納豆菌による樹状細胞の活性化と免疫制御機能の解明

 納豆菌による樹状細胞の活性化と免疫制御機能の解明 国立研究開発法人 産業技術総合研究所 辻 典子 動物は腸から栄養を摂取し、生命を維持している。 また腸は外界とのバリア機能を果たし、身体のほかの臓器とも機能的に連関して、生
体恒常性維持を考える上で最も重要な臓器・器官としてはたらいている。 口腔、食道、胃、小腸、大腸とつづく“管”の中でも、とりわけ小腸(上部消化管)に
は免疫細胞が多く集まり、それらの機能（生体防御と抗炎症）の成熟に重要な環境場と
なっている。小腸は外界に接する面積が広いだけではなく、口から摂取した食物や侵入
してきた外来因子に早期に接し、同化(受容)するか排除するかの素早い判断を行う。小
腸における外来因子とは食品成分と腸内共生微生物であり、つまり“管として生きる”
個体の免疫機能の発達に、食品成分は大きく寄与していることがわかる。 われわれはこれまでに、小腸の主要な共生微生物であり、発酵食品にも広く活用され
ている乳酸菌が免疫機能を増強する機構を明らかにしてきた。すなわち乳酸菌は特徴的
に二本鎖RNA（dsRNA）を豊富に含み、自然免疫受容体のひとつであるトル様レセプ
ター３（TLR３）を介して樹状細胞からのインターフェロン–β産生を促進すること、
このインターフェロン−βが抗ウイルス活性あるいは抗炎症機能を発揮して生体恒常性
の維持に貢献していることを見出した
（１）
。
また乳酸菌は他のグラム陽性細菌と同様に、
ペプチドグリカンなどTLR2を活性化する成分も含有しており、インターフェロン-β以
外にもIL-10、IL-18など生体恒常性の維持に必要なサイトカイン産生にも寄与すること
を示している（２）
。
本研究では食品成分である納豆菌がどのように免疫システムを活性化するかを明らか
にすることを目的とした。免疫システムは上述のように微生物（共生細菌や食品微生物
含む）中の核酸や多糖を認識して免疫を機能成熟させ、身体を守っている。そして発酵
食品は乳酸菌やそのほかの食品微生物を豊富に含むことから、さまざまな免疫賦活機能
を有することが期待される。日本食には多くの発酵食品が伝わっているが、その有力な
免疫賦活食品の一つとして納豆が挙げられる(図１)。
また、微生物成分を認識して免疫細胞を活性化するための自然免疫レセプターと、そ
れらを介した細胞内シグナリングの知見は近年急速に蓄積されてきた（図２）
。食品成分
がどのような自然免疫活性化経路を介して身体の免疫機能の成熟と賦活に貢献している
のか、分子レベルで理解される時代が訪れたといえよう。
図１：伝統的な発酵食品には様々な微生物が利用され、食品群を形成している。その中
でも納豆は特徴的な食品となっており、日本およびアジアの食生活の中で免疫機能の増
進に貢献していると考えられる。
（ヒトマイクロビオーム研究最前線 2016年 株式会社
エヌ・ティー・エス 刊: 第６編第３章 醗酵食品による腸内環境の最適化とアレルギー
予防 p406-413 辻 より改変・引用） 図２ 食品成分も、近年明らかにされた自然免疫活性化経路を使って小腸の免疫細胞を
活性化していると考えられる。納豆菌により同様の免疫賦活作用があるかについて、マ
ウス樹状細胞を用いた実験系で検証する。
（ヒトマイクロビオーム研究最前線 2016年 株式会社エヌ・ティー・エス 刊: 第６編第３章 醗酵食品による腸内環境の最適化とア
レルギー予防 p406-413 辻 より改変・引用） 【実験方法】
1. 微生物菌株
納豆菌（６株：A、B、C、D、E、F）は、タカノフーズ株式会社より供与された。対照
サンプルとして乳酸菌株を用いて解析を進めた。
基礎情報として、我々の構築した二本鎖 RNA（dsRNA）の ELISA 系を用いて菌体に
含まれる dsRNA 量を測定した。
2．樹状細胞と納豆菌の共培養
マウス骨髄細胞を GM-CSF で刺激し、樹状細胞を作製した。得られた樹状細胞を納豆
菌で刺激し、翌日の培養上清中の液性因子産生量を ELISA 法により測定した。また、
遺伝子発現は樹状細胞よりRNA、cDNA を順次作成し、
qPCR 法により測定を行った。
サイトカインはインターロイキン（IL）-10、IL-6、IL-12、TNF-αを、インターフェ
ロン(IFN)は IFN-βを測定した。
3．納豆菌が T 細胞機能に及ぼす効果
マウス樹状細胞および CD4 陽性 T 細胞の共培養系（抗原存在下）に納豆菌を添加し、
T 細胞の機能分化および機能成熟への効果を評価した。
T 細胞は卵白アルブミン
（OVA）
で免疫した C57BL/6 マウスの脾臓より CD4 陽性細胞を調製し、抗原として OVA ペプ
チドを用いた。樹状細胞により産生される液性因子の種類と量は T 細胞分化の方向性を
決定づけるはたらきがあるため、2．で得られた結果と併せて考察した。樹状細胞は免
疫履歴のない C57BL/6 マウスの CD11c 陽性細胞を用いた。
＊ また、納豆菌体をマウスに経口投与した際の腸管免疫細胞の機能を評価するため、
間欠加熱滅菌の菌体調製を行った（８−９月に経口投与および解析を予定）
。
＊ 樹状細胞は骨髄由来細胞を用いた。マウス腸管由来の細胞を用いた実験が進行中で
ある。
【実験結果および考察】
１．樹状細胞と納豆菌の共培養（遺伝子発現）
タカノフーズ株式会社より供与された６株の納豆菌を用い、マウス骨髄由来樹状細胞
（BMDC）と共培養し、サイトカイン遺伝子発現誘導能を測定した（図３）
。いずれの
菌株も概ね同等の誘導活性を有し、添加する菌数依存性としては GM-CSF 誘導型樹状
細胞(2×10^5 cells)に対し、10^5 個〜10^7 個の死菌体数で比較したところ、TNF-α、
IL-12 については菌体量が少ない条件で効率よく遺伝子発現が見られた。IL-6 、IL-10、
IFN-βについては菌体量の増加と遺伝子発現誘導が比例する関係が見られた。また
IFN-βについては納豆菌 A が顕著に高い遺伝子発現誘導を示した。
また、1 型インターフェロンのシグナルが他のサイトカイン産生に与える影響を考察
するため、1 型インターフェロンレセプターの遺伝子欠損マウス由来の樹状細胞も用い
て同様の試験を行い比較したところ、
興味深いことに IL-6 の遺伝子発現の変動がブロッ
クされる現象が観察された。
２．樹状細胞と納豆菌の共培養（タンパク質産生）
１．と同様に BMDC と納豆菌を共培養し、培養上清中に産生されたサイトカインタ
ンパク質を ELISA で測定した（図４）
。TNF-α、IL-10、IL-6 のいずれも菌体量依存的
に産生量が増加していた。TNF-αについて遺伝子発現量は非常に早期に誘導されるた
め、サンプリングの時間が発現ピークを過ぎていた可能性がある。
また、１．と同様に 1 型インターフェロンレセプター（IFNRA）の遺伝子欠損マウス
由来の樹状細胞を用いた結果を野生型マウスの結果と比較したところ、
やはり IL-6 の産
生がみられず、納豆菌による IL-6 の産生誘導と IFN-βの間に連関があることが示唆さ
れた。IRF-5 と NF-kBp50 が IFN-βと IL-6 の co-regulator であることについては報告
があるが（ref 3 Steinhagen et al）
、IFN-βが IL-6 の上流に位置するかについては知
られておらず、大変興味深い結果であるため、他菌種での刺激においてもみられる現象
かなどさらに解析していく必要がある。
3．納豆菌が T 細胞機能に及ぼす効果
マウス樹状細胞および T 細胞の共培養系（抗原存在下）に納豆菌を添加し、T 細胞の
機能分化および機能成熟への効果を評価した（図５）
。OVA で免疫したマウスの脾臓
CD4 陽性 T 細胞と脾臓樹状細胞の共培養に抗原と納豆菌を添加する試験を行ったとこ
ろ、多くの納豆菌株において T 細胞からの IFN-γおよび IL-10 の産生増強と、IL-17
および IL-4 の産生を抑制する傾向が観察された。
IFN-γの産生増強について納豆菌 C は相対的に弱い活性であった。一方で、IL-17 の
産生抑制は相対的に強い結果であった。
IFN-βの遺伝子発現の増強が顕著であった納豆菌 A については、
抗原濃度が高い条件
下で IFN-γの誘導活性が相対的に最も高い結果であった。同条件下で IL-10 の産生誘
導能も比較的高かった。IL-4 の抑制活性は他の株と同様であったことから、Th2 は抑制
しながら IL-10 産生型の細胞（おそらく Tr1 型の抗炎症性細胞）を誘導しやすい性質を
持つことが推測される。今後 in vivo 試験で確認していく必要がある。
２．納豆菌中の二本鎖 RNA の解析
我々は以前の研究で、多くの乳酸菌は二本鎖 RNA（dsRNA）を豊富に含み、樹状細
胞からの IFN–β産生を促進することを示した（１）また、IFN-βが腸管免疫のみなら
ず全身性の免疫でも重要な役割を果たすことを観察している。これまでに乳酸菌以外で
dsRNA を多く含む細菌は同定できていないため、乳酸菌と同様にプロバイオティクス
として注目されている納豆菌に dsRNA が含有されているか確認する実験を行った。
細菌から核酸を調製して dsRNA を測定したところ、対照株とした乳酸菌においては
600 ng/細胞ほどの dsRNA が検出されたが、納豆菌群における検出量は低かった。これ
までの観察でも、dsRNA は乳酸菌に特徴的に検出されるのに対して、ほかの細菌群で
は数十 ng 程度の含有量であることがわかっており、納豆菌群においても dsRNA が高
いという特性はみとめられなかった。
今回評価した納豆菌 A は樹状細胞からの IFN-β産生を誘導したが、dsRNA とは異な
る成分が役割を果たしていると考えられた。納豆菌 A は T 細胞からの IFN-γ産生誘導
能も高く、その機能に IFN-βが関与しているのか、またどのような微生物成分が樹状細
胞による IFN-βの産生を増強しているのかについて、
さらに確認していくことが重要と
思われた。
【要約】
腸内環境因子としては食物と腸内微生物が多くを占めており、それらの成分が自然免
疫シグナルとして免疫システムを賦活する。このような腸管を起点とした免疫機能の成
熟は、身体の恒常性を維持する上で想像以上に大きな役割を果たしているのではないだ
ろうか。そうした疑問に対して分子レベルまでの理解をめざして、食品微生物である納
豆菌が樹状細胞及び T 細胞に対して及ぼす影響を評価した。樹状細胞に対して、納豆菌
６株は TNF-α、IL-10、IL-6 のいずれに対しても発現を増強した。脾臓由来ナイーブ T
細胞と骨髄由来樹状細胞の共培養に抗原と納豆菌を添加する試験を行ったところ、多く
の納豆菌株において T 細胞からの IFN-γおよび IL-10 の産生増強と、
IL-17 および IL-4
の産生抑制を促進する傾向が観察された。Th1/Th2 比（IFN-γ/IL-4 比）の増強による
アレルギーの制御や、Th17 細胞の制御による自己免疫性疾患の抑制などに貢献する可
能性が示唆された。納豆菌のプロバイオティクスとしての価値が提唱されており、今後
in vivo 試験において上記の現象が再現されるのか、健康増進に寄与する現象であるのか
などを評価していく必要がある。
【文献】
1. Kawashima T, Kosaka A, Yan H, Guo Z, Uchiyama R, Fukui R, Kaneko D,
Kumagai Y, You DJ, Carreras J, Uematsu S, Jang MH, Takeuchi O, Kaisho T,
Akira S, Miyake K, Tsutsui H, Saito T, Nishimura I, Tsuji NM. Double-stranded
RNA of intestinal commensal but not pathogenic bacteria triggers production of
protective interferon-β. Immunity. 38(6):1187-97, 2013
2. Kosaka A, Yan H, Ohashi S, Gotoh Y, Sato A, Tsutsui H, Kaisho T, Toda T, Tsuji
NM. Lactococcus lactis subsp. cremoris FC triggers IFN-γ production from NK
and T cells via IL-12 and IL-18. Int Immunopharmacol. 14(4):729-33, 2012
3. Steinhagen F, McFarland AP, Rodriguez LG , Tewary P, Jarret A, Savan R,
Klinman DM IRF-5 and NF-κB p50 co-regulate IFN-β and IL-6 expression in
TLR9-stimulated human plasmacytoid dendritic cells. Eur J Immunol. 43: 1896–
1906, 2013
【謝辞】
本研究を遂行するにあたりまして試料提供など多大なご協力を賜りましたタカノフー
ズの西谷 啓氏、西川宗伸氏始め研究所の皆様に感謝申し上げます。また、研究助成金
を賜りました公益財団法人タカノ農芸化学研究助成財団に重ねて御礼を申し上げます。