Pseudochoricystis ellipsoidea

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"Pseudochoricystis
ellipsoidea"の窒素栄養欠乏下における窒素安定同位体を用いたタンパク質分解物の代謝解析
田中, 美穂(Tanaka, Miho)
慶應義塾大学湘南藤沢学会
生命と情報 No.19 (2012. ) ,p.41- 44
オートファジーは飢餓時に細胞質のオルガネラやタンパク質を液胞で低分子へとバルク分解する
機構であり, 細胞は分解されたアミノ酸をタンパク質合成に再利用することで飢餓に応答すると考
えられている。緑藻"Pseudochoricystis ellipsoidea"は,
窒素栄養欠乏(-N)下で中性脂質の一種であるトリアシルグリセロールを蓄積する。また,
真核生物では飢餓時にオートファジーが誘導されることから, "P. ellipsoidea"のN下においてもオートファジーによるタンパク質分解がおこり,
分解されたアミノ酸はタンパク質合成に再利用されている可能性がある。一方で,
この際にタンパク質量とアミノ酸プールが顕著に減少することから,
分解されたアミノ酸はタンパク質合成以外にも代謝されていることが考えられるが,
利用先については知見が乏しい。
本研究では"P. ellipsoidea"の-N下におけるタンパク質分解の仮説を検証し, さらに分解物がどの代
謝物へ再利用されているのか明らかにすることを目的とした。唯一の硝酸源である15N03を用い
てタンパク質を窒素安定同位体標識させた細胞を作出し, -N下に移行後,
経時的にタンパク質と遊離アミノ酸のラベル率を測定したところ,
遊離アミノ酸のラベル率が増加し, タンパク質分解が確認された。さらに、アミノ酸以外に同位体
が検出された窒素代謝物を網羅的に解析したところ,
ArgやLysの分解経路上の物質から標識が検出された。このことから,
窒素がない状態においていくつかのアミノ酸は,
アンモニアとして窒素源を排出するかアミノ基転移をすることで,
炭素骨格へ分解されると推測された。
Technical Report
http://koara.lib.keio.ac.jp/xoonips/modules/xoonips/detail.php?koara_id=KO92001004-00000019
-0041
"Pseudochoricystis ellipsoidea"の窒素栄養欠乏下における窒素安定同位体
を用いたタンパク質分解物の代謝解析
政 策 •メ デ ィ ア 研 究 科 修 士 課 程 2年
田中美穂
要旨
オートファジーは飢餓時に細胞質のオルガネラやタンパク質を液胞で低分子へとバルク分解す
る機構であり，細胞は分解されたアミノ酸をタンパク質合成に再利用することで飢餓に応答する
と 考 え ら れ て い る .緑 藻 “
/*sewゴoc/ioWcァ池ど//扣 o /Jeゴ’
は， 室 素 栄 養 欠 乏 （
-N) 下 で 中 性 脂 質 の 一
種 で あ る ト リ ア シ ル グ リ セ ロ ー ル を 蓄 積 す る .ま た ， 真 核 生 物 で は 飢 餓 時 に オ ー ト フ ァ ジ ー が 誘
導されることから，
“P
の- N 下 に お い て も オ ー ト フ ァ ジ ー に よ る タ ン パ ク 質 分 解 が お こ
り， 分 解 さ れ た ア ミ ノ 酸 は タ ン パ ク 質 合 成 に 再 利 用 さ れ て い る 可 能 性 が あ る .一 方 で ， この際に
タンパク質量とアミノ酸プールが顕著に減少することから，分解されたアミノ酸はタンパク質合成
以外にも代謝されていることが考えられるが，利用先については知見が乏しい.
本研究では”
户 e//抑 ゐ ゴ ’の- N 下 に お け る タ ン パ ク 質 分 解 の 仮 説 を 検 証 し ， さ ら に 分 解 物 が ど
の 代 謝 物 へ 再 利 用 さ れ ている の か 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し た .唯 一 の 硝 酸 源 で あ る 15N 0 3を用
いて タ ン パ ク 質 を 窒 素 安 定 同 位 体 標 識 さ せ た 細 胞 を 作 出 し ， - N 下 に 移 行 後 、経 時 的 に タ ン パ ク 質
と 遊 離 ア ミノ酸のラベル率を測定したところ，遊 離 ア ミ ノ 酸 の ラ ベ ル 率 が 増 加 し ， タンパク質分
解 が 確 認 さ れ た .さ ら に 、 ア ミ ノ 酸 以 外 に 同 位 体 が 検 出 さ れ た窒素代謝物を網羅的に解析したと
ころ， Argや Lys の 分 解 経 路 上 の 物 質 か ら 標 識 が 検 出 さ れ た .こ の こ と か ら ， 窒 素 が な い 状 態 に お
いていく つ か の ア ミ ノ 酸 は ， ア ン モ ニ ア と し て 窒 素 源 を 排 出 す る か ア ミ ノ 基 転 移 を す る こ と で ，
炭素骨格へ分解されると推測された.
キーワード：
1•オ イ ル 生 産 微 細 藻 ， 2 . 窒 素 栄 養 欠 乏 ，3 . オ ー ト フ ァ ジ ー ， 4.窒 素 安 定 同 位 体 ， 5. メ 夕 ボ ロ ー ム 解
析
略 語 ：2-0G : a - ケ ト グ ル タ ル 酸 ， Ac-CoA : ア セ チ ル CoA， Ala : ア ラ ニ ン ， Arg : ア ル ギ ニ ン ，
Asp : ア ス パ ラ ギ ン 酸 ， Asn : ア ス パ ラ ギ ン ， Cys •• シ ス テ イ ン ， Gin : グ ル 夕 ミ ン ， Glu : グ ル タ ミ ン 酸 ， GW :グリ
シン ， His : ヒ ス チ ジ ン ， lie : イ ソ ロ イ シ ン ， Leu : ロ イ シ ン ， Lys : リジン ， Met : メ チ オ ニ ン ， Ox : オ キ サ ロ 酢
酸，
Phe : フ エ ニ ル ア ラ ニ ン ， PI : ホ ス フ ア チ ジ ル イ ノ シ ト ー ル ， Pro : プ ロ リ ン ， Ser : セ リ ン ， Su : コ ハ ク 酸 ，
S u -C o A : ス ク シ ニ ル CoA, T h r : ス レ 才 ニ ン ， T r p : トリプトフアン， T y r : チ ロ シ ン ， VaJ : パ リ ン
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1. 序論
緑 藻 “/ ^ wゴ
沿
e //z> so /ぬゴ，
は， 窒 素 栄 養 欠 乏 （
-N) 下でトリアシルグリセロ一ル
(TAG) を 蓄 積 す る （
Satoh が <
2010) . しかし，- N 下 で の ス ト レ ス 応 答 や TAG蓄 積 の 代 謝 制 御
機 構 は 不 明 で あ る . - N 下 で TAGを 蓄 積 す る い く つ か の オ イ ル 生 産 微 細 藻 に お い て ， - N 下 で は 新 規
のアミノ酸合成の低下（
Msanneが a /., 2 0 1 2 ) ， ま た ア ミ ノ 酸 プ ー ル や タ ン パ ク 質 量 の 減 少 が 調 べ ら
れ て い る （ Ito ef a/.，2012; B6 lling and Fiehn, 2005; Hu and Gao, 2006) .
オートファジーは飢餓時に細胞質のオルガネラやタンパク質を液胞で低分子へとバルク分解す
る 真 核 生 物 で 広 く 保 存 さ れ た 機 構 で あ り （M izushim a , 2 0 0 7 ) ， 緑 藻 の モ デ ル 生 物 で あ る
C hlam ydom onas reinhardtii の - で も オ 一 ト フ ァ ジ 一 が 誘 導 さ れ る （
P6rez-Pさrez W a/.，2 0 1 0 ) . 酵
母 で は -N下 で ア ミ ノ 酸 プ ー ル が 一 時 的 に 増 加 す る と タ ン パ ク 質 合 成 が 促 進 し た こ と か ら ， 分 解 さ
れたアミノ酸がタンパク質合成に再利用されることが示されている
（ Onodera and Ohsumi,
2005) . こ の こ と か ら ， 飢 餓 時 に 誘 導 さ れ る オ ー ト フ ァ ジ ー は ， タ ン パ ク 質 合 成 の ア ミ ノ 酸 を 供
給 す る こ と で ， 飢 餓 に 適 応 す る 役 割 が あ る と 考 え ら れ て い る . “/
從
”の - N 下 に お い て も
オートファジーによるタンパク質分解がおこり，分解されたアミノ酸はタンパク質合成に再利用
さ れ て い る 可 能 性 が あ る .一 方 で タ ン パ ク 質 量 と ア ミ ノ 酸 プ ー ル が 顕 著 に 減 少 し た こ と か ら
W a/.,
（ Ito
2012 ) ， タ ン パ ク 質 分 解 に よ り 供 給 さ れ た ア ミ ノ 酸 は タ ン パ ク 質 合 成 以 外 に も 代 謝 さ れ て い
る こ と が 考 え ら れ る .し か し ， 分 解 さ れ た ア ミ ノ 酸 の 利 用 先 に つ い て は ， タ ン パ ク 質 合 成 以 外 に
調 べ ら れ て い な い .オ ー ト フ ァ ジ ー の モ ニ タ ー 方 法 に は ， オ ー ト フ ァ ジ ー に 必 須 で あ る オ ー ト フ ァ
ジー関連タンパク質8
(ATG 8 ) の 脂 質 修 飾 を 検 出 す る 方 法 が 利 用 さ れ て い る が （M izushima ,
2004) , 物 質 分 解 を 物 質 レ ベ ル で 直 接 的 に モ ニ タ ー す る 長 寿 命 タ ン パ ク 質 分 解 ア ッ セ イ 法 も あ る
(Klionsky d d
20〇7 ; U eno が
a/. 2 0 0 8 ) .
例 え ば ， [14C]
Valの 放 射 性 同 位 体 で 長 時 間 培 養 す る こ と
で 細 胞 内 の タ ン パ ク 質 を 標 識 し た 後 ， 非 標 識 の Valで 短 時 間 培 養 す る こ と で ， 置 換 に 時 間 の か か る
タンパク質は標識されたまま，遊離の
Valは 非 標 識 さ れ た 細 胞 が で き る . こ れ に 飢 餓 や 薬 剤 添 加 と
いった処理を施し， その後，細胞質や培地中に放出された物質の放射線量を測定することで， 夕
ン パ ク 質 分 解 率 を 定 量 す る こ と が で き る .こ の 手 法 は ほ 乳 類 や 酵 母 で 古 く か ら 利 用 さ れ て い る
が，単一のアミノ酸でタンパク質を標識しているため， タンパク質から分解された全てのアミノ酸
の代謝を追跡することができない.
本 研 究 で は
e//如
〇/ふゴ’の - N 下 に お け る タ ン パ ク 質 分 解 の 仮 説 を 検 証 し ， さ ら に 分 解 物 が ど
の 代 謝 物 へ 再 利 用 さ れ て い る の か 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し た .そ の た め に ， 長 寿 命 タ ン パ ク
質分解アッセイ法を参考に安定同位体により標識された化合物を細胞内に取り込ませてメ夕ボ
ロ ー ム 解 析 を 行 う . 本 手 法 で は ， 唯 一 の 硝 酸 源 で あ る i5N 〇3を 用 い て タ ン パ ク 質 を 窒 素 安 定 同 位 体
( 15N
) ，遊 離 ア ミ ノ 酸 を ， と な る よ う に 標 識 さ せ た 細 胞 を 作 り 出 し ， そ の 後 _ N 下 で 培 養 し た 細
胞 に お け る タ ン パ ク 質 と 遊 離 ア ミ ノ 酸 の 丨 4N と15N の 割 合 を 測 定 す る こ と で タ ン パ ク 質 分 解 を 検 証 す
る .ま た ， 分 解 さ れ た ァ ミ ノ 酸 は 同 位 体 標 識 さ れ て お り ， 同 位 体 が 検 出 さ れ た 窒 素 代 謝 物 を 網 羅
的 に 解 析 す る こ と に よ り ， 同 時 に - N下 に お け る 窒 素 代 謝 物 の 分 配 を 明 ら か に す る こ と が で き る と
考えている.
2. 材 料 と 手 法
論文投稿のため非公開
3. 結 果 と _ 論
論文投稿のため非公開
4. 結 論
本 研 究 で は ， i5N 〇3を用いて， タ ン パ ク 質 が 1 % , 遊 離 ア ミ ノ 酸 が mn と な る よ う に 標 識 し ， _N 後
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の 標 識 率 の 変 化 を 測 定 す る こ と で ， タ ン パ ク 質 由 来 と み な さ れ る 高 度 に i 5N 標 識 さ れ た 遊 離 ア ミ ノ
酸 か 龙 出 さ れ ，”
户
e//扣 〇流ゴ’
の- N 下 に お い て オ ー ト フ ァ ジ ー に よ る タ ン パ ク 質 分 解 が 起 こ る 事 を
検 証 し た .タ ン パ ク 質 由 来 の ア ミ ノ 酸 か ら 代 謝 さ れ た と 考 え ら れ る 高 度 に 15N 標 識 さ れ た 代 謝 物 が
2 8 物 質 検 出 さ れ た . そ の 中 に は ， Argや Lysの 分 解 経 路 上 の 物 質 が 検 出 さ れ ， 窒 素 が な い 状 態 に お
い て 一 部 の ア ミ ノ 酸 は 分 解 さ れ て い る こ と が 分 か っ た .ま た タ ン パ ク 質 分 解 に よ る ア ミ ノ 酸 供 給
が あ る に も 関 わ ら ず 遊 離 ア ミ ノ 酸 と タ ン パ ク 質 の 量 が 顕 著 に 減 少 し た こ と か ら も ，他 のアミノ酸
も 積 極 的 に 分 解 し て い る と 考 え ら れ る .こ れ ま で は 他 の 真 核 生 物 に お い て ， オ ー ト フ ァ ジ ー に よ
り 分 解 さ れ た アミノ酸はタンパク質合成に再利用されていると言われてきたが，本 研 究 に よ り ，
そ の 他 に ア ミ ノ 酸 を 積 極 的 に 分 解 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た .こ れ に よ り 生 産 さ れ た 炭 素 骨 格 は
TAGの 炭 素 源 と な っ て い る 可 能 性 が あ る .ま た ， 本 研 究 で 述 べ た 手 法 は ， タ ン パ ク 質 分 解 を 証 明
する際に一般的に用いられるプロテアーゼ活性測定法やオートファジー検出方法とは異なり， 夕
ン パ ク 質 分 解 の 検 証 だ け で な く ， 分 解 物 か ら 生 産 さ れ た 代 謝 物 も 検 出 す る こ と に 成 功 し た .本 手
法を用いることでオートファジーによる分解物のリサイクルとその意義の解明が進むと期待してい
る.
謝辞
アドノs'イ ザ 一 の 伊 藤 卓 朗 博 士 に は 研 究 の 方 向 性 か ら 実 験 ま で 昼 夜 問 わ ず 御 指 導 と 御 助 言 を いた
だ き ま し た .中 東 憲 治 博 士 ，仲 田 崇 志 博 士 に は 多 く の 実 り あ る 議 論 を し て く だ さ り ，親身になっ
て お 力 添 え い た だ い た 事 に 感 謝 致 し ま す .ま た ， 冨 田 勝 教 授 を は じ め ， こ の よ う な 研 究 活 動 を 行
える環境と機会を設けてくださった先端生命科学研究会の皆様に， この場を借りて深く感謝申し
上げます.
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