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ハイスループット mRNA ノーザンブロットで各遺伝子の検出限界はどのくらいか？
単位面積あたりに使用されるプローブの量は，従来のノーザンブロットの場合と同じく，比較的
多く発現しているβ-アクチン遺伝子で 10∼100 ng だが，このブロットはかなり小さいため，プロ
ーブの必要量も非常に少なくなる．
ハイスループット mRNA ノーザンブロットで繰り返し使用は何回まで可能か？
約 3 回はリプロービングできる．発現量の多い遺伝子については，回数は多くなる．
ハイスループット mRNA ノーザンブロットでリプロービングを行う場合，ストリッピング 1 回あ
たりどのくらいの mRNA が剥がれるのか？
1 回あたり約 10∼20％剥がれる．
ハイスループット mRNA ノーザンブロットに使用されているナイロン膜の大きさは？
47 x 26 mm
ハイスループット mRNA ノーザンブロットのロットサイズは？
少なくとも数百枚である．それぞれの組織について，ある特定のドナー由来 mRNA がなくなるま
で製造に使用され続ける．
ハイスループット mRNA ノーザンブロットで，ハイブリダイゼーションを行う際の留意点は？
ブロットをハイブリ用チューブ(直径 3 cm)に入れ，RNA ブロット面が内側に向いて回転(非ブロッ
ト面はチューブ壁に付着)するよう，ハイブリ用オーブンにセットする．
ハイスループット mRNA ノーザンブロットで適切なバイブリダイゼーション温度は？
使用するバッファーによって異なる．ホルムアミドでは 42℃，BioChain 社製の FastHyb
Hybridization Solution (7. Kit & Reagent 参照)の場合は 65℃である．
mRNA / Total RNA ノーザンブロット，mRNA / Total RNA アレイの使い分けは？
いずれの製品も目的遺伝子の組織間における発現を比較するときに用いる．mRNA ノーザンブロ
ットはプローブと mRNA とのハイブリを検出する．Total RNA ブロットでは，rRNA や tRNA が多
く含まれており mRNA 量は少なくなるため，感度が低いことになる．目的遺伝子の発現量が多い
場合は Total RNA ブロットで問題ないが，発現量が少ない場合は mRNA ブロットの使用をお勧め
する．RNA アレイはノーザンブロットよりも多種類のサンプルが載っているため，一度に多種の
組織をスクリーニングできるのが特長である．Total RNA ブロット／アレイの方が mRNA ブロッ
ト／アレイより低価格である．
mRNA ノーザンブロットの NBA と NBE の使い分けは？
NBA (Normalized By Amount of mRNA)は，各組織由来 mRNA を絶対量で標準化した製品で，NBE
(Normalized By beta-actin Expression)は，各組織由来 mRNA をβ-アクチン遺伝子の発現量で標準
化した製品である．β -アクチンは，組織に関係なく発現しているハウスキーピング遺伝子で，標
準化によく使用されている．NBE ブロットでは，β -アクチン mRNA が各組織に一定量含まれてい
るので，β -アクチンのバンドの濃さを基準にして，目的の遺伝子の発現量を組織間で比較するこ
とができる．一方，NBA ブロットでは，mRNA 量の絶対量で標準化しており，検出したバンドが
各組織での発現量を反映していないため，リプロービングにより，β-アクチンや GAPDH のプロ
ーブを用いた検出を行って補正する必要があるが，NBE ではその必要がない．NBA は，目的遺伝
子が発現しているかどうかの確認試験に適している．
ノーザンブロットで使用可能なプローブは？
cDNA プローブだけでなく，RNA プローブも使用することができる．
ノーザンブロットで適切なバイブリダイゼーション温度は？
使用するバッファーによって異なる．ホルムアミドでは 42℃，BioChain 社製の FastHyb
Hybridization Solution (7. Kit & Reagent 参照)の場合は 65℃である．
mRNA ノーザンブロットで各遺伝子の検出限界はどのくらいか？
比較的多く発現しているβ-アクチン遺伝子で 10∼100 ng のプローブが必要である．
mRNA ノーザンブロットで繰り返し使用は何回まで可能か？
少なくとも 5 回はリプロービングできる．
mRNA ノーザンブロットでリプロービングを行う場合，1 回あたりどのくらいの mRNA が剥がれ
るのか？
サンプルにもよるが，1 回あたり約 10％剥がれる．Clontech 社の相当製品よりは耐久性が高い．
Total RNA ノーザンブロットは繰り返して使用できるか？
可能だが，多くて 3 回程度である．Total RNA に含まれる mRNA は少量で，ストリッピングで多
くが剥がれるため，mRNA ノーザンブロットに比べて繰り返し使用回数は劣る．
ノーザンブロットでリプロービングを行う場合のストリッピング方法は？
0.5% SDS 中で 1∼5 分間煮沸後，室温に放置．0.05X SSC/0.1% SDS 中で約 5 分間煮沸後，イメージ
ングプレートによりプローブが除去されたかどうかを確認してもよい．
ノーザンブロットに使用されているナイロン膜は何か？
Amersham 社製の Hybond N+ (Positively Charged Nylon Membrane)が使用されている．
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ノーザンブロットに使用されているナイロン膜の大きさは？
mRNA ブロットでは
8 レーンの製品：70 x 55 mm
6 レーンの製品：70 x 45 mm
5 レーンの製品：70 x 40 mm
4 レーンの製品：70 x 30 mm
Total RNA ブロットでは
8 レーンの製品：70 x 55 mm
Total RNA ノーザンブロットに添付されているコントロールプローブが，18S ribosomal RNA に対
する cDNA であるのはなぜか？
Pancreas (膵臓)組織には RNase が多量に存在し，その RNA の品質を保証するために 18S
ribosomal RNA を指標としている (18S ribosomal RNA は非常に分解されやすい RNA であるため)．
仮に Total RNAノーザンブロットで GAPDH やβ-actin のプローブを用いて検出しようとした場合，
mRNA のバンドが見られないことも考えられる．
mRNA ノーザンブロットで，2004-2005 カタログ p. 42 の Fig 3.4 の各ブロットの lane 1 (Heart)に
バンドが 2 つ検出されている．BioChain 社は下のバンドで標準化を行っているが，一方，Clontech
社では上のバンドで標準化している．どちらが正しいのか？
2 つのバンドともβ-アクチンであるため，どちらも正しい．要望に応じて，どちらのバンドでも
標準化可能であるが，研究には大差はない．(BioChain 社の見解)
(補足)
心筋などでは，β-アクチン以外に筋肉型アクチン(α-，γ-アクチン)が多く発現しており，β-ア
クチンと相同性が高く，β-アクチンプローブで検出されてしまう．BioChain 社によると，検出さ
れているバンドはすべてβ-アクチンだそうだが，β-アクチンの分子量は上のバンドに相当するた
め，下のバンドは他のアクチンである可能性が高い．
mRNA ノーザンブロットで，2004-2005 カタログ p. 42 の Fig 3.7 では，どのような検出系を用いて
いるのか？
β-actin の標識には，Amersham 社製 CDP-start Ap system (Non-RI 検出系)を使用している．
ノーザンブロットで，製品の引用文献や他社との比較データはあるのか？
Int. J. Cancer, 78, 95 (1998)にヒト腫瘍組織由来 Total RNA ノーザンブロットを使用したデータが
掲載されているが，目下，これ以外の文献は不明である．また，2004-2005 カタログ p. 42 の Fig 3.7
が他社のノーザンブロットとの比較データである．
RNA アレイで使用可能なプローブは？
cDNA プローブだけでなく，RNA プローブも使用することができる．
RNA アレイで適切なバイブリダイゼーション温度は？
使用するバッファーによって異なる．ホルムアミドでは 42℃，BioChain 社製の FastHyb
Hybridization Solution (7. Kit & Reagent 参照)の場合は 65℃である．
RNA アレイに使用されているガラススライドの大きさは？
96 スポットの製品：115 x 75 mm
RNA アレイのどちらの面にサンプルがスポットされているのか？
カットされている角を左上にして置いた時，上面にスポットされている．
RNA アレイに使用されている Soft Tissue (軟組織)はどの部位か？
ロットによって異なる．例えば，大腿組織や心臓の心膜組織など．
RNA アレイで，非放射性(non-RI)プローブを用いて検出したデータはあるのか？
BioChain 社では，品質管理試験の一環として，18s rRNA の非放射性プローブでハイブリしており，
2004-2005 カタログ p. 51 の Fig 3.12 がそのデータである．
組識からどのくらいの量の Total RNA を抽出できるのか？
組識によって収量は異なる．一般的には，組織 1 g あたり約 1 mg である．
マウスの脂肪組識からどのくらいの量の Total RNA を抽出できるのか？
脂肪組織 1 g あたり約 0.1 mg で，他の組織の収量の 1/10 である．BioChain 社では，20 匹のマウ
スから集めた脂肪組織を用いて製品を製造する．その場合，20 匹のマウスから約 5 g の脂肪組織
が採取できるため，約 0.5 mg の Total RNA が得られるが，マウスの個体によって収率は大きく変
動する．
組識からどのくらいの量の mRNA を抽出できるのか？
組識によって収量は異なる．一般的には，組織 1 g あたり約 10 ug である．脂肪など幾つかの組
織では，収量はもっと低くなる(脂肪組織 1 g から得られる mRNA は< 0.9 ug)．
Total RNA を調製する際にゲノム DNA は除去されているのか？
DNase I 処理によりゲノム DNA は除去されており，PCR で DNA フリーであることが確かめられ
ている．ただし，Human Tumor Tissue Total RNA Matched Pair (5. Matched Product 参照)につい
ては，低収量のため，精製工程において DNase 処理は行われない．PCR の条件は以下のとおりで，
β-アクチン遺伝子を検出する．
温度，時間，サイクル数：
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1. 95℃ 2 min
2. 95℃ 30 sec 35 cycles
55℃ 45 sec
72℃ 30 sec
3. 72℃ 10 min (Extension)
Total RNA の品質はどのように試験しているのか？
(1) アガロースゲル上で 18S rRNA と 28S rRNA の電気泳動像を視認(規格値：28s/18s＞1)．28S/18S =
2 なら高純度，28S/18S < 0.5 なら Total RNA の分解が進行していることを意味する．この時，mRNA
はバンドとしては検出されず，スメアーな像になり，mRNA 量が多いとレーンが白くなる．
(2) 分光光度計で純度確認(規格値：A260/A280＝1.8∼2.0)．
(3) DNase 処理後，PCR で DNA フリーの RNA 増幅を確認．
(4) この RNA をテンプレートとして，cDNA が首尾よく合成されることを確認．
mRNA 中にはどれくらいの rRNA が含まれているのか？
約 5∼10%含まれている．rRNA フリーの mRNA 製品は製造不可能である．
mRNA 製品には，分解を防ぐために何か添加されているのか？ Clontech 社の mRNA 製品にはマ
ウス由来の rRNA が添加されているが．
添加剤は使用していない．
Universal Total RNA に使用されているドナーの年齢，性別，人種(系統)は？
これらのドナー情報を提供することはできない．
ハイスループット mRNA ノーザンブロット設計のカスタムサービスはできるか？
別の種類の組織由来 mRNA を含むブロットは，最低注文量 100 個で特注製造可能．従来のノーザ
ンブロットとは違って製造費用が高いため．
ハイスループット mRNA ノーザンブロットの品揃え予定は？
マウスやラットなど，他の組織由来 mRNA を含むブロットが発売予定である．
ノーザンブロット設計のカスタムサービスはできるか？
可能．mRNA ブロットの NBA は 3 ug 以上/レーンで注文．
mRNA ノーザンブロットの NBE で，GAPDH 遺伝子の発現量で標準化したものは製造可能か？ 同
じハウスキーピング遺伝子の中でも，β -アクチンは各組織において一定レベルで発現しておらず，
標準化用の遺伝子として適さないという意見もあるが．
カスタムサービス可能．参考までに，β-アクチンは生体内で高レベルで発現しているのに対し，
GAPDH は中レベル，Clathrin は低レベルで発現している遺伝子である．
カタログ非掲載の組織由来 RNA 調製のカスタムサービスはできるか？
可能．
細胞質由来の RNA を抽出できるか？
カスタムサービス可能．RNase 阻害剤を大量に使用するため高価になる．BioChain 社では，細胞
質 RNA 抽出法を開発中である．
血液由来の RNA を抽出できるか？
Total RNA はカスタムサービス可能．米国の血液銀行では，毎回ドナー1 人あたりから血液を 25
∼30 mL だけ採取するのが標準的であり，血液から抽出できる RNA の収量は低いため，mRNA の
製造はできない．
マウス／ラット Dorsal Root Ganglion (後根神経節)組織由来の RNA は供給可能か？
マウス／ラットの後根神経節組織は極めて小さいため，高品質 RNA を 製 造 す る の は 困 難 で あ る ．
マウス／ラット Spinal Cord (脊髄)組織由来の RNA は供給可能か？
マウス／ラットの脊髄組織は極めて小さいため，十分量の RNA を製造するのは困難である．
ビーグル犬組織由来の製品は供給可能か？
RNA および cDNA は供給可能である．
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