナ法該当製品である事、また、数万遺伝子をターゲットとし、数十万クローンを持つライブラリーから、製品仕様をご選択いただくため、 にご記入いただいております。必要な情報をご記入いただき、弊社代理店までお渡しください。 ご注文の仕様を同定するための『ご注文用紙』 （22ページ） 弊社ホームページに掲載しておりますご注文用紙は、PDF に直接ご入力いただけます。製品を検索いただいたのち、必要な情報をコピー & ペーストに てご入力いただけます。 PDF は sigma.com/shrna-jp からご取得ください。 個別クローン基本価格（1 クローンご注文の場合の単価） フォーマット 製品番号 価格 納期※ 大腸菌グリセロールストック SHCLNG ¥72,500 2-3 週間 保管温度：-70℃ , 内容物：Terrific Broth, carbenicillin 100 µg/mL, 15% glycerol 基本仕様 精製プラスミド DNA SHCLND ¥90,000 3-4 週間 保管温度：- 20℃ , 容量：50 µL , 内容物：1 µg プラスミドDNA, 20 ng/µL Tris-EDTA buffer レンチウイルスパーティクル SHCLNV ¥105,000 4-6 週間 保管温度：-70℃ , 容量：200 µL , 内容物：≧ 106 TU/mL 液体培地 (DMEM, 10% FBS、penicillin-streptomycin) shRNA ※受注生産品のため、ご発注後の仕様変更、キャンセルはできません。 5 クローンセット割引価格（5 クローン以上ある製品に適用） ・ある遺伝子（RefSeq) に対する shRNA クローンを同一生物種、 同一フォーマットから 2 クローン以上お求めの場合は、 お得な 5 クローンセッ トでお申し込み下さい。 ターゲット遺伝子に対して 5 クローン以上製品が無い場合には別途お問合せ下さい。 （その場合、全クローンお選びいただければセット価格が適用になります。） 6 クローン以上ご購入いただく場合は、5 クローンセット時の 1 クローン単価×クローンの個数となります。 納期は 1 クローンご注文の場合と同様です。 ・クローンセットでご購入の場合、 バリデート保証が適用されます。（15ページ） フォーマット 製品番号 5 クローンセット 合計価格 1 クローン単価 納期 大腸菌グリセロールストック SHCLNG ¥145,000 ¥29,000 1 クローンと同様（上記表を参照） 精製プラスミド DNA SHCLND ¥180,000 ¥36,000 1 クローンと同様（上記表を参照） レンチウイルスパーティクル SHCLNV ¥210,000 ¥42,000 1 クローンと同様（上記表を参照） オプション価格（ベクター変更・タイター変更・容量変更） カスタムベクターの詳細についてはカスタムクローニングのページをご参照く ださい。（26 ページ） 1 クローン、または 5 クローンセット価格に各オプション金額が加算されます。 オプション選択時にも、5 クローンセット割引価格は適用となります。 （5 クローンセットでお求めの際は、全てのクローンにおいて同一オプションと なります。） 納期は、1 オプションにつき、通常納期に 2 週間ずつ加算されます。 オプションの種類 ベクター変更 タイター変更 ( レンチウイルスパーティクルのみ） ※基本仕様：1x106 TU/mL 容量変更 ( レンチウイルスパーティクルのみ） ※基本仕様：0.2mL 納品形態：レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV) ①クローン数：5 クローンセット ¥210,000 ②オプション：ベクター変更（pLKO.1-CMV-Neo) ¥156,000 仕様合計（①と②の合計） 1 クローン購入時 各種（プラスミド DNA） セット価格で 計算した場合 価格 － 計算例 － 5 クローンセットで購入時 （5 クローン合計） ¥366,000 納期 + ¥78,000 + ¥156,000 + 2 週間 1x108 TU/mL + + ¥108,000 ¥225,000 + + ¥216,000 ¥450,000 + 2 週間 + 2 週間 1x109 TU/mL + ¥427,000 + ¥854,000 + 2 週間 0.1 mL - ¥32,000 - ¥64,000 変更なし 各種（レンチウイルスパーティクル） 1x107 TU/mL ※ 1.0 mL + ¥70,000 + ¥140,000 + 2 週間 2.0 mL + ¥110,000 + ¥220,000 + 2 週間 5.0 mL + ¥152,000 + ¥304,000 + 2 週間 10.0 mL + ¥189,000 + ¥378,000 + 2 週間 ※ 107 TU/mL 以上のタイターオプションとの併用時のみ選択可 ※ 受注生産品のため、ご発注後の仕様変更、キャンセルはできません。 ※ 25 クローン以下の購入の場合：バイアル（側面に一次元バーコード付 ,TRC 番号）出荷 , 大腸菌のみ 1.4 mL TrakMates_ チューブ ※ 26 クローン以上の購入の場合：96Well Plate（一次元バーコード付 ,TRC 番号）, Plate Map CD-ROM 付 ご注文方法 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] 21 弊社の情報検索ウィンドウより、ターゲット遺伝子に対する shRNA クローンの検索を行うことができます。 ご注文の際は製品番号（SHCLNG、SHCLND、SHCLNV）と Symbol、クローン番号を専用注文用紙（22 ページ）にご記入のうえ、 お取次ぎ代理店様へご連絡ください。ホームページ上の専用注文用紙は、PDF に直接ご入力いただけます。 また、PDF 編集ソフトをお持ちの場合は別途保存が可能です。 ① sigma.com/japan Accession.No. で検索。 ②ターゲット遺伝子選択 ターゲット遺伝子を探し、青字の製品カテゴリーにある 『 shRNA 』をクリック。 ③生物種とフォーマット選択 生物種（ヒト、マウス）、および 3 種類のフォーマットより、 ご希望の製品番号に該当する“価格”ボタンをクリック。 ④クローンの選択 各クローンの情報（ターゲット遺伝子情報、 バリデーションの有無、配列、TRC バージョン情報など） が表示されるので、これらの情報より目的クローンを選択。 一部のオプションはプルダウンでご選択いただけます。 ※オプションには別途費用が掛かりますのでご注意ください。 ⑤専用注文用紙に記入 専用注文用紙（22 ページ）に必要事項を記入。 用紙は以下の URL からもダウンロード可能。 sigma.com/shrna-jp shRNA 遺伝子名や 22 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] shRNA 個別クローン専用注文用紙 2014.01 MISSION® shRNA Library 製品につきましては、「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律（通称カルタヘナ法）」 の使用規制対象品となります。ご使用に際しては、規制に則し適切にお取り扱い下さい。また、本製品をご購入の際には、弊社へのご登録をお願い致 しております。何卒宜しくお願い申し上げます。 施設申請の際は sigma.com/shrna-jp をご参照ください。 MISSION shRNA Library（下表にご記入いただくか、製品の Web 検索結果を印刷し、本誌に添付してください。） ご注文 チェック欄 P 製品 精製プラスミド DNA 製品番号 SHCLND Gene Symbol EGFR 記 入 TRC（クローン）番号 RefSeq No. NM_005228 TRCN0000010329 TRCN0000039633 TRCN0000039634 TRCN0000039635 例 TRCN0000121067 P shRNA ※ベクター変更 □ pLKO.1-CMV-tGFP □ pLKO.1-Puro-CMV-tGFP □ pLKO.1-hPGK-Neo □ pLKO.1-CMV-Neo □ pLKO.1-hPGK-Neo-CMV-tGFP □ 通常 pLKO.1-puro 大腸菌 グリセロールストック SHCLNG 精製プラスミド DNA SHCLND ※ベクター変更 □ pLKO.1-CMV-tGFP □ pLKO.1-Puro-CMV-tGFP □ pLKO.1-hPGK-Neo □ pLKO.1-CMV-Neo □ pLKO.1-hPGK-Neo-CMV-tGFP □ 通常 pLKO.1-puro レンチウイルス パーティクル SHCLNV ※容量変更 □ 1mL □ 2mL □ 5mL □ 10mL □ 0.1mL ※※ ( ※※他オプションとの併用時のみご選択いただけます。 ) □ 通常 0.2mL ※ Titer 変更 □ 107 TU/mL □ 108 TU/mL □ 109 TU/mL □ 通常 106 TU/mL ※ベクター変更 □ pLKO.1-CMV-tGFP □ pLKO.1-Puro-CMV-tGFP □ pLKO.1-hPGK-Neo □ pLKO.1-CMV-Neo □ pLKO.1-hPGK-Neo-CMV-tGFP □ 通常 pLKO.1-puro ※オプションは別途納期、費用がかかりますので、十分にご注意下さい。 ※ベクターの詳細は 26 ページをご覧ください。 コントロール・関連製品 販売代理店様へ : コントロールのご注文は通常通り承ります。(MISSION shRNA 専用注文用紙不要 ) 右ページ (MISSION RNAi カタログ 23 ページ ) をご参照下さい。 ました情報は、 ダイレクトメール配信、 カタログ送付、 お問い合わせへの返答に使用させていただきます。その他、詳しい内容は、弊社 WEB サイト・プライバシー お客様情報 ご登録いただき ポリシーの項をご覧下さい。送付不要の場合は『ご案内送付』欄にて "NO" にチェックをお願い致します。 ご注文内容、お客様情報全てご記入が終わりましたら、弊社代理店までお渡し下さい。 ご氏名 様 ご職位 日 付 ご所属 ご住所 − − TEL FAX − − ご担当教官様または実験責任者のご氏名 様 E-mail □ Yes □ No ご案内送付 郵送 □ Yes □ No □登録済み E-mail ご注文書を添えて弊社宛にお送り下さいますようお願い申し上げます。本紙をご注文書として利用される場合は、 代理店ご担当者様へ 本紙はご注文内容の仕様補足書です。 必ず代理店名、営業所名、 ご担当者様氏名、 カスタマーコード （49から始まる8桁の番号） 、 ご注文番号を記入の上、 下記の番号へFAXしてください。 FAX: 03-5796-7325 MISSION shRNA 担当宛 代理店 （営業所） 名 カスタマーコード ご注文番号 49 営業ご担当者名 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] コントロール 23 Overview of MISSION shRNA Control Products MISSION shRNA Controls 各種コントロールをご利用いただけます。フォーマット、蛍光マーカー、 プロモーターなどから細胞や実験に適した製品をご選択ください。 Positive Negative 高タイターのコントロールをご希望の場合、別途ご相談ください。 Transduction UbC-TagFP635 ™ UbC-TurboGFP ™ CMV-TagFP635 ™ CMV-TagYFP ™ CMV-TagCFP ™ TurboGFP shRNA (SHC004/SHC004V) pLKO.1-puro (SHC001/SHC001V) TurboGFP (SHC003/SHC003V) eGFP shRNA (SHC005/SHC005V) Non-Target shRNA #1 (SHC002/SHC002V) TagCFP (SHC010/SHC010V) Luciferase shRNA (SHC007/SHC007V) Non-Target shRNA #2 (SHC016/SHC016V) TagYFP (SHC011/SHC011V) shRNA Positive Control #1 (Human/B2M) (SHC008/SHC008V) TurboGFP shRNA (SHC004/SHC004V) TagFP635 (SHC013/SHC013V) UbC-TurboGFP (SHC014/SHC014V) コントロール一覧 eGFP shRNA (SHC005/SHC005V) shRNA Positive Control #2 (Human/ARHGDIA) (SHC009/SHC009V) Luciferase shRNA (SHC007/SHC007V) TurboGFP shRNA TRC2-pLKO-puro (SHC201/SHC201V) (SHC204/SHC204V) UbC-TagFP635 (SHC015/SHC015V) Non-Target shRNA #1 (SHC202/SHC202V) TRC2-pLKO-puro (SHC201/SHC201V) Non-Target shRNA #2 (SHC216/SHC216V) TurboGFP (SHC203/SHC203V) TurboGFP shRNA (SHC204/SHC204V) 黒字 ¥59,000 青字 ¥93,000 * 製品番号 用途 ネガティブコントロール 蛍光タンパク トランスダクションコントロール ( ポジティブコントロール） 外来性遺伝子用 shRNA コントロール 内在性遺伝子用 shRNA コントロール empty vector 製品名 pLKO.1-puro Non-Target shRNA Control #1 pLKO.1-puro Non-Target shRNA Control #2 TRC1 series plasmid DNA Lentiviral SHC002 SHC002V SHC016 SHC016V TRC2 series plasmid DNA Lentiviral SHC202 SHC202V SHC216 SHC216V pLKO.1-puro CMV-TurboGFP pLKO.1-puro CMV-TagCFP ™ SHC003 ※ SHC010 ※ SHC003V SHC203 ※ SHC010V - - pLKO.1-puro CMV-TagYFP ™ SHC011 ※ SHC011V - - pLKO.1-puro CMV-TagRFP ™ SHC012 ※ SHC012V - - pLKO.1-puro CMV-TagFP635 ™ SHC013 ※ SHC013V - - pLKO.1-puro UbC-TurboGFP SHC014 ※ SHC014V - - pLKO.1-puro UbC-TagFP635 SHC015 ※ SHC015V - TurboGFP shRNA Control eGFP shRNA Control Luciferase shRNA Control SHC004 SHC005 SHC007 SHC004V SHC005V SHC007V SHC204 - SHC204V - shRNA Human Positive Control #1(B2M) shRNA Human Positive Control #2(ARHGDIA) pLKO.1-puro Control SHC008 SHC009 SHC001 SHC008V SHC009V SHC001V SHC201 SHC201V SHC203V - 仕様：plasmid DNA : 5 µg DNA, -20℃ stock, 500 ng/µl TE buffer Lentiviral : 4 x 50 µl, -70℃ stock, 106 TU/ml (via p24 titering assay) ハイタイターコントロールのご用意もございます。別途お問合せ下さい。 sigma.com/controls shRNA pLKO.1-puro (SHC001/SHC001V) TagRFP (SHC012/SHC012V) 各コントロールを MOI = 5 にて導入した A549 細胞。 ( 上図は明視野、 下図は蛍光画像） Monitor Knockdown 24 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] 関連製品 組み換えレンチウイルスのパッケージング過程 Packaging Plasmids Lentiviral Packaging Mix shRNA MISSION Lentiviral Packaging Mix は、 MISSION TRC shRNA コレクションに最適化し CMV たパッケージング用プラスミドのプレミックス です。本製品には、レンチウイルスの構造およ び複製に関与する遺伝子（gag および pol）を 有するパッケージングプラスミド、VSV-G エン ベロープ遺伝子（広範な親和性）を有するエン ベロープベクターから成ります。本製品は、独 自のウイルス粒子を作製したい方にもご利用い ただけますが、Sigma-Aldrich では時間を節約 し品質を確保するために弊社がご提供するウイ ルスフォーマットのコレクションをご使用いた だくことを強くお勧めいたします。 CMV gag Sv40 Packaging Vector pMISSION GAG POL Envelope Vector pMISSION VSV-G 12,150 bp 5,824 bp ampR pol insulin polyA rev tat VSV-G MISSION Transfer Vector Co-Transfection of HEK 293T Cells Maturation Synthesis of Viral Proteins Recombinant Lentiviral Particles Assembly & Budding Packaging Vector Envelope Vector Transfer Vector Transcription Recombinant RNA Transcript Export 製品名 CAT.NO. SHP001-0.25ML SHP001-1.7ML MISSION lentiviral Packaging Mix 価格 ¥50,000 ¥175,000 その他試薬 製品名 CAT.NO. puromycin dihydrochloride Hexadimethrine bromide protamine sulfate Carbenicillin disodium salt Terrific Broth Terrific Broth, Modified EZMix™ Powder P9620-10ML H9268-5G H9268-10G H9268-50G P3369-10G P3369-100G C3416-250MG C3416-1G C3416-5G T5574-500ML T9179-6X500ML T9179-2X5L 価格 ¥16,800 ¥6,300 ¥9,600 ¥37,400 ¥33,400 ¥199,700 ¥6,900 ¥17,500 ¥52,600 ¥9,000 ¥14,900 ¥32,200 必要な試薬の確認はこちら ⇒ 備考 ready-to-useのpuromycin溶液 レンチウイルスの導入効率を向上 レンチウイルスの導入効率を向上 Hexadimethrineで細胞毒性を示す細胞に有効 液体培地 顆粒 各種製品添付資料 sigma.com/shrnatechbull-jp Technical Support 03-5796-7330 [email protected] 25 導入効率を向上させる磁気ビーズ ExpressMag® Lentiviral Delivery マグネットビーズを用い、レンチウイルス導入の難しい細胞でも、トラン スフェクション効率を向上させます。 特長 ■ 最大で 10 倍以上のトランスフェクション効率の向上が可能 ExpressMagシステムWorkflow MISSION Lentiviral Particles ExpressMag Nanoparticle Complexes ExpressMag Nanoparticles ■ トランスフェクションプロセスをたった 15 分に短縮可能 （通常約 1 日かかります。） ■ 浮遊系細胞や初代培養細胞などに対する革新的なトランスフェクショ ン方法 Wide Variety of Cell Culture Dishes ■ MISSION® shRNA lentiviral particles によって確認試験済み Apply to Target Cells Super Magnetic Plate 96-well Magnetic Plate Entry Transduction HEK 293T浮遊細胞 における効果 ExpressMagにより、トランスフェクションの成功が確認されてい る初代培養細胞リスト Primary Cell Type A. 臭化ヘキサジメトリンによる 標準的トランスフェクション B.ExpressMagを使用した トランスフェクション ExpressMag を 使 用し、MISSION TurboGFP™ Control Particles (SHC003V) を感染させた。 MOI=1、49 時間インキュベート。 MISSION ExpressMag 製品名 製品番号 Size Super Magnetic Kit 96-well Magnetic Kit Beads ※ SHM01 SHM02 1KT 1KT ¥126,800 ¥184,800 価格 SHM03 Super Magnetic Plate 96-well Magnetic Plate SHM04 SHM05 100µL 300µL 1mL 1EA 1EA ¥34,100 ¥89,600 ¥219,000 ¥141,000 ¥129,800 ※ 概算使用回数 100µL：63 回（96-well）、15 回（24-well）、1 回（T-25） 300µL：190 回（96-well）、47 回（24-well）、4 回（T-25） 1mL：633 回（96-well）、158 回（24-well）、15 回（T-25） sigma.com/expressmag Airway epithelium Aortic endothelial cells Carotid artery smooth muscle Chondrocytes Chromaffin Cytotrophoblastic Embryonic fibroblast Epicardial mesothelial Fibroblast Fibrochondrocyte Gastric gland Glial Hippocampal neurons Human umbilical vein endothelial cells Human mammalian epithelial cells Keratinocyte Megakaryocyte progenitor Nasal airway epithelium Neurons Peripheral blood lymphocytes Peripheral blood mononuclear cells Rat hepatocytes Smooth muscle T lymphocytes (CD4+) T lymphocytes (CD8+) Trophoblastic Species Human, Porcine Human, Bovine Bovine Porcine Bovine Human, Mouse Mouse Rat Human Porcine Human Human, Mouse, Rat Mouse, Rat Human Human Human, Mouse Mouse Human Mouse, Rat Human, Mouse Macaques Wistar Rat Porcine Macaques Mouse Human shRNA キットには ExpressMag Bead バイアルが含まれており、このビーズがレ ンチウイルスパーティクルと結合し、ExpressMag 磁性プレートによりプ レート側に引き寄せられます。更に、細胞表面にウイルスを誘引すること によって、トランスフェクション効率が飛躍的に向上します。標準サイズ のウェルプレート、 T-25 ∼ T-75 の組織培養フラスコや 5 cm 以下のシャー レと組み合わせてご使用いただけます。 ExpressMag により、MISSION レンチウイルスによる 293T 浮遊細胞のトランスフェクションが向上するこ とが実証されており、MOI が 1 程度のケラチノサイトなどのヒト初代培 養細胞のトランスフェクションも可能です。 96-well Cell Culture Dish 26 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] shRNA 作製オプション用 カスタムベクター一覧 MISSION® shRNA のサービスをお客様のニーズに合わせてカスタマイズすることが可能です。 CMV、ネオマイシン耐性、IPTG による発 現誘導、tGFP などの蛍光タンパク導入済みのベクターなどのオプションをご用意しております。下表、下図には、MISSION shRNA のカ スタマイズベクターの一部を示しています。これ以外にもお客様ご要望の配列を組み込むカスタムサービス等もございます。ご要望がござ いましたらお気軽にお申しつけください。 MISSION shRNA Vector Collection, Vector Map U6 U6 shRNA puroR CMV TurboGFPTM puroR hPGK TurboGFP CMV hPGK shRNA U6 pLKO.1-puro pLKO.1-CMV-tGFP (Ψ) Psi pLKO.1-puro-CMV-tGFP 7,435 bp 7,032 bp 8,371 bp shRNA (Ψ) Psi ( ) Psi shRNA U6 shRNA hPGK CMV neoR neoR hPGK TurboGFP CMV U6 neoR shRNA U6 (Ψ) Psi pLKO.1-hPGK-Neo pLKO.1-CMV-Neo (Ψ) Psi pLKO.1-hPGK-Neo-CMV-tGFP 8,497 bp 7,241 bp 7,178 bp (Ψ) Psi hU6 1xLacO LacO cPPT hPGK promoter 1xLacO hU6 2xLacO LacO cPPT hPGK promoter puroR LacO RRE puroR RRE GSG-F2A GSG-F2A 5’LTR pLKO_IPTG_1xLacO 8684 bp pLKO_IPTG_3xLacO 5’LTR Lacl WPRE PUC Origin WPRE PUC Origin HIV sin 3’ LTR HIV sin 3’ LTR AMP resistance Vector Backbone pLKO.1-puro TRC2-pLKO-puro pLKO.1-CMV-tGFP pLKO.1-puro-CMV-tGFP pLKO.1-CMV-Neo pLKO.1-hPGK-Neo pLKO.1-hPGK-Neo-CMV-tGFP pLKO.1-puro-CMV-TagCFP™ pLKO.1-puro-CMV-TagYFP™ pLKO.1-puro-CMV-TagRFP™ pLKO.1-puro-CMV-TagFP635™ pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP pLKO.1-puro-UbC-TagFP635 pLKO-puro-IPTG-1xLacO pLKO-puro-IPTG-3xLacO Lacl 8726 bp RSV RSV AMP resistance F1 ORI Expression Constitutive Inducible ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ Puromycin ○ F1 ORI Selection Method Neomycin (G418) Fluorescence ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ sigma.com/customcloning Technical Support 03-5796-7330 [email protected] 27 IPTG 発現誘導 shRNA ベクター shRNA が一定のレベルで安定的に発現されることは RNAi 実験において非常に重要です。しかし、さらなる機能解析を行う場合、遺伝子 の発現をコントロールすることが重要な要素の１つです。発現のコントロールは、特に致死性や重要な遺伝子の研究に不可欠です。新しい pLKO IPTG 誘導ベクターは LacI( リプレッサー ) 及び改変ヒト U6 プロモーターと LacO（オペレーター）が導入されています。 IPTG 非存 在下では、LacI リプレッサーが LacO オペレーターに結合し、shRNA の発現を抑制します。 IPTG を添加するとアロステリックな LacI は構 造が変化することで解離し、U6 プロモーターによって shRNA が発現されるようになります。 Switch OFF hU6 LacO hPGK shRNA Puro 2A LacI Switch ON hU6 LacO hPGK shRNA Why Use IPTG-Inducible shRNA? 2A LacI Gene Silencing Potency • IPTG によって shRNA 発現の ON/OFF を調節可能 • 単一ベクターシステムで shRNA を効率的に発現調節 w/o IPTG 80 Vector 1x LacO 100 3x LacO with IPTG w/o Repressor 60 Constitutive 0% 40 20% 40% 60% 80% Expected % Knockdown of Target Gene 100% 20% 40% 60% 80% Expres s ion without IPTG induction 100% Leakiness 20 1x LacO 0 1xLacO 3xLacO Vector remaining GFP median FL [%] Puro shRNA IPTG U6 promoters variants 3x LacO shRNA発現誘導効率の比較 GFP 発現 Jurkat 細胞へ、GFP 特異的な shRNA を組み込んだベクターを導入した。コン トロールとして、リプレッサーを除去したプラスミドも導入した。全ての細胞は 1 mM IPTG で処理した。導入後 5 日目に GFP の発現量を測定し、empty ベクターコントロール のデータを用いて標準化した。 Constitutive 0% IPTG inducible shRNA コントロール 用途 製品名 製品番号 プラスミドＤＮＡ レンチウイルス MISSION 1x LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC312 SHC312V MISSION 3X LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC332 SHC332V MISSION 1x LacO Inducible TurboGFP™ shRNA Control SHC314 SHC314V MISSION 3x LacO Inducible TurboGFP shRNA Control SHC334 SHC334V MISSION 1x LacO Inducible Luciferase shRNA Luciferase shRNA Control コントロール MISSION 3x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC317 SHC317V SHC337 SHC337V ネガティブ コントロール tGFP shRNA コントロール カスタマイズ可能です ご要望に応じてカスタムクローニングサービスをご提供いたします。 • ベクター： 1x LacO または 3x LacO • フォーマット： プラスミド DNA または ウイルス粒子 • タイター： 1x106 – 1x109 TU/ml • 容量： 200µl – 10ml • shRNA 配列： MISSION shRNA 配列 または カスタム配列 sigma.com/inducible 28 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] shRNA カスタムクローニングお見積り用紙 2014.01 挿入配列 コントロール shRNA 作製を希望 □ Non-Target shRNA 配列を導入 □ TurboGFP™ 発現マーカーを導入 □ TurboGFP ノックダウン shRNA 配列を導入 □ eGFP ノックダウン shRNA 配列を導入 □ Luciferase ノックダウン shRNA 配列を導入 □ 他（ ） ターゲットに対する shRNA 作製を希望 （遺伝子、配列に関する詳細情報をご記入ください。） □ 既存 TRC クローンの配列を導入 □ お客様で同定された配列を導入 □ お客様で同定された遺伝子配列に対し、TRC アルゴリズムにて shRNA 配列を決定、導入 □ 他（ ） shRNA RefSeq No. 必要な TRC クローン（TRCN 00XXXXX) または 配列情報 Gene Symbol ベクター / 遺伝子マーカーの選択 （MISSION® shRNA Vector Collection 26 ページ） □ pLKO.1-puro, □ TRC2（TRC2-pLKO-puro, WPRE が含まれます ), □ pLKO.1-CMV-tGFP, □ pLKO.1-puro-CMV-tGFP, □ pLKO.1-hPGK-Neo, □ pLKO.1-CMV-Neo, □ pLKO.1-hPGK-Neo-CMV-tGFP, □ pLKO.1-puro-CMV-TagCFP™ , □ pLKO.1-puro-CMV-TagYFP™ , □ pLKO.1-puro-CMV-TagRFP™ , □ pLKO.1-puro-CMV-TagFP635™ , □ pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP, □ pLKO.1-puro-UbC-TagFP635, □ pLKO_IPTG_1 × LacO, □ pLKO_IPTG_3 × LacO 上記以外のベクターを選択 ( お客様がお持ちのベクターを利用する場合、詳細を添付してください。 ) ご希望の納品フォーマット □ プラスミド DNA □ レンチウイルスパーティクル （通常仕様 : 106 TU/mL, 0.2mL） 容量変更希望 ： □ 1mL □ 2mL □ 5mL □ 10mL Titer 変更希望 ： □ 107 TU/mL □ 108 TU/mL □ 109 TU/mL MISSION Targeted Integration shRNA Kit（ランダムインテグレーションの抑制） □ ご注文方法についてのお問い合わせ □ 製品詳細のご案内を希望 （ ） ご登録いただき ました情報は、ダイレクトメール配信、カタログ送付、お問い合わせへの返答に使用させていただきます。 お客様情報 その他、詳しい内容は、弊社 WEB サイト・プライバシーポリシーの項をご覧下さい。送付不要の場合は『ご案内送付』欄にて "NO" にチェックをお願い致します。 ご氏名 様 御職位 日 付 ご所属 ご住所 − − TEL FAX − − ご担当教官様または実験責任者のご氏名 様 E-mail □ Yes □ No ご案内送付 郵送 □ Yes □ No □登録済み E-mail FAX: 03-5796-7325 MISSION shRNA 担当宛 代理店 （営業所） 名 カスタマーコード 営業ご担当者名 49 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] 29 100 % Expression shRNA 配列のランダムインテグレーションを抑制 80 60 Targeted Integration shRNA kit powered by CompoZr ZFN 40 20 レンチウイルスによるランダムインテグレーションは、ターゲットではない他の遺伝子や配列が改変されることで、表現型にも影響を与える可能性があ 0 ることが知られています。 MISSION® Targeted Integration shRNA Kit は CompoZr® Zinc Finger Nuclease テクノロジーを用いることで、shRNA を "safe harbor" であることが知られているヒト AAVS1 領域に挿入されるよう設計されており、ランダムインテグレーションのリスクを軽減することが可能 です。 Features and Benefits Targeted shRNA integration in K562 cells • shRNA の挿入箇所が一定（ヒト AAVS1 領域）のため、実 験間・クローン間でのばらつきが減少 • Zinc Finger Nuclease を用いることで shRNA を効率的に AAVS1 領域へ挿入可能 Workflow 60 40 20 SA-2A-Puro-PolyA U6 A) AAVS1 Left 80 shRNA のみを詳細に観察可能 % Expression 100 • ランダムインテグレーションが抑制され、ターゲット遺伝子 Homology Arm 0 MCS pZDonor-AAVS1 Puromycin Ctrl AAVS1 Right Homology Arm shRNA Sigma MISSION Operations Subclones a user-specified shRNA coding sequence into MCS of pZDonor-AAVS1 Puromycin BRCA-1 Ctrl ULK-1 Ctrl TXN 任意の shRNA をクローニングしたプラスミド DNA 及び shRNA 配列をゲノム DNA に組 み込むために必要な AAVS1領域を切断するための ZFN-mRNA を K562 細胞へ導入した。 ターゲット遺伝子のノックダウン効率は qRT-PCR 法を用いて測定し、non-targeting shRNA のデータをもとに標準化した。 References DeKelver et al., 2010 Genome Research Lombardo et al., 2011 Nature Methods B) shRNA pZDonor Plasmid DNA Ordering Information mRNA Encoding ZFN Targeting AAVS1 製品番号 製品名 CSTPZD MISSION Targeted Integration shRNA Kit ※ こちらはカスタムサービスになります。詳細はお問い合わせ下さい。 C) Co-Transfect Donor Plasmid and ZFN mRNA into Cell Type of Interest D) ZFN Cuts AAVS1 Site in Genome of Cell Type of Interest (Human chr19:60,318,931-60,318,961) Kit Components Kit Reagents ZFN mRNA – AAVS1 Supplied 3 x ~0.6 µg/µL AAVS1 Forward Primer 1 x 25 µM Puro Reverse Primer 1 x 25 µM Integration Control – AAVS1 1 x ~35 ng/µL 1 x ~2.50 µg/µL pZDonor – AAVS1-shRNA shRNA pZDonor Plasmid DNA ZFN Cutting Stimulates Homology Directed Repair to Integrate Donor Plasmid-DNA E) Targeted Integration of shRNA F) Puromycin Selection to Identify Targeted Clones sigma.com/tishrna 30 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] shRNA Screening Sigma-Aldrich では TRC コレクションの網羅性を活用し、様々な RNAi スクリーニング用ライブラリーをご用意しています。全ゲノムスクリーニ ング可能なプール型 shRNA ライブラリー、遺伝子機能毎に焦点を合わ せた Gene Family set ライブラリーのほか、カスタムライブラリーの作 製も可能です。あらゆる研究の目的に適したフォーマットをご提供いたし ます。 Choose the Screen that Fits Your Research 製品番号 Content Format Screen Duration +++ = Longer SHPH01 whole genome, SHPM01 human or mouse LentiPlex LentiExpress SHX001 kinome, human Pre-designed Panels SHxxxx focused gene collections, （xxxx は数字）human or mouse Custom-designed Custom your gene list, any species Panels and Pools Knockdown Analysis Workload Arrayed – Single shRNA per well, ++ = Moderate Pooled – Multiple shRNAs per well + = Quick +++ = Advanced ++ = Intermediate + = Novice Pooled + +++ ※ Arrayed Arrayed + ++ + + Arrayed or pooled + to +++ + to +++ ※ shRNA の同定には、FACS や次世代シークエンサーが必要になる場合があります High-Throughput Screening MISSION® shRNA ライブラリー製品を用いることで、新たなパスウェイを解明し新たなマーカー遺伝子を発見できる大きな可能性があります。これら のライブラリー製品を使って細胞の生存、増殖、遊走、有糸分裂停止、酵素反応などに関する多様なスクリーニングアッセイを行なうことができます。 % Cell Growth Relative to pLKO Control with Paclitaxel Treatment shRNA 製品名 1000 Paclitaxel 感 受 性 に関 する腫 瘍 抑 制 遺 伝 子 ノックダウン細胞のスクリーニング Percent Cell Growth Relative to Control MISSION TRC Human Tumor Suppressor Family Set（製品番号 SH0531）を使用し、一般に使用さ れている癌治療薬である Paclitaxel に対する細胞の Decreased Sensitivity 100 10 1 Enhanced Sensitivity 0.1 0.1 1 10 100 1000 Percent Cell Growth Relative to pLKO Control with No Drug Treatment 感受性を増大させる遺伝子をスクリーニングした。レ ンチウイルス粒子を使用して 96 ウェルプレート内で 細胞に導入し、対応する腫瘍抑制遺伝子の発現をノッ クダウンした。細胞を 2 つに分け、一方のサンプルセッ トは Paclitaxel で処理し、もう一方のサンプルは培 地のみで処理した。結果を、pLKO.1-puro Control Transduction Particle（製品番号 SHC001V）で標 準化した。統計的に有意差のある遺伝子がいくつか 認められ、これらは shRNA 発現コンストラクトの導 入により Paclitaxel 処理に対する感受性が変化して いることをを示している。赤色のデータポイントは、 Paclitaxel に対する感受性増大のポジティブコント ロールを示している。 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] 31 遺伝子機能別 shRNA ライブラリー MISSION® shRNA Gene Family Sets Gene Family Sets は特異的な細胞間 / 分子間相互作用の情報を NCBI、Gene Ontology Protein Lounge、Ingenuity Systems より抽出した遺伝子セッ トとなります。コレクションは TRC1/1.5 のクローンで構成されています。 3 種類のフォーマット（大腸菌グリセロール、精製プラスミド DNA、レンチウ イルスパーティクル）で提供可能です。 仕様： ■ 大腸菌グリセロールストック ■ レンチウイルスパーティクル 50 µl aliquot of bacterial glycerol stocks (terrific broth, carbenicillin at 100 µg/ml and 15% glycerol), QC; No Sequencing, Visual Inspection for Growth. An average of 2 µg per clone (range of 400 ng – 4 µg) is provided, and is aliquoted at 40 µl per well, QC; Sequencing Verification, DNA Quantitation. 4 x 50 µl aliquots of VSV-G pseudotyped lentivirus, fully titered to individual wells, QC; Sequencing Verification, p24 ELISA Titer. カスタム品となります。詳細はお問合せ下さい。 表中のクローン数、ターゲット数が実際の納品物と異なる場合がございます。 価格については都度お見積りとなります。詳細はお問合せ下さい。 ■ レンチウイルスパーティクル (representational, plate titer) 4 x 50 µl aliquots of VSV-G pseudotyped lentivirus, 10% representational plate titer, QC; Sequencing Verification, p24 ELISA Titer. MISSION shRNA Gene Family Sets 製品番号 生物種 Human Mouse Gene Family Set Apoptosis Pathway B-Cell Activation Cell Adhesion Genes Cytokine and Chemokine Cytokine and Chemokine Receptors Cytoskeleton Genes Epigenetic Regulators DNA Repair Pathway Ubiquitin Hydrolases (DUBS) Extracellular Matrix Genes G-Protein Coupled Receptors (GPCRs) Helicase Ion Channel JAK-STAT Pathway Kinases, complete Nuclear Hormone Receptors p53 Pathway Phosphatases T-Cell Activation Tumor Supressors Tyrosine Kinases Ubiquitin Ligases (E1, E2, E3) Kinases, complete Phosphatase Tyrosine Kinase カスタムライブラリー Glycerol SH1911 SH2911 SH2211 SH0811 SH1311 SH2311 SH3011 SH1811 SH0711 SH2511 SH0211 SH2611 SH1011 SH2711 SH0111 SH1111 SH2411 SH0411 SH2811 SH0511 Plasmid DNA SH1921 SH2921 SH2221 SH0821 SH1321 SH2321 SH3021 SH1821 SH0721 SH2521 SH0221 SH2621 SH1021 SH2721 SH0121 SH1121 SH2421 SH0421 SH2821 SH0521 製品情報 Lentivirus Lentivirus Rep. Titer Full Titer SH1931 SH2931 SH2231 SH0831 SH1331 SH2331 SH3031 SH1831 SH0731 SH2531 SH0231 SH2631 SH1031 お問い合わせ ください SH2731 SH0131 SH1131 SH2431 SH0431 SH2831 SH0531 お問い合わせください SH2111 SM0111 SM0411 SM2011 SH2121 SM0121 SM0421 SM2021 SH2131 SM0131 SM0431 SM2031 Gene Count 443 99 368 106 93 275 10 117 127 331 541 136 279 190 672 218 242 316 242 73 133 349 618 290 133 Clone Count 3,512 661 2,396 538 584 1,991 59 837 830 1,968 2,864 909 1,456 1,358 7,742 1,448 1,865 2,065 1,469 575 1,728 2,151 3,916 1,734 850 お問い合わせください sigma.com/shrnascreen Avg Number Clone/Gene 7.9 6.7 6.5 5.1 6.3 7.2 5.9 7.2 6.5 5.9 5.3 6.7 5.2 7.1 11.2 6.6 7.7 6.5 6.1 7.9 13.0 6.2 6.3 6.0 6.4 shRNA ■ 精製プラスミドDNA (full, individual well titer) 32 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] プール型 全ゲノム shRNA ライブラリー LentiPlex® Pooled Whole Genome Library MISSION LentiPlex Pooled Library は、信頼性の高い TRC shRNA ライブラリーを用いて、ベンチトップ上でゲノムワイドな RNAi スクリーニングを可 能にするスクリーニングツールです。使いやすいフォーマットになっており、スクリーニング用の大型機器等は必要なく、試薬の使用量も最小限に抑え ることが可能です。 Human および Mouse 、それぞれ約 1 万 6 千遺伝子を網羅 約 8 万クローンを 10 種類のサブプール（1 サブプールは約 8 千クローンを含む）に分割 ウイルスタイターは、p24 アッセイにおいて 5ｘ108TU/mL 以上 ロボットや分注機が不要。全てベンチトップで実験可能 shRNA FACS 等、多くの蛍光を用いたアッセイに適応 10 チューブに 分かれた LentiPlex Content Total Validated Human Clones 82,017 24,550 Mouse Clones 77,819 20,564 159,836 45,114 16,019 7,405 Total Clones Human Genes Mouse Genes 15,960 6,506 Total Genes 31,979 13,911 LentiPlex Pooled Library シークエンスした配列と データベースを照会し、 目的の shRNA を同定 ウイルスを 予め決められた MOI で細胞集団に 感染させる 細胞からゲノム DNA を 抽出し増幅プライマー で PCR をかける インキュベーション 2-4 日 ピューロマイシンで選択 表現系により目的の細胞を選択 MISSION LentiPlex Pooled System Work Flow ※細胞をコロニークローニングか FACS で単離し PCR 後、シーケンサーで配列を同定 LentiPlex は 10 本のサブプールに分かれている。あらかじめ決定しておいた MOI でウイルス プールを感染させた後、薬剤選択を行う。その後、FACS 等を用い目的の表現型を示した細胞 群を分取する。ゲノムに組み込まれた shRNA は PCR の後にシーケンサーを用いて確認する。 各々の shRNA がターゲットとする遺伝子を同定後、それらの生物学的役割を検証する。 製品名 MISSION LentiPlex Human Pooled shRNA Library MISSION LentiPlex Mouse Pooled shRNA Library 製品番号 価格 SHPH01-1SET SHPM01-1SET ¥1,662,100 ¥1,662,100 References 1. 1.Richard Possemato et al. Functional genomics reveal that the serine synthesis pathway is essential in breast cancer. Nature, 476:346-350(2011). 2. Christine Karlsson et al. Forward RNAi screens in human stem cells.Methods Mol Biol., 650:29-43 (2010). 3. Sigma-Aldrich Corp. Genome-Wide RNAi Screens sigma.com/lentiplex Technical Support 03-5796-7330 [email protected] 33 次世代シーケンサーを用いたLentiPlex® pooled libraryの解析方法 Next-Gen Sequencing for Deconvolution of shRNA Pools DNA Preparation and • NGS による配列解析により、クローンの正確な出現頻度を知ることが できる • 網羅的で再現性の高いデータの取得が可能 • 情報が豊富なため、統計的にも堅牢なデータ or 1 × 10ˆ6 - 10 × 10ˆ6 Cells Tumor Samples Genomic DNA Extraction Why Use Next-Gen Sequencing Over Other Methods for Pooled Screen Deconvolution? 広いダイナミックレンジ 正確な shRNA 頻度をカウント可能 ハイブリダイゼーションのバイアスが無い：偽陰性データが少ない クロス - ハイブリダイズが無い：偽陽性データが少ない TA クローニングが不要 細胞のクローニングが不要 Genomic DNA PCR shRNA from Genomic DNA Extraction PCR of shRNA from genomic DNA shRNA Primers containing adapter, barcode and binding sites Sequence shRNA in pool Pool multiple samples High Throughput Sequencing Sequence Alignment and Data Clean-up カスタムライブラリーサービス TRC ライブラリーから、お客様の抽出されたクローンをプレートでご提供するサービスです。 100 クローン以上より承ります ( プールライブラリーは 500 クローン以上となります）。 Format Material Provided Bacterial Glycerol Stock 50 µl aliquot of bacterial glycerol stocks (terrific broth, carbenicillin at 100 µg/ml and 15% glycerol) Purified Plasmid DNA An average of 2 µg per clone (range of 400 ng - 4 µg) is provided, and is aliquoted at 40 µl per well Lentivirus (representational, plate titer) 4 x 50 µl aliquots of VSV-G pseudotyped lentivirus, 10% representational plate titer(1x106 TU/mL) Lentivirus (full, individual well titer) 4 x 50 µl aliquots of VSV-G pseudotyped lentivirus, fully titered to individual wells(1x106 TU/mL) Pooled lentivirus 8 x 25 µl aliquots of VSV-G pseudotyped lentivirus Quality Control No Sequencing, Visual Inspection for Growth Sequencing Verification, DNA Quantitation Sequencing Verification, p24 ELISA Titer Sequencing Verification, p24 ELISA Titer deep sequencing shRNA • • • • • • 34 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] shRNA ヒト キナーゼ用 shRNA ライブラリー MISSION® LentiExpress™ Human Kinases LentiExpress technology: Reverse transfection 法を採用することによ り、簡単で経済的にレンチウイルスによる迅速な shRNA スクリーニング が可能です。 96 ウェルプレートに予めウイルス粒子が分注されているた め、細胞を加えるだけで実験を行うことができます。 LentiExpress Method ■ レンチウイルス粒子を予め分注済み LentiExpress viral particle ■ reverse transfection 法を採用 ■ 導入効率の向上 Step 1 培養液に懸濁した細胞を LentiExpressの各 ウェルに分注 shRNA ■ コントロールも配列済み ■ 一遺伝子あたり 3-5 クローンで広範囲にカバー 本セットは 41 枚の 96 穴プレート上に配列した、約 500 のヒトキナーゼ 関連遺伝子に対する約 3,200 の shRNA 発現レンチウイルスで構成され ています。それぞれのプレートには最大 80 種の shRNA を搭載していま す。ネガティブコントロールが両側の列に配置されています。 Cells added to viral particles Step 2 オーバーナイト培養の後、 新鮮な培養液に交換 Step 3 (optional) Puromycinにより導入細 Transduced cells 胞をセレクションし、コロ ニーを増殖させる（5-7日） Step 4 表現系あるいは細胞応答 性によるファンクショナ ルアッセイ Phenotypic read-out Representative Kinase Plate Layout C C N N M M M M MISSION LentiExpress Optimization Plate K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K = Kinase N = Non-target Control K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K C C N N M M M M C = Empty Vector Control M = Media Only Optimization Plate Layout LentiExpress によるアッセイを成功させる上で、導入条件の最適化は非 常に重要です。本スクリーニングの前に Optimization Plate を用いて最 M M M M M M M M 適な細胞密度を決定する必要があります。 ■ 迅速に導入条件の最適化が可能 ■ 細胞種ごとの最適化を容易に ■ 予め配列された TurboGFP ™ control Particle による迅速な光学 モニタリング O O C N O O C N O O C N O O C N O O C N O O C N O O C N O O C N O O C N O O C N O = TurboGFP Control N = Non-target Control 製品名 MISSION LentiExpress Human Kinases MISSION LentiExpress Optimization Plate O O C N O O C N O O C N O O C N O O C N O O C N O O C N O O C N O O C N O O C N M M M M M M M M C = Empty Vector Control M = Media Only 使用回数 CAT.NO. 価格 1 3 1 3 SHX001-1EA SHX001-3EA SHXC01-1EA SHXC01-3EA ¥990,000 ¥1,990,000 ¥99,000 ¥199,000 bio biosilencing Biorevolution. Release your screening potential with our powerful range of RNAi screening tools. most validated and comprehensive screening tools available including lentiviral shRNA, siRNA, and esiRNA libraries and panels. Now, researchers have complete non-coding RNA solutions from screening to validation. Use the MISSION microRNA Human Mimics to screen, the Target ID Library to functionally identify microRNA targets and the MISSION 3’UTR Lenti GoClone™ products for microRNA target validation. MISSION RNAi technologies – release your screening potential. MISSION, Sigma and Sigma-Aldrich are registered trademarks of Sigma-Aldrich Biotechnology, L.P. and Sigma-Aldrich Co. GoClone is a trademark of SwitchGear Genomics. 36 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] microRNA発現定量 microRNA cDNA 合成キット mature microRNA target MystiCq microRNA Synthesis kit には、microRNA を qPCR のテンプレートとするためのポリアデニル化及び逆転写に必要 な試薬が全て含まれています。 5’ 3’ Poly(A) tailing Poly(A) polymerase AAAAAAAAAAAAAA キット内容 Poly(A) Tailing Buffer (5x) Poly(A) Polymerase microRNA cDNA Reaction Mix Reverse Transcriptase Universal PCR Primer Human Control Primer (SNORD44) RNase/DNase-Free Water Reverse Transcriptase AAA AAAAAAAAAAAAAA cDNA synthesis oligo-dT adapter primer AAAAAAAAAAAAAA 製品名 製品番号 MystiCq microRNA cDNA Synthesis Mix MIRRT 使用回数 価格 25RXN ¥46,300 100RXN ¥153,400 micoRNA 発現測定用プライマー MystiCq microRNA qPCR Primer はバリデーション済みの microRNA 特異的プライマーです。 MystiCq microRNA cDNA Synthesis Mix を用いて作製された cDNA サンプル から特異的な成熟 microRNA を検出するために用いるため MystiCq microRNA-specific Assay Primer (or Control Primer) のプレデザイン プライマーです。 Universal PCR primer 特徴 ncRNA 対象生物種： ヒト、マウス、ラット バリデート済み 自己相補性、プライマーダイマーの 抑制を考慮したデザイン 製品名 製品番号 使用回数 価格 MystiCq microRNA qPCR Assay Primer MIRAPxxxxx 250RXN ¥15,200 MystiCq microRNA qPCR Control Primer MIRCPxxxxx 250RXN ¥15,200 MIRUP 500RXN ¥15,200 MystiCq Universal PCR Primer 各ターゲットに対する製品情報は、弊社トップページを用いて検索してください。 ターゲット遺伝子に関連する全ての製品を閲覧することが可能です sigma.com/japan Use The Search Box Technical Support 03-5796-7330 [email protected] 37 SYBR® Green qPCR Ready Mix Ready Mix は ホット ス タ ート Taq ポリメラ ー ゼ を 用 い、 microRNA の検出に最適化された qPCR アッセイキットです。 リファレンス色素は各 qPCR 機器に最適化されています。 製品名 製品番号 MystiCq microRNA SYBR™ Green qPCR ReadyMix™ MIRRM00 MystiCq microRNA SYBR™ Green qPCR ReadyMix, Low ROX™ MIRRM01 MystiCq microRNA SYBR™ Green qPCR ReadyMix, with ROX™ MIRRM02 MystiCq microRNA SYBR™ Green qPCR ReadyMix, iQ™ MIRRM03 使用回数 価格 100RXN 500RXN 2000RXN 100RXN 500RXN 2000RXN 100RXN 500RXN 2000RXN 100RXN 500RXN 2000RXN ¥40,200 ¥173,600 ¥612,100 ¥40,200 ¥173,600 ¥612,100 ¥40,200 ¥173,600 ¥612,100 ¥40,200 ¥173,600 ¥612,100 qPCR機器適応表 Real-time PCR Instrument Name MystiCq microRNA SYBR® Green qPCR ReadyMix™ MIRRM00 MystiCq microRNA SYBR Green MystiCq microRNA SYBR Green qPCR ReadyMix Low ROX™ qPCR ReadyMix with ROX MIRRM01 MIRRM02 MystiCq microRNA SYBR Green qPCR ReadyMix iQ MIRRM03 ncRNA Applied Biosystems 5700 Applied Biosystems 7000 Applied Biosystems 7300 Applied Biosystems 7500 Applied Biosystems 7500 Fast Applied Biosystems 7700 Applied Biosystems 7900 Applied Biosystems 7900 HT Fast Applied Biosystems 7900HT Applied Biosystems StepOnePlus™ Applied Biosystems StepOne™ Applied Biosystems ViiA 7 Bio-Rad CFX384™ Bio-Rad CFX96™ Bio-Rad iCycler iQ™ Bio-Rad iQ™5 Bio-Rad MiniOpticon™ Bio-Rad MyiQ™ Bio-Rad/MJ Chromo4™ Bio-Rad/MJ Opticon 2 Bio-Rad/MJ Opticon® Cepheid SmartCycler® Eppendorf Mastercycler® ep realplex Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s Illumina Eco qPCR Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000 Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000 Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q Roche LightCycler™ 480 Stratagene Mx3000P® Stratagene Mx3005P® Stratagene Mx4000™ Takara DICE® Takara Smart Cycler® sigma.com/mysticq 38 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] ヒト成熟 microRNA mimic MISSION® microRNA Mimics MISSION microRNA(miRNA) Mimics は成熟 miRNA として機能するようにデザインされており、miRNA の機能解析に適したツールです。特殊な修 飾とデザインにより、パッセンジャー鎖のオフターゲット効果を低減しています。 特長 • 特殊な修飾とデザインによるオフターゲット効果の減少 • 他の生物種や異なる miRBase ver. に対するカスタムデザインも対応 MISSION miRNA mimics significantly reduce known gene target expression 120 MISSION miRNA mimic design and modification Extra base creates bulge 3 ’- d Td TACCU U UAC AU U CC U U C AC AC ACC - N H 2 - 5’ 5’- U G G - A AU G UA AGGA AG U GUGUGG Sense strand 3’ 5’ % Reporter Expression 可能 Anti-sense strand 特徴的なデザインと修飾により、センス鎖による フターゲット効果を低減するよう設 計されている。 80 60 40 20 0 - 3’ Amine Negative Control miR-X 100 1 101 206 15a 29a 10a 221 155 20a 21 27a 130a HeLa 細 胞 へ 任 意 の miRNA Mimics と miRNA の タ ー ゲ ット 配 列 を 含 ん だ psiCHECK2 Dual Luciferase Reporter(Promega) を導入した。それぞれのコンストラクト には、miRNA のターゲット配列と 100% 相補的な配列を含む、3 UTR の全長が組み 込まれている。ネガティブコントロールは、ヒトのゲノム / 転写産物に対応していない miRNA を使用した。 Reduction of passenger strand off-target effects 生物種 製品番号 Individual clones MISSION human microRNA mimic human HMIxxxx 容量 5 nmol 価格 ¥39,800 Negative control Control #1 A. thaliana HMC0002 5 nmol ¥39,800 Control #2 C. elegans HMC0003 Library MISSION microRNA Mimics human MI00200 0.25 nmol ¥1,500,000 Human Library each ncRNA ※ 納期は在庫状況により異なります。ご発注時にご確認ください。 % Reporter Activity 製品名 （ターゲット miRNA をご検索ください） Negative Control ~95 120 MISSION microRNA Mimic 100 80 60 40 20 0 siDesign (+) siDesign (-) MISSION (+) MISSION (-) hsa-miR-206 に対応する miRNA Mimics を用い、パッセンジャー鎖のオフターゲッ ト効果を検証した。従来の siRNA デザイン (siDesign) で設計した配列に対し、修飾 （siDesign ＋）と非修飾（siDesign −）を作製、また MISSION miRNA Mimics デザイ ン（MISSION）で設計した配列についても、修飾（MISSION ＋）と非修飾（MISSION −） を作製し、それぞれのオフターゲット効果を検証した。レポーターはパッセンジャー鎖 に 95% 相同的な配列を含んでいる。MISSION miRNA Mimics で使用されているデザ インと修飾が、オフターゲットの低減に効果的であった。 References 各ターゲットに対する製品情報は、弊社トップページを用いて検索してください。 ターゲット遺伝子に関連する全ての製品を閲覧することが可能です sigma.com/japan Use The Search Box Schultz, N. et al. 2001. Off-target effects dominate a large-scale RNAi screen for modulators of the TGF-β pathway and reveal microRNA regulation of TGFBR2. Silence 2:3 Collino F., Deregibus M., Bruno S., Sterpone L., Aghemo G., et al. 2010. Microvesicles Derived from Adult Human Bone Marrow and Tissue Specific Mesenchymal Stem Cells Shuttle Selected Pattern of miRNAs. PLoS One 5:e11803. sigma.com/mimics 他の生物種に対するデザイン、各種修飾、 in vivo 用途なども承ります。 お気軽にお問い合わせください。 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] 39 microRNA インヒビター (Tough Decoy RNA) MISSION® Synthetic microRNA inhibitor MISSION Synthetic miRNA inhibitor は、miRNA と相 補 的 な 配 列 を 有し、 効 率 的 且 つ 特 異 的に miRNA 活 性 を 抑 制 する「Synthetic Tough Decoy(S-TuD)」 RNA です。 S-TuD RNA は、ヌクレアーゼ耐性修飾された合成２本鎖 RNA であるため、導入された細胞内で長期間機能します。 S-TuD RNA は東京大学医科学研究所 伊庭英夫教授らによって開発された技術です。 Synthetic miRNA inhibitor 模式図 Reporter Expression (Renilla/Firefly) MISSION Synthetic microRNA Inhibitors Significantly Reduce Target microRNA Activity STEM II STEM I 20.0 15.0 10.0 miRNA binding site (MBS) 5.0 0.0 Synthetic miRNA inhibitor は 2 種類の 2 本鎖領域 (STEM I, II) 及び miRNA 結合領 域 (MBS) で構成され、1 分子中に 2 つの MBS を有する合成二本鎖 RNA 分子である。 RNA は 2 -O- メチル化されており、ヌクレアーゼ耐性である。 miRNA Inhibitor Negative Control 25.0 Let-7c 20b-5p 21-5p 27a-3p 101-3p 125a-5p Dual Luciferase Assay: Hela Synthetic miRNA Inhibitor Cell Lines Hela 細胞へ miRNA inhibitor および miRNA に対するルシフェラーゼ レポーター (Promega) を同時に導入した。miRNA inhibitor を導入した場合、ルシフェラーゼの 発光がコントロールに比べ優位に高かった。 Inhibition of miR-191-5p Reporter Expression (Renilla RFU / Firefly RFU) 35 Reference: 1.Haraguchi, T., et al., Vectors expressing efficient RNA decoys achieve the long-term suppression of specific microRNA activity in mammalian cells. Nucleic Acids Res., 37, (2009). 2.Haraguchi, T, et al. A potent 2’-O-methylated RNA-based microRNA inhibitor with unique secondary structures. Nucleic Acids Res., 40, (2012) 30 25 20 Sigma 15 Competitor 1 10 Competitor 2 5 各ターゲットに対する製品情報は、弊社トップページを用いて検索してください。 0 10nM ターゲット遺伝子に関連する全ての製品を閲覧することが可能です 1nM Inhibitor Concentration Hela 細胞へ各社の miRNA インヒビターおよび hsa-miR-191-5p と相補的な配列を組 み込んだ psi-CHECK2 Dual Luciferase Reporter（Promega）を導入した。48 時間後 にルシフェラーゼの発現を測定し、miRNA 活性の抑制効果を比較した。 sigma.com/japan Use The Search Box 製品情報 MISSION Synthetic miRNA inhibitor 個別クローン （ターゲット miRNA に対するクローンをご検索ください） 生物種 製品番号 Human HSTUDxxxx Mouse MSTUDxxxx MISSION synthetic miRNA inhibitor negative control #1 A. thaliana NCSTUD001 MISSION synthetic miRNA inhibitor negative control #2 C. elegans NCSTUD002 – – カスタム 容量 価格 ¥ 32,000 5 nmol ¥ 32,000 ¥ 32,000 ¥ 32,000 – お問い合わせ sigma.com/syninhibitor 他の生物種に対するデザイン、各種修飾、 in vivo 用途なども承ります。 お気軽にお問い合わせください。 ncRNA 製品名 40 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] microRNA インヒビター (Tough Decoy RNA) MISSION® Lenti microRNA inhibitor MISSION Lenti miRNA inhibitor は、miRNA と相補的な配列を有し、効率的且つ特異的に miRNA 活性を抑制する「Tough Decoy(TuD)」 RNA を 細胞内で発現させるための製品です。レンチウイルスフォーマットであるため、目的細胞への導入を効率的に行うことが可能です。 TuD RNA は東京大学医科学研究所 伊庭英夫教授らによって開発された技術です。 Lenti miRNA inhibitor 模式図 Lenti miRNA inhibitor の発現機構 Integrated lentiviral miRNA inhibitor cassette hU6 promoter miRNA inhibitor miRNA inhibitor bound to miRNAs Expression of miRNA inhibitor STEM II STEM I miRNA binding site (MBS) Lenti miRNA inhibitor は 2 種類の 2 本鎖領域 (STEM I,II) 及び miRNA 結合領域 (MBS) で構成され、1 分子中に 2 つの MBS を有する一本鎖 RNA 分子である。 レンチウイルスによって目的細胞のゲノムに導入された Lenti miRNA inhibitor はヒ ト U6 プロモーターにより転写され、各 miRNA 特異的にデザインされた MBS によっ て任意の miRNA の活性が抑制される。 製品情報 製品名 生物種 製品番号 MISSION Lenti miRNA inhibitor 個別クローン （ターゲット miRNA に対するクローンをご検索ください） Human HLTUDxxxx Mouse MLTUDxxxx MISSION Lenti miRNA inhibitor negative control #1 A. thaliana HLTUD001C MISSION Lenti miRNA inhibitor negative control #2 C. elegans HLTUD002C – – ncRNA カスタム フォーマット 価格 ¥ 100,000 レンチウイルス ≧ 1x106TU/mL, 0.2mL ¥ 100,000 ¥ 100,000 ¥ 100,000 – お問い合わせ 「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律（通 MISSION Lenti miRNA inhibitor 製品は、 称カルタヘナ法）」の使用規制対象品となります。ご使用に際しては、規制に則し適切にお取り扱い下さい。また、施設申請の 際は sigma.com/rnai-jp をご参照ください。 各ターゲットに対する製品情報は、弊社トップページを用いて検索してください。 ターゲット遺伝子に関連する全ての製品を閲覧することが可能です sigma.com/japan Use The Search Box References Haraguchi, T., et al., Vectors expressing efficient RNA decoys achieve the long-term suppression of specific microRNA activity in mammalian cells. Nucleic Acids Res., 37, (2009). Technical Support 03-5796-7330 [email protected] 41 Lenti miRNA inhibitor 検証データ Inhibition of miR-206 Upregulates NOTCH3 Expression 200 8 180 Notch3 mRNA Expression % 9 7 6 5 4 3 2 1 ito r in hi b Co nt ro l 140 120 100 80 60 40 20 5a ito r nh ib NA 12 0 iR Control m m iR NA 20 6i ito r nh ib 2i 22 NA iR m 160 miRNA 206 inhibitor qRT-PCR of NOTCH3 in Hela Lenti miRNA Inhibitor Cell Lines Hela 細胞において、miR-206 は NOTCH3 を制御していることが知られている。そこで、 miR-206 inhibitor を導入することにによって、NOTCH3 の発現がどのように変動す るのか、qRT-PCR によって検証した。NOTCH3 の発現は、コントロールに比べ、78% Higher MOI may Increase miRNA Inhibition Inhibition of miR-21 Upregulates RHOB Expression 向上していた。 1818 180 1616 160 RHOB mRNA Expression, % Renilla:Fire y Luciferase Luminescence Renilla:Firefly Luciferase Luminescence (Normalized to Control) (Normalized to Control) Dual Luciferase Assay: Hela Lenti miRNA Inhibitor Cell Lines 任意の Lenti miRNA inhibitor を導入した Hela 細胞を 2 週間培養した後、それぞれ の miRNA 配列を挿入したルシフェラーゼレポーター (Promega) を導入した。miRNA inhibitor を導入することによって、ルシフェラーゼの発光は優位に上昇した。 1414 1212 1010 88 66 44 22 140 120 100 80 60 40 20 00 Control Control miRNA Inhibitor - MOI miRNA Inhibitor - MOI miRNA 2121 Inhibitor - MOI 2 2 miRNA 2121 Inhibitor - MOI 1010 Dual Luciferase Assay for miR-21 in HepG2 Cells HepG2 細胞へ miR-21 に対するルシフェラーゼレポーターを導入した。その後、MOI を段階的に変更した miR-21 inhibitor を導入し、抑制効果を比較した。 0 Control miRNA 21 inhibitor qRT-PCR of RHOB in HepG2 Lenti miRNA Inhibitor Cell Lines 肝細胞において miR-21 が RHOB の発現を制御していることが知られているため、 HepG2 細胞を用いて miR-21 inhibitor の検証を行った。miR-21 inhibitor が導入され た細胞では、RHOB の発現がコントロールに比べ 55% 上昇した。また、同様のデータ が Hela 細胞でも確認された (data not shown)。 sigma.com/lentiinhibitor shRNA Co nt ro l 0 Co nt ro l Renilla:Firefly Luciferase Luminescence Validation of Lenti miRNA Inhibitors by Dual Luciferase Assay 42 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] ヒト microRNA のターゲット遺伝子探索用 網羅的な 3 UTR ライブラリー MISSION® Target ID Library MISSION Target ID Library Vector Overview 特長 • 網羅的なターゲット 3' UTR スクリーニング 約 20,000 種類の Human cDNA が組み込まれたライブラリー 網羅的な UTR 領域のスクリーニングが簡単に行えます BamHI,1 SmaI,7 PstI,13 EcoRI,19 HindIII,31 SnaBI,279 4878 ,SnaBI • 効率的 ポジティブ / ネガティブセレクションを組合せ、 バックグラウンドを抑えた UTR スクリーニングが可能です CAT. NO. MREH01-1SET 4539 ,SpeI CMV 4302 ,Bg1II PstI,786 5000 TKzeo 4169 ,SspI 価格 Kit components 4000 p3’TKzeo 3485 ,ScaI ¥600,000 Target ID Library, 200 µL, 1 µg/µL Target ID Amplification Primer 1, 200 µL, 25 µM Target ID Amplification Primer 2, 200 µL, 25 µM 1000 SmaI,267 5,190 bps SfiI,1624 SfiI,1637 EcoRI,1672 PvuII,1762 2000 3000 polyA MISSION Target ID Library ワークフロー PvuII,2296 MISSION Target ID Library Transfection: MISSION Target MISSION® Target ID Library Transfection Transfection 細胞に Target ID を導入します（約 3-5 日）。 Zeocin Selection (Positive Selection): ゼオシンによる細胞のセレクションを行います。 導入されているゼオシン耐性遺伝子により、 Target ID がゲノムに取り込まれた細胞のみがセレクションされます。 Zeocin selection (Positive Selection) 幾つかの細胞においては、内在性の miRNA がコンストラクトの 3'UTR に作用し、TKzeo を発現抑制してしまい、死滅する場合があります。 興味のある miRNA が対象細胞において発現しておらず、それらの遺伝子ターゲットが ポジティブセレクションにおいて選択可能である事が必要です。 microRNA Transfection: microRNA transfection Target ID ライブラリ−が導入された細胞に、目的の miRNA を導入します。 ncRNA Ganciclovir Selection (Negative Selection): 安定発現株が得られたら、ガンシクロビル処理を行ないます。 ガンシクロビルの存在下で、HSV チミジンキナーゼ (HSVTK) が作用すると 細胞は死滅します。これに対し、対象 miRNA が 3'UTR のターゲットサイトと作用し TKzeo が制御されるとガンシクロビル耐性となります。 PCR and Sequencing: Ganciclovir selection ターゲット同定のため、ゲノム抽出後にキット付属のプライマーを 利用して増幅し、シーケンス解析によって配列を同定します。 (Negative Selection) PCR and Sequencing References Gaken, J., et al. 2012. A functional assay for microRNA target identification and validation. Nucleic Acids Res., 40(19), e75 sigma.com/targetid Technical Support 03-5796-7330 [email protected] 43 ヒト microRNA ターゲット同定 3'UTR クローン MISSION® 3' UTR LentiGoClone® クローニングされた1万種類以上のクローン 製品概要 Sigma®レンチウイルスシステムに導入されたHuman 3’UTR Sigma と SwitchGear Genomics™ は MISSION 3’UTR Lenti GoClone 製品において提携を結びました。SwitchGear の持つ、ルシフェラーゼ レポーターと 3’UTR を導入したプレクローンのブランド『GoClone』と、 Sigma の持つ MISSION レンチウイルスデリバリーシステムを組合せ、 より簡便で、確実な細胞導入に成功しました。 luciferase miRNA mimic or non-targeting control 3’UTR promoter MISSION 3’UTR Lenti GoClone Vector pLSG_UTR_RenSP Lenti GoClone viral particle transfect transduce ■ Convenience： RISC complex express クローニング済みなので、即時トランスフェクション可能 inhibit hibit Light output with miRNA mimic Light output with control integrate Specific activity of miRNA mimic on target UTR Hybrid LUC-3’UTR Transcript ■ Flexibility： トランスフェクションの難しい細胞や分化した細胞への導入が レンチウイルスデリバリーで可能 ■ Experimental consistency： 1. 目的細胞に選択した MISSION 3’UTR Lenti GoClone を導入 2. 導入プロモーターにより、LUC-3’UTR ハイブリットコンストラクトが発 現します。RenSP( 最適化された Renilla Luciferase レポーター ) はル 簡便に安定発現細胞株を作製可能 ■ Quality： 優れた性能を提供する、経験に基づいた最高のウイルス品質 ■ Optimized： 最適化されたウミシイタケルシフェラーゼレポーターによる高感度化 シフェラーゼ基質の導入により発光します。 3. ここに MISSION miRNA mimic をトランスフェクションします。 4. 導入した miRNA が GoClones の 3’UTR と特異的に相互作用を起こす と、LUC-3’UTR の発光が抑制されます。 5. ルシフェラーゼ基質の蛍光測定にはルミノメーターを使用します。 MISSION 3’UTR Lenti GoClone Vector Map 製品名 3' UTR RenSP PGK promoter Puro poly A RPL 10prom LTR 7895 bp MISSION 3'UTR Lenti Housekeeping Control (GAPDH) MISSION 3'UTR Lenti Empty Vector Control MISSION 3'UTR Lenti Non-target Control #1 (random) MISSION 3'UTR Lenti Non-target Control #2 (random) MISSION LightSwitch Luciferase Assay Reagent CAT.NO. フォーマット HUTRｘｘｘｘｘ ¥70,000 HUTR001C ¥70,000 HUTR002C ≧1x106TU/mL, 0.2mL ori ¥70,000 HUTR003C ¥70,000 HUTR004C ¥70,000 MLS0001-1KT 100 assays LTR Amp 価格 sigma.com/lentigoclone ¥23,600 ncRNA pLSG_UTR_RenSP RRE 個別クローン (対象クローンはご検索ください） 44 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] Long Non-Coding RNA のノックダウン MISSION® esiRNA for Long Non-Coding RNA MISSION esiRNA Long-Non Coding RNA は Long Non-coding RNA をターゲットとした RNAi 試薬です。 esiRNA は多数の siRNA がプールされてい るため、オフターゲット効果を低減し、経済的に RNAi スクリーニングを行うことが可能なツールです。 esiRNA 製品の特徴は 10 ページをご参照ください。 特長 • マウスライブラリーは 643 クローン、ヒトライブラリーは 1,245 クローンの esiRNA を含有 • esiRNA のデザインには DEQOR デザインアルゴリズムを使用 mouse IncRNA DAPI + mouse IncRNA ヒト lncRNA に対する FISH の結 果。Hela 細胞にネガティブコント ロ ー ル (top)、lncRNA(bottom) に対する esiRNA を導入した。パ ネルの左側は DAPI による染色。 マウス lncRNA に対する FISH の結 果。マウスの細胞にネガティブコン ト ロ ー ル (top)、lncRNA(bottom) に対する esiRNA を導入した。パネ ルの右側は DAPI による染色。 個別 esiRNA コントロール 製品番号 生物種 （X は数字） 個別 esiRNA EHNCXXXXX EMNCXXXXX 容量 20µg 50µg Human 1245 種 Mouse 643 種 価格 ¥28,000 ¥50,000 製品名 容量 Negative Controls EHUEGFP esiRNA targeting EGFP 20 µg, 50 µg EHUFLUC EHURLUC esiRNA targeting FLUC esiRNA targeting RLUC 20 µg, 50 µg 20 µg, 50 µg EHU019931 esiRNA targeting human KIF11 20 µg, 50 µg EHU017691 esiRNA targeting mouse KIF11 20 µg, 50 µg Positive Control バリデーション済みクローンについては別途お問い合わせください。 ncRNA 全てのクローンをライブラリーとしてご提供することも可能です。 詳細はお問い合わせください。 製品番号 各ターゲットに対する製品情報は、弊社トップページを用いて検索してください。 ターゲット遺伝子に関連する全ての製品を閲覧することが可能です References Chakraborty,D., et al. 2011. Combined RNAi and localization for functionally dissecting long non-coding RNAs. Nat Methods 9(4), 360-2 sigma.com/japan Use The Search Box sigma.com/ncesirna Identify your miRNA target Experimentally identify the functional gene targets for your miRNA with the MISSION® Target ID Library from Sigma® Life Science. Bioidentify. The MISSION Target ID Library enables transcriptome-wide identification of gene targets regulated by microRNA and other non-coding RNA. Simplify target identification with these easy steps: transfect library, select, transfect miRNA and select target clones. Start identifying your miRNA gene targets sigma.com/targetid ©2012 Sigma-Aldrich Co. LLC. All rights reserved. SIGMA and SIGMA-ALDRICH are trademarks of Sigma-Aldrich Co. LLC, registered in the US and other countries. MISSION is a registered trademark of Sigma-Aldrich Co. LLC. Where bio begins is a trademark of Sigma-Aldrich Co. LLC. 46 Technical Support 03-5796-7330 [email protected] siRNAトランスフェクション試薬 N-TER™ Nanoparticle siRNA Transfection System リポフェクションをベースとするトランスフェクション試薬は、初代培養細胞、脂肪細胞、神経細胞、非分裂細胞のような細胞に対して siRNA が導入されに この問題を回避できるようにデザインされたペプチドベースのトランスフェクション試薬です。一般的にトランスフェ くいという難点がありました。N-TER は、 クションが困難とされている細胞に対し、siRNA を効率的に導入することができます。 特徴 GAPDH Expression and Cell Viability in Human Primary Astrocyte • 一般的にトランスフェクションが難しい細胞でも 高いトランスフェクション効率 • N-TER/siRNA ミックスは安定であるため、 そのまま保存して再利用が可能 • リポフェクション法と比べて低毒性 • リバーストランスフェクション、ハイスループット化にも対応可能 % GAPDH Expression 100 80 60 40 20 0 20 nM N-TER has been validated to work in these cell types HEK293T Human, embryonic kidney cell line HeLa Human, cervical adenocarcinoma cell line Hepatocyte Rat, hepatocyte primary cell HepG2 Human, hepatocarcinoma cell line HT-29 Human, colorectal adenocarcinoma cell line Huh-7 Human, hepatoma cell line MDA-MB-231 Human, breast adenocarcinoma cell line NHA Human, astrocyte primary cell NHEK-AD Human, adult keratinacyte primary cell RAW264.7 Mouse, macrophage cell line SK-N-SH Human, neuroblastoma cell line SW620 Human, colorectal adenocarcinoma cell line BSMC HUVEC THP-1 Human, bronchial smooth Human, umbilical vein epithe Human, acute monocytic lial primary cell muscle primary cell leukemia cells C2C12 LA-N-2 U-87 MG differentiated Mouse, myoblas Human, neuroblastoma cell line Human, glioblastoma toma line astrocytoma cell line C2C12 MCF-7 SK-N-AS undifferentiated Mouse, Human, breast Human, neuroblastoma cell line adenocarcinoma cell line myoblastoma line 5 nM ■ = % GAPDH Expression siRNA-only control 40 nM Cells only control ■ = Cell Viability 初代アストロサイトにおける siRNA 濃度と GAPDH の発現抑制効果お よび細胞生存率の比較。 GAPDH に対する siRNA を、N-TER を用いて 様々な濃度で導入した。導入 24 時間後に細胞を回収し、生存率および GAPDH の mRNA レベルを測定した。 GAPDH Expression and Cell Viability in Mouse Adipocyte 140 % GAPDH Expression 3T3-L1 differentiated Mouse, embryonic fibroblast cell line A2780 Human, ovarian carcinoma cell line A431 Human, ovarian carcinoma cell line A549 Human, lung carcinoma cell line ASPC-1 Human, pancreatic carcinoma cell line Astrocytoma Human, astrocytoma cell line 10 nM 120 100 80 60 40 20 0 30 nM 15 nM 7.5 nM ■ = % GAPDH Expression siRNA-only control 40 nM Cells only control ■ = Cell Viability 脂 肪 細 胞 に 分 化 誘 導 さ れ た 3T3-L1 細 胞 株 に お け る siRNA 濃 度と GAPDH の発現抑制効果および細胞生存率の比較。 GAPDH に対する siRNA を、N-TER を用いて様々な濃度で導入した。導入 24 時間後に細 胞を回収し、生存率および GAPDH の mRNA レベルを測定した。 製品情報 製品名 トランスフェクション試薬 N-TER Nanoparticle siRNA Transfection Reagent CAT.NO. 価格 備考 N2913-120UL N2913-400UL ¥16,300 ¥40,800 約 70 回分 （20 nM siRNA, 24 ウェルプレート） 約 230 回分 （20 nM siRNA, 24 ウェルプレート） N2913-1ML ¥76,900 約 580 回分 （20 nM siRNA, 24 ウェルプレート） sigma.com/nter Technical Support 03-5796-7330 [email protected] 47 siRNAトランスフェクション試薬 MISSION siRNA Transfection Reagent MISSION siRNAトランスフェクション試薬は siRNA, miRNA, synthetic miRNA inhibitor などの短い RNA をトランスフェクションするための試薬です。真 核生物細胞におけるターゲット遺伝の発現を 90％以上抑制することが可能です。低濃度の siRNA (1 nM) で RNAi 効果がえられるため、オフターゲット効 果を抑制することができます。また、調整方法が非常に簡便なため、容易にハイスループット化することが可能です。 特徴 • 接着細胞、初代培養細胞や浮遊細胞など様々な細胞に適応 • 低い細胞毒性 • 低濃度の siRNA で効果が得られるため、オフターゲット効果を抑制 • 非常に簡便な操作方法（血清を含む培地で使用可能） • ハイスループット化が容易 実施例 High Silencing Efficiency Vimentin に対する siRNA(5 nM) を 3T3 細胞へ導入した（左。右はコントロール）。導入 ４８時間後に抗 vimentin 抗体を用いて検出した。 Superior Cell Viability Silencing efficiency Adherent cell lines (1 nM siRNA) Gene 3LL GAPDH A549 Luciferase ≥ 90% Ca Ski GAPDH/ Lamin A/C ≥ 90% HEK-293 GAPDH ≥ 90% HeLa GAPDH/ Lamin A/C HepG2 GAPDH MCF7 GAPDH/ Lamin A/C ≥ 90% MDA-MB-231 GAPDH ≥ 90% NIH 3T3 Vimentin ≥ 90% RAW 264.7 Eg5 ≥ 90% SiHa GAPDH/ Lamin A/C ≥ 90% SK-OV-3 GAPDH ≥ 90% Murine embryonic fibroblasts GAPDH ≥ 90% Primary human fibroblasts GAPDH/ Lamin A/C ≥ 90% Primary human hepatocytes GAPDH ≥ 90% Primary human keratinocytes GAPDH ≥ 90% K562 GAPDH ≥ 80% THP-1 GAPDH ≥ 80% ≥ 90% ≥ 90% 60-70% Primary cells (1 nM siRNA) Suspension cell lines (5 nM siRNA) GL3 Luciferase 安定発現 A549 細胞へ Luciferase に対する siRNA(1 nM) を導入した。 48 時間後に細胞形態を観察した。左は MISSIONトランスフェクション試薬。右は他社製品。 製品情報 製品名 MISSION siRNA transfection reagent CAT.NO. S1452-100UL S1452-1ML 価格 ¥8,000 ¥47,000 備考 20-50 回 /24 ウェルプレート 200-500 回 /24 ウェルプレート トランスフェクション試薬 sigma.com/transfect 製品 / 遺伝子に関する文献検索が簡単に！ ◦シグマアルドリッチのウェブサイトから製品や ターゲット遺伝子に関する文献情報の取得が 可能です。 ◦文献で用いられているアプリケーションによって、 各製品の効果や有効性をご確認いただけます。 詳細はこちら sigma.com/geneinfo-jp 製品プロトコールはウェブサイトからご取得いただけます As part of Sigma’s commitment to enviromental sustainability, we have eliminated paper copies of this product’s technical bulletin. To download a copy, visit: www.sigmaaldrich.com and type in your products catalog number to find your technical bulletin. Sigma-Aldrich では、環境保護の観点（Go Green プロジェクト）から、 製品添付資料の見直しを行っています。 製品の詳細およびプロトコールは、弊社ウェブサイトで各製品ページの製 品名の下にある POPULAR DOCUMENTS 項目（Bulletin 、Product Information Sheet、Datasheet など各種）からご確認いただけます。 どうぞ、弊社ウェブサイトをご活用ください。 ©2015 Sigma-Aldrich Co. LLC. All rights reserved. SIGMA, SAFC, SIGMA-ALDRICH, ALDRICH, and SUPELCO are trademarks of Sigma-Aldrich Co. LLC, registered in the US and other countries. FLUKA is a trademark of Sigma-Aldrich GmbH, registered in the US and other countries. SAFC brand products are sold through Sigma-Aldrich, Inc. Purchaser must determine the suitability of the product(s) for their particular use. Additional terms and conditions may apply. Please see product information on the Sigma-Aldrich website at sigma-aldrich.com. CompoZr, ExpressMag, LentiPlex and MISSION are registered trademarks of Sigma-Aldrich Co. LLC. iScale Oligos, LentiExpress and N-TER are trademarks of Sigma-Aldrich Co. LLC. Agilent is a registered trademark of Agilent Technologies. TagCFP, TagFP635, TagRFP, TagYFP and TurboGFP are trademarks of Evrogen Co.. Cy3, Cy5 and Cy5.5 are registered trademarks of GE Healthcare UK Limited. Spectramax is a registered trademark of Molecular Devices Corp. SYBR is a registered trademark of Life Technologies. GoClone and SwitchGear Genomics are trademarks of SwitchGear Genomics. 本記載の製品および情報は2015年5月1日現在の情報であり、収載の品目、製品情報、価格等は予告なく変更される場合がございます。/最新の情報は、弊社Webサイト （sigma-aldrich.com/japan）をご覧ください。/掲載価格は希望納入価格（税別）です。詳細は販売代理店様へご確認ください。/弊社の試薬は試験研究用のみを目的と して販売しております。医薬品原料並びに工業用原料等としてご購入の際は、こちらのWebサイト（sigma.com/safc-jp）をご覧ください。 シグマ アルドリッチ ジャパン お問合せは下記代理店へ 〒 140-0002 東京都品川区東品川 2-2-24 天王洲セントラルタワー 4 階 製品に関するお問い合わせは、弊社テクニカルサポートへ TEL：03-5796-7330 FAX：03-5796-7335 E-mail : [email protected] 在庫照会・ご注文方法に関するお問い合わせは、弊社カスタマーサービスへ TEL：03-5796-7320 FAX：03-5796-7325 E-mail : [email protected] http://www.sigma-aldrich.com/japan SAJ1873 2015.5