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真菌多糖の免疫系による認識とその活性化作用
Jpn. J. Med. Mycol. Vol. 47, 185−194, 2006 ISSN 0916−4804 総 説 真菌多糖の免疫系による認識とその活性化作用 安 達 禎 之 大 野 尚 仁 東京薬科大学薬学部免疫学教室 要 旨 Candida albicans などの真菌の細胞壁には (1→3)-β-D-glucan が含まれている. 樹状細胞やマクロファージに発現 する C-type レクチンに属する Dectin-1 はβ-glucan に結合する膜タンパク質として菌体の認識に関わっている. しか し, 真菌感染あるいは真菌に対応する免疫機構が関連する疾患において Dectin-1 がどのような役割を演じているかは 明確ではなく, これらを明らかにすることは感染防御や炎症性疾患の発症と対策を考慮するために重要であると考え られる. Dectin-1 のβ-glucan 認識能と細胞活性化能を解析するために, Dectin-1 変異体および Dectin-1 モノクローナ ル抗体を作製し, 結合活性に関するアミノ酸残基を他の C-type レクチンと比較した. その結果, Dectin-1 は DC-SIGN などの mannose 結合性 C-type レクチンとは全く異なるアミノ酸残基を用いて, Ca2+ 非依存的にβ-glucan を認識す ることが示された. Dectin-1 による細胞の活性化機構の解析には従来, β-glucan を主成分とする酵母 Saccharomyces cerevisiae 由来の zymosan が汎用されている. zymosan は, TLR2 発現細胞に作用し NF-κB の活性化を引き起こす. Dectin-1 は TLR2 発現細胞において zymosan の NF-κB 活性化能を促進した. この促進作用はβ-glucan 非結合性 Dectin-1 変異体では起こらないことから, β-glucan の認識が重要であった. 一方, zymosan のクロロホルム-メタノー ル処理物は Dectin-1 結合性を保持しているにも関わらず TLR2 との共発現でも NF-κB を活性化できなかった. Candida 由来の精製β-glucan も同様に共発現細胞でも全く NF-κB の活性化を示さないことから, Dectin-1 によるβglucan 結合シグナルのみでは NF-κB を活性化するには不十分で, Dectin-1 以外の受容体からの NF-κB 活性化シグ ナル誘導も重要であることが示唆された. Key words: デクチン−1 (dectin-1), 自然免疫 (innate immunity), β-グルカン (beta-glucans), Candida albicans, マクロファージ (macrophage) 序 文 真菌の細胞壁には普遍的にマンナンやβ-グルカンが 含有されており 1）, 免疫系はこれら細胞壁多糖を特異的 に認識する様々な受容体分子を使って真菌に対する防御 反応に関与するとされている.（Fig. 1）マンナンの非還 元末端のマンノース残基は真菌細胞壁の最外層を形成 し 1）, 白血球表面の C-type lectin に属する様々なマン ノース受容体とマンナン分子が相互作用する 2）. その認 識には, C-type lectin の糖鎖認識ドメイン（CRD）内の 特徴的なアミノ酸配列, グルタミン酸−プロリン−アス パラギンからなる連続したアミノ酸残基（EPN 配列） が 関 与 す る. す な わ ち EPN 配 列 は Ca2+ を 介 し て マ ン ノースの C-3, C-4 位の水酸基と相互作用することでマ ン ナ ン 分 子 を 認 識 す る 3）（Fig. 2）. 一 方, 細 胞 壁 の 約 50％を占める（1→3）-β-D-グルカンの場合, マンナンの ような高度に分岐した糖鎖構造を持たず, 主鎖グルコー ス残基の C-3 位の水酸基はグリコシル結合のため存在し 別刷請求先：大野 尚仁 〒192-0392 東京都八王子市堀之内 1432-1 東京薬科大学薬学部免疫学教室 ないのでマンノース受容体には認識されない（Fig. 3）. 従って, マンノース受容体とは全く異なる受容体が（1 →3）-β-D-グルカンとの相互作用に関係することが推測 される. 近年, 酵母細胞壁成分 zymosan に結合すること が 明 ら か に さ れ た 膜 タ ン パ ク 質 Dectin-1 は, C-type lectin に特徴的な糖鎖認識ドメイン構造を有し,（1→3）β-D-グルカンに特異的に結合することが Gordon らに よって明らかにされた 4）（Fig. 4）. そのアミノ酸配列に EPN 配列は存在せず 5）, マンノース受容体とは異なる認 識機構を有していることが予測された（Fig. 5）. そこ で,（1→3）-β-D-グルカンとの相互作用およびその後の 細胞内シグナル伝達に関わる Dectin-1 の構造的特徴に ついて解析したので報告する. 材料及び方法 マウスマクロファージ細胞株 RAW264 細胞から RNA を 分 画 し, RT-PCR に よ り Dectin-1 の cDNA を 単 離 し た. Dectin-1 の cDNA を FLAG-tag と連結した発現ベク ターに挿入し, ヒト胎児腎臓上皮細胞 HEK293 細胞に導 入し, Dectin-1 発現 293 トランスフェクタントを作製し た. （1→3）-β-D-グルカン結合に関わる Dectin-1 のアミ 真菌誌 第47巻 第 3 号 平成18年 186 Mannose Galactose 㪚㪸㫉㪹㫆㪿㫐㪻㫉㪸㫋㪼㩷 㫃㫀㪾㪸㫅㪻 1,3-㱎-glucan 㪚㪄㫋㫐㫇㪼㩷㫃㪼㪺㫋㫀㫅㩷 㪺㪸㫉㪹㫆㪿㫐㪻㫉㪸㫋㪼㩷 㫉㪼㪺㫆㪾㫅㫀㫋㫀㫆㫅㩷㪻㫆㫄㪸㫀㫅 multi lectin 䌓 䌓 䌓 䌓 㫃㪼㪺㫋㫀㫅㩷㫃㫀㫂㪼 㪺㪸㫉㪹㫆㪿㫐㪻㫉㪸㫋㪼㩷 㫉㪼㪺㫆㪾㫅㫀㫋㫀㫆㫅㩷㪻㫆㫄㪸㫀㫅 Type㸈lectin family MMR family Scavenger receptor family 䇭 Dectin-1 CR3 Lac Cer Macrophage Fig. 1. Phagocytes pattern recognition receptors for fungal carbohydrates. H CH2OH OH E 㪉㪂 㪚㪸 P N OH H OH 㪚㪸㫉㪹㫆㪿㫐㪻㫉㪸㫋㪼㩷 㪩㪼㪺㫆㪾㫅㫀㫋㫀㫆㫅㩷 㪛㫆㫄㪸㫀㫅㩷㩿㪚㪩㪛㪀 O H H O H 㪦㫃㫀㪾㫆㫊㪸㪺㪺㪿㪸㫉㫀㪻㪼㩷 Mannose Type II receptors OH CH2OH H H OH Q 㪉㪂 P 㪚㪸 D H DC-SIGN BDCA-2 O H H OH O Galactose Fig. 2. Recognition of Man/Gal sugar residues by Type II C-type lectins. ノ酸残基の解析を目的として, mutation primer を用い て変異型 Dectin-1 発現ベクターを作製し, 同様に 293 細 胞に点変異型 Dectin-1 タンパク質を発現させた. Dectin-1 モノクローナル抗体の作製 Dectin-1 の CRD 部分を含む発現ベクターを CHO 細 胞に導入し, その上清から可溶性 Dectin-1（sDectin-1） を精製した. sDectin-1 をラットに免疫し, 得られたリン パ球とマウスミエローマとの融合により sDectin-1 反応 性モノクローナル抗体産生ハイブリドーマクローン 4B2 を 得 た. 4B2 は sDectin-1 と 可 溶 性（1→3）-β-D-グ ル カ ンである sonifilan（SPG）との結合を阻害する中和抗体 であった. （1→3）-β-D-グルカン結合活性の検討 Dectin-1発現 293 トランスフェクタントに対し, ビオ チン標識 SPG, FITC 標識 zymosan 或いは 4B2 の結合性 をフローサイトメーター解析（FACS）により検討し Jpn. J. Med. Mycol. Vol. 47（No. 3）, 2006 187 㪰㪼㪸㫊㫋㩷㪺㪼㫃㫃㩷㫎㪸㫃㫃㩷㩷㩿㪚㪸㫅㪻㫀㪻㪸㪀 㪪㫆㫃㫌㪹㫃㪼㩷㪾㫃㫌㪺㪸㫅㩷㩷㩿㫄㫌㫊㪿㫉㫆㫆㫄㪀 Long b-1,6-glucan chain b㪄㪈㪃㪍㪄㫃㫀㫅㫂㪼㪻㩷㪾㫃㫌㪺㫆㫊㪼㩷㫉㪼㫊㫀㪻㫌㪼 HO HO HO HO CH2 O HO O HO HO HO 㪟㪦 㪟㪦 㪟㪦 㪟㪦 㪚㪟㪉㪦㪟 㪟㪦 㪟㪦 㪦 㪟㪦㪟㪉㪚 㪟㪦 㪦 㪦 㪟㪦 㪦 㪦㪟 㪚㪟㪉 㪟㪦㪟㪉㪚 㪦 㪟㪦 㪦 㪦㪟 㪟㪦㪟㪉㪚 㪟㪦 㪦 㪦 㪦㪟 㪦 㪦 㪟㪦 㪦 㪦㪟 㫄 HO O CH2 HO HO HO HO 㪟㪦㪟㪉㪚 㪚㪟㪉 㪟㪦 㪦 㪦 㪦㪟 O O CH2 㪦 O HO O HO 㪦㪟 HO HO O CH2 HO HO 㪸 O O HO O OH n HO n HO HOH2C HO O O CH2 O O b㪄㪈㪃㪊㪄㪾㫃㫌㪺㪸㫅㩷㪺㪿㪸㫀㫅 O CH2 HO O HO CH2 HO O 㪚㪟㪉㪦㪟 㪦 㪦 CH2 CH2 HOH 2C O HO O O HOH2C HO O OH OH OH OH O HO C CH2 HOH 2 O O HO O O O OH a m b-1,3-glucan chain number of repeat =a,m,n: variable Fig. 3. Basic structure of β-glucans. • Clec7a 䋨C-type lectin domain family 7, member a 䋩 • Synonyms: BGR (b glucan receptor), CLECSF12 Cyto Amino acid 1 35 TM 36 68 69 Stalk 114 115 CRD 164 165 204 205 247 Dectin-1A Dectin-1B Dectin-1B Macrophage Dendritic cell Neutrophil Dectin-1A J A. Willment et al. : J. Biol. Chem., 276, 43818-43823, 2001 Fig. 4. Molecular characteristcs of Dectin-1. た. また, 変異型 Dectin-1 トランスフェクタントへの各 種リガンド結合性も FACS により検討した. とした. Zymosan の分画 TLR2 および Dectin-1 発現細胞における NF-κB 活性化 測定 Zymosan A（Sigma）を注射用蒸留水で懸濁し, 遠心 分離にて 3 回洗浄し, ZWISとした. さらに ZWIS をクロ ロ ホ ル ム/メ タ ノ ー ル 混 合 液 で 3 回 洗 浄 し, 残 渣 を CMIS とした. さらにβ-グルカン含量を高めるために Zymosan A を 1M NaOH 存 在 下 で 次 亜 塩 素 酸 処 理 し, 表層のマンノプロテイン等の夾雑物を除去し, OX-ZY HEK293 細 胞 に マ ウ ス TLR2 あ る い は Dectin-1 の cDNA を含む発現ベクターおよび NF-κB エンハンサー 部位を上流に有する Luciferase 遺伝子を含むプラスミド ベクターをリポフェクションにより導入し, 24 時間後に zymosan の分画物と 6 時間培養した. 培養後の細胞内 luciferase 活性を測定し, NF-κB 活性化の指標とした. 真菌誌 第47巻 第 3 号 平成18年 188 Binding site of Dectin-1 䋿 Mouse Dectin-1 PWFWEDGSAFFPNSFQ------VRNTVPQES-------L-LHNCVWIHGSE homology 䇭W+W DGS++ + + ++ ++ L ++C +++ mouse DC-SIGN TWYWVDGSPLTLSFMK------YWSKGEPNN-------LGEEDCAEFRDDG human DC-SIGN TWQWVDGSPLLPSFKQ------YWNRGEPNN-------VGEEDCAEFSGNG mouse IGFCR EFVWSDGSPVGYS---------NWNPGEPNN------GGQGEDCVMMRGSG human DC-SIGNR TWQWVDGSPLSPSFQR------YWNSGEPNN-------SGNEDCAEFSGSG mouse SIGNR1 TWLWVDGSTLSSRFQK------YWNRGEPNN-------IGEEDCVEFAGDG mouse SIGNR2 RWHWVDGSHLLFSFMK------YWNKGEPNN-------EWEEDCAEFRGDG mouse SIGNR3 TWHWVDGSPLSPSFTR------YWNRGEPNN-------VGDEDCAEFSGDG mouse SIGNR4 EWYWLDGSPLSDSFEK------YWKKGQPDN-------VGGQDCVEFRDNG mouse ASGPR-H1 PWKWVDGTDYETGFQ-------NWRPEQPDNWY-GHGLGGGEDCAHFTTDG mouse ASGPR-H2 SWKWVDGTDYRSNYR-------NWAFTQPDNWQ-GHEQGGGEDCAEILSDG mouse ASGPR-MF PWRWVDGTDFEKGFK-------NWAPLQPDNWF-GHGLGGGEDCAHITTGG mouse ASGPR-MF2 PWRWVDGTDFDKGFK-------NWRPLQPDNWH-GHMLGGGEDCAHFSYDG mouse DCIMMUNO QWQWVDQTPYEESIT-------FWHNGEPSSGN--------EKCATIIYRW mouse MINCLE QWQWVDDTPFTESLS-------FWDAGEPNN------IVLVEDCATIRDSS mouse BDCA-2 KWQWIDDTPFSQNVR-------FWHPHEPNL--------PEERCVSIVYWN mouse CLEC-6 QWQWVDKTPFNPHTV-------FWEKGESNDFM-------EEDCVVLVHVH mouse SCAVENGER EWKWLDGSPVDYK---------NWKAGQPDNWGSGHGP--GEDCAGLIYAG mouse LANGERIN DWYWVDQTSFNKEQSRR-----FWIPGEPNN------AGNNEHCANIRVSA mouse KUPFFER IWRWVDGTPFNNAQSKG-----FWGKNQPDNWRH--RNGEREDCVHVRQQFig. 5. Amino acid sequence around EPN/QPD on Type II C-type lectins. 㪤㫌㫋㪸㫋㫀㫆㫅㩷 㫇㫆㫀㫅㫋 㪝㪣㪘㪞 㪪㪧㪞 㪱㪰㪤 㪋㪙㪉 V220A 㪚㫆㫅㫋㫉㫆㫃㩷㪟㪜㪢㪉㪐㪊 㪤㫌㫋㪸㫅㫋㩷㪛㪼㪺㫋㫀㫅㪄㪈 㪮㫀㫃㪻㩷㫋㫐㫇㪼㩷 㪛㪼㪺㫋㫀㫅㪄㪈 W221A I222A H223A G224A 㪝㪣㪈㪄㪟 Fig. 6. Effect of Dectin-1 point mutation on binding to SPG-biotin, ZYM-FITC and 4B2. 結果と考察 Dectin-1 発現細胞に対する（1→3）-β-D-グルカン及び Dectin-1 抗体の結合 HEK293 細胞に Dectin-1 及びその点変異体を発現さ せた. Dectin-1 は 244 のアミノ酸残基からなる糖タンパ ク質であるが 6）, まず, それらアミノ酸残基の点変異が 細胞表面への発現量に影響するか検討した. Dectin-1 に 付加した FLAG-タグ配列に対する抗体の反応性を FACS にて測定したところ, 検討した 29 種類のアミノ酸一残 基変異体のうち C241A 変異体を除くいずれの変異体は 野生型と同様に細胞表面に発現した. さらに, これらの変異体発現細胞と可溶性（1→3）-βD-グ ル カ ン で あ る SPG の ビ オ チ ン 標 識 物, FITC-標 識 zymosan（ZYM）或いはビオチン化 Dectin-1 抗体（4B2） との結合性を FACS にて検討した. その結果, 221 番目 の Trp を Ala に変異した W221A は SPG との結合性が著 しく低下した（Fig. 6）. また, 223 番目の His の Ala 変 異 H223A も SPG の 結 合 量 が 低 下 し て い た. ま た, Dectin-1 抗 体 4B2 の 結 合 は W221A で の み 完 全 に 消 失 Jpn. J. Med. Mycol. Vol. 47（No. 3）, 2006 189 220 Exon 6 LHNCV 230 WIHGSEVYNQICNT Epitope for binding of SPG, 4B2 Double mutation 㪤㫌㫋㪸㫋㫀㫆㫅㩷 㫇㫆㫀㫅㫋 㪝㪣㪘㪞 㪱㪰㪤 㪪㪧㪞 㪋㪙㪉 㪤㫌㫋㪸㫅㫋㩷㪛㪼㪺㫋㫀㫅㪄㪈 㪚㫆㫅㫋㫉㫆㫃㩷㪟㪜㪢㪉㪐㪊 㪮㫀㫃㪻㩷㫋㫐㫇㪼㩷 㪛㪼㪺㫋㫀㫅㪄㪈 㪮㪉㪉㪈㪘 㪠㪉㪉㪉㪘 㪠㪉㪉㪉㪘 㪟㪉㪉㪊㪘 㪮㪉㪉㪈㪘 㪟㪉㪉㪊㪘 㪝㪣㪈㪄㪟 Fig. 7. Double points mutation alters binding ability of dectin-1 to SPG, ZYM, and neutralizing antibody 4B2. human mouse mouse mouse mouse mouse mouse mouse mouse human mouse mouse mouse mouse mouse mouse DECTIN DECTIN LDLR CLEC2 MCFA CD94 LLT1 HNKRP1 MDL-1 CD69 CD69 NKG2A NKG2C NKG2D NKG2E CD72 㱍1 㱍2 PCPPNWIIYEKSCYLFSMSLNSWDGSKRQCWQLGSN---LLKIDSS-NELGFIVKQV-SSQPDNSFWIGL SCLPNWIMHGKSCYLFSFSGNSWYGSKRHCSQLGAH---LLKIDNS-KEFEFIESQT-SSHRINAFWIGL PCPQDWLWHKENCYLFH-GPFSWEKNRQTCQSLGGQ---LLQING-ADDLTFILQAI-SHTT-SPFWIGL PCATKWRYHGDSCYGFFRRNLTWEESKQYCTEQNAT---LVKTASQST-LDYIAERI----T-SVRWIGL SCPILWTRNGSHCYYFSMEKKDWNSSLKFCADKGSH---LLTFPDN-QGVKLFGE----YLGQDFYWIGL VCLDKWVGHQCNCYFISKEEKSWKRSRDFCASQNSS---LLQPQSR-NELSFMN------FSQTFFWIGM ACPSGWIGFGSKCFYFSEDMGNWTFSQSSCVASNSH---LALFHSL-EELNFLK----RYKGTSDHWIGL ECPQDWLSHRDKCFHVSQVSNTWKECRIDCDKKGAT---LLPIQDQ-EELRFLLDS--IREKYNSFWIGL VCPRNWDFHQGKCFFFSFSESPWKDSMDYCATQGST---LAIVNTP-EKLKYLQ----DIAGIENYFIGL SCSEDWVGYQRKCYFISTVKRSWTSAQNACSEHGAT---LAVIDSE-KDMNFLK----RYAGREEHWVGL TCKNEWISYKRTCYFFSTTTKSWALAQRSCSEDAAT---LAVIDSE-KDMTFLK----RYSGELEHWIGL HCPKEWISYSHNCYFIGMERKSWNDSLVSCISKNCS---LLYIDSE-EEQDFLQ----SLSL---SWTGI HCPKEWISYSHNCYFIGMERKSWNDSLGSCLSKNCS---LLHIDSE-EEQDFLQ----SLSL--VSWTGI PCPNNWICHRNNCYQFFNEEKTWNQSQASCLSQNSS---LLKIYSKEEQDFL-K----LVKS--YHWMGL LCPKEWILYSHNCYYIGMERKSWNDSLVSCISKNCS---LLYIDSEEEQDFLQS----LSLV---SWTGI CCPCGWIPYQERCFYISHTLRSLEESQKYCTSLSSKLAAFDEPSKYYYEVSLPSGLEELLDRSKSYWIQM 㱎3 human mouse mouse mouse mouse mouse mouse mouse mouse human mouse mouse mouse mouse mouse mouse 㱎2 㱎4 㱎5 DECTIN SRPQTEVPWLWEDGSTFSSNLFQIRTTATQENPSPNCVWIHVSV--- -IYDQLCSVPSYSICEKKFSM DECTIN SRNQSEGPWFWEDGSAFFPNSFQVRNTVPQESLLHNCVWIHGSE-- --VYNQICNTSSYSICEKEL LDLR HRKKPGQPWLWENGTPLNFQFFKTRGVSLQLYSSGNCAYLQDGA-----VFAENCILIAFSICQKKTNH CLEC2 SRQNSKKDWMWEDSSVLRKNGINLSGN-TEE䇭—NMNCAYLHNGK-----IHPASCKERHYLICERNAGM MCFA RNID---GWRWEGGPALSLRILT-------NSLIQRCGAIHRNG-----LQASSCEVALQWICKKVLY CD94 HYSEKRNAWLWEDGTVPSKDLFPEFS----VIRPEHCIVYSPSKS----VSAESCENKNRYICKKLPI LLT1 HRASTQHPWIWTDNTEYSNLVLTR--------GGGECGFLSDNG-----ISSGRSYTHRKWICSKFVSSC HNKRP1 SYTLTDMNWKWINGTAFNSDVLKITGV----TENGSCAAISGEK-----VTSEGCSSDNRWICQKELNHE MDL-1 VRQPGEKKWRWINNSVFNGNVTNQ-------DQNFDCVTIGLTKT----YDAASCEVSYRWICEMNAK CD69 KKEP-GHPWKWSNGKEFNNWFNVT--------GSDKCVFLKNTE-----VSSMECEKNLYWICNKPYK CD69 KNE-ANQTWKWANGKEFNSWFNLT--------GSGRCVSVNHKN-----VTAVDCEANFHWVCSKPSR NKG2A LRKGRGQPWVWKEDSIFKPKIAEI------LHDECNCAMMSASG-----LTADNCTTLHPYLCKCKFPI NKG2C LRKGRGQAWDWKKDSIFKPKIAEI------SHDECNCAMMSASG-----LTADNCTTLHPYLCKCKFP NKG2D VQIPANGSWQWEDGSSLSYNQLTLV-----EIPKGSCAVYGSSFK----AYTEDCANLNTYICMKRAV NKG2E LRKGRGQPWVWKKDSTFKPKIAEI------LHDECNCAMMSASG-----LTADSCTTLHPYLCKCKFPI CD72 --SK---KWRHDYDSQ-------S----------RYCDKIKKYYQKWKRTFSECAELHPCICESEAFRFPD 㪚㪄㪫㪜㪩㪤㪠㪥㪘㪣 㪚㪄㫋㫐㫇㪼㩷㫃㪼㪺㫋㫀㫅㪄㫃㫀㫂㪼㩷㪻㫆㫄㪸㫀㫅㩷㩿㪚㪫㪣㪛㪀 㪥㪄㪫㪜㪩㪤㪠㪥㪘㪣 㱎1 㪛㫀㫊㫌㫃㪽㫀㪻㪼㩷㪹㫆㫅㪻㩷 Fig. 8. Amino acid sequence of CRD of Dectin-1 and NK receptor family. し, I222A や H223A では僅かに低下したにすぎなかっ た. 一方, ZYM の結合は変異による影響はほとんどな かった. これらのことから可溶性（1→3）-β-D-グルカン と酵母細胞壁β-グルカンとは結合性が異なることが示 唆された. 次に, アミノ酸二残基を同時に変異させた Dectin-1 変 異 体 を 作 製 し, 結 合 性 を 検 討 し た. そ の 結 果, I221A/ H223A 及 び W221A/H223A で ZYM と の 結 合 性 は 失 わ れ, W221A/I222A では結合した（Fig. 7）. これらのこと から ZYM と SPG では Dectin-1 との結合における分子 機構が異なることが示唆された 7）. また ZYM などの酵母 細胞壁（1→3）-β-D-グルカンは SPG とは異なり, 長鎖 （1→6）-β-D-グルコシル分岐を有することが知られてお り 1）, この分岐構造の差が Dectin-1 変異体との結合性に 真菌誌 第47巻 第 3 号 平成18年 190 影響した可能性も考えられる. Dectin-1 による（1→3）-β-D-グルカン認識機構の考察 （1→3）-β-D-グルカンとの結合に変化が認められた変 異部位が Dectin-1 のどの様な構造的特徴を有している か興味が持たれるが, 残念ながら Dectin-1 の CRD の結 晶構造解析はなされていない. しかし, Dectin-1 は NK 受 容 体 フ ァ ミ リ ー と ア ミ ノ 酸 配 列 が 類 似 し て お り, CD69, Ly49i, CD94, 或 い は NKG2D な ど の NK 受 容 体 については立体構造が詳細に解析されている 8）. Dectin1 のアミノ酸配列には NK 受容体 C-type レクチンに特徴 的なシステインが 6 残基あり, CRD 内の 4 番目と 5 番 目のシステイン残基はジスルフィド結合を形成すること が知られている. また, NK 受容体 C-type レクチンはβシート構造やα-へリックス構造の位置は互いに良く保 存されている 8）（Fig. 8）. それらの構造的特徴に Dectin1 の W221-H223（W-I-H）の配列を外挿すると, これら は 3 番目のβ-シート構造上に相当した（Fig. 9）. 立体構 造上で考察すると W-I-H 配列のβシート構造は CRD の 先端部位にあり, 細胞外で細胞壁糖鎖を認識するには都 合が良いように思われる. しかし, 実際に W-I-H のアミ ノ酸残基が（1→3）-β-D-グルカンのグルコース残基と直 接 的 に 相 互 作 用 し て い る の か は 不 明 で あ り, 今 後 Dectin-1 の立体構造が詳細に解析されることが期待され る. Zymosan との相互作用による自然免疫システムの活性 化における Dectin-1 の関与 Zymosan は酵母細胞壁成分であり, その多くがβ-グ ルカンからなることが知られている 9）. 実際に, マクロ ファージによる zymosan 粒子の貪食は可溶性の（1→ 3）-β-D-グルカンとの前処理で抑制され, その後の TNFαや活性酸素種の産生も低下することから, β-グルカン 部分が自然免疫の活性化に重要であると考えられてい る 10, 11）. しかし, zymosan はあくまでも細胞壁成分であ り,（1→3）-β-D-グルカン以外にもマンナン, タンパク 質, 或いは脂質なども含んでいることから 9）, これらβグルカン以外の成分による自然免疫活性化への影響につ いて明確であるとは言えない. Ozinsky ら は zymosan が マ ク ロ フ ァ ー ジ の Toll-like receptor 2（TLR2）を介して自然免疫の活性化, 特に Fig. 9. Typical ultrastructure of C-type lectin receptor. 㪟㪜㪢㪉㪐㪊㩷㫋㫉㪸㫅㫊㪽㪼㪺㫋㪸㫅㫋 㪂㩷㪱㫐㫄㫆㫊㪸㫅㩷㪽㫉㪸㪺㫋㫀㫆㫅 㪫㪣㪩㪉㪆㪛㪼㪺㫋㫀㫅㪄㪈 㪊㪎㷄㪃㩷㪍㪿㫉 㪥㪝㪄㱖㪙㩷㫃㫌㪺㫀㪽㪼㫉㪸㫊㪼 㪁㩷㫇㪓㪇㪅㪇㪌㩷㪁㪁㩷㫇㪓㪇㪅㪇㪈㩷 * Binding of sDectin-1 㪇㩷㱘㪾㪆㫄㫃 㪉㪇 ** 㪩㪼㫃㪸㫋㫀㫍㪼㩷㪸㪺㫋㫀㫍㫀㫋㫐 ZWIS 㪱㫐㫄㫆㫊㪸㫅㩷 㪱㪮㪠㪪㩷㩿㫎㪸㫋㪼㫉 㫀㫅㫊㫆㫃㫌㪹㫃㪼㪀 㪚㪤㪠㪪㩷㩿㪚㪤 㫀㫅㫊㫆㫃㫌㪹㫃㪼㪀 㪫㪣㪩㪉㪆 㪛㪼㪺㪄㪈 㪫㪣㪩㪉 㪫㪣㪩㪉㪆 㪛㪼㪺㪄㪈 㪫㪣㪩㪉 㪫㪣㪩㪉㪆 㪛㪼㪺㪄㪈 㪫㪣㪩㪉 㪫㪣㪩㪉 CMIS 㪫㪣㪩㪉㪆 㪛㪼㪺㪄㪈 㪈㪇 㪐 㪏 㪎 㪍 㪌 㪋 㪊 㪉 㪈 㪇 㪣㫌㪺㫀㪽㪼㫉㪸㫊㪼 㪩㪼㫇㫆㫉㫋㪼㫉㩷㪸㫊㫊㪸㫐 㪦㪯㪄㪱㪰㪤㩷㩿㪹㪼㫋㪸㪄 㪾㫃㫌㪺㪸㫅㩷㫉㫀㪺㪿㪀 Fig. 10. Activation of NF-κB via TLR2/Dectin-1 by zymosan-derived fraction. Jpn. J. Med. Mycol. Vol. 47（No. 3）, 2006 191 㪟㪜㪢㪉㪐㪊㩷㫋㫉㪸㫅㫊㪽㪼㪺㫋㪸㫅㫋 㪪㪧㪞㩷㩿㫊㫆㫃㫌㪹㫃㪼㩷㪈㪃㪊㪄㱎㪄 㪾㫃㫌㪺㪸㫅㪀䇭㫇㫉㪼㫋㫉㪼㪸㫋㫄㪼㫅㫋 㪫㪣㪩㪉㪆㪛㪼㪺㫋㫀㫅㪄㪈 㪥㪝㪄㱖㪙㩷㫃㫌㪺㫀㪽㪼㫉㪸㫊㪼 㪱㪮㪠㪪 * 㪩㪼㫃㪸㫋㫀㫍㪼㩷㪸㪺㫋㫀㫍㫀㫋㫐 㪉㪇 㪈㪌 㪣㫌㪺㫀㪽㪼㫉㪸㫊㪼 㪩㪼㫇㫆㫉㫋㪼㫉㩷㪸㫊㫊㪸㫐 㪁㩷㫇㪓㪇㪅㪇㪌㩷 㪇㩷㱘㪾㪆㫄㫃 㪌㪇 㪈㪇 㪌 㪇 㪱㪮㪠㪪 㪱㪮㪠㪪㩷㪂㩷㪪㪧㪞 㪫㪣㪩㪉 㪱㪮㪠㪪 㪱㪮㪠㪪㩷㪂㩷㪪㪧㪞 㪫㪣㪩㪉㪆㪛㪼㪺㫋㫀㫅㪄㪈 Fig. 11. Pretreatment with soluble 1,3-β-glucan reduced NF-κB activation of TLR2/Dectin-1 transfectant by ZWIS. NF-κB の活性化を誘導すること, また, Gantner らは TLR2 と Dectin-1 の共発現は zymosan による NF-κB の 活性化を増強することを報告している 13）. そこで TLR2 や Dectin-1 に対して zymosan のどのような成分が作用 して NF-κB を活性化しているのか検討することにし た. Zymosan の画分による NF-κB 活性化 Zymosan から水溶性及び脂溶性画分更にはマンノプ ロテインなどを除去する目的で, 水洗, クロロホルム/メ タノール処理, 及び次亜塩素酸処理により, それぞれ ZWIS, CMIS, 及 び OX-ZYM を 調 製 し た 14, 15）. HEK293 細胞に TLR2 単独あるいは TLR2 と Dectin-1 を共発現 さ せ, 各 zymosan 画 分 と 共 に 培 養 し 誘 導 さ れ た luciferasev 活 性 を NF-κB 活 性 化 能 と し て 評 価 し た. Zymosan および ZWIS は TLR2 発現細胞で有意な NF-κB 活性化を示したが, CMIS や OX-ZYM はほとんど活性化 し な か っ た. ま た, TLR2/Dectin-1 共 発 現 細 胞 で は, zymosan あるいは ZWIS は TLR2 単独発現細胞に比べよ り高い活性化を示したが, CMIS や OX-ZYM では有意な 活性上昇は認められなかった（Fig. 10）. CMIS が活性を 示さない理由として, Dectin-1 への反応性が zymosan や ZWIS に比べて低下していることが懸念されたため, リ コンビナント sDectin-1 と各 zymosan 各画分との結合性 を FACS で検討したが, いずれも同等の結合性を維持し ていたので, TLR2 あるいは TLR2/Dectin-1 発現細胞に おける NF-κB の活性化はクロロホルム/メタノールに より除去されるような脂溶性成分が関係し, Dectin-1 反 応性を維持していても, 脂溶性成分除去により TLR2/ Dectin-1 における活性上昇も著しく低下することが示唆 された. Zymosan による NF-κB の活性化増強における Dectin-1 の分子機構 TLR2/Dectin-1 共 発 現 細 胞 の NF-κB の 活 性 増 強 に Dectin-1 がどの様な分子機構で関与しているのかを検討 するために, 共発現細胞を予め可溶性の（1→3）-β-D-グ ルカン（ソニフィラン： SPG）で処理したのち, ZWIS を 添 加 し て, NF-κB 活 性 化 能 を 測 定 し た. そ の 結 果, SPG 前処理は TLR2 単独発現細胞と同等の NF-κB 活性 化能しか示さず, Dectin-1 による活性増強は（1→3）-βD-グルカン認識に基づくことが示唆された（Fig. 11）. さ ら に, Dectin-1 の 関 与 を 詳 細 に 検 討 す る た め に, Dectin-1 のアミノ酸配列の特徴に着目して, 細胞内領域 の ITAM 様配列（-YXXL-）の変異体 11） 及び CRD のβグルカン非結合性変異体（W-I-H 変異体）をそれぞれ TLR2 と共に発現させ, ZWIS で誘導される NF-κB の活 性を測定した. その結果, TLR2/Dectin-1 野生型の発現 細胞では有意な活性増強を示したのに対して, ITAM 変 異体及び W-I-H 変異体ではその増強作用が完全に消失 し て い た（Fig. 12）. こ れ ら の こ と か ら, Dectin-1 が TLR2 介在性の NF-κB 活性増強を誘導する際, β-グル カ ン 部 分 の 特 異 的 な 認 識 の み な ら ず, 細 胞 内 領 域 の ITAM 様モチーフも重要であることが示唆された. 一般 的にITAM 様モチーフのチロシン残基はリン酸化を受け て 活 性 化 に 関 与 す る こ と が 知 ら れ て い る が TLR2 と Dectin-1との協調的な zymosan の認識後, どの様なメカ ニズムでリン酸化が引き起こされるのかは不明である. これらのメカニズムを解析することで, 真菌菌体の認識 に伴う自然免疫の活性化や炎症反応の分子機構をさらに 真菌誌 第47巻 第 3 号 平成18年 192 㪟㪜㪢㪉㪐㪊㩷㫋㫉㪸㫅㫊㪽㪼㪺㫋㪸㫅㫋 㪫㪣㪩㪉㪆㪛㪼㪺㫋㫀㫅㪄㪈㩷㫄㫌㫋㪸㫅㫋 㪥㪝㪄㱖㪙㩷㫃㫌㪺㫀㪽㪼㫉㪸㫊㪼 㪫㪤 㪩㪼㫃㪸㫋㫀㫍㪼㩷㪸㪺㫀㫍㫀㫋㫐 㪚㫐㫋㫆 㪌 㪋㪅㪌 㪋 㪊㪅㪌 㪊 㪉㪅㪌 㪉 㪈㪅㪌 㪈 㪇㪅㪌 㪇 㪣㫌㪺㫀㪽㪼㫉㪸㫊㪼 㪩㪼㫇㫆㫉㫋㪼㫉㩷㪸㫊㫊㪸㫐 㪱㪮㩷㪠㩷㪪㩷 㪂㩷㩿㫎㪸㫋㪼㫉㩷㫀㫅㫊㫆㫃㫌㪹㫃㪼㪀 㪪㫋㪸㫃㫂 㪚㪩㪛 䌎 㪇㩷㫌㪾㪆㫄㪣 㪈㪇 㪚 㪘㫄㫀㫅㫆㩷㪸㪺㫀㪻 䊶䊶䊶㪈㪋㩷㩷㪈㪌㩷㩷㪈㪍䊶䊶䊶 䊶䊶䊶㪉㪉㪈㩷㩷㪉㪉㪉㩷㩷㪉㪉㪊䊶䊶䊶 㪮㫀㫃㪻㩷㪫㫐㫇㪼 㪞 㪰 㪫 㪮㫀㫃㪻 㪫㫐㫇㪼 㪰㪈㪌㪝 㪞 㪝 㪫 㪮 㪠 㪟 㪛㪼㪺㩷㪉㪉㪈㩷㪉㪉㪊 㪘 㪠 㪘 㪛㪼㪺㩷㪉㪉㪉㩷㪉㪉㪊 㪮 㪘 㪘 㪫㪣㪩㪉 㪫㪣㪩㪉㪆㪛㪼㪺 㪮㪫 㪫㪣㪩㪉㪆㪛㪼㪺 㪰㪈㪌㪝 㪫㪣㪩㪉㪆㪛㪼㪺 㪉㪉㪈㩷㪉㪉㪊 㪠㪫㪘㪤 㪫㪣㪩㪉㪆㪛㪼㪺 㪉㪉㪉㩷㪉㪉㪊 㪚㪩㪛㩷㫄㫌㫋㪸㫋㫀㫆㫅 Fig. 12. Mutation of CRD and ITAM of Dectin-1 failed to enhance NF-κB activation in TLR2/Dectin-1 transfectant. 㪱㪮㪠㪪 㪦㪯㪄㪱㪰㪤 㪱㪮㪠㪪 WIH mutation 㪚㪩㪛 㱎㪄㪾㫃㫌㪺㪸㫅 㪚㪤㪠㪪 㪫㪣㪩㪉 㪫㪣㪩㪉 㪛㪼㪺㫋㫀㫅㪄㪈 㪛㪼㪺㫋㫀㫅㪄㪈 㪠㪫㪘㪤 Y 15 F mutation 㪼㫅㪿㪸㫅㪺㪼 㬍 㪤㫐㪛㪏㪏 㪥㪝㪄㱖㪙㩷 㪸㪺㫋㫀㫍㪸㫋㫀㫆㫅 㪠㫅㪽㫃㪸㫄㫄㪸㫋㫆㫉㫐㩷 㫉㪼㫊㫇㫆㫅㫊㪼 Fig. 13. Mutation mechanisms for enhanced NF-κB activation in TLR2/Dectin-1 transfectant. 明確にできるものと期待される. 結 論 Dectin-1 は真菌の（1→3）-β-D-グルカンに特異的に結 合する C-type レクチンであるが, その結合において, マ ンナンの認識に関与するマクロファージマンノース受容 体（MMR）とは全く異なるアミノ酸残基が関わること が示唆された. また, 酵母細胞壁のβ-グルカンと直鎖状 （1→3）-β-D-グルカンとでは Dectin-1 への結合性も僅か に異なることが示唆されたが, 今後の発現タンパク質の 詳細な立体構造解析が期待される. 酵母の細胞壁画分 zymosan のマクロファージからの 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン の 産 生 を 誘 導 し, そ の 誘 導 に は TLR2 及び Dectin-1 を介した NF-κB の活性化を必要と す る こ と が 示 唆 さ れ て い る. そ の 活 性 誘 導 に お け る Dectin-1 の 役 割 を 解 析 し た と こ ろ, Fig. 13 の よ う に, Dectin-1 単独では（1→3）-β-D-グルカンに結合しても, NF-κB の活性化を誘導できず, TLR2 のリガンドがβグルカンと共存することが必要であった. Dectin-1 の CRD の β-グ ル カ ン 結 合 部 位 あ る い は 細 胞 内 領 域 の ITAM 様部位が強い NF-κB の活性化に重要であること が, 変異体を用いた解析で明らかとなった. Dectin-1 は Jpn. J. Med. Mycol. Vol. 47（No. 3）, 2006 β-グルカンの認識を介して真菌に対する防御反応に関 与するが, 菌体の認識, 細胞内への取り込みのみなら ず, Dectin-1 以外の自然免疫系受容体によるシグナル伝 達を調節するような役割を演じていると考えられる. 謝 辞 本研究は東京薬科大学免疫学教室大学院生の石井崇司 氏および池田義彦氏の研究成果に基づくものである. 両 氏の尽力に, また, 免疫学教室員の協力に深謝する. 参考文献 1）Lipke PN, Ovalle R: Cell wall architecture in yeast: new structure and new challenges. J Bacteriol 180: 3735−3740, 1998. 2）Marodi L, Schreiber S, Anderson DC, MacDermott RP, Korchak HM, Johnston RB Jr: Enhancement of macrophage candidacidal activity by interferon-gamma. Increased phagocytosis, killing, and calcium signal mediated by a decreased number of mannose receptors. J Clin Invest 91: 2596−2601, 1993. 3）Drickamer K: Engineering galactose-binding activity into a C-type mannose-binding protein. Nature 360: 183−186, 1992. 4）Brown GD, S Gordon: Immune recognition. A new receptor for β-glucans. 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Receptor molecules relating to innate immunity may recognize such cell wall products, and affect host defense systems. A β-glucan receptor, dectin-1, is a C-type lectin and may contribute to the innate immune responses. To examine the role of dectin-1 in recognition of 1,3-β-glucans and subsequent activation of intracellular signaling, the molecular characteristics of a carbohydrate recognition domain（CRD）of dectin-1 were investigated. The binding ability to β-glucans was abolished by mutating two amino acid residues, Trp221 and His223, on the CRD. Dectin-1 increased TLR2-mediated NF-κB activation in response to zymosan. However, dectin-1 alone could not affect the activation pathway for NF-κB, nor did co-expression of dectin-1 mutant and TLR2 increase the NF-κB activation. These results suggest that dectin-1 may have a co-stimulatory effect on leukocyte activation in response to fungal infection. この論文は, 第 49 回日本医真菌学会総会の“シンポジウム 4 : 真菌感染と 自然免疫”において発表されたものです.