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SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0
SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 英語版 Version 1.0 対応 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 もくじ 1. 必要機器・試薬 ............................................................................................................................................... 3 1.1. SeqCap RNA Enrichment Kit ............................................................................................................... 3 1.2. Roche から販売されている関連試薬・消耗品 ....................................................................................... 4 1.3. 一般研究用試薬・消耗品 ........................................................................................................................ 5 1.4. 一般実験機器 .......................................................................................................................................... 6 2. はじめに .......................................................................................................................................................... 7 2.1. ワークフロー .......................................................................................................................................... 7 2.2. 本マニュアルで使用されている用語 ...................................................................................................... 8 3. 実験の前に ...................................................................................................................................................... 9 4. ライブラリ調製 ............................................................................................................................................. 10 4.1. Index アダプターの溶解 ....................................................................................................................... 10 4.2. RNA サンプルの品質確認 ..................................................................................................................... 12 4.3. ライブラリ調製用の各反応マスターミックスの準備 ........................................................................... 13 4.4. total RNA サンプル への ERCC RNA Spike-In Mix の添加 ................................................................ 14 4.5. ERCC RNA Spike-In Mix 入り total RNA サンプルの断片化 .............................................................. 15 4.6. 1 本鎖・2 本鎖 cDNA 合成反応と精製 ................................................................................................. 16 4.7. A-テーリング反応 ................................................................................................................................. 19 4.8. アダプターライゲーション反応............................................................................................................ 19 4.9. ライゲーション反応後の精製 ............................................................................................................... 21 5. Pre-Capture LM-PCR 反応と反応産物の精製 .............................................................................................. 25 5.1. Pre-Capture LM-PCR の準備 ............................................................................................................... 25 5.2. Pre-Capture LM-PCR 増幅 .................................................................................................................. 26 5.3. Pre-Capture LM-PCR 産物の精製 ....................................................................................................... 26 5.4. Pre-Capture LM-PCR 産物の品質確認 ................................................................................................ 29 6. ハイブリダイゼーション............................................................................................................................... 30 6.1. SeqCap RNA プローブプール の分取および保存 ................................................................................ 30 6.2. Pre ライブラリプール溶液の準備 ........................................................................................................ 31 6.3. SeqCap HE オリゴの準備 .................................................................................................................... 32 6.4. SeqCap HE オリゴプール溶液の調製 .................................................................................................. 32 6.5. ハイブリダイゼーションの準備と開始 ................................................................................................. 35 7. 洗浄と回収 .................................................................................................................................................... 39 7.1. 洗浄用バッファーの準備 ...................................................................................................................... 39 7.2. Capture Beads の準備 ......................................................................................................................... 40 7.3. Capture Beads とハイブリダイゼーション DNA の結合 .................................................................... 42 7.4. cDNA が結合した Capture Beads の洗浄 ........................................................................................... 43 8. Post-Capture LM-PCR 反応と反応産物の精製 ............................................................................................ 46 8.1. Post-LM PCR オリゴの準備................................................................................................................. 46 8.2. Post-LM PCR の準備 ........................................................................................................................... 47 8.3. Post-Capture LM-PCR 増幅 ................................................................................................................ 48 8.4. Post-Capture LM-PCR 産物の精製 ..................................................................................................... 49 8.5. Post-Capture LM-PCR 産物の品質確認 .............................................................................................. 52 9. 付録 ............................................................................................................................................................... 53 9.1. ERCC RNA Spike-In Mix によるキャプチャーパフォーマンスの検証 ................................................ 53 9.2. トラブルシューティング ...................................................................................................................... 56 2 / 59 もくじ SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 1. 1.1. 必要機器・試薬 SeqCap RNA Enrichment Kit 構成品 SeqCap RNA プローブ プール CD / DVD ・ 備考 lncRNA, Choice, Choice XL, Developer などのプローブ プール溶液 デザイン情報・アノテーション情報が記載されたファイル (.bed ) や ユーザーズガイド (.pdf) が保存されています。 拡張子 bed のファイルは、UCSC ゲノムブラウザ (http://genome.ucsc.edu/) または Roche NimbleGen SignalMap ソフトウェア v2.0 以降 (www.nimblegen.com/products/software/signalmap/) で内容を確認できます。 3 / 59 1.1 SeqCap RNA Enrichment Kit SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 1.2. Roche から販売されている関連試薬・消耗品 試薬・消耗品 品番 仕様 07277261001 24 反応 07277253001 96 反応 SeqCap Adapter Kit A 07141530001 各 96 反応 SeqCap Adapter Kit B 07141548001 (12 インデックス × 8 反応) 05634261001① 24 反応 05634253001 96 反応 07145594001② 24 反応 06776345001 96 反応 SeqCap HE-Oligo Kit A 06777287001③ 各 96 反応 SeqCap HE-Oligo Kit B 06777317001 (12 インデックス × 8 反応) SeqCap Pure Capture Bead Kit 06977952001④ 24 反応 PCR grade water 03315843001 4 x 25 ml KAPA Stranded RNA-Seq Library Preparation Kit 備考 いずれか SeqCap Hybridization and Wash Kit 注） いずれか いずれか SeqCap EZ Accesory Kit v2 注） 注）ハイブリダイゼーションおよびシークエンシングランの計画に従い、SeqCap Adapter Kit A を使用す る場合には SeqCap HE-Oligo Kit A を、SeqCap Adapter Kit B を使用する場合には SeqCap HEOligo Kit B をそれぞれご準備ください。 ①∼④）これらの試薬はセットキットとしてもご購入いただけます。 試薬・消耗品 品番 仕様 備考 SeqCap EZ Reagent Kit Plus 06953247001 24 反応 (①+②+③+④) 注１） SeqCap EZ Reagent Kit 06953212001 24 反応 (①+②+③) 注２） P P 注１）本キットは、① SeqCap Hybridization and Wash Kit (05634261001) と、② SeqCap EZ Accessory Kit v2 (07145594001) 、③ SeqCap HE-Oligo Kit A (06777287001) 、④ SeqCap Pure Capture Bead Kit (06977952001) の４種類のキットがセットになったキットになります。 注２）本キットは、① SeqCap Hybridization and Wash Kit (05634261001) と、② SeqCap EZ Accessory Kit v2 (07145594001) 、③ SeqCap HE-Oligo Kit A (06777287001) の３種類のキットがセットになっ たキットになります。 4 / 59 1.2 Roche から販売されている関連試薬・消耗品 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 1.3. 一般研究用試薬・消耗品 機器 販売元 品番 備考 Agilent DNA 1000 Kit Agilent 5067-1504 1 kit (25 chips) Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent 5067-1511 1 kit (25 chips) Agencourt AMPure XP reagent Beckman Coulter A63880 A63881 A63882 5 ml 60 ml 450 ml ERCC RNA Spike-In Mix Life Technologies 4456740 1 kit Ethanol, 200 proof (absolute), for molecular biology Sigma-Aldrich E7023-500ML 500 ml TE Buffer, 1 X Solution pH 8.0, Low EDTA Affymetrix USB 75793 100 ml 10mM Tris-Hcl pH8.0 指定なし チューブ類 指定なし フィルターチップ 指定なし 0.2 ml / 1.5 ml 5 / 59 1.3 一般研究用試薬・消耗品 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 1.4. 一般実験機器 機器 販売元 DNA 遠心濃縮機 (1.5 ml チューブが使用可であること) 指定なし DynaMag-2 Magnet (16 x 1.5 ml tube holder) Life Technologies 12321D DynaMag-96 Side Magnet Life Technologies 12331D ヒートブロック 指定なし ウォーターバス または オーブン (インキュベーター) 指定なし 1.5 ml チューブ遠心機 (16,000 x g で遠心できること) 指定なし Spectrophotometer NanoDrop Bioanalyzer 2100 Agilent サーマルサイクラー 指定なし ボルテックス ミキサー 指定なし ピペッター 一式 (2-1000 μl) 指定なし 6 / 59 1.4 一般実験機器 品番 ND-1000 以降 備考 オプショナル SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 2. はじめに 本マニュアルでは、SeqCap RNA Enrichment System を用いた、シングルもしくはマルチプレックスの cDNA サンプル ライブラリのキャプチャー手順を示しています (下図ワークフロー)。本マニュアルに従っていただくこ とで、Illumina 社製シークエンサーにて直接シークエンシング可能なキャプチャーされた cDNA 断片が調製され ます。 Note：本プロトコールは SeqCap RNA Enrichment System の全ての製品群に適用可能です。 お使いのマニュアルが最新のものかどうかにつきましては、www.nimblegen.com/lit/ でご確認ください。 2.1. ワークフロー SeqCap RNA Enrichment System を用いた実験の大まかな流れは以下の様になります： ① KAPA Stranded RNA-Seq Library Preparation Kit を用いて cDNA サンプル ライブラリを準備・増幅 ② SeqCap RNA プローブと cDNA サンプル ライブラリとをハイブリダイゼーション ③ SeqCap Hybridization and Wash Kit を用いてキャプチャーされたサンプルを回収 ④ キャプチャーされたサンプルを増幅 ⑤ Illumina 社製シークエンサーを用いてキャプチャー・増幅された cDNA 断片をシークエンシング 図 1 は上記一連の実験のワークフローになります。 各ステップ横に記載されている所要時間は、1 キャプチャー反応を実施する場合を想定しています。各ステップ の所要時間の間に記載されている時間はインキュベーション時間を示しています。 手順 所用時間 ライブラリの準備 (KAPA Stranded RNA-Seq Library Preparation Kit） 6 時間 LM-PCRによるサンプル ライブラリの増幅 2 時間 増幅したサンプル ライブラリを混合 （マルチプレックスでキャプチャーを実施する場合のみ） 0.5 時間 ハイブリダイゼーションの準備 1 時間 16 ∼ 20 時間 インキュベーション 洗浄とキャプチャーされたDNAの回収 2 時間 LM-PCRによるキャプチャーされたDNAの増幅 3 時間 シークエンシングへ 図 1：SeqCap RNA 実験のワークフロー 7 / 59 2.1 ワークフロー SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 2.2. 本マニュアルで使用されている用語 LM-PCR： Ligation Mediated PCR の略。本マニュアルでは、シークエンシングアダプターに相補的なプライマーを使用し た PCR を指します。 シークエンス キャプチャー (キャプチャー)： cDNA からターゲットとした領域を濃縮する実験。本マニュアルでは、増幅したサンプル ライブラリと SeqCap RNA プローブ プールとのハイブリダイゼーションと、それに続く洗浄の工程を指します。 SeqCap RNA Enrichment Kit (プローブ プール)： シークエンス キャプチャーを実施する為の Roche NimbleGen から供与されるビオチンが付与された長鎖のオリ ゴヌクレオチドのセットが混合された溶液。製品名：SeqCap lncRNA Enrichment Kit や SeqCap RNA Choice Enrichment Kit、SeqCap RNA Choice XL Enrichment Kit、SeqCap RNA Developer Enrichment Kit。 サンプル ライブラリ： 断片化した RNA から調製した cDNA にシークエンシングのプラットフォームに即した特異的リンカーがライゲ ーションされたライブラリ。本マニュアルでは、シークエンス キャプチャー前に LM-PCR で増幅される前の状 態を指します。 Pre-Capture LM-PCR 産物 (シークエンスキャプチャー前の増幅されたサンプル ライブラリ)： LM-PCR によりシークエンスキャプチャー前に増幅されたサンプルを指します。 Pre ライブラリプール： 複数の Pre-Capture LM-PCR 産物を混合した、シークエンスキャプチャー前のサンプルを指します。 Post-Capture LM-PCR 産物： キャプチャー済み cDNA サンプルを LM-PCR により増幅したサンプル。シークエンシング反応に進めるサンプ ルを指します。 8 / 59 2.2 本マニュアルで使用されている用語 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 3. 実験の前に ・ サーマルサイクラーにプログラムを入力しておきます。プログラムは下記の箇所に記載されています。 4章5項③ (15 ページ) 4章6項③ (16 ページ) 4章6項⑥ (17 ページ) 4章7項③ (19 ページ) 4章8項⑤ (21 ページ) 5章2項 (26 ページ) 6章5項⑬ (38 ページ) 8章3項 (48 ページ) ・ SeqCap RNA プローブ プールの保存方法に関しては、6 章 1 項 (30 ページ) を参照ください。 ・ 下記試薬は使用するまで -15 ∼ -25 ℃ で保存します。 KAPA Stranded RNA-Seq Library Preparation Kit SeqCap Adapter Kit A / B SeqCap Hybridization and Wash Kit SeqCap EZ Accessory Kit v2 SeqCap HE-Oligo Kit A / B ・ (Roche, 07277261001 or 07277253001) (Roche, 07141530001 and/or 07141548001) (Roche, 05634261001 or 05634253001) (Roche, 07145594001 or 06776345001) (Roche, 06777287001 and/or 06777317001) 下記試薬は使用するまで +2 ∼ +8 ℃ で保存します。 SeqCap Pure Capture Bead Kit (Roche, 06977952001) SeqCap Pure Capture Bead Kit は凍結させないでください。 ・ 弊社販売以外の試薬につきましては、各メーカーの指示に従い保管ください。 ・ コンタミネーションの防止のために実験用手袋 (パウダーフリー) を着用してください。 ・ 全ての遠心操作は特に記載の無い限り +15 ∼ +25 ℃ の設定で行ってください。 ・ 96 ウェルプレートとオートメーションシステム (Liquid Handler System) をご利用になる場合、SeqCap RNA Enrichment System User’s Guide (version 1.0) の Appendix B・C をご参照ください。 9 / 59 3 実験の前に SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ライブラリ調製 4. 本章では、KAPA Stranded RNA-Seq Library Preparation Kit と SeqCap Adapter Kit、Life Technologies 社の ERCC RNA Spike-In Mix を用いて 100 ng の total RNA サンプルからサンプルライブラリを調製する方法につい て記載します。 本章は、KAPA Stranded RNA-Seq Library Preparation Kit に付属されるプロトコール (KAPA Stranded RNA-Seq Library Prep Kit Technical Data Sheet, KR0935 ‒ v2.14) に準拠しています。操作方法の詳細や実験を一時中断す るタイミング・方法につきましては、KAPA Library Prep Kit Technical Data Sheet, KR0935 ‒ v2.14 をご参照く ださい。 4.1. Index アダプターの溶解 ① 冷凍保存されている SeqCap Adapter Kit A または B の PCR Grade Water (バイアル “H2O”) を融解します。 ② SeqCap Index Adapter (バイアル “H2O”と”LP1” 以外のバイアル) をスピンダウンします。 SeqCap Adapter Kit B (Roche, 07141548001) SeqCap Adapter Kit A (Roche, 07141530001) バイアル No. 品名 バイアル No. 品名 A2 SeqCap Index Adapter 2 A1 SeqCap Index Adapter 1 A4 SeqCap Index Adapter 4 A3 SeqCap Index Adapter 3 A5 SeqCap Index Adapter 5 A8 SeqCap Index Adapter 8 A6 SeqCap Index Adapter 6 A9 SeqCap Index Adapter 9 A7 SeqCap Index Adapter 7 A10 SeqCap Index Adapter 10 A12 SeqCap Index Adapter 12 A11 SeqCap Index Adapter 11 A13 SeqCap Index Adapter 13 A20 SeqCap Index Adapter 20 A14 SeqCap Index Adapter 14 A21 SeqCap Index Adapter 21 A15 SeqCap Index Adapter 15 A22 SeqCap Index Adapter 22 A16 SeqCap Index Adapter 16 A23 SeqCap Index Adapter 23 A18 SeqCap Index Adapter 18 A25 SeqCap Index Adapter 25 A19 SeqCap Index Adapter 19 A27 SeqCap Index Adapter 27 これらは以降 SeqCap Index Adapter と総称しますが、各 SeqCap Index Adapter # の「#」はイン デックス配列の種類を示す数値が入ります。 10 / 59 4.1 Index アダプターの溶解 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ③ 各 SeqCap Index Adapter のバイアルに、PCR Grade Water (バイアル ”H2O”) を 50μl ずつ添加します。 開封時に乾燥オリゴ DNA 粉末の飛散にご注意ください。 50μl PCR Grade Water (バイアル ”H2O”) ④ 各 SeqCap Index Adapter Vortex などにより十分に溶解させた後、スピンダウンします。10μM の各 SeqCap Index Adapter 溶液が 調製されました。 -15 ∼ -25 ℃ で保存できます。 SeqCap RNA 実験では、4 章 8 項 (20 ページ) に記載のように更に希釈して使用します。 11 / 59 4.1 Index アダプターの溶解 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 4.2. RNA サンプルの品質確認 Agilent BioAnalyzer と RNA 6000 Nano Kit を用いて RNA サンプルの品質を確認します。 高品質なヒト由来 total RNA の場合、2 本の rRNA のピークが僅かなバックグラウンド シグナルと共に検出され ます。研究検体の RNA サンプルとこのようなリファレンス RNA の結果とを比較し、分解が疑われる場合には RNA サンプルを再抽出してください。分解している RNA サンプルでは最適な結果を得られない可能性がありま す。 図 2：高品質なヒト由来 total RNA サンプルの Agilent RNA 6000 Nano chip での泳動結果例 100 ng の total RNA を出発材料とする場合、12.5 ng /μl (100 ng / 8μl) 以上の濃度でご準備くださ い。 高品質な cDNA を十分量得るためには高品質な RNA が必要です。RNase の混入に十分注意して ください。操作中は常に手袋を着用し、作業台や備品は RNase 除去剤で処理してください。 RNase の混入の可能性があるものに触れた場合は手袋を交換してください。使用しない試薬はフ タを閉めるようにしてください。 DNA の混入した RNA や純度の低い組織サンプルから抽出した RNA サンプルは、不正確な結果の 原因となります。 12 / 59 4.2 RNA サンプルの品質確認 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ライブラリ調製用の各反応マスターミックスの準備 4.3. ① 冷凍保存されている KAPA Stranded RNA-Seq Library Preparation Kit から、必要試薬を氷上で融解します。 KAPA Fragment, Prime and Elute Buffer (2X) (4 章 5 項で使用) st KAPA 1 Strand Synthesis Buffer KAPA Script KAPA 2nd Strand Marking Buffer nd KAPA 2 Strand Synthesis Enzyme Mix KAPA A-Tailing Buffer (10X) KAPA A-Tailing Enzyme KAPA Ligation Buffer (5X) KAPA DNA Ligase PCR grade water 必ず氷上で融解、調製を行ってください。 本項 ② ∼ ⑤ のマスターミックスの混合に Vortex は使用しないでください。 一時作業を中断する場合には、2 本鎖 cDNA 合成後に中断してください。その場合のマスターミッ クスの組成については、KAPA Stranded RNA-Seq Library Prep Kit Technical Data Sheet, KR0935 ‒ v2.14 の指示に従ってください。 ② 1 本鎖 cDNA 合成マスターミックスを調製します。 1 本鎖 cDNA 合成マスターミックス 1 反応あたりの容量 8 反応時 24 反応時 96 反応時 1 Strand Synthesis Buffer 11μl 88μl 264μl 1056μl KAPA Script 1μl 8μl 24μl 96μl 12μl (うち 10μl を使用) 96μl 288μl 1152μl 1 反応あたりの容量 8 反応時 24 反応時 96 反応時 31μl 248μl 744μl 2976μl 2μl 16μl 48μl 192μl 33μl (うち 30μl を使用) 264μl 792μl 3168μl st total ③ 2 本鎖 cDNA 合成マスターミックスを調製します。 2 本鎖 cDNA 合成マスターミックス nd 2 Strand Marking Buffer nd 2 Strand Synthesis Enzyme Mix total 13 / 59 4.3 ライブラリ調製用の各反応マスターミックスの準備 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ④ A-テーリング反応マスターミックスを調製します。 1 反応あたりの 容量 8 反応時 (+10%) 24 反応時 (+10%) 96 反応時 (+10%) PCR grade Water 24μl 211.2μl 634μl 2534μl 10X KAPA A-Tailing Buffer 3μl 26.4μl 79μl 317μl KAPA A-Tailing Enzyme 3μl 26.4μl 79μl 317μl 30μl 264μl 792μl 3168μl 1 反応あたりの 容量 8 反応時 (+10%) 24 反応時 (+10%) 96 反応時 (+10%) PCR grade Water 16μl 140.8μl 422μl 1690μl 5X KAPA Ligation Buffer 14μl 123.2μl 370μl 1478μl KAPA T4 DNA Ligase 5μl 44μl 132μl 528μl 35μl 308μl 924μl 3696μl A-テーリング反応マスターミックス total ⑤ ライゲーション反応のマスターミックスを調製します。 ライゲーション反応マスターミックス total 4.4. ① total RNA サンプル への ERCC RNA Spike-In Mix の添加 冷凍保存されている ERCC RNA Spike-In Mix キットから、ERCC RNA Spike-In Mix 1 と Nuclease-free Water を融解します。 ERCC RNA Spike-In Mix は凍結融解を 8 回以上繰り返さないでください。 ② Nuclease-free Water による 10 倍希釈を繰り返し、1000 倍希釈の Spike-In Mix 1 溶液を 調製します。 1μl Spike-In Mix 1 (原液) 1μl 1μl Nuclease-free Nuclease-free Nuclease-free Water 9μl Water 9μl Water 9μl (10 倍希釈溶液) (100 倍希釈溶液) (1000 倍希釈 Spike-In Mix 1 溶液) 1000 倍希釈 Spike-In Mix 1 溶液は用事調製してください。 14 / 59 4.4 total RNA サンプル への ERCC RNA Spike-In Mix の添加 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ③ 2μl の 1000 倍希釈 Spike-In Mix 1 溶液を 100 ng の total RNA に加え、Nuclease-free Water にて 10μl に 調製します (0.2 ml チューブ)。 RNA サンプル + ERCC RNA Spike-In Mix 容量 total RNA 溶液：100 ng 相当 *μl 1000 倍希釈 Spike-In Mix 1 溶液 2μl Nuclease-free Water *μl total 10μl 出発材料が total RNA 100 ng ではない場合 (polyA によりエンリッチされた RNA や rRNA を除い た RNA を使用する場合を含む) は、ERCC RNA Spike-In Control Mixes User Guide を参照して適 切に ERCC RNA Spike-In Mix を添加してください。 ④ 4.5. ① 10 回、ピペッティングすることでよく混ぜます。 ERCC RNA Spike-In Mix 入り total RNA サンプルの断片化 4 章 4 項 ④ の ERCC RNA Spike-In Mix が入った RNA サンプル 10μl に 2x Fragment, Prime and Elute Buffer を 10μl 添加します。 断片化用 RNA 溶液 容量 RNA サンプル + ERCC RNA Spike-In Mix 10μl 2x Fragment, Prime and Elute Buffer 10μl total 20μl ② 氷上に保持したまま、数回のピペッティングでゆっくりとよく混ぜます。 ③ 94 ℃ で 8 分間 インキュベーションします。 20μl 分解していない RNA の使用を推奨しておりますが、部分的に分解されている RNA を使用せざる を得ない場合には、インキュベーション温度と時間を適宜変更してください。 ④ 氷上にサンプルを移し、直ちに次のステップへ進みます。 15 / 59 4.5 ERCC RNA Spike-In Mix 入り total RNA サンプルの断片化 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 4.6. ① 1 本鎖・2 本鎖 cDNA 合成反応と精製 20μl の断片化 RNA 溶液のチューブ (4 章 5 項 ④) に、1 本鎖 cDNA 合成マスターミックス (4 章 3 項 ②) を 10μl 添加します。 1 本鎖 cDNA 合成反応 1 反応あたりの容量 断片化 RNA 溶液 20μl 1 本鎖 cDNA 合成マスターミックス 10μl total 30μl ② 氷上に保持したまま、数回のピペッティングでゆっくりとよく混ぜます。 ③ サーマルサイクラーで下記のプログラムを実行します。 温度 時間 25 ℃ 10 min 42 ℃ 15 min 70 ℃ 15 min 4℃ Hold 30μl ④ 本項 ③ の 1 本鎖 cDNA 合成反応後のチューブに、2 本鎖 cDNA 合成マスターミックス (4 章 3 項 ③) を 30μl 添加します。 2 本鎖 cDNA 合成反応 1 反応あたりの容量 1 本鎖 cDNA 合成反応産物 ⑤ (30μl) 2 本鎖 cDNA 合成マスターミックス 30μl total 60μl 数回のピペッティングでゆっくりとよく混ぜます。 16 / 59 4.6 1 本鎖・2 本鎖 cDNA 合成反応と精製 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ⑥ ⑦ サーマルサイクラーで下記のプログラムを実行します。 温度 時間 16 ℃ 60 min 4℃ Hold 60μl 前項 ⑥ の反応中に精製に必要な下記の試薬の準備をします。 Agencourt AMPure XP reagent を室温に置きます (遅くとも使用する 30 分前)。 80% エタノールを準備します (200μl x サンプル数 x 6 + α)。 Agencourt AMPure XP reagent は凍結させないでください。使用前にメーカー提供のプロトコール をご確認ください。 ⑧ Agencourt AMPure XP reagent を Vortex でよく混合し、108μl を 2 本鎖 cDNA 合成反応後の溶液 (60μl) に添加します。 108μl Agencourt AMPure XP reagent 10 秒間 精製 1 反応あたりの容量 2 本鎖 cDNA 合成反応後溶液 (60μl) Agencourt AMPure XP reagent 108μl total ⑨ 60μl：2 本鎖 cDNA 反応後溶液 168μl ピペッティングでよく混合した後、室温で 15 分間インキュベーションします。 ピペッティング 室温、15 分間 次の操作を 1.5 ml チューブ用のマグネティックラックで行う場合、全量を新しい 1.5 ml チューブ に移します。 17 / 59 4.6 1 本鎖・2 本鎖 cDNA 合成反応と精製 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ⑩ チューブをマグネティックラックに差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸い 取り、除去します。 マグネティックラックの種類により、 凝集箇所が異なる場合もあります ビーズが完全にマグネット側に凝集するまでに必要な時間は、チューブの種類やマグネティックラ ックの種類に依存します。 ⑪ マグネティックラックにチューブを差し込んだまま、80% エタノール 200μl を添加し、そのまま室温で 30 秒間インキュベートします。 200μl 室温、30 秒間 80% エタノール (用時調製) ⑫ 上澄みをピペットで吸い取り、除去します。 ⑬ 本項 ⑪ ∼ ⑫ を繰り返します。 80% エタノールにより合計 2 回洗浄します。 ⑭ チューブの蓋を開けた状態で、エタノールが蒸発するまで室温で乾燥させます。 上澄み除去後にピペットチップを交換してもう一度余分なエタノールを除去すると、乾燥時間を短 縮することができ、また、常に同じ乾燥時間で操作をすることができます。この場合、乾燥時間は 室温で 2 ∼ 3 分間となります。 乾燥させ過ぎは収量の低下につながります。すぐに次の工程に進めてください (37 ℃ での乾燥は 推奨しておりません)。 18 / 59 4.6 1 本鎖・2 本鎖 cDNA 合成反応と精製 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 4.7. ① A-テーリング反応 2 本鎖 cDNA 合成反応後産物 (4 章 6 項 ⑭) に、A-テーリング反応マスターミックス (4 章 3 項 ④) を 30μl 添加します。 A テーリング反応 1 反応あたりの容量 2 本鎖 cDNA 合成反応後産物 (ビーズ) A-テーリング反応マスターミックス total ② 30μl 30μl + ビーズ ピペッティングでよく混合します。 Vortex を使用せずに充分混合してください。 1.5 ml チューブで操作していた場合、全量を新しい 0.2 ml チューブに移します。 ③ サーマルサイクラーで下記のプログラムを実行します。 温度 時間 30 ℃ 30 min 60 ℃ 30 min 4℃ Hold 30μl + ビーズ この反応の間に 4 章 8 項 ① ∼ ② の操作を実施すると作業が効率的です。 アダプターライゲーション反応 4.8. ① 使用する必要試薬を溶解・準備します。 ライゲーション反応に用いる SeqCap Index Adapter 10μM 溶液 (4 章 1 項 ④ で調製したもの) KAPA PEG / NaCl SPRI Solution (4 章 9 項で使用) Elution buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0) (4 章 9 項で使用) 19 / 59 4.7 A-テーリング反応 / 4.8 アダプターライゲーション反応 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ② SeqCap Index Adapter 10μM 溶液を 700 nM となるように希釈します。 SeqCap Index Adapter 希釈溶液 容量 PCR grade Water 9.3μl SeqCap Index Adapter #, 10μM 0.7μl total ③ 10μl A-テーリング反応後産物 (4 章 7 項 ③) に、ライゲーション反応マスターミックス (4 章 3 項 ⑤) を 35μl と 前項 ② で希釈した SeqCap Index Adapter 希釈溶液を 5μl 添加します。 アダプターライゲーション反応 1 反応あたりの容量 (30μl + ビーズ) A-テーリング反応後産物 ライゲーション反応マスターミックス 35μl SeqCap Index Adapter #, 700 nM 5μl 70μl + ビーズ total 出発材料の RNA 量が 100 ng でない場合、ライゲーション反応に用いるアダプター希釈溶液の濃 度や使用容量は適宜調整する必要が有ります。詳しくはトラブルシューティングの項 (9 章 2 項) を 参照ください。 ハイブリダイゼーションおよびシークエンシング時のサンプルの混合計画に従い、サンプル毎にア ダプター溶液を適切な組み合わせで添加してください。 例） SeqCap Index SeqCap Index SeqCap Index SeqCap Index Adapter 2 Adapter 4 Adapter 5 Adapter 6 (バイアル ”A2”) 5μl Sample 1 ④ (バイアル ”A4”) 5μl Sample 2 (バイアル ”A5”) 5μl Sample 3 (バイアル ”A6”) 5μl Sample 4 10 回、ピペッティングで混合します。 Vortex を使用せずに充分混合してください。 20 / 59 4.8 アダプターライゲーション反応 SeqCap Index SeqCap Index Adapter 7 Adapter 16 (バイアル ”A7”) 5μl Sample 5 (バイアル ”A16”) 5μl Sample 6 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ⑤ 20 ℃ で 15 分間、サーマルサイクラーでインキュベーションします。 70μl + ビーズ ヒートリッドはオフにしてください。 4.9. ① ライゲーション反応後の精製 4 章 8 項 ⑤ のチューブ (アダプターライゲーション反応後のビーズ溶液) に、PEG/NaCl SPRI Solution を 70μl 添加します。 70μl PEG/NaCl SPRI Solution アダプターライゲーション後の ビーズ溶液 (70μl) 精製 (1 回目) 1 反応あたりの容量 アダプターライゲーション反応後のビーズ溶液 PEG/NaCl SPRI Solution 70μl total ② (70μl + ビーズ) 140μl + ビーズ ピペッティングでよく混合した後、室温で 15 分間インキュベーションします。 ピペッティング 室温、15 分間 次の操作を 1.5 ml チューブ用のマグネティックラックで行う場合、全量を新しい 1.5 ml チューブ に移します。 ③ チューブをマグネティックラックに差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みから 135μl をピ ペットで吸い取り、除去します。 135μl マグネティックラックの種類により、 凝集箇所が異なる場合もあります 21 / 59 4.9 ライゲーション反応後の精製 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ④ マグネティックラックにチューブを差し込んだまま、80% エタノール 200μl を添加し、そのまま室温で 30 秒間インキュベートします。 200μl 室温、30 秒間 80% エタノール (用時調製) ⑤ 上澄みをピペットで吸い取り、除去します。 ⑥ 本項 ④ ∼ ⑤ を繰り返します。 80% エタノールにより合計 2 回洗浄します。 ⑦ チューブの蓋を開けた状態で、エタノールが蒸発するまで室温で乾燥させます。 上澄み除去後にピペットチップを交換してもう一度余分なエタノールを除去すると、乾燥時間を短 縮することができ、また、常に同じ乾燥時間で操作をすることができます。この場合、乾燥時間は 室温で 2 ∼ 3 分間となります。 乾燥させ過ぎは収量の低下につながります。すぐに次の工程に進めてください (37 ℃ での乾燥は 推奨しておりません)。 ⑧ チューブをマグネティックラックから外し、Elution buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0) を 50μl 添加し、ピペ ッティングでよく懸濁します。 50μl Elution buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0) ⑨ 室温で 2 分間、インキュベートします。 室温、2 分 22 / 59 4.9 ライゲーション反応後の精製 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ⑩ 前項のチューブに、PEG/NaCl SPRI Solution を 50μl 添加します。 50μl 精製 (1 回目) 後の ビーズ溶液 (50μl) PEG/NaCl SPRI Solution 精製 (2 回目) 1 反応あたりの容量 精製 (1 回目) 後のビーズ溶液 PEG/NaCl SPRI Solution 50μl total ⑪ 100μl + ビーズ ピペッティングでよく混合した後、室温で 15 分間インキュベーションします。 ピペッティング ⑫ (50μl + ビーズ) 室温、15 分間 チューブをマグネティックラックに差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みから 95μl をピペ ットで吸い取り、除去します。 95μl マグネティックラックの種類により、 凝集箇所が異なる場合もあります ⑬ 本項 ④ ∼ ⑤ を 2 回繰り返します。 80% エタノールにより合計 2 回洗浄します。 ⑭ チューブの蓋を開けた状態で、エタノールが蒸発するまで室温で乾燥させます。 上澄み除去後にピペットチップを交換してもう一度余分なエタノールを除去すると、乾燥時間を短 縮することができ、また、常に同じ乾燥時間で操作をすることができます。この場合、乾燥時間は 室温で 2 ∼ 3 分間となります。 乾燥させ過ぎは収量の低下につながります。すぐに次の工程に進めてください (37 ℃ での乾燥は 推奨しておりません)。 23 / 59 4.9 ライゲーション反応後の精製 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ⑮ チューブをマグネティックラックから外し、Elution buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0) を 22.5μl 添加し、ピ ペッティングでよく懸濁します。 22.5μl Elution buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0) ⑯ 室温で 2 分間、インキュベートします。 室温、2 分 ⑰ チューブをマグネティックラックに差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みから 20μl をピペ ットで吸い取り、新しい PCR チューブ (0.2 ml) に移します。 20μl 22.5μl ⑱ 新しい PCR チューブ (0.2 ml) 20μl のライブラリ溶液が調製されました。 4 ℃ で 1 週間、または -20 ℃ で 1 か月間保存できます。 24 / 59 4.9 ライゲーション反応後の精製 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 Pre-Capture LM-PCR 反応と反応産物の精製 5. 本章では、KAPA Stranded RNA-Seq Library Preparation Kit の構成品である KAPA Library Amplification Primer Mix (10X) と KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) を用い、4 章で調整したライブラリを増幅します。増幅後の溶 液は SeqCap Pure Capture Bead Kit の構成品である AMPure XP Beads (または QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, 28106) ) を用いて精製を行います。 Pre-Capture LM-PCR の準備 5.1. ① 必要試薬とサンプル溶液を氷上で融解します。 サンプルライブラリ溶液 (20μl) (4 章 9 項 ⑱) KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) KAPA Library Amplification Primer Mix (10X) ネガティブ、ポジティブコントロール を同時に調製していただくことをお奨めします。ネガティ ブコントロールとしては PCR grade water を、ポジティブコントロールとしては以前に増幅が確 認されているライブラリ溶液をご利用ください。 Pre-Capture LM-PCR マスターミックス 1 反応あたりの容量 2X KAPA HiFi HotStart ReadyMix 25μl 10X KAPA Library Amplification Primer Mix 5μl total 30μl KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) および本試薬を含む溶液は温度に対して敏感です。必ず氷上で 融解、調製を行ってください。 マスターミックスの容量の算出には、ピペッティング誤差を見込んで上記容量に 5% 程度を増量し て計算してください。 ② マスターミックスをピペッティング 10 回により混合し、スピンダウンします。 Vortex を使用せずに充分混合してください。 ③ サンプルライブラリ溶液 (20μl) に、 Pre-Capture LM-PCR マスターミックスを 30μl 添加します。 30μl 20μl：サンプルライブラリ溶液 (または) PCR grade water Pre-Capture LM-PCR マスターミックス ④ ピペッティングによりよく混合します。 Vortex を使用せずに充分混合してください。 25 / 59 5.1 Pre-Capture LM-PCR の準備 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 Pre-Capture LM-PCR 増幅 5.2. サーマルサイクラーで下記のプログラムを実行します。 温度 時間 98 ℃ 45 sec 98 ℃ 15 sec 60 ℃ 30 sec 72 ℃ 30 sec 72 ℃ 5 min 4℃ Hold サイクル 11 サイクル 50μl SeqCap RNA プローブプールとのハイブリダイゼーションには本反応産物を 1μg 使用します。こ のため、初発サンプルである RNA の品質と量によってはサイクル数を増やす必要がある場合があ りますが、PCR サイクル数を増やすとシークエンスリードの重複率が増加する危険性が増加しま す。逆に、一貫して 1μg 以上の増幅産物が得られる場合にはサイクル数を減らすことも可能で す。 Pre-Capture LM-PCR 産物の精製 5.3. ① 必要な試薬の準備をします。 SeqCap Pure Capture Bead Kit の AMPure XP Beads (ボトル ②) を室温に置きます。 (遅くとも使用する 30 分前)。 PCR Grade Water (バイアル “H2O”) を融解します。 80% エタノールを準備します (200μl x サンプル数 x 2 + α)。 AMPure XP Beads ではなく QIAquick PCR Purification Kit を用いてサンプルを精製することも可 能です。この場合、製品付属のマニュアルと異なり、最後の溶出のステップでは Buffer EB ではな く PCR grade water を使用してください。 ② AMPure XP Beads を Vortex でよく混合し、Pre-Capture LM-PCR 反応各チューブに 50μl 添加します。 50μl (1.0 倍量) AMPure XP Beads 10 秒間 50μl：増幅後溶液 26 / 59 5.3 Pre-Capture LM-PCR 産物の精製 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ③ ピペッティングでよく混合した後、室温で 15 分間インキュベーションします。 ピペッティング 室温、15 分間 次の操作を 1.5 ml チューブ用のマグネティックラックで行う場合、全量を新しい 1.5 ml チューブ に移します。 ④ チューブをマグネティックラックに差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みから 95μl をピペ ットで吸い取り、除去します。 95μl マグネティックラックの種類により、 凝集箇所が異なる場合もあります ⑤ マグネティックラックにチューブを差し込んだまま、80% エタノール 200μl を添加し、そのまま室温で 30 秒間インキュベートします。 200μl 室温、30 秒間 80% エタノール (用時調製) ⑥ 上澄みをピペットで吸い取り、除去します。 ⑦ 本項 ⑤ ∼ ⑥ を繰り返します。 ⑧ チューブの蓋を開けた状態で、エタノールが蒸発するまで室温で乾燥させます。 上澄み除去後にピペットチップを交換してもう一度余分なエタノールを除去すると、乾燥時間を短 縮することができ、また、常に同じ乾燥時間で操作をすることができます。この場合、乾燥時間は 室温で 2 ∼ 3 分間となります。 乾燥させ過ぎは収量の低下につながります。すぐに次の工程に進めてください (37 ℃ での乾燥は 推奨しておりません)。 27 / 59 5.3 Pre-Capture LM-PCR 産物の精製 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ⑨ チューブをマグネティックラックから外し、PCR Grade Water を 52μl 添加し、ピペッティングでよく懸 濁します。 52μl PCR Grade Water Buffer EB や 1x TE ではなく、 必ず PCR Grade Water を使用してください。 タッピングからのスピンダウンも可。 ⑩ 室温で 2 分間、インキュベートします。 室温、2 分間 ⑪ チューブをマグネティックラックに差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みから 50μl をピペ ットで吸い取り、新しいチューブ (1.5 ml) に移します。 50μl 新しい 1.5 ml チューブ ⑫ 50μl の Pre-Capture LM-PCR 産物が調製されました。 28 / 59 5.3 Pre-Capture LM-PCR 産物の精製 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 5.4. ① Pre-Capture LM-PCR 産物の品質確認 吸光度を測定し、測定上での品質基準を満たしていることを確認します。 Pre-Capture LM-PCR 産物の品質 A260/280 比 基準 1.7 - 2.0 収量 1.0μg 以上 ネガティブコントロールでの収量 ごく微量 Pre-Capture LM-PCR 産物の容量は約 50μl ですので、約 20 ng/μl 以上の濃度で測定されると見 込まれます。 各ライブラリで均等なシークエンシングデータ (リード) を得るためには、正確な定量が非常に重 要 となります。吸光度測定以外の方法で評価することが有効である場合があります。 U U ② 1μl の Pre-Capture LM-PCR 産物あるいはネガティブコントロール産物を Agilent DNA 1000 Kit で泳動し、 平均サイズが 150 ∼ 500 bp の範囲にあること (断片化 RNA サイズが 100 ∼ 250 bp のとき) を確認します。 図 3：Pre-Capture LM-PCR 産物の Agilent DNA 1000 chip 結果例 ネガティブコントロール産物で 150 ∼ 500 bp の範囲にピーク見られないことをご確認ください。 一方で 150 bp 以下にピークが見られる場合があります。 150 bp 以下のサイズに 1 本以上のシャープなピークが見られる場合がありますが、LM-PCR 前の ステップからのオリゴヌクレオチドなどのキャリーオーバー等と考えられます。こうしたピークが 見られる場合でも、キャプチャー反応に影響はありません。 29 / 59 5.4 Pre-Capture LM-PCR 産物の品質確認 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 6. ハイブリダイゼーション 本章では、SeqCap RNA Enrichment Kit、SeqCap Hybridization and Wash Kit、SeqCap EZ Accessory Kit v2、 SeqCap HE-Oligo Kit を用いたハイブリダイゼーション溶液の調製方法とハイブリダイゼーションの手順につい て記載します。 ハイブリダイゼーションには、47 ℃ を 16 ∼ 20 時間キープできるサーマルサイクラーが必要です。 温度制御可能なヒートリッドが付属している機種を推奨しています。 6.1. SeqCap RNA プローブプール の分取および保存 ① SeqCap RNA Enrichment Kit の SeqCap RNA プローブプールを氷上で融解します。 ② 3 秒間 Vortex します。 3 秒間 ③ 10,000 x g で 30 秒間遠心し、SeqCap RNA プローブプールをチューブの底に集めます。 ④ PCR チューブ (0.2 ml) に 4.5μl ずつ分注します。 4.5 μl ずつ SeqCap RNA プローブプール ハイブリダイゼーションに使用するサーマルサイクラーに対応したサイズの PCR チューブに分注 してください。 4.5μl は 1 回分の使用量になります。 凍結中の揮散を防ぐためにチューブの蓋を確実に閉めてください。 SeqCap RNA プローブプールは製品反応数の容量より若干多く梱包されています。このため、分 注操作後、元の製品チューブに多少溶液が残ることがあります。 ⑤ -15 ∼ -25 ℃ で保存します。 SeqCap RNA プローブプールは凍結融解を繰り返さないでください。 30 / 59 6.1 SeqCap RNA プローブプール の分取および保存 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 6.2. Pre ライブラリプール溶液の準備 ＜ライブラリ毎に個別にキャプチャーハイブリダイゼーションする場合＞ 1μg に相当する Pre-Capture LM-PCR 産物の容量を算出しておきます。 1μg に相当する 溶液量を算出しておく Pre-Capture LM-PCR 産物 ＜ライブラリを混合してからキャプチャーハイブリダイゼーションする場合＞ それぞれの Pre-Capture LM-PCR 産物を一定量ずつ新しいチューブに分取し、「Pre ライブラリプール溶液」 を調製します。 例） 6 サンプルを混合する場合 Sample 1 A2 Sample 2 A4 Sample 4 A6 Sample 3 A5 Sample 5 A7 Sample 6 A16 等量ずつ (例；0.5μg 相当量ずつ) 新しいチューブ 「Pre ライブラリプール溶液」 各ライブラリで均等なシークエンシングデータ (リード) を得るためには、正確な定量、正確な容量 の分取が非常に重要となります。 1μg 相当をハイブリダイゼーションに使用しますので、上記の 6 サンプルを混合する例では、総 容量の 3 分の 1 の容量を使用します。 ピペッティングや定量による誤差の拡大を防ぐために、十分な容量の Pre-Capture LM-PCR 産物を 混合してください。 エンリッチメントの確認のために qPCR を実施する場合には、1μg 相当を使った後の残りの溶液 を -15 ∼ -25 ℃ で保存しておいてください (9 章) 。 31 / 59 6.2 Pre ライブラリプール溶液の準備 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 6.3. SeqCap HE オリゴの準備 ① 冷凍保存されている SeqCap HE-Oligo Kit の PCR Grade Water (バイアル “H2O”) を融解します。 ② 乾燥オリゴの封入された各 SeqCap HE オリゴのバイアル (13 / 26 本、バイアル “H2O”以外 ) をスピンダウ ンします。 ③ SeqCap HE Universal Oligo (バイアル “BU”) には、PCR Grade Water (バイアル “H2O”) 120μl を添加し、 その他の SeqCap HE Index # Oligo (12 / 24 本、バイアル”H2O”・”BU”以外 ) には PCR Grade Water (バイ アル “H2O”) 10μl ずつを添加します。 開封時に乾燥オリゴ DNA 粉末の飛散にご注意ください。 SeqCap HE Index # Oligo の「#」にはインデックス配列の種類を示す数値が入ります。 120μl PCR Grade Water (バイアル “H2O”) 10μl SeqCap HE Universal Oligo (バイアル “BU”) PCR Grade Water (バイアル “H2O”) SeqCap HE Index # Oligo ピペッティング誤差を防ぐために、更に 1 / 10 希釈した溶液を調製しても構いません。希釈した場 合には次の工程で 10 倍量を使用するようご注意ください。 ④ Vortex などにより十分に溶解させた後、スピンダウンします。1,000μM の各 SeqCap HE オリゴ溶液が調 製されました。 -15 ∼ -25 ℃ で保存できます。 凍結融解を繰り返さないために、少量ずつ分注していただくことをお勧めいたします。 凍結中の揮散を防ぐためにチューブの蓋を確実に閉めてください。 6.4. ① SeqCap HE オリゴプール溶液の調製 各 SeqCap HE オリゴ溶液が凍結保存されている場合には、適宜融解させます。 SeqCap HE Index # Oligo の「#」にはインデックス配列の種類を示す数値が入ります。 SeqCap HE Index # Oligo は以降の記述で HE Index オリゴと総称しますが、ライブラリに使用さ れた Index に対応したものを必ずご使用ください。 32 / 59 6.3 SeqCap HE オリゴの準備 / 6.4 SeqCap HE オリゴプール溶液の調製 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ② SeqCap HE Universal Oligo は、使用する SeqCap Index Adapter の番号に関わらず使用しますが、これと 併用する HE Index オリゴは SeqCap Index Adapter に対応したものを使用します。どの HE Index オリゴを 使用するかを確認します。 BU SeqCap HE Universal Oligo と、下記のいずれかの HE Index オリゴを組み合わせて使用します。 SeqCap HE-Oligo Kit A (Roche, 06777287001) SeqCap HE-Oligo Kit B (Roche, 06777317001) アダプター 番号 バイアル No. 品名 アダプター 番号 バイアル No. 品名 Index Adapter 2 B2 SeqCap HE Index 2 Oligo Index Adapter 1 B1 SeqCap HE Index 1 Oligo Index Adapter 4 B4 SeqCap HE Index 4 Oligo Index Adapter 3 B3 SeqCap HE Index 3 Oligo Index Adapter 5 B5 SeqCap HE Index 5 Oligo Index Adapter 8 B8 SeqCap HE Index 8 Oligo Index Adapter 6 B6 SeqCap HE Index 6 Oligo Index Adapter 9 B9 SeqCap HE Index 9 Oligo Index Adapter 7 B7 SeqCap HE Index 7 Oligo Index Adapter 10 B10 SeqCap HE Index 10 Oligo Index Adapter 12 B12 SeqCap HE Index 12 Oligo Index Adapter 11 B11 SeqCap HE Index 11 Oligo Index Adapter 13 B13 SeqCap HE Index 13 Oligo Index Adapter 20 B20 SeqCap HE Index 20 Oligo Index Adapter 14 B14 SeqCap HE Index 14 Oligo Index Adapter 21 B21 SeqCap HE Index 21 Oligo Index Adapter 15 B15 SeqCap HE Index 15 Oligo Index Adapter 22 B22 SeqCap HE Index 22 Oligo Index Adapter 16 B16 SeqCap HE Index 16 Oligo Index Adapter 23 B23 SeqCap HE Index 23 Oligo Index Adapter 18 B18 SeqCap HE Index 18 Oligo Index Adapter 25 B25 SeqCap HE Index 25 Oligo Index Adapter 19 B19 SeqCap HE Index 19 Oligo Index Adapter 27 B27 SeqCap HE Index 27 Oligo 33 / 59 6.4 SeqCap HE オリゴプール溶液の調製 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ③ 1,000μM SeqCap HE Universal Oligo と、該当の 1,000μM HE Index オリゴ溶液 を等量ずつ混合 (例 1) 、 または、1,000μM SeqCap HE Universal Oligo と、1,000μM となるよう混合した HE Index オリゴ混合溶 液 を等量ずつ混合 (例 2) し、HE オリゴプール溶液を調製します。 例 1）B2 インデックスを付加したライブラリのみでキャプチャーハイブリダイゼーションを行う場合 バイアル No. HE Index オリゴ溶液 分取量の例 BU 1,000μM SeqCap HE Universal Oligo 1μl B2 1,000μM SeqCap HE Index 2 Oligo 1μl SeqCap HE Universal Oligo 1μl 新しいチューブ SeqCap HE Index 2 Oligo 1μl キャプチャー反応数が少ない場合には「HE オリゴプール溶液」を調製せず、6 章 5 項 ③ のステッ プで上記 2 種類を 1μl ずつ添加してください。 例 2）下記インデックスの 6 サンプルを混合してからキャプチャーハイブリダイゼーションを行う場合 バイアル No. HE Index オリゴ溶液 分取量の例 BU 1,000μM SeqCap HE Universal Oligo 6μl B2 1,000μM SeqCap HE Index 2 Oligo 1μl B4 1,000μM SeqCap HE Index 4 Oligo 1μl B5 1,000μM SeqCap HE Index 5 Oligo 1μl B6 1,000μM SeqCap HE Index 6 Oligo 1μl B7 1,000μM SeqCap HE Index 7 Oligo 1μl B16 1,000μM SeqCap HE Index 16 Oligo 1μl SeqCap HE Index オリゴは等容量ずつを混合します。SeqCap HE Universal オリゴは SeqCap HE Index オリゴの合計容量と等量を添加します。 1 回のハイブリダイゼーションで 2μl ずつ使用しますので、上例の場合、最大 6 回分使用できる と見込まれます。 (次ページに続く) 34 / 59 6.4 SeqCap HE オリゴプール溶液の調製 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 (前ページより引き続き) SeqCap HE Universal Oligo 6μl SeqCap HE Index 2 Oligo, 1μl SeqCap HE Index 4 Oligo, 1μl SeqCap HE Index 5 Oligo, 1μl SeqCap HE Index 6 Oligo, 1μl SeqCap HE Index 7 Oligo, 1μl 新しいチューブ SeqCap HE Index 16 Oligo, 1μl 「HE オリゴプール溶液」 ライブラリ調製時に使用したアダプターに対応した HE Index オリゴ溶液を混合してください。実 際に使用しているインデックス以外の HE Index オリゴ溶液を混合することで様々なインデックス 混合パターンに対応させることはできません。 例えば 1μl 以上ずつのように、ピペッティング誤差のない容量で調製していただくことをお奨め いたします。 ④ HE オリゴプール溶液を Vortex でよく混合し (10 秒間) 、最高速度設定で 10 秒間遠心します。 10 秒間 遠心、10 秒間 -15 ∼ -25 ℃ で保存できますが、凍結融解を繰り返さないようにしてください。 6.5. ① ハイブリダイゼーションの準備と開始 ヒートブロックを 95 ℃ に加温しておきます。 95 ℃ 35 / 59 6.5 ハイブリダイゼーションの準備と開始 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ② サンプル溶液と必要試薬を氷上で融解します。 Pre ライブラリプール溶液 または Pre-Capture LM-PCR 産物 (6 章 2 項) HE オリゴプール溶液 (6 章 4 項 ④) SeqCap RNA Enrichment Kit の分注した SeqCap RNA プローブプール (6 章 1 項 ⑤) SeqCap EZ Accessory Kit v2 の バイアル “COT” SeqCap Hybridization and Wash Kit のバイアル ⑤ と ⑥ バイアル “COT” HE オリゴプール溶液 バイアル ⑤ Pre ライブラリプール溶液：1μg 相当 (または) Pre-Capture LM-PCR 産物：1μg 相当 バイアル ⑥ SeqCap RNA プローブプール ヒト以外の生物種での実験を行う場合にも、バイアル “COT” をご使用ください。 ③ 新しい 1.5 ml チューブに、COT-1 Human DNA 5μl 注）、Pre ライブラリプール または Pre-Capture LMPCR 産物 1μg 相当量、HE オリゴプール溶液 2μl を分注します。 P 5μl 注） バイアル “COT” COT DNA 注） ＊μl P 2μl Pre ライブラリプール溶液 (または) Pre-CaptureLM-PCR 産物 ハイブリダイゼーションコンポーネント HE オリゴプール溶液 混合容量 バイアル “COT” (COT-1 Human DNA) 5μl Pre ライブラリプール溶液：1μg 相当 ＊μl (または) Pre-Capture LM-PCR 産物：1μg 相当 HE オリゴプール溶液 2μl 注） ヒト以外の生物種の実験でも COT-1 Human DNA をご使用ください。 36 / 59 6.5 ハイブリダイゼーションの準備と開始 新しいチューブ SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ④ 18 - 20 ゲージ以下のサイズの注射針で本項 ③ のチューブの蓋中央に穴を開けます。 乾燥工程中でのコンタミネーションを防止するために、このような方法を推奨しています。 複数のサンプルを乾燥させる場合にはチューブ毎に新しい注射針を使用してください。 注射針は感染性廃棄物となります。施設の廃棄方法に従って適切に廃棄してください。 ⑤ 真空乾燥機にセットし、溶液を完全に乾燥させます。容量により乾燥時間を調節します。 後の工程で熱変性を行うことから、このステップでの加温 (60 ℃ 以上) は問題ありません。 ⑥ 本項 ⑤ のチューブに、2x Hybridization Buffer (バイアル ⑤) を 7.5μl と、Hybridization Component A (バ イアル ⑥) を 3μl 添加します。 7.5μl 3μl 2x Hybridization Buffer (バイアル ⑤) Hybridization Component A (バイアル ⑥) 正確な容量を添加してください。 ⑦ チューブの蓋の穴をステッカーかラボ用テープ片で塞ぎます。 10.5μl 37 / 59 6.5 ハイブリダイゼーションの準備と開始 ⑤ のチューブ SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ⑧ Vortex でよく混合し (10 秒) 、最高速度設定で 10 秒間遠心します。 遠心、10 秒間 10 秒間 ⑨ 95 ℃ のヒートブロック上で 10 分間の熱変性を行います。 10 分間 95 ℃ ⑩ 最高速度設定で 10 秒間遠心します (室温) 。 ⑪ 4.5μl ずつ分注した SeqCap RNA プローブプール溶液に、全量 (10.5μl) を移します。 全量 (10.5μl) SeqCap RNA プローブプール 4.5μl ⑫ Vortex で 3 秒間混合し、最高速度設定で 10 秒間遠心します。 遠心、10 秒間 3 秒間 ⑬ 47 ℃ で 16 ∼ 20 時間、サーマルサイクラーでインキュベーションします。 16 ∼ 20 時間 47 ℃ サーマルサイクラーのヒートリッド機能を利用し、PCR チューブの上蓋が 57 ℃ 以上となるよう 設定してください。 38 / 59 6.5 ハイブリダイゼーションの準備と開始 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 7. 洗浄と回収 本章では 、SeqCap Hybridization and Wash Kit、SeqCap Pure Capture Bead Kit を用いた非特異的ハイブリダイ ゼーションの洗浄およびキャプチャー産物の回収の方法について記載しています。 7.1. ① 洗浄用バッファーの準備 47 ℃ のインキュベーターを準備します。 このインキュベーターは、洗浄用バッファーを予加温、Stringent Wash バッファーでの洗浄時の保 温に使用します。 実測値として 47 ℃ が保持されるウォーターバス、サーマルサイクラー、ヒートブロック、オーブ ン (インキュベーター) 等をご用意ください。温度は温度計を使用してご確認ください。 ② SeqCap Hybridization and Wash Kit のバイアル ①・②・③・④、ボトル ⑦ を溶解させます。 10x Wash Buffer I (バイアル ①) は、18 ℃ 以下で析出します。25 ℃ で 5 ∼ 10 分間加温して完全 に溶解してからご使用ください。同様に、10x Stringent Wash Buffer、2.5x Bead Wash Buffer に ついても低温で析出することがありますので、完全に溶解してご利用ください。 ③ 本項 ② の各溶液を希釈します。 SeqCap Hybridization and Wash Kit PCR grade water 1x 溶液の 必要量 使用温度 10x Wash Buffer I (バイアル ①) 10μl 90μl 100μl 47 ℃ 10x Wash Buffer I (バイアル ①) 20μl 180μl 200μl 室温 10x Wash Buffer II (バイアル ②) 20μl 180μl 200μl 室温 10x Wash Buffer III (バイアル ③) 20μl 180μl 200μl 室温 10x Stringent Wash Buffer (バイアル ④) 40μl 360μl 400μl 47 ℃ 2.5x Bead Wash Buffer (ボトル ⑦) 200μl 300μl 500μl 室温 上記の容量は、ハイブリダイゼーションサンプル 1 本あたりに必要となる容量です。複数本のハイ ブリダイゼーションを行っている場合には適宜増量させてください。 希釈後の溶液は室温 ( +15 ∼ +25 ℃) で 2 週間保存可能です。 ④ 本項 ③ で調製した 1x 溶液のうち、 100μl 1x Wash Buffer I と、400μl 1x Stringent Wash Buffer を 47 ℃ に加温します。 実測値として 47 ℃ に設定されたインキュベーターを使用してください。 少なくとも 2 時間は加温し、溶液の温度を安定化させてください。 39 / 59 7.1 洗浄用バッファーの準備 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 7.2. Capture Beads の準備 ① 冷蔵保存されている SeqCap Pure Capture Bead Kit の SeqCap Capture Beads (ボトル ①) を室温に置きま す。 (使用する 30 分前) ② SeqCap Capture Beads を Vortex でよく混合し、100μl を新しいチューブに分注します。 100μl SeqCap Capture Beads 15 秒間 新しいチューブ 例えば 4 反応量の場合、400μl を分取して複数サンプル分をまとめて準備することも可能です。 ただし、分取量は 1 チューブに 6 反応量までとしてください。 ③ 本項 ② のチューブを DynaMag-2 (または他のマグネティックラック) に差し込み、チューブ内の溶液が透 明になったら上澄みをピペットで吸い取り、除去します。 DynaMag-2 を使用する場合には、通常、5 分以内に溶液は透明になります。MagnaBot II Magnetic Separation Device (96 ウェルプレート用マグネティックラック) を使用する場合には 1 分間置いて ください。 以下では 1.5 ml チューブを用いて洗浄する方法について説明します。 96 ウェルプレートを使用す る場合は、SeqCap RNA Enrichment System User’s Guide (Version1.0、英語版) の Appendix C を ご参照ください。 上澄みを捨てる際にビーズに触れないようご注意ください。多少の上澄み溶液の残存は次のステッ プで取り除かれます。 上澄み溶液を捨てた後はビーズが乾燥しないよう手早く次のバッファー等を添加してください。 懸濁中に溶液がチューブの蓋裏に付着してしまった場合には軽くスピンダウンを行ってから次のス テップに進んでください。 40 / 59 7.2 Capture Beads の準備 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ④ 200μl の 1x Bead Wash Buffer を添加し、十分に懸濁します。 200μl 10 秒間 1x Bead Wash Buffer (室温) ③ のチューブ まとめて準備している場合、例えば 4 反応量の Capture Beads を準備している場合、800μl の 1x Bead Wash Buffer を添加します。 ⑤ マグネティックラック にチューブを差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸 い取り、除去します。 ⑥ 本項 ④ ∼ ⑤ をもう一度繰り返します。 ここまでのステップで、1x Bead Wash Buffer で合計 2 回洗浄します。 ⑦ 100μl の 1x Bead Wash Buffer を添加し、Vortex またはピペッティングでよく懸濁します。 100μl 10 秒間 1x Bead Wash Buffer (室温) ＜サーマルサイクラーに対応していないサイズのチューブを使用している場合＞ 47 ℃ サーマルサイクラーに対応したサイズのチューブに 100μl ずつ分注します。 100μl ずつ 47 ℃ サーマルサイクラーに対応したサイズの新しいチューブ 例えば 4 反応量の Capture Beads を準備している場合、400μl の 1x Bead Wash Buffer を添加し、 Vortex でよく懸濁した後、100μl ずつ 4 本に分注します。 96 ウェルプレートを使用している場合には、ピペッティングにより充分に懸濁してください。こ の場合には移し変えなどの操作は必要ありません。 41 / 59 7.2 Capture Beads の準備 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ⑧ マグネティックラック にチューブを差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸 い取り、除去します。 ここまでのステップで、1x Bead Wash Buffer で合計 3 回洗浄します。 多少の洗浄溶液の残存は後のストレプトアビジンとビオチンの結合反応に影響を与えません。 上澄みを除去した後は、直ちに次のステップへ進んでください。Capture Beads を乾燥させないよ うにしてください。 7.3. ① Capture Beads とハイブリダイゼーション DNA の結合 洗浄済みの Capture Beads にハイブリダイゼーション溶液の全量を添加し、10 回のピペッティングにより 充分に懸濁させます。 全量 (15μl) ハイブリダイゼーション溶液 47 ℃ 洗浄済み Capture Beads (ビーズペレット) 手早く充分に懸濁してください (軽度の Vortex、スピンダウンは可)。 ② 47 ℃ のサーマルサイクラーに入れます。 ① のチューブ 約 15μl + ビーズ 47 ℃ ヒートリッド機能を利用し、PCR チューブの上蓋が 57 ℃ 以上となるよう設定してください。 ③ 15 分毎に 3 秒間の Vortex をしながら、45 分間 47 ℃ でインキュベーションを行います。 15 分間 3 秒間 47 ℃ 42 / 59 7.3 Capture Beads とハイブリダイゼーション DNA の結合 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 7.4. ① cDNA が結合した Capture Beads の洗浄 47 ℃ に加温した 1x Wash Buffer I を 100μl 添加し、Vortex でよく懸濁します。 100μl 10 秒間 1x Wash Buffer I 47 ℃ ＜0.2 ml チューブで操作している場合＞ 全量を新しい 1.5 ml チューブに移します。 全量 (約 115μl) 新しい 1.5 ml チューブ 1.5 ml チューブに移し替えることにより、以降の洗浄ステップでマグネティックデバイスのサイズ とチューブサイズが一致し分離操作が容易になり、また、洗浄バッファーの容量に対して充分なチ ューブ容積を持たせることができるようになります。 サンプル数が多く、移し替えに時間が掛かる場合には、数本ずつ操作を行うことで温度の低下を防 いでください。 ② マグネティックラック にチューブを差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸 い取り、除去します。 このステップでは、溶液は直ぐに透明になります。迅速に上澄みを除去してください。 ③ 47 ℃ に加温した 1x Stringent Wash Buffer を 200μl 添加し、10 回のピペッティングでよく懸濁します。 200μl 1x Strigent Wash Buffer 47 ℃ 手早く充分に懸濁してください (軽度の Vortex、スピンダウンは可)。 ④ 47 ℃ で 5 分間加温します。 43 / 59 7.4 cDNA が結合した Capture Beads の洗浄 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ⑤ マグネティックラック にチューブを差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸 い取り、除去します。 このステップでは、溶液は直ぐに透明になります。迅速に上澄みを除去してください。 ⑥ 本項 ③ ∼ ⑤ を繰り返します。 1x Stringent Wash Buffer での洗浄は合計 2 回です。 ⑦ 1x Wash Buffer I を 200μl 添加し、2 分間の Vortex でよく懸濁します。 200μl 2 分間 1x Wash Buffer I 室温 ⑧ マグネティックラック にチューブを差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸 い取り、除去します。 ⑨ 1x Wash Buffer II を 200μl 添加し、1 分間の Vortex でよく懸濁します。 200μl 1 分間 1x Wash Buffer II 室温 44 / 59 7.4 cDNA が結合した Capture Beads の洗浄 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ⑩ マグネティックラック にチューブを差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸 い取り、除去します。 サンプルが複数本の場合には、本項 ⑩ ∼ ⑬ までの操作を 1 本ずつ進めてください。 ⑪ 1x Wash Buffer III を 200μl 添加し、30 秒間 の Vortex でよく懸濁します。 200μl 30 秒間 (厳守) 1x Wash Buffer III 室温 ⑫ マグネティックラック にチューブを差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みをピペットで吸 い取り、除去します。 手早く操作してください。Wash Buffer III に長時間置くと回収率や Complexity が低下する恐れが あります。 ⑬ PCR grade water を 50μl 添加し、よく懸濁します。 50μl PCR grade water サンプルが複数本あり、1 本ずづ操作している場合には、本項 ⑩ に戻り残りのサンプルの操作を 1 本ずつ進めてください。 次の章に進めるサンプルは 、この Capture Beads 懸濁溶液 (茶色の溶液) です。ここで上澄みを捨 てる操作は絶対にしないでください！ ⑭ -15 ∼ -25 ℃で保存するか、8 章へ進めてください。 45 / 59 7.4 cDNA が結合した Capture Beads の洗浄 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 8. Post-Capture LM-PCR 反応と反応産物の精製 本章では 、SeqCap EZ Accessory Kit v2 を用いたキャプチャー後のサンプルライブラリを増幅する方法について 記載しています。増幅後の溶液は SeqCap Pure Capture Bead Kit (または QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, 28106) ) を用いて精製を行います。 8.1. Post-LM PCR オリゴの準備 ① 冷凍保存されている SeqCap EZ Accessory Kit v2 の PCR Grade Water (バイアル “H2O”) を融解します。 ② SeqCap EZ Accessory Kit v2 の Post-LM-PCR-Oligonucleotides 1&2 (バイアル ”LP2”) をスピンダウンしま す。 開封時に乾燥オリゴ DNA 粉末の飛散にご注意ください。 1 本のバイアルチューブにフォワードとリバースのプライマーの両方が含まれています。 ③ Post-LM-PCR-Oligonucleotides 1&2 (バイアル ”LP2”) に、PCR Grade Water (バイアル “H2O”) を 480μl 添 加します。 480μl バイアル “H2O” ④ バイアル “LP2” Vortex などにより十分に溶解させた後、スピンダウンします。5μM の Post-LM-PCR-Oligonucleotides 1&2 溶液が調製されました。 -15 ∼ -25 ℃ で保存できます。 46 / 59 8.1 Post-LM PCR オリゴの準備 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 Post-LM PCR の準備 8.2. ① 必要試薬とサンプル溶液を氷上で融解し、Post-Capture LM-PCR マスターミックスを調製します。 Capture Beads 懸濁溶液 (茶色の溶液) (7 章 4 項 ⑭) SeqCap EZ Accessory Kit v2 の KAPA HiFi HotStart ReadyMix (バイアル “KH”) SeqCap EZ Accessory Kit v2 の溶解済み Post-LM PCR オリゴ (8 章 1 項 ④) 1 本のキャプチャーサンプルにつき、2 反応 (2 チューブ) を行います。 ネガティブ、ポジティブコントロール を同時に調製していただくことをお奨めします。ネガティ ブコントロールとしては PCR grade water を、ポジティブコントロールとしては以前に増幅が確 認されているライブラリ溶液をご利用ください。 2 反応 (1 キャプチャーサンプル) あたりの容量 Post-Capture LM-PCR マスターミックス KAPA HiFi HotStart ReadyMix (バイアル “KH”) 50μl Post-LM PCR オリゴ, 5μM (溶解済みバイアル “LP2”) 10μl total 60μl KAPA HiFi HotStart ReadyMix および本試薬を含む溶液は温度に対して敏感です。必ず氷上で融解、 調製を行ってください。 マスターミックスの容量の算出には、ピペッティング誤差を見込んで上記容量に 10% 程度を増量 して計算してください。 ② マスターミックスをよく混合し、スピンダウンします。 Vortex を使用せずに充分混合してください。 ③ 新しい PCR チューブに、Post-Capture LM-PCR マスターミックスを 30μl ずつ分注します。 30μl ずつ Post-Capture LM-PCR マスターミックス ④ 7 章 4 項 ⑭ の Capture Beads 懸濁溶液 (茶色の溶液) を Vortex でよく混合します。 47 / 59 8.2 Post-LM PCR の準備 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ⑤ 本項 ④ の Post-Capture LM-PCR マスターミックス分注チューブに、20μl ずつ の Capture Beads 懸濁溶 液 (茶色の溶液) を添加します。 Capture Beads 懸濁溶液 (茶色の溶液) (または) PCR grade water (negative control) ライブラリ溶液 (positive control) 20μl ずつ ⑥ ピペッティングでよく混合します。 Vortex を使用せずに充分混合してください。 残りの Capture Beads 懸濁溶液 (茶色の溶液) (約 10μl ) は、-15 ∼ -25 ℃ で保存します。 8.3. Post-Capture LM-PCR 増幅 サーマルサイクラーで下記のプログラムを実行します。 温度 時間 98 ℃ 45 sec 98 ℃ 15 sec 60 ℃ 30 sec 72 ℃ 30 sec 72 ℃ 5 min 4℃ Hold (72 時間まで) サイクル 14 サイクル 50μl Pre-Capture LM-PCR でのプログラムとは異なりますので、実行プログラムを間違えないようご注 意ください。 反応終了後は 4 ℃ で保存し、72 時間以内に精製の工程へ進んでください。 48 / 59 8.3 Post-Capture LM-PCR 増幅 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 Post-Capture LM-PCR 産物の精製 8.4. ① 必要な試薬の準備をします。 SeqCap Pure Capture Bead Kit の AMPure XP Beads (ボトル ②) を室温に置きます。 (遅くとも使用する 30 分前)。 PCR Grade Water (バイアル “H2O”) を融解します。 80% エタノールを準備します (200μl x サンプル数 x 2 + α)。 AMPure XP Beads ではなく QIAquick PCR Purification Kit を用いてサンプルを精製することも可 能です。この場合、製品付属のマニュアルと異なり、最後の溶出のステップでは Buffer EB ではな く PCR grade water を使用してください。 ② 新しい 1.5 ml チューブに、各増幅後溶液を移します。 全量 (約 100μl) 増幅後溶液 新しい 1.5 ml チューブ ネガティブ、ポジティブコントロールサンプルについても同様に操作してください。 ③ AMPure XP Beads を Vortex でよく混合し、180μl を本項 ② のチューブに添加します。 180μl (1.8 倍量) AMPure XP Beads 10 秒間 ④ ② のチューブ Vortex で混合し、室温で 15 分間インキュベーションします。 室温、15 分間 ⑤ チューブを DynaMag-2 (または他のマグネティックラック) に差し込み、チューブ内の溶液が透明になった ら上澄みをピペットで吸い取り、除去します。 49 / 59 8.4 Post-Capture LM-PCR 産物の精製 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ⑥ マグネティックラックにチューブを差し込んだまま、80% エタノール 200μl を添加し、そのまま室温で 30 秒間インキュベートします。 200μl 室温、30 秒間 80% エタノール (用時調製) ⑦ 上澄みをピペットで吸い取り、除去します。 ⑧ 本項 ⑥ ∼ ⑦ を繰り返します。 80% エタノールにより合計 2 回洗浄します。 ⑨ チューブの蓋を開けた状態で、エタノールが蒸発するまで室温で乾燥させます。 上澄み除去後にピペットチップを交換してもう一度余分なエタノールを除去すると、乾燥時間を短 縮することができ、また、常に同じ乾燥時間で操作をすることができます。この場合、乾燥時間は 室温で 2 ∼ 3 分間となります。 乾燥のさせ過ぎは収量の低下につながりますのでご注意ください。 ⑩ PCR Grade Water を 52μl 添加し、ピペッティングでよく懸濁します。 52μl PCR Grade Water Buffer EB や 1x TE ではなく、 必ず PCR Grade Water を使用してください。 タッピングからのスピンダウンも可。 50 / 59 8.4 Post-Capture LM-PCR 産物の精製 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ⑪ 室温で 2 分間、インキュベートします。 室温、2 分間 ⑫ チューブをマグネティックラックに差し込み、チューブ内の溶液が透明になったら上澄みから 50μl をピペ ットで吸い取り、新しいチューブ (1.5 ml) に移します。 50μl 新しい 1.5 ml チューブ ⑬ 50μl の Post-Capture LM-PCR 産物が調製されました。 このサンプルがシークエンシング反応に進める溶液となります。 51 / 59 8.4 Post-Capture LM-PCR 産物の精製 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 8.5. ① Post-Capture LM-PCR 産物の品質確認 吸光度を測定し、測定上での品質基準を満たしていることを確認します。 Pre-Capture LM-PCR 産物の品質 A260/280 比 基準 1.7 - 2.0 収量 500 ng 以上 ネガティブコントロールでの収量 ごく微量 Post-Capture LM-PCR 産物の容量は約 50μl ですので、約 10 ng/μl 以上の濃度で測定されると見 込まれます。 ② 1μl の Post-Capture LM-PCR 産物あるいはネガティブコントロール産物を Agilent DNA 1000 Kit で泳動し、 平均サイズが 150 ∼ 500 bp の範囲にあることを確認します。 図 4： Post-Capture LM-PCR 産物の Agilent DNA 1000 chip 結果例 ネガティブコントロール産物でピーク見られないことをご確認ください。 吸光度測定上の品質基準を満たしていない場合には、もう一度精製を行って下さい。電気泳動上で の品質基準を満たしていない場合にはトラブルシューティングをご参照ください。 52 / 59 8.5 Post-Capture LM-PCR 産物の品質確認 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 付録 9. 9.1. ERCC RNA Spike-In Mix によるキャプチャーパフォーマンスの検証 ERCC RNA Spike-In Mix の ERCC Control 配列は、国際的な発現解析研究による感度・定量性の実績から設計さ れており、合成配列や超好熱性細菌に由来するゲノム配列から構成されています。市販されている ERCC RNA Spike-In Mix には、92 種類の ERCC 転写物が幅広い既知の濃度で正確に混合されています。 一方で、92 種類の ERCC 転写物のうち 83 種類に対するキャプチャープローブは SeqCap RNA Enrichment Kit に予め含まれています。ERCC RNA Spike-In Mix を初発 RNA サンプルに添加して SeqCap RNA 実験を実施す ると、プローブが設計された ERCC 転写物は必ずキャプチャーされると期待される事から、キャプチャーパフォ ーマンスの評価が可能です。 ERCC Control 領域に qPCR プライマーを設計してキャプチャー前後の ERCC 転写物存在量を比較するこ とにより、シークエンス前にエンリッチメントを確認する。 シークエンス結果を解析することによりキャプチャーパフォーマンスを評価する。 キャプチャー工程による ERCC Control 濃度比の変化 (異なる ERCC Control 間の濃度比が、リード数の比として保持されているか) エンリッチメント効率 (キャプチャープローブの有無で、同濃度の異なる ERCC Control 間でリード数がどの程度変化するか) 以下では 、シークエンス結果からキャプチャーパフォーマンスを評価する方法について概説します。 ① テクニカルノート「How to Evaluate NimbleGen SeqCap RNA Target Enrichment Data」に記載の指示に従 い、キャプチャーサンプルのシークエンスデータから、各 ERCC Control の FPKM (Fragments Per Kilobase of exon per Million mapped fragments) を算出します。 どの ERCC Control にプローブが設計されているかは、SeqCap RNA Enrichment Kit に付属するデ ザイン情報中の ERCC_controls.bed ファイルに記載されています。 プローブが設計されていない ERCC Control は非常にリード数が低いために FPKM 値を算出できな いかもしれません。そのような ERCC Control は以下の解析に含めないようにしてください。 53 / 59 9.1 ERCC RNA Spike-In Mix によるキャプチャーパフォーマンスの検証 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ② それぞれの ERCC Control の FPKM を既知濃度情報と照らし合わせ、必要であればプロット図を作成しま す。濃度情報は ERCC RNA Spike-In Mix の製造元より入手できます。 ERCC RNA Spike-In Mix 1 と ERCC RNA Spike-In Mix 2 とでは、同じ転写産物が異なる濃度で使 われていることがありますので、ご注意ください。 図 5：ERCC Spike-In Control の各濃度に対する相対比 横軸に ERCC Control 配列の各濃度を、縦軸に FPKM をプロットしています。黒いプロット は、キャプチャープローブが設計された ERCC Control の FPKM を示し、赤いプロットは、 キャプチャープローブが設計されていない ERCC Control の FPKM を示しています。緑の四 角で囲われた部分では、同濃度で混合されていた ERCC Control のプロットをハイライトし ています。 ③ プローブが設計されていない ERCC Control と、プローブが設計された ERCC Control の FPKM の平均値 を各濃度ごとに算出します。 ④ 各濃度において、プローブが設計された ERCC Control の FPKM の平均値を、プローブが設計されていな い ERCC Control の FPKM の平均値で割り算をします (Fold Difference)。 54 / 59 9.1 ERCC RNA Spike-In Mix によるキャプチャーパフォーマンスの検証 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ⑤ Fold Differece の平均値を算出します (Average fold difference)。 ERCC Control 既知濃度 (amol /μl) プローブが設計されていない ERCC Control の FPKM の平均値 プローブが設計された ERCC Control の FPKM の平均値 Fold Difference 15000 20.655 8159.57 395.05 3750 4.394 2191.65 498.84 937.5 2.038 330.97 162.40 468.75 0.815 478.15 586.53 58.59 0.108 81.00 750.59 Average fold difference 478.68 表 1： Average fold difference の算出例。図 5 のデータから算出しています。 ⑥ キャプチャーパフォーマンスを評価します。 図 5 と表 1 のキャプチャー実験の場合、ERCC Control 既知濃度に対して FPKM 平均値が直線的に相関し ていることから、転写物の存在比はキャプチャーや PCR の過程を経てもきちんと保持されていることが示 されました。また、平均 Fold difference は 478.68 倍となり、効率よくエンリッチメントが実施されたこと を示しています。 Average fold difference は 10 倍以上であることが望まれます。図 6 はキャプチャーの効率が良くなかった データ例です。 図 6：キャプチャー効率が良くない場合のプロット例 55 / 59 9.1 ERCC RNA Spike-In Mix によるキャプチャーパフォーマンスの検証 SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 9.2. トラブルシューティング ＜サンプルライブラリの調製 ＞ 症状 原因 / 対処法 total RNA 100 ng 以外を出発材料としても高品質な結果を得るこ とはできますが、より微量の RNA を出発材料とすると、存在頻 度が低い転写産物を検出する感度が減少することがあります。例 えば、内部検証実験では、10 ng の total RNA を出発材料とした 場合、100 ng の total RNA の場合と比較して、転写産物の検出限 界が 2 ∼ 5 倍異なっていました。 例）100 ng の total RNA の検出限界： 0.2 amoles/μl 10 ng の total RNA の検出限界： 0.4 ∼ 1.0 amoles/μl 100 ng 以上の total RNA を用いることもできます。SeqCapRNA のワークフローは、最高 1μg の total RNA でも問題が無いこと が確認されています。より多くの RNA を用いる場合には、PreCapture LM-PCR のサイクル数を減らす必要があります。このこ とにより、PCR バイアスや PCR 重複リードの割合を減らすこと ができます。 出発材料が total RNA 100 ng 以外の場合 RNA 量を変える場合には、幾つかのステップを修正する必要があ ります。 ERCC RNA Spike-In Mix の添加量を製造元のマニュアルに従 い調整します。 アダプター濃度を KAPA Stranded RNA-Seq Library Preparation Kit のマニュアルに従い調整します。このことによ り、ライゲーション反応の効率を維持するとともに、アダプ ターダイマーの形成を減少させることができます。 RNA 量により、Pre-Capture LM-PCR のサイクル数を 1 ∼ 4 サイクル変更します。 例）1μg の total RNA の場合 7 サイクル ( - 4 サイクル) 例）10 ng の total RNA の場合 15 サイクル ( + 4 サイクル) 上記は目安であり、サンプルにより増減すべきサイクル数は 変動します。 NOTE: 上記は、良好な結果を得る可能性を上昇させるための手法で、良 好な結果を保証するものではありません。 サンプルライブラリは Poly-A RNA や rRNA 除去処理された RNA からも調整することができます。ERCC RNA Spike-In Mix は製造 元のマニュアルに従い添加してください。rRNA 除去処理された RNA の場合、除去処理前に ERCC RNA Spike-In Mix を添加する ことをお勧めしています。アダプター濃度も RNA 量によって調 整される必要があります。Pre-Capture LM-PCR のサイクル数も Poly-A RNA や rRNA 除去処理された RNA を用い RNA 量によって 1 ∼ 4 サイクル増減させる必要があります。 る場合 Poly-A RNA や rRNA 除去処理された RNA からでも高品質なサン プルライブラリを調製可能で、total RNA から調製されたサンプ ルライブラリと同様のキャプチャー実験結果が得られます。PolyA RNA から調製されたサンプルライブラリは、total RNA とは異 なり、ノンコーディング転写産物などが含まれていないことに留 意ください。 56 / 59 9.2 トラブルシューティング SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ＜Pre-Capture LM-PCR 産物＞ 症状 原因 / 対処法 収量が 1μg 以下である。 ライブラリ調製の操作に間違いがあった、使用した試薬が劣化し た、PCR プログラムが間違っていた、プライマーの希釈に TE を 使用したなどの可能性があります。LM-PCR 用の試薬・プライマ ーについては、評価済みのサンプルをポジティブコントロールと して使用してください。PCR プログラムを確認してください。必 要であればライブラリ調製をやり直してください。 Agilent DNA 1000 chip の結果において、増幅産 物の平均長が 150 ∼ 500 bp でない。 適切に RNA が断片化されていなかった可能性があります。ライ ブラリ調製をやり直してください。RNA の断片化の条件と、 AMPure XP Beads での精製・サイズ調製のステップでの操作に ご注意ください。 Agilent DNA 1000 chip の結果において、予想さ れるサイズのピークより大きなサイズのピークが 観察される。 本項の＜Post-Capture LM-PCR 産物＞を参照ください。 A260/280 比が 1.7 未満である。 サンプルの精製が充分ではありません。もう一度精製を繰り返し てください。 LM-PCR のステップからのオリゴヌクレオチドのキャリーオーバ ーによるものと考えられます。こうしたキャリーオーバーは 150 bp 以下のサイズに 1 本か複数のシャープなピークとして観察さ れます。こうした短い核酸はコンタミネーションとはみなされ LM-PCR のネガティブコントロールで、バックグ ず、キャプチャーの工程にも影響を与えません。しかし、ネガテ ランドレベル以上に吸光度測定値が観察された。 ィブコントロールからの LM-PCR 産物の吸光度測定値がかなり高 い値を示す場合にはサンプルライブラリのコンタミネーションが 起こっている可能性があります。必ず電気泳動で核酸サイズ分布 を確認し、必要であれば LM-PCR / ライブラリ調製をやり直して ください。 150 bp 以下に 1 本か複数のシャープなピークが 観察される。 LM-PCR のステップからのオリゴヌクレオチドのキャリーオーバ ーによるものと考えられます。こうした短い核酸はコンタミネー ションとはみなされず、キャプチャーの工程にも影響を与えませ んが、吸光度による濃度測定が過大評価されてしまいます (実際 のライブラリ濃度は吸光度測定値よりも低濃度となります) 。 LM-PCR のネガティブコントロールで、150 ∼ 500 bp のサイズで増幅産物が観察される。 増幅サンプル間でのクロスコンタミネーションが原因である可能 性があります。ライブラリ調製試薬のコンタミネーションが無い かどうかを確認し、必要であれば新しいキットでライブラリ調製 をやり直してください。 ＜ハイブリダイゼーション＞ 症状 ハイブリ時間を長くしたい。 原因 / 対処法 ハイブリ時間は 3 日間 (72 時間) まで延長出来ます。延長による パフォーマンスの低下は殆ど見られませんが、サンプルが蒸発し てしまうリスクが増加します。 NOTE: ハイブリ後に顕著なサンプルの蒸発が認められた場合、そのキャ プチャー実験を中止してください。 57 / 59 9.2 トラブルシューティング SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 ＜Post-Capture LM-PCR 産物＞ 症状 原因 / 対処法 ハイブリダイゼーションか洗浄のステップでの温度が適正ではな かった可能性があります。それぞれの機器の温度を実測で測定 し、正しい温度でもう一度実験を繰り返してください。 PCR 用の試薬が劣化していた可能性があります。ポジティブコン トロールを用いた場合に充分に増幅されるかどうかをご確認くだ さい。ポジティブコントロールでの増幅が確認できなかった場合 には、ハイブリダイゼーションをやり直し、新しい PCR 試薬で 操作を行ってください。 NOTE: ターゲット領域の設定が小さい場合や存在頻度が低い転写産物を ターゲットとしている実験では、収量が充分に得られない場合で も十分なシークエンス結果が得られる場合があります。キャプチ ャーターゲットのサイズと予想される存在量も併せて結果を評価 してください。 収量が 500 ng 未満である。 Agilent DNA 1000 chip の結果において、増幅産 物の平均長が 150 ∼ 500 bp でない。 Agilent DNA 1000 chip の結果において、予想さ れるサイズのピークより大きなサイズのピークが 観察される。 A) 適切に RNA が断片化されていなかった可能性があります。ライ ブラリ調製をやり直してください。必要であれば、適切に RNA が断片化されたか、断片化直後の RNA を Agilent RNA 6000 Pico chip を用いて確認してください。 反応液中のプライマーの枯渇により一本鎖 DNA の増幅が起きた と考えられます。両端のアダプター配列のホモロジーにより相互 にアニールしたヘテロ二本鎖が、実際の長さよりも明らかに大き いサイズで検出されます。この産物は、LM-PCR 時のプライマー 濃度を増やすかサイクル数を減らすことで発生を抑えられます が、この産物自体はシークエンスキャプチャーやシークエンシン グに影響を与えないと考えられます。しかし、もし定量を BioAnalyzer の結果から実行しようとする場合には、注意が必要 となります。 B) 左の A) ∼ C) の図は、キャプチャーされた同一の gDNA サンプル ライブラリを用いた Post-Capture LM-PCR の結果です。A) は 16 サイクル、B) は 18 サイクル、C) は 22 サイクルで PCR を実施 しています。A) は予想されたサイズのピーク (150 ∼ 500 bp) し か観察されていませんが、B) では 1500 bp 以上のサイズにピー ク状のものがもう一つ観察され、C) では 150 ∼ 500 bp のピーク の代わりに 1500 bp 以上のサイズでピークが観察されています。 このような現象は、cDNA サンプルライブラリでも同様に発生す ると考えられます。また、Pre-Capture LM-PCR でも同様にこの 事象が観察されます。 C) A260/280 比が 1.7 未満である。 サンプルの精製が充分ではありません。もう一度精製を繰り返し てください。 Illumina 社製シークエンサーのワークフローにつきましては、弊社はサポートしておりません。 58 / 59 9.2 トラブルシューティング SeqCap RNA Enrichment System 日本語マニュアル v1.0 R ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社 〒105-0014 東京都港区芝 2-6-1 TEL: 03-5443-5287 MAIL: [email protected]