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熊本大学学術リポジトリ Kumamoto University Repository System
熊本大学学術リポジトリ Kumamoto University Repository System Title 感染症および癌におけるプロテアーゼによる補体系活性 化非依存性C5a遊離とC5aの病態への関与の研究 Author(s) 新田, 英利 Citation Issue date 2009-03-25 Type Thesis or Dissertation URL http://hdl.handle.net/2298/14381 Right 学位論文 Doctois Thesis 感染症および癌におけるプロテアーゼによる補体系活性化非依存性C5a遊離と C5aの病態への関与の研究 （Studies on the complement system activation－independent C5a generation by proteases and a pathological role of C5a in infection and cancer ） 新田英利 Hidetoshi Nitta 熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻消化器外科学 指導教員 馬場秀夫教授 熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻消化器外科学 指導補助教員 今村隆寿准教授 熊本大学大学院医学教育部博士課程病態制御学専攻分子病理学 2009年3月 文 昌＝口 ム冊 学 位 Doctor’s Thesis 論文題名 感染症および癌におけるプロテアーゼによる補体系活性化非依存性C5a遊離と C5aの病態への関与の研究 （Studies on the complement system aetiyation－independent Csa generation by proteases and a pathological role of Csa in infection and cancer ） 著者名 （単名） 新 田 英 利 Hidetoshi Nitta 指導教員名 熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻消化器外科学馬場秀夫教授 指導補助教員名 熊本大学大学院医学教育部博士課程病態制御学専攻分子病理学今村隆寿准教授 審査委員名 免疫識別学担当教授 西村 泰治 細胞病理学担当教授 竹屋 元裕 小児外科学担当教授 猪股 裕紀洋 血液内科学担当教授 満屋 裕明 2009年3月 目次 目次．＿＿．．．．．．．．＿．＿＿＿．．＿．＿．．．＿．＿＿＿．．＿＿．＿＿＿．1 1．要旨＿．＿＿．＿．．．．．．＿＿．＿＿＿．＿．＿＿．．．＿．．＿＿．＿＿．5 2．発表論文リスト，．．．．．．．．．．．．．．．，．．，．．．．書．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．t ■一．，．．．8 3・謝辞・……・…・…・…■■……………・……………・・…・・………9 4．略語一覧．．．．．．．．．．．．，，．．．．．．．，．．．．．．．．．，．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．10 5．研究の背景と目的．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11 5－1）補体免疫系とC5aについて．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．11 図1補体系経路．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11 5－2）加zo加。照3感染症とA・eromonas sobria産生プロテアーゼ．。．．．．。．，．．．．，．．．12 図2 Aθromonas sohTia皮膚感染．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12 図3 ヒトC5の構造．，．．．．9．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．13 5－3）癌とC5a受容体．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．13 図4腫瘍細胞に発現したケモカインレセプター．＿．＿．．＿．＿＿．＿＿．．14 5－4）癌とC5a．．■■■■．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．。．．．．．．14 図5 補体調節因子．．，．，．，．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．15 5－5）本研究の目的．．．．．．．．．．．．．畢．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．15 6．実験方法 A：A ei－omonas sohri∂放出プロテアーゼによるC5a産生作用解析．．．．．．．．．．．．．．16 6－A－1）実験材料．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．・．．．．．．．・．．．．．．．・．・，・．・．・．．．16 6－Am2） ASP・・・・・・・・・・・… t・・・・・・・・・・・・・・… e・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・… 16 図6ASPのSDS－PAGE解析，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．16 6－A－3）好中球遊走試験．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．。．．．．．．．．．．．．．．．．．．17 6－A－4）活性酸素測定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．17 6－A－5）モルモット皮膚における好中球浸潤と血管透過性充進活性測定．．．．．．．．．．17 1 6－A－6）フローサイトメトリー．．．．，．．．．．．．．．．．．．∴．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．，．．18 6－A－7） SDS－PAGE．．．．．，．．．，．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 18 6－A－8）イムノブロッティング．＿．．＿＿＿．＿．＿＿＿＿＿＿．．．＿．．19 B：C5aの癌細胞による産生と癌細胞への作用の解析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．19 6－B－1） 癌糸田月産培養魯．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．1g 6－B－2）C5aRの免疫組織化学的解析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．19 6－B－3）癌細胞F一アクチン免疫蛍光染色．．，．．．．．．．．．．．．，．．．、．．．．，．．．．．．．．．．．．20 6－B－4）細胞内カルシウム濃度測定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．20 6－B－5）癌細胞増殖効果判定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．。20 6－B－6）細胞からのRNA抽出とreverse transcriptase PCR（RT－PCR） ．＿＿．．．21 6－B－7）C5aRcDNA作製．．．．．．．．．．。，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．。．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．21 6－B－8）C5aR cDNAのHuCCT1への遺伝子導入（Stable Transfection）．．．．．．．．．．．．21 6－B－9）イムノブロッティング＿＿＿，∴＿＿．．＿＿＿．＿＿＿．．． 22 6－B－10）フローサイトメトリーによるC5aR発現の確認．．．．．．，．．．．．．．．．，．．．．．．．22 6－B－U）マトリゲルインベージョンアッセイ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．5．，．22 6－B－12）醜P濃度測定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．23 6－13）統計．．．．．．．．．．．．．．馳．．．．．．．．．．．．．．．，．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．23 7．実験結果 A Aeromonas sobria産生プロテアーゼASPによるC5a遊離．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．24 7－A－1）ASPによるC5からの好中球遊走活性産生．．．．．．．．．．．．．．．。，．．．．．．．．．．．．24 図7ASP処理されたC5による好中球遊走試験．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．24 7－A－2）ASP処理したC5のモルモット皮膚好中球浸潤誘導．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．25 図8ASP処理したC5のモルモット皮膚における好中球浸潤．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．25 7－A－3）ASPによるC5からの好中球活性酸素放出誘導．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．26 図9ASP処理したC5の好中球活性酸素産生誘導．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．26 7－A－4）ASP処理したC5の血管漏出誘導．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．27 2 図10ASP処理したC5の血管透過性漸進作用．．．t．．．．．．．，．．．．．．．，．．．．．，，．．．．．27 7－A－5）ASPがC5から産生するC5aの同定．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．，．．28 図11ASPによるC5の分解とC5aの産生．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．28 7－A－6）ASPの好中球C5aRとC5aに対する作用．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．29 図12好中球C5aRに対するASPの影響．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．29 図13ASPのC5aに対する影響．．．．．．．．．，．．．．。．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．30 B：癌細胞によるC5a遊離とC5aの癌細胞への作用．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．31 7－B－！） ヒト癌組織におけるC5aR発現．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．31 図14 各種癌組織におけるC5aRの発現．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．，32 7－B－2）胆管細胞癌細胞株のC5aR発現．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．。．．．．．33 図15 胆管細胞癌細胞株におけるC5aRの発現．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．33 7－B－3）C5aR高発現HuCCT 1細胞の作製と発現確認．．，．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．34 図16 C5aR高発現HuCCT1細胞におけるC5aR発現．。．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．34 7－B－4）C5aの細胞増殖への作用．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．，．．35 図17 C5a刺激による胆管細胞癌細胞株増殖．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．35 7－B－5） C5aの癌細胞浸潤：充進作用．．．．．．．．．．，．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．36 図18C5aの浸潤充進作用．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．37 7－B－6）C5aの癌細胞アクチン重合誘導作用．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．38 図19 C5a刺激による癌細胞アクチンの変化．．．．．．。．．．．．．．。．．．．．．．．．．．．．．．．．．39 7－B－7） C5aの癌細胞MMP産生誘導作用．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．。．．．．．．．．．40 表1．C5a刺激24時間後の培養上清MM［P濃度＿＿．＿．＿．＿＿＿．．＿．。．40 図20MMPインヒビターによる癌細胞浸潤抑制．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．41 7－B－8） 癌細胞膜型プロテアーゼによるC5a産生．．．．．．．．．．．．。．．．．．．．．．．．．．．．．42 図21胆管細胞癌細胞株によるC5a遊離＿＿＿．．＿＿．＿．．．＿＿＿＿43 7－B－9）HuCCT1細胞によって遊離されたC5aの癌細胞浸潤充進作用．．．．．．．．，．．．44 図22HuCCTI細胞とC5との反応液のC5aR高発現HuC（rr1細胞の浸潤充進作用．．．．．．．．44 3 8 Q1 σ0 考察．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．45 結語．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．，．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．49 参考文献．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．50 4 1．要旨 補体系5因子（C5）の断片であるC5aは、免疫複：合体や細菌などの侵入微生物表面で 活性化される補体系の生理活性分子であり、白血球の遊走や活性酸素産生および脱穎粒 などのアナフィラトキシンとしての作用を発揮して、炎症やアレルギー病態に関わって いる。 C5aは補体系活性化で形成されたC5コンベルタ川堰複合体のプロテアーゼ作用によっ てC5が限定分解されて遊離される。一方、細菌などの病原微生物がプロテアーゼを放 出する場合はそのプロテアーゼがC5コンベルターゼ複合体の様に直接C5を限定分解し、 切り出されたC5aが感染症病態を引き起こすことも推定できる。加∫oπoη∂∬o加∫∂感染 症では膿瘍形成や浮腫などC5aのもつ作用と関連する病態がみられる。そこで、 Aei’omonas sohTia感染症病態とC5aの関係を明らかにするために、本菌産生セリンプロ テーゼ（ASP）に着目してそのC5a産生能を調べた。 ASPとヒトC5をインキュベートす ると、ボイデンチャンバー法による好中球遊走、モルモット色素漏出測定法による血管 漏出、ルシゲニン化学発光測定法による好中球活性酸素放出がみられ、C5a様の機能が 出現することが解った。さらに抗C5a抗体を用いたイムノブロッティングにより、C5a と同じ抗原性および分子量のC5断片が産生されることを確認した。 ASPはヒト血漿から もC5aを産生したが、 C5aおよびC5a受容体に対する分解作用は示さなかった。 ASPは C5aを産生し加ro吻。刀∂∬o加ゴ∂感染症でみられる浮腫、膿瘍形成に関わっていることが 示唆された。 ケモカインとその受容体の癌における重要な役割が最近明らかされてきているが、ケ モカインのように白血球刺激作用を有するC5aと癌との関係は未だ解析がなされていな い。C5aの癌病態への関与を解明するために、ヒト胆管細胞癌やその株化細胞のC5a受 容体（C5aR）発現とC5aの癌細胞への作用、さらに癌細胞のC5a遊離能を解析した。胆 管細胞癌は免疫染色で、胆管細胞癌細胞株MECはPCR、ウェスタンプロッティング、フ ローサイトメトリs一一一・一でC5a受容体発現が認められた。 MEC細胞およびC5aR遺伝子導入高 発現型HuCCT1細胞は、 C5a刺激でアクチンが重合することを免疫蛍光染色で観察し、マ トリックスメタロプロテアーゼ（MMP）産生増加を伴って浸潤能が充進ずることをマト リゲルインベージョンアッセイで見いだした。この効果は抗C5aR抗体で抑制された。 胆管癌細胞株によるC5からのC5a遊離をイムノブロッティングで検出した。このC5a 遊離はセリンプロテアーゼインヒビターで抑制された。胆管細胞癌セリンプnテアーゼ によって産生されたC5aがC5a受容体を発現する癌細胞に作用して運動性を高め、さら にMMPの産生・放出を参進することによって、その浸潤能を充外していることが示され た。 感染症や癌病態におけるC5aの関与が明らかになり、抗C5a抗体やC5aR拮抗剤など のC5aやC5aRを標的とした新たな治療法開発の可能性が提示された。 5 Summary Purpose： ，To investigate an involvement of Csa in the pathology of bacterial infection and cancer， C5a l iberation from C5 by proteases from、4θTomon∂5 sobrゼ∂ （ASP） and cholangiocarcinoma cells， and C5a functions associated with diseases were studied， together with Csa receptor （CsaR） expression of the cancer cells． Method： 1： Liheration of Csa from human C5 and plasma by ASP was examined by a neutrophil chemotaxis assay， a superoxide assay， a vascular leakage assay， and the immunoblotting using anti－Csa antibody． The effect of ASP on Csa receptor and Csa was also investigated． II： CsaR expression of cancer cells from surgically resected tissues and cell lines， and effects of C5a on the cancer cell proliferation， cell shape， MMPs production and invasion activity were examined． Furthermore， the ability of cancer cells to liberate Csa was studied in vitro． Results： 1： C5 incubated with enzymatically active ASP generated the neutrophil chemotactic activity in a dose－dependent and an incubation timentdependent manner， inducing neutrophil infiltration at intradermal injection sites of guinea pigs， and neutrophil superoxide release． ASP incubation mixture with C5 but not with C3 elicited vascular leakage when injected into the guinea pig skin． ASP c’leaved C5， releasing a single Csa antigen with an m． w． identical with that of Csa． Imnunoblotting revealed the generation of a Csa－like molecule from human plasma incubated with ASP． The neutrophils chemotaxis assay and flow cytometry revealed that ASP did not affect functions of Csa and neutrophil Csa receptor． II： Cancer cell C5aR expression was detected immunohistochemically in several types of cancer tissues． Using RT－PCR， immunoblotting and flow cytometric analysis， CsaR expression was found in cholangiocarcinoma cell l ine MEC but not HuCCTI． Incubation with Csa did not increase both cancer cell numbers， indicating no mitogenic effect of Csa on these cells． lnterestingly， Matrigel assay revealed that Csa enhanced invasion activity of MEC cells and CsaR－expressing transformed HuCCTI cells． Csa induced actin polymerization and MMPs production of MEC and CsaR－expressing HuCCTI cells were shown by F－actin staining and MMPs array analysis． When C5 was incubated with MEC or HuCCTI cells， incubation t ime－dependent Csa liberation was detected by immunoblotting using the anti－Csa antibody． Furthermore， 6 C5 incv，bated with HuCCTI enhanced the invasion activity of CsaR－expressing HuCCTI cells and the anti－Csa antibody abolished the enhancing effect． Conclusion： Csa released by ASP could be involved in the leukocyte infiltration and edema caused by A． sobi－ia infection， Csa was suggested to be generated by cholangiocarcinoma cells， enhancing their mobility and invasion activity． The participation of the C5a in the pathology of the infection and cancer may raise availability of protease inhibitors and CsaR antagonists in the therapy of these diseases． 7 2．発表論文リスト 1． Hidetoshi．．．N．i．pata， Takahisa lmamura， Yoshihiro Wada， Atsushi lrie， Hidetomo Kobayashi， Keinosuke Okamoto， and Hideo Baba． Production of Csa by ASP， a Serine Protease Released from Aeromonas sobria． ノ；1加αη01． 181：3602－3608． 2008 2． Hidetoshi Nitta， Hidemoto Kobayashi， Atsushi lrie， Hideo Baba， Keinosuke Okamoto and Takahisa lmamura． Activation of prothrombin by ASP， a serine protease released from AeTomonas sobria． FEBS letters， 581：5935－5939． 2007 3 Takahisa Imamura， Hidemoto Kobayashi ， Rasel Khan， Hidetoshi Nitta， and Keinosuke Okamoto． Induction of vascular leakage and blood pressure lowering through kinin release by a serine proteinase from AeTozzionas sobi－ia． ノ；1加αη01． 177：8723－8729， 2006 4． 111tdg！gsbl－Nl－lxt｛d i1etoshi Nitta， Masahiko Hirota， Ayumi Oh－kado， Yutaka Motomura， Akira Chikamoto， Muneyuki Shibata， Hiroshi Takamori， Keiichiro Kanemitsu， Takahisa Imamura， Tetsuro Yamamoto， and Hideo Baba． Coexistence of Serous Cystadenoma and Ductal Adenocarcinoma in the Pancreas： A case report． Pancreas， 36：218－219． 2008 5． lmamura T， Nlt一1！Q－Ut ta H， Wada Y， Kobayashi H， and Okamoto K． lmpaired plasma clottability induction through fibrinogen degradation by ASP， a serine ptotease released from A eromonas sobria． f7EUS Uierobiol lett． 284：35－42． 2008 6． Toshiyuk i Okuma， Masahiko Hirota， UrLdQlllgsbZdetoshi－N． tr t ta， S e i ya Saito， Takeshi Yagi， Satoshi Ida， Shigeki Okamura， Akira Chikamoto， Kennichi Iyama， Hiroshi Takamori， Keiichiro Kanemitsu， and Hideo Baba． Pancreatic schwannoma： Report of a c a s e． Sui7g Today． 38：266－70． 2008 7． 111r－s11g！gdetoshi Nitta， Takahisa lmamura， Yoshihiro Wada， Atsushi lrie and Hideo Baba． Promotion of cancer cell invasion through self－protease－mediated release of anaphylatoxin Csa． in prepare tion 8 3．謝辞 本研究は 熊本大学大学院博士課程消化器外科学 馬場秀夫教授 お よび分子病理学 今村隆寿 准教授の指導のもとに行いました。研究の 遂行のみならず、多面にわたり厳しくも暖かいご指導を頂き心より感謝申 し上げます。 またC5aRの遺伝子導入などの実験手技をご指導いただきました免疫識別 学分野 入江厚先生に感謝申し上げます。 最後に免疫染色や実験などを助けていただいた久保多津子さまに深く感 謝申し上げます。 9 4．略語一覧 Arg ： Arginine ASP ： Aeromonas Sobria serine protease C5： complement 5th component CsaR ： Csa receptor CVFP ： cobra venom factor treated plasma cDNA： complementary DNA DFP ： diisopropylfluorophosphate ELISA ： Enzyme－Linked lmmunoSorbent Assay FBS ： fetal bovine serum FITC ： Fluoresceinisothiocyanate isomer fMLP： formyl－Met－Leu－Phe HE染色： Hematoxylin－Eosin染色 HBSS ： Hank’ s balanced salt solution HPF ： High power field ICC： intrahepatic cholangiocarcinoma kDa： kilodalton MBL： mannose binding lectin MCP： monecyte chemoattractant protein rCsa ： recombinant Csa RT－PCR： reverse transcription－polymerase chain reaction SDS－PAGE ： sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis VL ： vascular leakage 10 5．研究の背景と目的 5－1）補体免疫系とC5aについて 補体系は血漿中や細胞膜上に存在する30種以上のタンパク質から構成され、侵入微 生物の排除に重要な働きを果たす。補体系はエフェクター因子とその制御因子に分けら れ、前者は通常未活性の状態であるが活性化によっていくつかの因子が細胞膜上で連鎖 的に活性型に変i換され、最終的にはC5b、 C6、 C7、 C8、 C9からなる膜侵襲複合体が形成 されて細胞膜を傷害する（1）。補体系の活性化には3つの生化学的プロセスがあり、細 胞膜の抗原に結合した抗体にClqが反応して開始する古典的経路、 C3が細菌膜のリボ多 糖類に結合して始まる副経路、病原体表面のマンノース基にマンノース結合レクチンが 結合して活性化されるレクチン経路である（1）（図1）。 Alternative Pathway Classical Pathway Lectin Pathway lmmune （lgG ＋ lgM） complexes and others ｛e，g．．CRP） Microbial surfaces （mannose） and others （e．g．． egA） 匪；］ト＿H一・・Ps Spontaneously occurring and after contact with foreign surfaces． e．g， LPS 國 ↓轡・ 画 ／ 画 C3｛H201Bb FaGヒorD 匝 罫ご響 ゆ のお ＼圓 ／ ＾・aphyl・電。・i・■ x an Terminal Membrane C6＋C7＋Cs＋cg 1 Attack Complex （MAC， Csb－9） 図1補体系経路 アナフィラトキシン（C4a、 C3a、 C5a）は補体活性化に伴い産生され、そのなかでもっ とも強力な炎症メディエーターがC5aである。 C5aはC5α鎖のアミノ末端から74番目 のArgまでの断片である（2）。C5aはC5aに対する受容体（C5aR）を有する好中球、単球、 マクロファージに対するケモアトラクタントとして働くほか（3）、活性酸素放出を誘導 する（4－6）。肥満細胞に対してはその受容体結合を介してヒスタミンを放出させ、血管 透過性を充進ずる（7）。 11 5－2）Aeromonas感染症とAeromonas sobria産生プロテアーゼ Aertvonas属は通性嫌気性のグラム陰性桿菌でVibrio属から新たに分類された（8）。淡 水系に生息し（9）、主に経口または経皮的に感染する（10，11）。経皮感染をおこすと局所 で発赤、浮腫、膿瘍形成を来たし、悪化すると水泡症、蜂窩織炎、壊疽性出訴、壊死性 筋膜炎、骨髄炎を来たすことがある（12－14）（図2）。 Oett“tttts 暉聯憶■働0㎜吊 図2 Aero■onas sobria皮膚感染 左：水泡症、中：蜂窩織炎、右：壊疽性急減 Aeromona感染症は腹膜炎、髄膜炎、胆道系感染、肺炎、敗血症など全身感染症に至る ことがあり、しばしば致死的となる。本心は溶血素、エンテロトキシン、プロテアーゼ などの病原因子を産生する（15）。そのなかでプロテアーゼに注目しAeromonas属のなか で患者血液から最も高頻度に検出され病原性も高いAeromonas・sobria（16）の培養上清か ら分子量65kDaの一本鎖タンパク質であるAeromonas sobria serine protease（ASP） を精製した（17）。我々は、これまでにASPの血漿カリクレイン・キニン系活性化を介し たキニン遊離による血管透過性充進作用および血圧降下作用（17）、さらにプロトロンビ ンをトロンビンに変換することによる血液凝固誘導作用を明らかにし（18）、敗血症にお けるショックと致死的合併症であるDIC発症との関連を提示した。しかし、 Aeromonas 感染巣でみられる浮腫形成や好中球の浸潤の機序は未だ解明されていない。 ASPはArg残基のカルボキシル末端側を切断しやすい性質をもつプロテアーゼである ことから（18）、C5a産生に必要なC5α鎖のアミノ末端から74番目のArgのC末端側を 切断しうることが示唆される（図3）。また、ASPの血管透過性充進作用が抗ヒスタミン 剤で一部抑制されることは（17）、C5aによる肥満細胞からのヒスタミン放出の関与を示 しており、ASPのC5a産生が想定される。 12 伽［ a chatn Csb ㊥ e v▼｛］Rし t N覧 ニへ ユ B 一chaln ＿｛⊥＝＝＿…， 65 噛 図3 ヒトC5の構造 C5はα鎖、β鎖から構成される196kDaの蛋白である。 C5コンベル一一ゼ複合体によりα鎖 のアミノ末端から74番目のArgが切断され（↓）、 C5aが産生される。 C5aは糖鎖が付いてお り、糖鎖を含まないC5aの分子量は約8900Daである。 5－3）癌とC5a受容体 癌の15～20％が炎症または感染を伴う（19）といわれており、持続的な炎症刺激は発 癌およびその進展と深く関わっている。炎症によってさまざまな体細胞から産生される ケモカインは、受容体を発現する白血球の炎症局所への遊走、浸潤を誘導する（20）。近 年、ケモカイン受容体が癌細胞にも発現しており、ケモカインを利用して自身の遊走、 浸潤、転移を促進することが解明されてきている（21）（図4）。なかでもCXCR4は大腸癌、 乳癌、肝細胞癌、食道癌などで発現と癌の浸潤、転移への関与が報告されている（21－24）。 13 e ＾ 鱗i 鱒麺縛◎ ◎一 く璽〉一 ㊥臨一P・…一・ ◎聯枷。嚢 鯛鰭 ㎜．・…M…一 ● ケモカ噸ン ● 働リサイトカイン． 脚 ◎ 正糊 図4腫瘍細胞に発現したケモカインレセプター・ A：ケモカインレセプター発現腫瘍細胞は転移巣における高いケモカイン濃度に対し、反応し て浸潤、転移を起こす。 B：転移巣でのケモカインは腫瘍細胞に抗アポトーシス効果、増殖効果を促進させ、TNF一α産 生を誘導する。このサイトカインは間質周囲での腫瘍一炎症ネットワークを惹起し腫瘍の生 存、増殖をさらに促進させる。 しかし、癌と古典的なケモアトラクタントであるC5aとその受容体であるC5aRの関 係はほとんど研究されていない。C5aR発現は血球系以外の細胞にも認められ、血管内皮 細胞ではmonocyte chemoattractant protein（MCP）一1，2の産生（25）、細胞収縮による 血管漏出機能（26）、占冠サンギウム細胞ではMCP－1産生、細胞増殖（27）、気管上皮細胞 ではIL－8産生（28）への関与が報告されており、その生物学的意義は宿主側の感染防御 機構の範疇を越えて広がりつつある。 5－4）癌とC5a Helicobae tor py1 orゴ感性胃炎と胃癌（29）、Opis thorchis vi verrini感染と胆管癌（30） など感染に起因する癌や、自己免疫が原因の癌（原発性硬化性胆管炎一胆管細胞癌）（31）、 潰瘍性大腸炎から発生した大腸癌（32）においては癌周囲の炎症による補体活性化に伴 いC5aが産生され、癌組織へ影響が推定される。また、ある種の癌細胞では癌化にとも ない細胞表面の糖鎖が構造変化してmannose binding lectin（MBL）リガンドとなる糖 鎖が出現し、これに血中のMBLが結合してレクチン経路を介した補体活性化がおこる （33）。しかし、細菌感染や自己抗体を伴わない癌では、非癌細胞と同様に細胞膜表面 に補体調節因子（complement regulatory protein；CD46，55，59）が存在し細胞膜上で の補体の活性化は抑制され、C5aは産生されにくい（34）（図5）。 14 P』鵬 Classical Pathway Ntemative Pathway ← ［ 。3，〉「 c3b／1 iC3b＼U 。1画［1奪動 り C3－convertase ｛C4b2a｝ 。灘騨i／＼［魎副 、回［f csa／（ユ ．（iEEi） Csb－9 ｛MAC） 図5 補体調節因子 CD46， CR1は、 C4b， C3bの分解を抑制することでC3コンベルターゼの形成を阻害する。 CD55は、 C3コンベルタ一直、 C5コンベルターゼの分解を促進させる。 CD59は、 C9の結合を阻害することでMACの形成を阻害する。 しかし、補体系活性化に伴わず直接C5を分解し、 C5aを産生するプロテアーゼが報告 されている（35）。癌に同様の活性をもつプロテアーゼがあれば補体系活性化に依存せず C5a産生する可能性がある。最近、 C5aR knockout mouseを用いた実験では癌周囲の微 小環境において補体の活性化がおこり、C5aが癌の増殖、浸潤に関与しているとの報告 もある（36）。したがって、癌周囲の微小環境でC5aが産生され、C5aR発現癌ではC5a－C5aR 相互作用が誘導されて癌病態への影響が想定される。 5－5）本研究の目的 以上のような背景から、本研究は、Aeromonas sobriaおよび癌産生プロテアーゼが C5a遊離に関与している可能性を見出すこと、また癌細胞におけるC5aRの発現とC5aの 作用を解析し、感染症と癌病態におけるC5aの意義を検討することを目的とする。 15 6．実験方法 A Aeromonas sobTia放出プロテアーゼによるC5a産生作用解析 6－Ar 1）実験材料 フェノールレッドフリーHBSSは日水製薬株式会社から購入した。 Recombinant C5a（rC5a）とN， N’一dimethyl－9，9’一biacridiniumdinitrate（1ucigenin）はSigma社か ら購入した。ヒトC5とC3はCalbiochem社から購入した。 formyl－Met－Leu－Phe（fMLP） はPeptide Institute社から購入した。ヒツジ抗ヒトC5a抗体とHRP－conjugated rebbit IgG against goat IgGはそれぞれR＆D systemes社およびニチレイ社から購入した。 Cobra venom factor（CVF）はQuidel社から購入した。 C5a receptor antagonistの ！V－methyl－Phe－Lys－Pro一ナcyclo－hexylalanine－d－cyclo－hexylalanine－aLArgは、以前の 報告のように合成した（37）。他の試薬はWakoケミカル社から購入した。ヒト血漿は健 常人の血液を1／10量の3．8％クエン酸ナトリウムを混ぜて採血し遠心分離して採取した。 6－A－2） ASP ASPは岡山大学薬学部の岡本敬の介教授より御供与頂いた。 ASPをSDS－PAGE（10％アク リルアミドゲル）で解析すると分子量65kDaの1手鎖蛋白質で、2－melcaptoethano1共 存下でも単tのバンドを示した（17）（図6）。 2 kha ・1 s 驚繕麟一一磯 幅嬉…一 1蔭馨一』』・』・ ＿三顧■噺 7暴 ・痴瞳繭舷 嚇 ＄，9一輪 37一 ・・一＝ 鷺謬一無 図6ASPのSDS－PAGE解析 0．6μgのASPをポリアクリルアミドゲルに電気泳動し、銀染色にて解析した。 Lane 1：分子量マーカs一一・、 Lane 2：2－MEあり、lane 3：2－MEなし。 16 6－A－3）好中球遊走試験 好中球の採取は以下の実験法で行った。ヘパリン化した血液を6％デキストラン200000 を含む0．9％NaClと混ぜ、室温に40分静置した。上清をFicoll－Paque PLUS（GE healthcare Bio sciences社）に投与し（38）、4℃20分300×gで遠心した。遊走試験に はNeuro PrQbe社の48穴プレートと3ym poreのポリカーボネイトメンブレンを使用し た。90μ1のC5（350nM）を10ulのASPと37℃、60分反応させ、その後、酵素反応を停 止させるためにlu1のdiisoporopyl fluorophosphates（DFP）（10mM）を投与した。反 応液30plをlowerチャンバーにいれた。 PBS、 ASP（100nM）、 C5のみをネガティブコン トロールとして同様にlowerチャンバーに入れた。 rC5a（0．1～100nM）とfMLP（IOOnM） をポジティブコントロールとして使用した。50ulの好中球（2×106 cells／ml in phenol red－free HBSS containing 3％BSA）をupperチャンバーに入れ、各チャンバーの問に メンブレンを留置した。また10plのC5aRアンタゴニスト（100μM）または10plのPBS で37℃10分処理した好中球も使用した。チャンバーを37℃90分静置した後、メンブレ ンを取り出し、PBSで洗浄したのち、メタノールにて固定し、20倍希釈のギムザ溶液に て染色した。無作為に5視野選び、×400視野にて浸潤した好中球をカウントした。同 実験を3回繰り返し、その平均を示した。 6－A－4）活性酸素測定 活性酸素の測定はMatthewsらの方法でおこなった（39）。1×105個の好中球を3％BSA、 100pM lucigeninを含むHBSS 100plに浮遊し96穴プレートにいれた。37℃30分静置し たのち、7．8plのC5（1mg／ml）と3．3μ1のASP（0、0．3、1、3pM）を加え、 Wallac 1420 ARVO Multilabel Counter（PerkinElmer社）を用いて37℃の環境下で30秒毎に12分間 蛍光を測定した。コントロールとしてlplのrC5a（1、10pM）または3．3plのASP（3pM） をおのおの単剤で使用した。表記はcpmで表し3回繰り返し実験した結果の平均をcpm で示した。またC5aRアンタゴニスト（1μM）で37℃10分処理した好中球でも同様の測定 をおこなった。 6－A－5）モルモット皮膚における好中球浸潤と血管透過性充進活性測定 ■nγi VOでの好中球の浸潤効果を検証するため、轡部にケタミン（80mg／kg体重）筋 注して麻酔したモルモット（350－450g）に、 DFPで不活化したASP（30nM）、ASP（30nM）、 17 ASP（30nM）で37℃1時間処理したC5、未処理のC5をそれぞれ100p1背部に皮内注射し た。6時間後脱血死させ、皮膚を採取した。ホルマリンで24時間固定後、パラフィン包 埋組織を作製し、2μmに薄切した切片をH＆E染色した。400倍視野で無作為に5視野を 選び、好中球数をカウントした。 C5（350nM）と種々の濃度のASPを37℃30分間、またはC5（350nM）と10nMのASPを様々 な時間インキュベートした。その後、DFP lmMを加えてASPを失活させ、反応を停止さ せた。ケタミン麻酔したモルモットにエバンスブルー溶液（2，5％solution in O．6％ saline）を30mg／kg静脈投与した直後、上記サンプル50plを背部に皮内注射し、10分 後に脱下し注射部皮膚を採取した。血管外に漏出した色素量を定量するため、皮膚をホ ルムアミド溶液に60℃、48時間抽出したのち、各サンプルを620nmの吸光度で測定し た（40）。血管漏出のヒスタミン依存性を確認するため各サンプルを皮下注射する前にヒ スタミンH1受容体拮抗剤diphenhydramine（30mg／kg body）を静脈投与したモルモットで 同様の実験を行った。 6－A－6）フローサイトメトリー 100plの好中球（1×106 cells）をキモトリプシン（0．1mg／m1）またはASP（100nM） で37℃60分処理したのち、FITC－conjugated抗C5a receptor抗体（Serotec社）また はFITC－conjugatedマウスIgGと4℃30分反応させた。 C5aRの発現はFACScan（Becton Dickinson社）で定量した。 6－A－7） SDS－PAGE ASP（100nM）10p1をC5（350nM）90ロ1と37℃で反応させた。一定の時間後、10p1を 採取しDFP lplを添加したのち、サンプルバッファーに溶解して、100℃、5分沸騰させ た。15％ポリアクリルアミドゲルで各サンプルのSDS電気泳動を行った。タンパク質染 色はSilver stain IIキット（Wako Biochemica1社）で行った 18 6－A－8）イムノブロツテイング C5をASPと一定時間インキュベート後、10plの反応物にDFPを添加した。遊離され るC5aは糖鎖があり、rC5aと分子量が異なるため、1Uのコブラ毒因子（CVF）と37℃、30 分反応させたヒト血漿（CVFP）中に遊離されるC5aを糖鎖含有C5aのコントロールとした。 またヒト血漿からのC5a産生能を評価するため、45p1の血漿と5plのASP（1．7pM）を37℃ で一定時間反応させ、ASP処理後SDS－PAGEで解析した。電気泳動した15％ポリアクリ ルアミドゲルからタンパク質をpolyvinylidene fluorideメンブレンに転写し、メンブ レンをヒツジ抗ヒトC5a抗体で2時間反応させた後、 HRP－conjugated抗ヒツジIgGで1 時間反応させた。結合したHRPはECL（Amersham Bioscicences社）にて検出した。 B C5aの癌細胞による産生と癌細胞への作用の解析 6－B－1）癌細胞培養 胆管細胞癌細胞株であるMEC、 HuCCT1、大腸癌細胞株であるHCT15、 COLO205、 DLD－1 は東北大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センターから御供与いただいた。その他の一 胆管細胞癌細胞株であるRBE、 SSp－25、 TKKK、 YSCCCは理化学研究所バイオリソースセ ンターから購入した。これらの細胞は10％FCSを添加したRPMI 1640あるいはD－MEM培 養液中で培養した。 6－B－2）C5aRの免疫組織化学的解析 1993年～2007年までの期間に、熊本大学付属病院で外科的摘出あるいは針生検によ り得られた各種癌組織（食道癌、胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管細胞癌、肝細胞癌、乳癌、 肺腺癌、前立腺癌、腎細胞癌）をEnvision＋システムキット（DAKO社）を用い、アビジ ンービオチン複合体ペルオキシダーゼ法により免疫組織化学的解析を行った。一次抗体 にはマウス抗ヒトC5aR抗体を使用した。ホルマリン固定パラフィン包埋切片よりパラ フィン除去を行った後、メタノール希釈した0．3％H202で内因性ペルキシダーゼをブロ ッキングした。C5aR抗体は2pg／m1の濃度で4℃14時間反応させた。 Phosphate－buffer saline（PBS）にて洗浄後、ビオチン標識抗マウスIgG抗体と室温で1時間反応させた。 PBSにて洗浄後、ストレプトアビジンービオチン標識ペルオキシダーゼと室温で1時間反 応させ、PBSで洗浄した。結合したペルオキシダーゼの反応によって 19 3，3ノーdiaminobenzidine tetrahydrochlorideを沈着させた後、ヘマトキシリンで核染 色した。同一切片の癌部と正常部を比較し、癌部の方に染色が強い場合を陽性、同程度 か弱い場合を陰性と判定した。 6－B－3）癌細胞F一アクチン免疫蛍光染色 MEC、 C5aR高発現HuCCT1を円形カバースライド上で24時間、 FBS（10％）添加RPMI1640 で培養した。その後FBS非添加RPMI1640下で2時間培養した後、rC5a（100nM）を含むRPMI で一定9寺間培養した。PBS洗浄後、4％パラホルムアルデヒドで10分間室温で固定した。 PBS洗浄後、0．2％ToritonX溶液に室温で5分間浸し、さらに1％BSA含むPBSで20分 間ブロッキングした。Alexa 488－phalloidin（Molecular Probes社）5U／mlと1時間室 温で反応させた後、PBS洗浄して封入した。観察はOympus FluoView 300 Laser Scanning Confocal Microscope（01ympus社）を使ってMEC細胞は400倍視野、 HuCCT1細胞およ びC5aR高発現HuCCT1細胞は600倍視野で蛍光観察をおこなった。 6－B－4）細胞内カルシウム濃度測定 Hanks2溶液（0．5％BSA、10mM Hepes、pH 7．4）で作製した1×106個のC5aR高発現HuCCT1 細胞浮遊液に2μMのfura2／削（同仁堂化学）を添加し、37℃で30分間インキュベート して細胞内に導入した。Hanks2溶液で洗浄後、693plの細胞浮遊液をキュベットに入れ、 30秒後に7p1のrC5a（1～100nM）を添加した。 F－2500型分光蛍光光度計（日立社）を 使って励起波長はF1：340nmとF2：380nm、蛍光波長は500nmで細胞内カルシウム濃度を 測定した。カルシウム濃度はC＝Kd×R（F1：F2）で表示した。 6－B－5）癌細胞増殖効果判定 各細胞（HuCCT1：0．・3×104、 MEC：1×104個／100pl）を96穴プレートに入れFBS（10％） 添加RPMI 1640で12時間培養した後、 r C5a（1～100nM）を添加し、一定時間後WST－8 を10p1加えた。2時間後にELISAプレートリーダーで450nmのODで測定した。各生存 細胞の測定はcell counting kit－8（同仁堂社）で3回行い、その平均を表記した。 20 6一・B－6）細胞からのRNA抽出とreverse transcriptase PCR（RT－PCR） 各細胞からtotal RNAをRNase－Free DNase SetおよびQiagen RNAeasy Kit（Qiagen社） で抽出し、オリゴdTプライマーを用いてRNA PCR Kit AMV（Takara社）でcDNAを合成し た。RT－PCRのヒトC5aR特異的プライマーは、センスに5’一CGGGAGGAGTACTTTCCACC－3’、 アンチセンスに5’一CTACACTGCCTGGGTCTTCTG－3’を用いた。またヒトβ actinプライマー はセンスに 5’一CATCCACGAAACTACCTTCAACT－3’、アンチセンスに 5’一TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG－3’を用いた。 PCR反応は94℃30秒、58℃30秒、72℃30秒の条件でC5aRではで36サイクル、βアクチ ンでは32サイクルで行った。PCR産物を1％アガロースゲルで分離し、エチジウムブロマ イドで染色して特異的バンドを検出した。 6－B－7） CsaRcDNA作製 1053塩基対から構成されるC5aRのcDNAをヒトマクロファージのcDNAライブラリーか ら抽出し、センスに5’一CACCATGAACTCCTTCAATTATACC－3’；アンチセンスに5’一 CTACACTGCCTGGGTCTTCTG－3’をプライマーとしてPCRで増幅した。つぎに pENTR／D－TOPO－vector（lnvitrogen社）に挿入し、 DNAシークエンスにPCRミスがないこと を確認した後、C5aRcDNAをGateway System（lnvitrogen社）でpCAGベクターに挿入し Plasmid Mini Kit（Qiagen社）でC5aRcDNAを採取した。 6－B－8） C5aR cDNAのHuCCT1への遺伝子導入（Stable Transfection） pCAG－C5aR（5．4pg）をLipofectamine（Invitrogen社）でHuCCT1細胞に遺伝子導入した。 48時問後、puromycin（1μg／ml）を培養液に添加し2週問セレクションをかけた。 FACS vantage（Becton Dickinson社）を用いてシングルセルソーティングを行しC5aR発現細 胞をクm一ニングした。このC5aRの発現確認はPCRおよびFACSでおこなった。 21 6－B－9）イムノブロツテイング C5a受容体 MEC細胞あるいはHuCCT1細胞を1％Triton X－100で溶解しその溶解細胞 液をSDS－PAGEにアプライして電気泳動した後polyvinylidene fluorideメンブレンに 転写した。メンブレンにウサギ抗ヒトC5aR抗体（Santa cruz社）を2時間反応させた 後、HRP－conjugated抗ウサギIgGを1時間反応させた。結合したHRPはECL（Amersham Bioscicences）で検出した。βアクチンをコントロv一・ルとした。 C5a C5（350nM）6．8plをHuCCT1細胞（2×104／100pl）あるいはMEC細胞（2×104／100pl） と反応させた。また上記細胞の24時間後の培養上清100plとC5（350nM）6．8μ1とを一定 時間反応させた。反応液20plをSDS－PAGEに電気泳動した後、 polyvinylidene fluoride メンブレンに転写した。また、C5（350nM）を添加したメディウムに各種プロテアーゼ 阻害剤（E64：10pM、アプロチニン10μg／ml、ペプスタチン1μM、 GM－60015pM、フォスフ ォルアミドン10μM）をそれぞれ加え、HuCCT1と37℃24時間反応させた。15plをSDS－PAGE に電気泳動した後、polyvinylidene fluorideメンブレンに転写した。メンブレンにヒ ツジ抗ヒトC5a抗体を室温で2時間反応させた後HRP－conjugated抗ヒツジIgGで1時 間反応させた。バンドはECL（Amersham Bioscicences社）にて検出した。同様に56℃、 30分処理で錠口化したヒト血漿と各細胞を一定時間反応させて2plをSDS－PAGEに電気 泳動し、抗C5a抗体でイムノブロッティングをおこなった。 C5aのポジティブコントロ ールとしてCVF処理した血漿2plを使用した。同様に56℃30分にて非動化したヒト血 漿と各細胞を一定時間反応させた。2plをSDS－PAGEに電気泳動した後、上記と同様の方 法で抗C5a抗体にてイムノブロッティングを行った。ポジティブコントロールとしてCVF 処理した血漿2u1を使用した。 6－B－10） フローサイトメトリーによるC5aR発現の確認 5×104個のMEC細胞、HuCCT1細胞、 C5aR高発現HuCCT1細胞をマウスFITC－conjugated 抗C5aR抗体（Serotec社） （10μg／ml）あるいはFITC－conjugatedマウスIgG2a抗体 （10pg／m1）と30分室温にて反応させた。 PBSにて3回洗浄後、FACScan（Becton Dickinson 社）による蛍光測定でC5aR発現細胞の解析を行った。 6－B－11）マトリゲルインベージョンアッセイ MEC細胞、 HuCCT1細胞、 C5aR高発現HuCCT1細胞に対するC5aの浸潤増強効果をマトリゲ ルインベージョンアッセイキット（Becton Dickinson社）を用いてマニュアルに沿って 22 以下の方法で解析した。3．75×104（HuCCTI細胞またはC5aR高発現HuCCT1細胞）または 7．5×104個（MEC細胞）の細胞（500μ1）を上層に、 C5a（1～100nM）またはPBSを添加した RPMI1640750plを下層に置いた。 HuCCT1細胞およびC5aR高発現HuCCT1細胞は37℃、24時 間、MEC細胞は37℃、36時間温算した。また抗C5aR抗体（10pg／ml）で処理したMECを用 いて同様の実験方法を行った。さらに、各細胞をC5a（1～100nM）添加したRPMI 1640で24 時聞培養した細胞を回収、PBSにて洗浄後、上層に置き、下層にはFBS（10％）添加RPMI1640 を置いた。HuCCT1細胞は37℃24時間、 MEC細胞は37℃36時間温置した。上層の底部にコ ーティングしてあるマトリゲルを綿棒で拭い除去した後、メンブレンをメタノールで3 分固定、1％トルイジンブルー溶液にて3分間浸して染色した。風乾した後、カッターで メンブレンを切り出しスライドグラスに封入した。解析は無作為に5視野選び、浸潤し た細胞を数えた。各実験は3回施行し平均細胞数で表した。効果の評価をPBSによる浸潤 細胞数との比較による倍率で表した。 HuCCT1細胞により産生されたC5aに対する浸潤増強効果を測定するため、下層に HuCCT 1細胞7．5×104個をFBS（10％）添加RPMI1640で24時間培養後、 C5（350nM）のみを添加 したRPMI1640に交換し、24時間培養した。その後、上層にC5aR高発現HuCCT1（3．75×104 個／500p1）を置き、同様の手順でインベージョンアッセイを行った。 6－B－12）］㎜P濃度測定 C5a刺激した癌細胞培養上清中の㎜P濃度をQuantibody human MM［P assay l Kit （RayBiotech社）で測定した。6穴プレートにMEC細胞（5×105個）、C5aR高発現HuCCT1細 胞（2．5×105個）を入れFBS（10％）添加RPMI1640で24時間培養した。 PBSまたはC5a（100nM） を加えたRPMI1640に交i換し、24時間培養し、各培養上清を採取した。 Array用プレパラ s一一・一 gに培養上清を入れ、室温で1時間反応させた。Wash bufferで洗浄後、 MMP抗体液を 添加し1時間反応させた。洗浄後、Alexa Fluor結合ストレプトアビジン液を1時間反応 させた。解析はフィルジェン社に依頼した。各MMPに付き抗体スポットは4ヵ所あり、そ の平均を各々のMMP濃度として示した。 6－13）統計 有意差検定はStudent’s6testを用い、 P〈0．01を有意差ありと判定した。統計解析 はStatView 5．0（Abacs Concept社）を使用した。 23 7．実験結果 A：Aeromonas sobria産生プロテアーゼASPによるC5a遊離 7－A－1）ASPによるC5からの好中球遊走活性産生 ASPがC5からC5aを産生するかを検討するため、まずC5a機能のひとつである好中球 遊走活性の産生を調べた。ヒト血中濃度である350nMのC5（41）を種々の濃度のASPと 37℃、60分間反応させ、好中球遊走活性を測定した。ASPは3nMから好中球遊走活性を 産生し、その活性は30nMで最大値に達し100nMではやや低下した（図7A）。10nMのASP によってC5から10nMのrC5aとほぼ同程度の遊走活性が産生され、 DFPで不活化した ASPは遊走活性を産生しなかった（図7A）。C5を10nMのASPと反応させると7分から 活性が出現して60分まで経時的に増加し、その活性はC5aRアンタゴニストでほぼ完全 に抑制された（図7B）。以上からASPはその酵素活性によりヒトC5に作用してC5aRを介 した好中球の遊走を引き起こすことが分かった。 ＾難嚢雛 葡（） 辮 A 線 農 s 珠 嚢 翫 住 コ： 鱒か 瞬 珍 塑300 蔦 導 3《驚 蓮置 畠 蕊 難解の 盤 20g 麺 影番 謬 婁櫛 2’ P⑪芋 窯 む 窯 ＃ 麟騒：＄践慧騨 Φ 3翌藪鋤嘆鱒 鵬燃 A麗く嚇 u．t壕嘆燈翌ζ）難 叢s騨 ｛｝ 慧 7 欝 鱒 醇騒飾鑑群 τ一纏魏晦 緊磯瞼勘汽羽角総ge紳鹸｝ 図7ASP処理されたC5による好中球遊走試験 A：ASP（0～100nM）とC5（350nM）を37℃、60分反応させ、遊走した好中球を無作為に選んだ5視野で数 えた。rC5aをポジティブコントロ・一ル、 PBSおよびASPのみをネガティブコントロールとした。黒カ ラムはDFP lmMで不活化した100nM ASPとC5を反応させたものの好中球遊走を示した。 ＊P〈0．01vs C5のみ、＊＊P〈O． Ol vs C5＋ASP 100nM。 B：10nMのASPをC5と37℃、0～60分反応させ、遊走した好中球を無作為に選んだ5視野で数えた。 灰色カラムはC5aRアンタゴニストと反応させた好中球の遊走を示す。ポジティブコントu一ルとし てrC5a 10nMおよびfMLP 100nMを使用した。 ＊P〈0．01vs C5のみ、＊＊P〈O． Ol vs C5aR antagonist非処理好中球。 24 7－A－2）ASP処理したC5のモルモット皮膚好中球浸潤誘導 ASP処理したC5のC5a様活性が∫刀卿0でも好中球遊走を発揮するか検討するために、 ASP（30nM）と37℃60分間反応させたC5（350nM）をモルモット皮内に注射し浸潤好中球 数を調べたところ、好中球数は20．8±10．9個／High Power Field（HPF）（図8A）であっ た。DFP（1mM）で不活化したASPと反応させたC5では3個／10HPFであった（図8B）。 ASP 単独ではわずかに好中球浸潤を認めた（6．9±5．5個／HPF）（図8C）。 C5単独では全く浸 潤を認めなかった（0個／10HPF）（図8D）。この結果から、 ASPがin vivoでC5に作用す ると好中球浸潤が誘導されることが明らかとなった。 図8ASP処理したC5のモルモット皮膚における好中球浸潤 C5（350nM）をASP（30nM）と37℃60分インキュベートし、100μ1をモルモット背部に皮内注射した。 6時間後、注射した部位の皮膚を採取しホルマリン固定後、パラフィンブロックを作製し、2μm切片を H＆E染色した。染色した切片は顕微鏡を使い400倍視野で観察した。 a：ASP十C5、 b：DFP処理したASP＋C5、 c：ASPのみ、 d：C5のみ 25 7－A－3）ASPによるC5からの好中球活性酸素放出誘導 ASPによってC5から産生されたC5a様活性をさらに検証するため、 C5aの作用である 好中球からの活性酸素放出作用を調べた。ASPはC5とインキュベートすると濃度依存的 に好中球の活性酸素放出を誘導した（図9B）が、 C5aRアンタゴニストで処理した好中 球には活性酸素の放出を誘導しなかった（図9B）。 C5単独およびASP単独でも好中球か らの活性酸素の放出はみられなかった。以上の結果から、ASP処理したC5はC5aRを介 して好中球の活性酸素放出を誘導することがわかり、ASPによりC5からC5a様活性が産 生されていることがさらに確かめられた。 蓼 日 蓼 纏 導 稼 轟 麹 ⑪ （も罠蔓3冨謹ゆ鵠謹崔三整盤9 A 鶏譲 A慧iP 栂 鴨。 o 鱒 30 100 図9 ASP処理したC5の好中球活性酸素産生誘導 A：好中球（1×105個）をASP（100nM）、 rC5a（10，100nM）で刺激したときの活性酸素放出量。 B：ASP（10、30、100nM）と30分間インキュベートしたC5（350nM）で好中球を刺激したときの活性酸素 放出量。灰色カラム：C5aRアンタゴニストで処理した好中球。 ＊P＜0．01vsC5のみ、＊＊P〈0．01vsC5aRアンタゴニスト未処理 26 7－A－4）ASP処理したC5の血管漏出誘導 ASPによってC5から産生されたC5a様活性をさらに検証するため、次にC5aで引き起こ される肥満細胞脱血振によって放出されるヒスタミンの作用を血管漏出作用で調べた。 ASPは酵素活性と3nMから濃度依存的に、かつインキュベート時間依存的にC5から血管漏 出活性を産生した（図10A、10B左、10C）。ヒスタミンH1受容体アンタゴニストで処理し たモルモットでは血管漏出作用は認められなかった（図10B右、10C）。C3に対しても同 様の実験をおこなったが、ASPによる血管漏出作用産生は認めなかった（図10B下）。以 上の結果から、ASP処理したC5はrC5aと同様に肥満細胞からヒスタミン放出を誘導し、 ヒスタミンによって血管漏出が引き起こされることが明らかとなった。さらに、ASPは C3から肥満細胞脱油画作用をもつC3aを産生しないことがわかった。 too 10 C5壱ASP 削n 120 ぼ ア 総鐸 30 軋 墾ぜ 、醗 3 C5a C5＋ASP 醐 留 ：1灘 ヨ ピゆ みノ HIS 繋 BK C3＋ASP 据 田s BK 1 10 100 PBS ASP ooncentration （nM） 欝・・ ．灘’． 5 ． c ・ ． 器 薯 ロ 璽60 A ． 這∫80 1誘 ． 聖 ＾100 B Csa 辱 ⑳ 30 20 10 （ ?jΦ0顧5潔邸O闘」05一＝OooP♪ （0 ： 40 820 タ o O 20 40 oo lncubation time （min） 図10 ASP処理したC5の血管透過性注進作用 A：C5（350nM）をASP（3、10、30nM）と37℃30分反応させ、その後DFP（1mM）を加えた。100plをモルモ ット皮下に投与し、血管外に漏出した色素量を測定した。 ●：DFP処理したASP 30nMとC5。＊P〈0．01 vs C5のみ B：（左）C5（350nM）をASP（10nM）と3分、30分、120分反応させた後DFP（1rnM）を加えた。100μ1をモルモッ ト皮下に投与した際の写真。（右）抗ヒスタミンアンタゴニストを処理したモルモットで左と同様の サンプルを投与した際の写真。（下）C3（5μM）をASP 100nMと37℃で各時間反応させ、その後DFP（1rnM） を加えた。 BK， bradykinin 1μM；HIS， histamine 10μM C：ASP（10nM）と37℃で2～60分反応させた後DFP（1mM）を加えたC5を100μ1モルモットに皮内注射し、 血管漏出活性を測定した。 ○：未処理モルモット；△：抗ヒスタミンアンタゴニスト処理モルモット。＊ρ〈0．01vsC5のみ 27 7－A－5）ASPがC5から産生するC5aの同定 ASPがヒトC5を分解しC5aを遊離することを分子的に証明するために、 ASPとインキ ュベートしたC5をSDS－PAGEで解析した（図11A）。 ASPによって2分後にはC5分解が 始まり、7分後にはC5aに相当する分子量の断片が出現して増加した（図11A）。 ASPの C5a遊離作用を抗C5a特異的抗体によるイムノブロッティングで検証した。インキュベ ート開始後2分でC5a抗原出現が始まり増加した。この抗原の分子量はCVFで処理した 血漿に出現するC5aと同じ分子量だった（図11B）。ヒト血漿中に存在するC5からもASP がC5aを遊離するかを検討するため、 ASPとインキュベートしたヒト血漿に対して同様 のイムノブロッティングを行った。インキュベート開始後90分からC5a抗原を認めイ ンキュベート時間依存的に増加した（図11C）。以上から、 ASPはC5からC5a分子を遊離 し、この作用はin vi VOにおいても発揮される可能性が示唆された。 kDa 鐘轟騨 A a b c d e 35nO “ 2S．O 一 c B f g h jk lmno pq ．譲 ＿轟◎鱒 20．§顯 95一 図11コ口PによるC5の分解とC5aの産生 A：90μ1のC5（350nM）と10μ1のASP（100nM）を37℃でインキュベートし、時間経過ごとにサンプルを回 白してDFP（1mM）を加えた後15％のアクリルアミドゲルにてSDS－PAGE解析を行った。 1ane a：C5のみ、 lane b～e：ASPとC5とのインキュベート時間各2，7， 20，60分。 B：上記サンプルをSDS－PAGEにて解析した後、メンブレンに転写後、抗C5a抗体を用いてイムノブロッテ ィングを行った。lane f：C5のみ、1ane g～j：ASPとC5とのインキュベート時間2，7，20，60分、1ane k：CVF処理したヒト血漿。 C：ヒト血漿とASPを反応させた際のC5a抗体を用いたイムノブロッティング。1ane 1＝血漿のみ、1ane m ～p：ASPとのインキュベート時間各60，90， 120，180分、 lane q：CVF処理したヒト血漿。 28 7－A－6）ASPの好中球C5aRとC5aに対する作用 C5aは細胞膜表面に存在するC5aRに結合することでさまざまな細胞反応を引き起こす。 しかしC5aやC5aRが酵素的に分解されると、その作用は低下する。例えば、動伽。θ加 histolvtioa（42）や歯周病の原因菌であるPouphrromonas gingivalisから産生される システインプロテアーゼ（43）はC5aおよびC5aRを分解する事が報告されている。 ASPが このようなC5a、 C5aRに対する分解作用があれば、 ASPによるC5a－C5aRを介した作用は 減弱すると考えられる。そこで、ASPのC5aおよびC5aRに対する分解作用を調べた。 好中球をASP（100nM）で処理し、膜上のC5aRの量および機能の変化をフローサイト メトリーおよび好中球遊走試験で解析した。キモトリプシンで処理すると点線ラインの ように好中球膜上のC5aR抗原が減少し、かつ好中球のC5aに対する遊走活性も低下が 認められた。しかし、ASPで処理しても好中球のC5a抗原および遊走活性には変化を認 めなかった（図12A、12B）。 雛縫麟 鵬讐懲Φ婚 O禦 霧 ㌧降勺亀匿 聯轡や A 慧 冠俺 が SBtl 10艶 103 撃転1－H 直。 豊 野帰 冨広 悪鋤 蕃 庭櫛 窯 ⑪ 惚融鵬鎌 ｛一｝ （一） A＄ge Chym 無織伽覇セP騰 c5a（1⑪n購 図12好中球C5aRに対するASPの影響 29 1 ・9 ＃ 4 A：好中球（2×106／ml）をASP（100nM）と37℃60分インキュベートした後C5aR抗体でフローサイト メトリーを行った。灰色、黒の領域は各々FITC・conjugated抗C5aRマウスIgG、非特異的マウスIgG を示す。実線と点線はそれぞれASP処理、キモトリプシン（0．1mg／ml）処理した好中球を示す。 B：好中球をそれぞれASP（100nM）、キモトリプシン（100nM）で37℃60分間処理し、 C5a（10nM） に対する遊走活性を測定した。（一）：酵i素未処理の好中球、ASP：ASPで処理した好中球、 Chym：キモ トリプシン処理した好中球。＊P＜0．01vs（一）。 キモトリプシンまたはASPで処理したC5aの好中球遊走活性を測定すると、キモト リプシン処理したC5aは好中球遊走活性が低下したが、 ASP（100nM）処理したC5a では好中球遊走活性に変化を認めなかった（図13）。以上の結果から、ASPはC5aと C5aRに対しては影響を与えないことが明らかになった。 購 ゆ の ホ れ 鋤 ⑳ 樽 鑑工睦．韮憩慕鱒職霊婁悉竃 〈一） A＄P 樵醇m C5鋤童懸翻m磁賞 鍛翫誠繍電 PB欝 図13ASPのC5aに対する影響 rC5a（10nM）をASP（100nM）またはキモトリプシン（0．1mg／m1）で37℃60分間処理し、好中球5の遊走活性 を測定した。（一）＝酵素未処理のC5a、 ASP：ASP処理したC5a、 Chym：キモトリプシン処理したrC5a 30 B：癌細胞によるC5a遊離とC5aの癌細胞への作用 7－B－1）ヒト癌組織におけるC5aR発現 まず、外科的に切除された、あるいは生検で得られた各種癌組織におけるC5aRの発 現を免疫組織化学染色にて検討した。同一切片内に存在する正常組織より強ければ陽性、 弱ければ陰性と判定した。その結果を図14に示す。正常組織では、肝内胆管、近位尿 細管、胃粘膜、結腸粘膜、前立腺基底細胞層に淡い染色性を認めた例もあったが、C5aR 陽性例ではこれら正常部と比較し、癌細胞の細胞膜に強い染色性を認めた（図14A）。各 発生臓器別にC5aR陽性率を解析すると大腸癌、胆管細胞癌、前立腺癌、腎細胞癌にお いて過半数以上の検体でC5aR陽性であった（図14B）。 A 型『騰1ビ 、踊輔9－ 雨 轟諸 灘 ，鋳曝 驚 ・ ｝、』 卿｝ 燕 磯陸 戦 31 考調燭 ㌢慧 墨 篭㈱覇「 巳 ハリ ハ∪ ハU ⑪Oハ∪ 了 ・654321・ （ 勾 ハ∪ 凸U 図14各種癌組織におけるC5aRの発現 各種癌組織におけるC5aRの発現を免疫組織化学染色にて検討した。 A：各種癌組織のC5aR陽性例。すべての癌種においてC5aR陽性の症例が認められた。 挿入図は各組織のC5aR陰性例を示す。スケールバー：50pm。 B：発生臓器別各種癌組織におけるC5aR陽性率（C5aR陽性検体数／各臓器の検体数）。 n： 免疫組織化学染色に用いた検体数。 32 7－B－2） 胆管細胞癌細胞株のC5aR発現 各種ヒト癌細胞株におけるC5aRの発現の有無をRT－PCR、ウェスタンプロッティング で検討した。MEC、 RBE、 HCT15、 COLO205、 HCT116でC5aR mRNAの発現を認めた。肝細胞 癌、胃癌、膵癌の細胞株は調べ得た範囲で、C5aRの発現を有する細胞は認められなかっ た。胆管細胞癌細胞株、大腸癌細胞株についてウェスタンプロッティングでC5aRの発 現を確認したところ、MEC、 HCT 15、 COLO205、 HCT 116でC5aRの発現を認めた。 A chofangiocareinoma colon cancer C51R 9「FO＝ ＝鵬蔓」 5咀閲眺 壽ll OO“O」00 …i醒 0卿号●■ 一ト00＝＝ 〇四署 000鱒〉 蓬 B 一ctin Ptncre ttic cancer Hepatocellulv carcinoma 6astric cancer CSIR B “etin 盟國望臥 ト6◎ト■＝ 腎◎鰯匹理 ■蟹鮎 卜ZとΣ ■W2＝署 福nト《冨 “O含＝ ロ警＝ 三●＝と。● ト＝コ＝ B 一一 cholangiocarcinoma …匿∴バ acttn 曇ll田誓l colon cancer 』 t一 ‘ 澱 ・ E、 k鞠い一轍L 曲繭幽幽仙洞嘲三一騨鰍噸騨1寒 g i 1 i， ”e 図15 胆管細胞癌細胞株におけるC5aRの発現 A：RT－PCR法による各種癌細胞株のC5aRmRNAの発現解析。 B：抗ヒトC5aR抗体を用いたウェスタンプロット法による各種癌細胞株のC5aR蛋白質 の発現解析。 33 7－B－3）C5aR高発現HuCCT 1の作製と発現確認 C5aRの癌細胞における機能をより深く検討するため、マクロファージのcDNAライブ ラリー一一一・から得たC5aR cDNAをC5aRの発現を認めなかったHuCCT1細胞に遺伝子導入し、 恒常的にC5aRを発現するHuCCT1変異株を作製した。作製したC5aR高発現HuCCT 1細胞 におけるC5aR mRNAの発現をRT－PCRで調べると強い発現を認めた（図16A）。さらに抗 ヒトC5aR抗体にてフローサイトメトリーを行ったところ、ほぼ100％の細胞にC5aRの 発現がみられた（図16B）。発現するC5aRが機能的であることを確認するため、 C5aで 刺激して細胞内カルシウム濃度を測定すると、ヒト好中球と同様C5a lnMからカルシウ ム濃度の上昇を認めたことから、生物学的活性を有するものと考えられた（図16C）。 HuO6■「1 「rr置罰5f睦6t置rlt ．一542bp 槻一己コ09 CsaR B actin 0のF ONF O昌O 目 D8N c Negative Sg6 CsaKAb 鼎“へ㌦． 口 ，Ao th1 ，62 ’，AS ：64 おロ E 、。。 250 200 150 100 50 0 0 65量 N 1eo 50 150 200 （S） 図16C5aR高発現HuCCTI細胞におけるC5aR発現 A：RT－PCR法によるC5aR高発現HuCTT 1細胞のC5aRmRNAの発現解析。 B：フ八一サイトメトリー法によるC5aR高発現HuCTT1細胞のC5aRの発現解析。 C：C5a投与時のC5aR高発現HuCCT 1細胞の細胞内カルシウム濃度。 1 ：0nM． O： lnM． D：10nM． A：100nM 34 7－B－4）C5aの細胞増殖への作用 MEC細胞、HuCCT 1細胞およびC5aR高発現型HuCCTI細胞の3っ細胞株に対して、C5a（0、 10、100nM）刺激後生細胞数をcell counting kit－8を用いて72時間まで測定した。い ずれの細胞においてもC5a濃度による細胞増殖に差を認めず非刺激時と同様の増殖経過 を示した（図17）。C5aがこれらの癌細胞の増殖に対して促進作用も抑制作用もないこ とがわかった。 fio 色 O 2e 1 1 8 β ←・ 主 O 」 O ?｡OO）Φりこ範Ω」Omnく ゆ （O な に な な 等 （8寸098毒D」o賀く 佃 － 佃 備 04 01 0 M104㎝04㎝O ｛8菖98焉28Ωく 14 O O 船 50 en （h r） B 20 oo 80 （hr） 図17 C5a刺激による胆管細胞癌細胞株増殖 1×103個のMEC細胞あるいは3×103個のHuCCTI細胞、C5aR高発現HuCCT1細胞を96穴プレー トに入れ、FBS（10％）添加RPMI1640で24時間培養した。その後、 C5a（IO， IOOnM）またはPBS を加えたFBS無添加RPMI1640に交換，し、 C5a刺激後0、12、24、36、48、72時間で細胞数を 数えた。 A：MBC細胞、 B：HuCCTI細胞、 C：C5aR高発ij HuCCTI細胞。 O ：PBS． ZX ：Csa 10nM． 一 ：C5a 100nM 35 7－B－5）C5aの癌細胞浸潤充進作用 C5aは好中球、単球、マクロファージなどC5aRを有する白血球に対して刺激作用をも つ（3）。C5aR陽性癌細胞に対してもC5aは活性化作用を発揮し、この作用が癌の浸潤に 関わっている可能性がある。この可能性を検討するため、C5aの胆管細胞癌細胞株浸潤 への作用をマトリゲルインベージョンアッセイで調べた。 MEC細胞では添加したC5aの濃度依存的に浸潤能が急進し、 C5aがない場合と比較し それぞれ1．7倍（1nM）、3．2倍（10nM）、3．7倍（100nM）の浸潤充進がみられた（図18A、 18B）。この浸潤充進効果は抗C5aR抗体でMEC細胞C5aRへのC5a結合を阻害すると抑制 された（図18A）。 C5aRを発現しない野生型HuCCT 1細胞ではC5aによる浸潤充進作用は 認めなかったが、C5aR高発現型HuCCT1細胞ではC5a濃度依存的に6．7倍（1nM）、10．3 倍（10nM）、12．8倍（100nM）の浸潤充進作用がみられた（図18C、18D）。 つづいて、C5aが癌において浸潤能を増強させるアクチベーターとして作用しうるかを 検討した。MEC細胞をC5aと24時間反応させた。その後PBSにて洗浄しC5aを除去した 細胞をマトリゲルチャンバーの上層に置き、下層に10％FBSを置いた。その結果、 MEC は反応させたC5aの濃度依存的にその浸潤能を増強させ、ネガティブコントロール（PBS） と比較しそれぞれ1．3倍（1nM）、2．1倍（10nM）、2．4倍（100nM）の浸潤増強効果を認めた。 また抗C5aR抗体を用いることでその浸潤増強効果は抑制された（図18C）。同様に野生 型HuCCT 1およびC5aR高発現型HuCCT 1細胞をC5aと12時間共培養し、 PBSで洗浄後、 上層に置いた。野生型HuCCT 1細胞においては浸潤増強効果は認めなかったが、 C5aR高 発現型HuCCT 1細胞では反応させたC5aの濃度依存的にその浸潤能が増強し、それぞれ 4．3倍（1nM）、6．1倍（10nM）、7．2倍（100nM）の浸潤効果を認めた（図18D）。以上の結果 から、C5a－C5aRは癌細胞においても走化因子、走化因子レセプターとしての関係を有し、 かつC5aはC5aRを有する癌細胞の浸潤能を増強させることが示された。 ビ A 4 50 4． 3 3 2 2 1 1 T0 O0 @0050 0050 ●＝0010峯＝＝0」●』E＝翠 繋2だ9響も巴 00 T0 ・嗣 ・… ∴．・、二二・・1潔二ylご㌶曵． 0 6．伽置 1r欄 10nM ，00哺 100醜蘭。 o5■農仙 Csa concentratjen 36 ……㎜…枷……柵鋤 ●●＝OO10℃閲》艦一一〇」0Ω雷一32 （馴9漏昭00一〇 ≠一 C D 0 eentrol fteM 1細闇 C5a◎on6●r臆「記lo門 F ワ で で 0 0 0 0 0 0 5 0 5 【騨93冨00一〇詳り ・＝00口0量【一一〇」02ε5Z 5 i．；i・・．1，1／1 1・1 一． ： h 翁 E 300 ； ，：T，i， ．．’ ， ：：． ”’． ，v．．’ P一 ：t ・”ii曽’碧し』ナ：あタ iili セ・辱 ・． ．評、 ’ t・撃弓欄・．ご ドニ淫．．鴨 o 60ntre1 唖開閉 10縮絹 1●●圃蘭 f●◎の凹 噸。5■風勘 c5a 60門6●nt「瓠且on G 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ∩石」芒◎0も巴 250一冨馨＝0」●ρε3記 98765432誓 10 oo 00 〔1腿■㎝ ■6脚脚CCT’t 叩騨「 疇創陪虚1剛凹1■■‘吻 elt 魔■●r lo覧F85 H 審認落懸 0 eentret lnM tenM leOnM CSa◎◎nc●「嘘「atle闘 図18 C5aの浸潤充進作用 マトリゲル層を超えて浸潤した細胞を浸潤細胞とし、無作為に選んだ5視野で平均浸潤細胞数を数えた。 各C5a濃度での浸潤細胞数を、 C5aの代わりにPBS（コントロール）を用いた場合の浸潤細胞数を100％と して比で示した。実験は3回おこなった。＊P〈0．01vsコントロール、＊＊Pく0．01 vs C5a lOOnM A，B：上層に肥C細胞、下層にC5aを入れ、37℃、36時間培養後、浸潤細胞数を数えた。 C，D：上層にHuCCT 1細胞あるいはC5aR高発現HuCCTI細胞、下層にC5aを入れ、37℃、24時間培養後、 浸潤細胞数を数えた。 E，F：肥C細胞をC5a存在下で24時間培養した後PBS洗浄して上層に入れ、 FBS（10％）添加RPMI1640を 下層に置いた。37℃、36時間培養後、浸潤細胞数を数えた。 G，H：C5a存在下で12時間培養した後PBSで洗浄したHuCCT1細胞あるいはC5aR高発現HuCCT 1細胞を 上層に入れ、FBS（10％）添加RPMI1640を下層に入れた。37℃、24時間培養後、浸潤細胞数を数えた。 37 7－B－6）C5aの癌細胞アクチン重合誘導作用 細胞運動には細胞骨格の変化を起こすアクチンの重合が不可欠である（44）。C5aの胆 管細胞癌細胞株浸潤充進におけるアクチン重合誘導を調べるために、MEC細胞のアクチ ンの免疫蛍光染色を行いC5a刺激によるアクチンの変化を観察した。 MECではC5a （100nM）刺激後30分でアクチンのストレスファイバー（矢印）の形成がみられ（図19B）、 3時間後にはlamellipodia様の構造（矢頭）をもつ細胞を認めた（図19D）。 C5aR高発 現型HuCCT 1細胞ではC5a刺激後1時間でストレスファイバーの形成がみられ（図19G）、 1amellipodia様構造、 filopodia様構造（矢頭）の形成を認めた（図19H，1）。一方、 C5aR を発現しないHuCCT1細胞ではC5a刺激後もほぼ円形が保たれ1amellipodia様構造、 filopodia様構造の出現はみられなかった。またC5aを投与して5時間後にはPBS投与 （図19K）と比較し個々の細胞間の接着が弱まっており、24時間後にはそれが著明とな り細胞のスキャッタリング様の所見を認めた（図19N）。以上から、 C5aはC5aRへの結 合を介してアクチンの重合を誘導することにより運動性を高め、浸潤充進を引き起こし ていると考えられた。 38 図19C5a刺激による癌細胞アクチンの変化 MEC細胞、 C5aR高発現HuCCT1細胞をC5a（100nM）で刺激した後、 Alexa Fluor488 phalloidinラベルした 抗アクチン抗体でF一アクチンを免疫染色しアクチンの蛍光を共焦点顕微鏡で観察した。コントロールとし てC5aRを発現しないHuCCT1細胞を同様の処理後観察した。 A～D：MEC細胞（×600）、 A：刺激前、 B：刺激後30分、 C：刺激後1時間、 D：刺激後3時間。 矢印：ストレスファイバー、矢頭：lamellipodia。細スケールバー：5μm。 E～J：C5aR高発現HuCCTI細胞（×400）、E：刺激前、 F：刺激後30分、 G：刺激後1時間、 H：刺激後3時間、 1：刺激後6時間（挿入図は野生型HuCCTI細胞）、 J：刺激後24時間（挿入図は野生型HuCCT1細胞）、 矢頭：lamellipodia、 filopodia、太スケールバ’一一 1 Oμm。 K～N：C5aR高発現HuCCT 1細胞にPBSまたはC5a（100nM）を加え、5時間または24時間培養した後、 F一 アクチンを免疫染色し観察した（×400）。 K：PBS投与後5時間、 L：C5a刺激後5時間、 M：PBS投与後24時間、 N：C5a刺激後24時間。 スケールバー50μm。 39 7－B－7）C5aの癌細胞剛P産生誘導作用 癌細胞はマトリックスメタロプロテア・一‘一一’ゼ（㎜）s）を産生・放出することによって細 胞外マトリックスタンパク質を分解し間質への浸潤を高めている（45）。C5aは好中球の ㎜P－9産生を充進させてその浸潤を促進すること（46）から、C5a刺激は癌細胞のMMP産 生充進をも引き起こし癌の浸潤に関与する可能性がある。そこで、MEC細胞、 C5aR高発 現HuCCT 1細胞にC5a（100nM）を添加し24時間後の培養上清中のMMP－1，2，3，8，9，10，13 の濃度をELISA法で測定した。 MEC細胞ではいずれのMMPもC5a刺激により産生が増加 し、C5aR高発現型HuCCT 1細胞では㎜）一8．10の増加がみられた（表1）。 MMPインヒビタ ーGM6001（5μM）の癌細胞浸潤への効果を調べると、MEC細胞では約42％、 C5aR高発現型 HuCCT1細胞では約75％の浸潤抑制がみられた（図20）。以上の結果から、 C5aがC5aR に結合すると癌細胞は㎜P産生が増加して浸潤が充進ずることが示された。 MEC培養上清中のMM「鵬度 24hr Fもゼ。 P騰 伽 MMF・1 146671 288493 1．97 0．0004 MMF・2 32 1IO 3．45 α092 MMF・3 25 1認 513 α0085 MMF・8 16 了3 4留 0．0256 閉MF・9 0翼 12 一 0．0022 MMP・10 刀5 9296 12．00 0．0001 MMF・¶3 覇 1357 383 0．0009 縺YP［蛤 P一肌lue x算出濃度が低すぎて計測不能 MMP濃度の単位：pglMIM × 106 cells CsaR高発現HuCCTIの培養上清中のMMP濃度 24hr P［B C崩 F』tio ｾノP［B ρ「旭lue t48 0．0557 1216 869 0．了5 α0167 MMF・3 963 922 0－95 0コ971 MMF・8 344 112了 3．37 O．0041 MMF幽9 6105 6213 1．02 09702 MMP・10 57585 111606 τ．93 oooo1 MMP．13 1409 1636 1．16 O．2063 MMP・1 876蕊 129器6 MMF騨2 MMP濃度の単位＝ pgltnllS × t os cells 表1．C5a刺激24時間後の培養上清剛P濃度 40 6穴プレートにMEC細胞（5×105個）、C5aR高発現HuCCT1細胞（2．5×105個）を入れ FBS（10％）添加RPMI 1640で24時間培養した後、 C5a（100nM）あるいはPBSを添加した RPMI1640に交換して24時間培養した培養上清を測定した。酬P濃度測定にはQuantibody human MMP assay l Kit（RayBiotech社）を用いた。各測定は4穴ずつで行った。 A B MEC C5aR高発現HuOCTl 1 fiOO ＊ 豊暫 2 2 1 1 ⑳ 50 00 50 00 珀 聰■隔一〇馨層0層”｝富LbO』O』蟷』＝り鞠 暫O」一＝O聞」O 鵠一 1ooo t1oo 諺oo 4eo O e cont囮1 Csa csa＋ GM6eOl centrel csa Csa＋ GM6eOl 図20㎜インヒビターによる癌細胞浸潤抑制 MMPインヒビターGM6001（5μM）存在下でMEC細胞、 C5aR高発現HuCCT 1細胞の浸潤活性をマト リゲルチャンバーで測定した。上層に細胞のみまたはGM6001を添加した細胞浮遊液、下層に C5a 100nMまたはPBS（コントロール）を入れた。 A：MEC細胞、 B：C5aR高発現HuCCTI細胞。各測定は3回おこなった。＊P＜0．01 vs C5a 41 7－B－8）癌細胞膜型プロテアーーゼによるC5a産生 癌細胞は宿主細胞と同様に細胞膜表面に補体調節因子（CD46， CD55， CD59など）があり 癌細胞上での補体活性化はおこりにくい（34）。したがって感染性胆管炎など細菌感染 症が合併する状況以外では癌細胞周囲でC5aはほとんど産生されないと考えられる。し かし、癌の微小環境においてC5aが遊離されて癌の増殖に寄与しているとの報告があり （36）、また補体系活性化なしにC5から直接C5aを産生するプロテアーゼも報告されて いる（47－50）。そこで、癌細胞由来のプロテアーゼによってC5からC5a遊離が起こる可 能性について検討した。 MEC細胞またはHuCCT1細胞をC5添加メディウムで培養し、上清中のC5aをウェスタ ンプロット法で検出した。MEC細胞によるC5a遊離は2時間後には認められ、6時間後 に最大となり以後漸次減少した（図21A）。 MEC細胞を24時間培養した上清とC5をイン キュベートしたがC5a遊離は全く検出できなかった（図21A）。 HuCCT1によるC5a遊離 は12時間後から検出され、以後増加した（図21B）。 HuCCT1を24時間培養した上清とC5 をインキュベートしたがC5a遊離は検出されなかった（図21B）。癌細胞はC5からC5aを 遊離できることが明らかになったが、これは癌細胞の分泌プロテアーゼではなくむしろ 細胞膜結合プロテアーゼによることが示唆された。 次にC5a遊離にするプロテアーゼがどのタイプに属するかを調べるために、各種プロ テアーゼ阻害剤（E64：システインプロテアーゼ、アプロチニン：セリンプロテアーゼ、 ペプスタチン：酸性プロテアーゼ、GM6001、フォスフォルアミドン：メタロプロテアー ゼ）の存在下で細胞とC5を反応させ24時間後の培養上清中のC5aをウェスタンプロッ ト法で検出した。これらの阻害剤は細胞毒性のない濃度を使用した（51）。デンシトメト リーでC5aバンドの濃度を計量した結果、アプロチニンによって60％以上の抑制がみら れたが、他の阻害剤では抑制は約30％かあるいは全く抑制を認めなかった（図21C下）。 以上の結果から、癌細胞膜の主にセリンプロテアーゼによってC5からC5aの遊離が引 き起こされていることが示された。 癌細胞のC5a遊離作用が生体で起こっている可能性をさらに探るために、血漿と癌細 胞を反応させ血漿中のC5からC5aを遊離するかを調べた。非特異的な補体系の活性化 を抑えるため、56℃、30分処理で非動化した血漿を用いた。MEC細胞では12時間から C5aが検出され24時間でさらに増加した（図21D上）。HuCCT1細胞では3時間後からC5a がみられ、6時間まで増加しその後はほとんど変わらなかった（図21D下）。アプロチニ ン存在下での癌細胞による血漿からのC5a産生は両者とも抑制された（図21D上、21D 下）。以上の結果から、血漿からも癌細胞膜結合セリンプロテア口脇によってC5a遊離 が引き起こされることが示唆された。 42 B 紬・鱒欄騰・ A 1 00 0 0 0 0 8 6 4 2 開凹C◎1［1噌圃：5 H閲CC1［15凹，。◎C5 §言。遺£‘藍旧コ。」 Q壷耳蝉璽撃墜剛堅ぜ ・・5翼 一 2hr 5hr S2hr 24髄r 48日目 CUF， 24伽r ロ 14 ’閣匠C。C5 MEC 5叩．。C5 2e’5K「躊 @12 糠畿鮭鱒警搬器 0 6◎n財ol E64 ハP F屡F ◎昭 FA c MEC＋plasma ltt．． ．！h 12h 24恥 CVFP 置∵＝‘ けヒマ ロ ヴ ド 2艦5K ur 艦5麗＿三 24駒 24髄 測P C●1書1・， 禰押蹄蝉，蔓ど 実遵輪の一 樽 臨泌、，； 7 曽与 P HuCC11■，1■霞m己 ロ コ 罐繋鎚罵麹 図21 胆管細胞癌細胞株によるC5a遊離 A：C5添加RPMI1640でMEC細胞（上）またはHuCCT 1細胞（下）を2～48時間培養し、培養上清中のC5a をウエスタンプロット法で検出した。また、MEC細胞、 HuCCT 1細胞の24時間培養上清にC5を添加しさら に24時間インキュベートしてC5a遊離を調べた（最右）。ポジティブコントロールとしてCVFP 2plを使 用した。CVFP：CVF処理血漿。 B：（上）各プロテアーゼ阻害剤の存在下でHuCCTI細胞とC5を24時間インキュベートし、上清中のC5a をウエスタンプロット法で検出した。（下）ウエスタンプロットのバンドをデンシトメトリーで濃度を数 値化した。プロテアーゼ阻害剤非処理のものを100％として、それぞれの阻害剤共存下によるバンドの濃 度を比で表示した。3回測定しその平均値を示した。AP：アプロチニン、 PEP：ペプスタチン、 GM：GM6001、 PA：フォスフォルアミドン。＊P〈0．01 vs PBS C：56℃、30分間処理で非動化した血漿と癌細胞（上：MEC細胞、下：HuCCTI細胞）をインキュベートし、 血漿中のC5aをウェスタンプロット法で検出した。ポジティブコントロールとしてCVF処理した血漿を使 用した。また、アプロチニン（10μg／m1）存在下で血漿と癌細胞をインキュベートしたもの、血漿のみを 24または48時間インキュベートしたものに対してもウエスタンプロット法を施行した。AP：アプロチニ ン、ce11（一）：血漿のみ。 43 7・B・9）且uCCT1によって遊離されたC5aの癌細胞浸潤充進作用 HuCCT 1細胞によって遊離iされたC5aの癌細胞に対する浸潤充進作用をマトリゲルイン ベージョンチャンバーで測定した。C5添加してHuCCT1細胞を培養するとC5aR高発現型 HuCCT 1細胞の浸潤を約13倍充進ずる作用が出現し、その作用は抗C5a抗体の存在でほ ぼ完全に抑制された（図22）。HuCCT 1細胞やC5のみからはC5aR高発現型HuCCTI細胞の 浸潤を充進ずる作用はみられなかった（図22）。以上の結果から、HuCCT1細胞が遊離し たC5aはC5aR高発現型HuCCTI細胞の浸潤充進作用を発揮することが示された。 昌 1eoo 1600 雷 1400 ：冒12。。 輩一 si e“ eoo 彗 E．e． 600 Z 400 200 0 十 十 H闘COT1 十 es 十 十 十 十 十 十 Anti闘C5己Ah 閥Omal置』G 十 図22HuCCT1細胞とC5との反応液のC5aR高発ij HuCCTI細胞の浸潤充進作用 マトリゲルインベージョンチャンバーの下層にHuCCT1細胞（7．5×104個／ml）を入れ、24時間 FBS（10％）添加RPMI1640で培養した後、 C5（350nM＞を加えたFBS無添加RPMI1640－FBS（一）に 交換し、37℃で24時間培養した。その後、上層にC5aR高発現 HuCCTI細胞（3．75×IO4個／500 μ1）を入れた。37℃24時間静置後、マトリゲル層を超えて浸潤した細胞を浸潤細胞とし、ラ ンダムに5視野選びその平均浸潤細胞数を測定した。また、下層に抗C5a抗体（2．6μg／ml） または非特異的IgG（2．6μg／m1）を添加して同様の測定をおこなった。同実験を3回繰り返し、 その平均を示した。下層にHuCCT1細胞のみを入れた時の浸潤細胞数を100％としてC5やIgG 添加時の浸潤細胞数の比を示す。 ＊P〈0。01vs HuCCT1のみ、＊＊P〈0．01 vs HuCCT1＋C5、＊＊＊N． S． vs HUCCT1＋C5． 44 8．考察 C5aは3つの補体活性経路を介して産生されるC5－convertase（C4b3b2aまたは C3bBb3b）によってC5が限定分解を受けることで遊離される（52，53）。今回の研究から A eromonas sobri∂菌から放出されるプロテアーゼ（ASP）は新しいC5a遊離プロテアー ゼであることが明らかになった。好中球遊走試験（図7）、好中球活性酸素産生（図9）、 血管透過性試験（図10）の結果から、ASPをC5と反応させてできるC5aは生物学的活性 があり、さらにこれらの生物活性はすべてC5aRアンタゴニストで抑制されることから、 ASPによって分解されてできるC5のフラグメントのなかにC5aが存在していることが分 かる。C5aを遊離するにはC5α鎖のアミノ末端側から74番目のArgで切断されること が不可欠であり（2）、ASPはArgのカルボキシル端側を切断しやすいという性質と合致す る（18）。もうひとつのアナフィラトキシンであるC3aは、 C3のArg77のカルボキシ末端 で切断されて遊離され（54）、ASPのArgを切断する特性から考えるとC3aが遊離されて もおかしくないが、図10Bの血管透過性試験で示したようにASPはC3からC3aは遊離 しないようである。ASPは連続した塩基性アミノ酸側鎖のカルボキシル端側を切断しや すい特性をもつケキシンファミリーというプロテアーゼに属する（55）。C3のアミノ酸配 列は一Arg64－Arg65一という配列を有し（54）、おそらくArg77のカルボキシル翠黛を切断 する前にこの部位を切断するためにC3aの遊離がおこらないのではないかと考えられる。 今回の研究で、ASPはヒト血漿においてもC5aを遊離したことから（図11C）、血漿中に はさまざまなプロテアーゼインヒビターが存在するにも関わらずin viVOにおいてもこ の反応が起こりうると思われた。さらに、C5aおよびC5aRとASPを1時間反応させても その活性、機能を失わなかったことから（図12、13）、ASPがC5aとC5aRの結合能を障 害することなくC5a遊離によって好中球の浸潤を促進させていることが推定された。 今回の研究結果から、ASPはAeTomonas感染症のさまざまな症状、病態に関連して いると思われる。ヒスタミンリッチな食物を摂取すると下痢や鼓腸を起こすと報告され ている（56）。またマウスの実験系においてStaphylococous aurθusのべプチドグリカン やヒスタミンを経口摂諏させると小腸内の肥満細胞の脱穎粒がおこり、これが下痢につ ながるとの報告もある（57）。ASP遊離i C5aによって肥満細胞の脱穎粒が血管漏出を起こ した結果からも、加zo馬刀∂∬o房m感染性腸炎の主症状である下痢の一因としてASPの C5a遊離による腸管肥満細胞からのヒスタミン放出が想定される。 Aeromonas皮膚感染や肺炎でおこる肺浮腫では、以前われわれが報告したASPのカ リクレイン・キニン系の活性化による血管漏出作用（17）と今回のC5a産生を介したヒス タミン産生作用が感染部位で相乗的に浮腫を引き起こしている可能性がある。膿瘍形成 はASPのC5a遊離による好中球浸潤作用が原因の1つかもしれない。グラム陰性桿菌感 染においてLipopolysaccharide（LPS）は好中球エラスターゼの放出を促進させること が知られている（58）。したがって、敗血症などの全身感染症へに進展した場合、ASPの C5a遊離を介した好中球活性酸素産生とA． sobn’∂のLPSによるエラスターゼ産生によ って臓器障害が増悪し予後を悪くする可能性もある。また、ASPのプロトロンビンから 45 トロンビンを生成させて凝固を起こす作用（18）やC5aの血管内皮細胞（59）や単球（60）の tissue factorの発現誘導作用から、 A． sobria全身感染症においてASPはトロンビン の産生かつtisseu factor発現促進を起こして凝固誘導さらにはdisseminated intravascular cogulation（DIC）を発症させることも想定される。 補体系は外来微生物に対する宿主側の代表的な防御機構である。補体系活性化に伴 いC5はC5aとC5bに分離され、 C5bはC6～9と結合して膜侵襲複合体を形成し細胞膜に 穴をあけて溶菌する。したがって、ASPが膜侵襲複合体形成を誘導することはAeromonas sobTiaの生存には不利である。しかし、図11Aに示したように、 ASPは2分でC5を細 かいフラグメントに分解しており、C5aを分離してできる残りの分子量約18万Daのフ ラグメントであるC5bは分解されて膜侵襲複合体の形成には至らないようである。敗血 症患者でみられる高い血中濃度のC5aを好中球に暴露するとC5a－C5aRによるシグナル 経路が麻痺して好中球が機能低下を起こす（61）。また、ラット敗血症モデルでは早期に 好中球のC5aRが減少し予後悪化に関係している（62）。 Aθromo∂s・sobriaのASP遊離は過 剰なC5aを産生することにより好中球の機能不全を引き起こし、かつ補体系の殺菌シス テムを破壊するので、生体防御系からの逃避機構として働いているのかもしれない。 本研究では、1）多種の患者癌組織の様々な割合でのC5aR発現（図14）、2）株化胆 管細胞癌細胞、大腸癌細胞のC5aR発現（図15）、3）C5a濃度とC5aR発現量に相関した癌 細胞浸潤充進作用（図18）、4）C5a刺激による癌細胞のアクチン重合および形態変化の 誘導（図19）、5）C5aの癌細胞MMP産生・放出早舞作用（表1，図20）を示し、 C5a－C5aR 系の癌細胞での存在とその会合の癌細胞への作用について初めて明らかにした。 さらに、癌細胞膜結合セリンプロテアーゼのヒト血漿濃度の精製C5からのC5a遊離 という癌細胞独自のC5a遊離機序を見いだし、しかも生理的にC5が存在する血漿を使っ てもこのプロテアs一・・一・ゼの作用が発揮されることを示して、癌細胞による新たなCsa－CsaR システムが生体でも機能している可能性を提示した。この結果は、生体防御に働くと考 えられていた補体系を癌が利用しているという報告（36）を支持し、しかも癌細胞が補体 系に積極的に作用している事象を加えて補体の概念をさらに変えるものである。 C5aで刺激した癌細胞がアクチン重合によってアクチンストレスファイバー、 lamellipodia様構造、 filopodia様構造を形成（図19）する一連の形態変化は細胞の動 きの活発化を反映していると考えられる（44）。またC5a刺激後24時間には線維芽細胞様 の形態変化、細胞間接着の低下とこれによるスキャッタリング（散在化）をともなってい ることから、C5aにより癌細胞が浸潤・転移する時にみられる現象であるepithelial mesenchymal transition（EMT）（63）も誘導されている可能性が示唆されるため、上皮、 間葉マーカーの発現の変化を調べてさらなる検討が必要である。癌細胞が産生・放出す るMMPは間質を構成するコラーゲンなどのタンパク質を分解して癌細胞の浸潤・転移を 促進（45）することが知られており、C5aによるMMP産生画聖（表1）がC5aの癌細胞浸潤 充進作用に寄与していることは、㎜OinhibitorによるC5aの癌細胞浸潤芋餌作用の抑制 （図20）からも明らかである。C5aによる浸潤増強作用はC5aR高発現HuCCT1がC5aR発現の 少ないMECに比べて強かった（図18）にもかかわらずMMP産生量の元進の割合はいずれの 46 MMPにおいてもMECのほうが大きかった（表1）ことから、 C5aR高発現HuCCT1がC5a刺激前 から細胞1個あたりのMMPの産生・放出量がMECに比べて多いので刺激があってもそれ程 充進できないのかもしれない。しかし、MMP産生・放出量の充進が少なかったC5aR高発現 HuCCT1がMECに比較してC5aによる浸潤駅馬が大きかったこと（図18）は、癌浸潤におい てMMPだけでなくC5aによって誘導される運動性の活発化（図19）が重要であることを示 しているのであろう。 胆管細胞癌はその発育に伴い、胆管閉塞を来たすことで胆汁うっ滞から胆管炎を引 き起こすことがある（64）。また原発性硬化性胆管炎は胆管癌または胆管細胞癌を併発す るリスクが高く、また自己免疫抗体により補体系の古典的経路が活性化していることが 報告されている（65）。このような癌を伴う胆管炎において細菌感染や自己免疫抗体によ って補体系が活性化し、胆管細胞癌組織とC5aは容易に接する機会が多いことが推測さ れる。よって生体内においてC5aR発現癌細胞とC5aの結合は十分起こりうる事象である と考えられる。しかし、このような補体系活性化に伴い産生されるC5aとは別に、癌細 胞の膜型セリンプnテアーゼにより直接C5からC5aを遊離することが今回の研究から明 らかになった（図21、22）。膜型セリンプロテアーゼとしてtype II transmembrane serine protease（TTSP）ファミリーがこれまでに20種類同定され、様々な癌種での高発現が報 告されている（66）。TTSPのなかでも代表的であるマトリプターゼ（66）の触媒ドメイン に対する抗体で処理したHuCCT1とC5と反応させて抗C5a抗体によるウェスタンプロット 法でC5a遊離を確認したが、 C5a遊離の低下は認められなかった（データは省略）。今後、 このC5a遊離酵素の同定にはさらなる実験が必要と思われる。仮に正常上皮細胞にこの ようなプロテアーゼが存在しても正常組織では細胞間接着が密であるため高分子であ るC5と反応する可能性は低く、正常細胞のプロテアーゼがC5aを遊離する可能性は殆ど ないと考えられるが、細胞間の接着性が弱く、血管透過性が高まった状態の癌組織では 血管外に漏出したC5と反応しやすく、さらに遊離したC5aが癌細胞のC5aRに結合できる 可能性が高いと思われる。癌細胞膜型押リンプロテアーゼがC5aを遊離すると、同時に 残りのC5bが癌細胞膜上でC6～9と結合して膜侵襲複合体（C5b6789）を形成して癌細胞 傷害を引き起こす（1）可能性がある。しかし、多くの癌細胞膜にはCD59があって （67，68）C9の結合を阻害することで膜侵襲複合体形成を抑制し補体系の攻撃から身を守 っている（68）。また、ASPでみられた様に（69）、 C5aが遊離する前にC5bの内部が数カ所 切断されてC5bが完全な形で遊離されない可能性が高く、癌細胞傷害は誘導されにくい と考えられる。 本来、C5aは好中球、単球、マクロファージといった炎症細胞を動員することで外来 微生物に対し、感染防御機構を発揮する。癌においてその膜型セリンプロテアーゼによ りC5aが産生された場合、このような炎症細胞の浸潤が起こると考えられる。近年、腫 瘍周囲に浸潤するマクロファージをtumor－associated macrophages（TAMs）と呼称して おり、TNF一α、 MMP－9産生、 VFGF産生、 EGF産生などを起こすことで腫瘍の増殖、浸潤、 転移、血管新生に深く関係している（70．71）。また腫瘍に浸潤したTAM数はさまざまな癌 において予後不良因子とされている（72－78）。TAMに対するケモアトラクタントとして 47 CSF－1、 CC一ケモカイン、 MIP－1αなどが報告されているが（72）、癌周囲で産生されうる C5aもTAMのケモアトラクタントの1つとなっている可能性がある。またNozawaらは腫瘍 内に浸潤した好中球はMMP－9を産生し、血管新生を促進させたと報告している（79）。癌 周囲の微小環境において産生されたC5aはmyeloid－drived suppressor cells（MDSCs）を 動員することでCD8＋T－cellの腫瘍免疫を抑制し、腫瘍増大につながるとの報告もある （36）。以上のような事象から、癌に浸潤した炎症細胞は癌の増殖、浸潤、転移を増強さ せているコラボレーターとして機能している可能性がある。今回の研究で示した癌細胞 自身のC5a－C5aRを介した浸潤増強作用に加えて腫瘍を取り巻く免疫細胞も癌の増殖、浸 潤を増強させうることが示唆される。 MMP－arrayの結果、C5aを投与することでコントm一ルと比較しMECにおいては㎜L 10 が12倍、C5aR高発現HuCCT1においては1．93倍の増加が有意差をもって認められた。 MMP－10は別名stromelysin2といわれ、コラーゲン分解のほか、フィブロネクチン、皿 ～V型コラーゲン、ゼラチン、ラミニン，エラスチン、プロテオグリカンの分解、他の procollagenaseの活性化などの機能を有し、癌の細胞外マトリックスへの浸潤を促進さ せる酵素の1つである（80，81）。㎜P－10は乳癌（82）、肺癌（83）、腎細胞癌（84）、胃癌（85） などで高発現しており、乳癌においてはリンパ節転移のrisk factor（82）、肺癌（83）、 胃癌（85）においては予後不良因子の1つといわれている。C5aRとMMP－10の関係に関す る報告は未だないが、C5aRはC5aと結合するとリン酸化酵素であるG－protein coupled receptor kinase（GRK）によるリン酸化を受け、活性化される。 GRKのうちGRK5は㎜）一10 遺伝子転写のアクチベ一挙・一・一一・である（86）転写因子myocyte enhancer factor 2（MEF2） を活性化する（87）。C5aRからのシグナルはおそらくこのようなルートでMMP－10遺伝子 発現を誘導し産生・放出が充進ずるのであろう。 胆管細胞癌は成人の肝原発腫瘍のなかで2番目に多く肝悪性腫瘍の15％を占め、近 年増加傾向にある（88）。肝内胆管から発生するmalignant potentialの高い癌で、早期 から血行性、リンパ行性に転移しやすく、また強いinvasive growthを呈するため、診 断時には既に手術適応外であることが多い。外科的切除ができても5年生存率は20～ 40％と予後は悪く（88，89）、その要因として有効な化学療法も確立されていないことが ある（88，89）。今回の実験結果から、胆管細胞癌のもつ強い浸潤性にC5a－C5aRの関与が 示され、プロテアーゼインヒビターやC5aR拮抗剤、 C5a特異的抗体などが癌の新たな治 療薬として有用であることが想定される。Csa－CsaRは胆管細胞癌のみならず大腸癌、前 立腺癌など他のさまざまな癌種にも発現しており、また感染症にも関わっていることか ら、この治療法は広い応用性が期待される。 48 9．結語 AeTomonas産生プロテアーゼがヒトC5からC5aを遊離し、さまざまな病態に関与してい ることが分かった。また癌細胞がヒトC5を分解、 C5aを遊離し、自身のC5aRと結合する ことでオートクライン的に浸潤能を獲得している可能性が示唆された。しかし、in vi tro での実験であり、in卿。でのさらなる研究が必要と思われる。 今後、加mo囎5感染症患者や癌患者にC5aおよびC5aRが新たな治療ターゲットとなり 効果を得ることを期待している。 49 10．参考文献 1 Guo RF．， and Ward PA． Role of Csa in inflammatory responses． Annu Rev lmaiunol． 2005． 23：821一一852 2 DiScipio RG．， Smith CA．， Muller－Eberhard HJ．， and Hugli TE． The activation of human complement component C5 by a fluid phase C5 convertase． f Biol Chem． 1983． 258： 10629－10636 3 Marder SR．，Chenoweth DE．，Goldstein IM．， and Perez HD． Chemotactic responses of・ human peripheral blood monocytes to the complementderived peptides Csa and C5a des Arg． f lmaunol． 1985．134： 3325－3331． 4 Goldstein IM．， and Weissmann G． Generation of C5－derived lysosomal enzyme releasing activity （C5a） by lysates of leukocyte lysosomes． ノ’Jmamunol． 1974． 113：． 1583－1588． 5 Sack T．， Moldow CF．， Craddock PR．， Bowers TK．， and Jaeob HS． Oxygen radicals mediate endothelial cell damage 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