Page 1 Page 2 480 新潟医学会雑誌 第 ー24巻 第 9 号 平成 22年 (20

47
9
ラ ッ ト心 筋 梗塞 再 環 流 モデル に対す る
アシアロエリスロポエチン投与の有効性
高
山 亜
美
新潟大学大学院医歯学総合研究科循環 器学分野
(
主任 :相滞義房教授)
The Effects of Asialoerythropoietin on Coronary Reperfusion Model in Rats
Tsugumi
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旨
【目的】急性心筋梗塞の予後は経皮冠動脈 インタ-ペ ンシ ョン治療の標準化によって改 落した
が,これ に代 わ って慢性心不 全の治療があ らたな 目標 となった,赤 血球造 血因子のエ リスロポ
エチ ン (
EP0)には造 血器以外の臓器 .組織 に対す る生存/保護作 用があることが明 らかにな
って きた 我 々はこれ まで各種 EPO誘導体の生物作用の違 いに関す る一連の研究 をお こなって
きたが,今 回は ラッ ト心筋梗塞再環流モデル を用いて EPO とアシアロ EPO (
AEPO) の心筋保
護効果を比較 した.
【
方法 と結 果】 ラッ ト冠動脈左前 F降桟 を 30分間結梨す ることで心 筋梗塞 再環流 モデル を作
成 した.5
00I
U/kg/da
yの EPO または AEPO またはメデ ィウムの持続静脈内投 与･
を行 い,28日
%) はコン トロ
後の心機能 ,組織染色,および心臓での mRNA 発現 を比較 した.左室駆 出率 (
-ル :42.
6± 2.
3,r
hEPO 投与群 :5
3.
2± 5A,r
hもEPO 投 等群 :60.
2± 5.
2で あった.また心
筋梗 塞面積比 率 (
%)はコン トロ-ル :8.
24± 0.
8
8,r
hEPO 投 与一
群 :7
.
6
8± 0.
53, r
hAEPO 投
与群 :3.
1
7± 0.
68 (
p< 0.
01) であった.r
hEPO 投与 による心筋梗塞 および 心機能 の 改善効果
はわずかで あったが,r
hAEPO による攻 落効 果は顕 著 であった AEPO群 では心筋 の 抗 アポ ト
ーシス因子 Bc
卜 2お よび心筋保護因子 eNOSの強 い発現 が見 られ た.EPO段 与野 では 多血症
による心負荷増大 に起 因す ると思われ る I
L-6お よび BNPの発現増強 が見 られ たが,AEPO 投
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劉刷請求先 :〒951-851
0 新潟 市中央 区旭町 遜 1-7
5
7
新潟大学医学 部第 .
内科学教室
高 山 亜 美
4
8
0
新潟 医学会雑誌
第
1
2
4巻
第 9号
平成
2
2午 (
2
0
旦
0
)9月
与では多血症の誘発はなかった.心臓 における E
P
O を介 した生理的なパ ラタ リンのシステムを
推測す る目的で,正常 ヒ ト細胞 を用いた mRNA発現解析 を行 った.冠動脈血管内皮および同平
P
Oの発現が見 られ,心筋 に対す る恒常的な細胞保護作用に関 与している可能性が推測
滑筋に E
された.
【
結論】AEPO は多血症 を誘 発す ることな く,強 い心筋保護作用 を抱っ ことが示 された,本
EP
O誘導体はおそ らく生理的な生体内自然物の lつであり,安全に臨床応用 される[
3
1能性 があ
P
Oを介 した,心筋保護の生理的
る.また心臓では冠動脈血管内皮および閲平滑筋の発現す る E
パ ラタリンが存在す ることが示唆 された,
孝一ワー ド :心筋梗塞,再環流モデル,エ リスロポエチ ン,アシアロエ リスロボエテ ン,心筋保
護作用
緒
筋 梗塞 1校 病 変 患 者の PCI後 に 1
2
,
0
0
0国際単 位
口
の
急性 心 筋梗 塞
(
AMI) は力テ-テル的 にバル ー
r
b
EP
Oを静 脈 内投 与 した.左室 機 能 の低 下 が
著 しい左前下降 枝 1枝病変患 者の 6ケ月後の左室
解 除 す る経 皮 冠 動 脈 イ ン タ - ペ ン シ ョン治 療
駆出 率の 自然 回復 (AL
VEF)がプ ラゼボ群 で は
5
.
3%で あったの に対 し,E
P
O投 与群 で は 1
5
.
30
/
0
(
PCI
) の 標 準 化 に よ り大 幅 に死 亡 率 が低 下 した
で あ り,E
P
O投 与 が AMI後の慢 性 心 不 全の 発症
が,それ に伴 って表面 化 した慢性 期心 不 全 によ る
を予防す ることを種害 した 7).
ンあ るい は ステ ン トを用 いて冠動 脈 狭窄 /閉塞 を
QOL 書労 働 力の低 下 お よび医療 費 の増 大 を改 善
す ることが新たなテーマ とな った.
エ リスロポエチ ン
ヒ トの E
P
Oは ア ミノ酸 1
6
5残 基 か らな る糖 タ
ンパ クで,1コの 0型 糖鎖 と 3コの N型糖鎖 を
(
EP
O)は赤血球造 血 因 子と
有 し,2カ所の
SS結合 によって
-
定 の形状 を保
して発 見 され,腎 性貧 血の治療 に用 い られ て きた.
つ 8)
.E
P
Oの生物 活性 には糖鎖 が必須 であるため
gp
o/
EP
O受 容 体 (
EP
OR)システ ムは赤 血 球 系
DNAを大腸 菌 に党現 させ て得 られ た EP
O
ヒ トc
造 血細胞 のみ な らず心 血管 系や 中枢神経 な どの 多
は活性 を持 たない.各糖鎖 の生 合成 は単糖の複雑
様 な 臓 器 に 存 在 して お り
1),
EP
ORか
らの
な付 加 と刈 り込 み の あ と,最終 的 に α (
2- 3)
J
a
b/
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t
a
t経 路 な どの細 胞 内 シ グナル を活 性 化 し,
細 胞保護 作用 ･血管 新生作 用等の 多彩 な生物作 用
終了す る
を介 して一定 の役割 を果 た してい ることが推測 さ
泌 され る E
P
Oは 1分 子 あた り 1
0- 1
4コの シア
れて い る.
P
Oとシァル化
ル酸 を有 す る.シ ァル化 され た E
シアル酸転移酵素 に よって シアル酸 を付加 されて
(シアル酸 キ ャ ッピ ング).腎臓 か ら分
AMI動 物 モ デル の治 療 実 験 にお いて ,EP
Oの
され ないか または脱 シァル化 され た シアル酸 を も
全身投与 は梗塞範 囲の縮小 と心機 能 の予 後を改善
P
O(
AEP
O)ではその生物 活性
たない アシア ロ E
した
2)3).我
々 は動 物 下 肢 虚 血 モ デ ル に対 す る
EP
Oは糖鎖末端 が ガ ラク ト
が著 しく異 な る 9), A
EP
O投 与 が鹿管新生作 用 を示す ことを示 したが 4),
AMIにお いて も虚 血心組 織 にお いて EP
Oが強 い
血管新 生作 用 を示す ことが心機 能改 善の 作 用機序
体 )10) によ って速 や か に代 謝 され るため,血 中濃
と して重要 で あることが明 らか となった 5).
度 が上昇せず i
nvi
voでの造血活性 を欠 く.
臨床 において先 行 した研究 と して,貧血 を合併
した慢 性 心 不 全患者 を対 象 と した試験 で
EP
O投
- スで終止 し,肝 臓 の ク ッパ -細胞 に発現 してい
るア シア ロ糖 タンパ ク受容体 (ガラク ト-ス受容
我 々 は これ まで各種
EP
O誘 導 体 に お け る,追
血作 用以外の生物 活性 に関す る日
日
連の研究 をお こ
与 が心機 能 を改善 したが 6),我 々は急性 心筋梗塞
な い,その 中 で T
h
EP
Oに比
Lr
h
AE
P
Oに強 い血
患者 を対 象 と したパ イ ロ ッ ト臨床試験 を,本学 を
管新生作 用 が あ り,血管再 生治療 に応 用可能 で あ
中心 と した 多施設共 同研究 と して実施 し,急性 心
2
0
0
5
0
9号 ,平 成 2
0年
る こ と を示 した (
特許第 4
高山 :ラット心筋梗塞再環流モデルに対するアシアロエリスロボエチン投与･
の有効性
l
Q剛 .今回 は急性心筋梗塞の薬物治療への応 用
4
8
1
した.
を目指 し,ラッ ト心筋梗塞 再環流 モデル に対す る
EPO と AEPOの効 果 を比較す る 目的 で研究 をお
こなった.
心腹摘出標本の処理
心基部で切断 し心臓 を摘 出 し,中心線 で心臓 を
二分割 した.中心線 よ り心基部側へ 向 けて 1mm
材料 と方法
厚で順 に切 り出 し,目視 にて梗塞部 ･境界 部 ･非
梗塞部の判定 を行 い,境 界部 を RNA抽 出 に用 い
ラ ッ ト心筋梗塞再環流モデルの作成
チ ャール ズ
リ
バ-(Yokohama,Japan)よ り 8-
た.中心線 よ り心尖 都側 は 1
0% ホル マ リンで固
定 し,パ ラフ ィンに包埋 した.この 車か ら心基部
0適 齢 の雄 kwi
sラ ッ ト (
28
0- 3
2
0
g) を購 入
1
し実験 に用いた.全ての実験手順 は Gui
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側の部分 と心 尖都側の部分 を切 り出 し (
厚 さ 5〃
m),H,
E,
染色 お よび Az
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y染 色標 本 を BX6
0顕 微
心基 部側 の Az
鏡 (
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n) を剛 ､て 20倍 で観
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,MD,USA)に基づ き無菌的に行われた.
察 し,Ol
ympusTVシステ ム DP5
0を用 いて デ ジ
研究計画 は施設の動物研究委員会か らの承認 を受
タル 画 像 を 稚 成 し た . Ma
cSCOPE (Mi
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,
けた.
Fukui
,
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n) を摺 いて画 像処理 を行 い,心 筋 梗
塞面積 比率 を計算 した.
1640メデ ィウ ム (Ni
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あ らか じめ RPMI
To
kyo,
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n) で希 釈 した リコ ン ビナ ン ト ･ヒ
ト･エ リスロポエチ ン (
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hEPO) またはアシアロ
gpo:
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hAEPO (
いずれ も Chuga
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n) を満 た した Nz
e
t小浸 透 圧 ポ ンプ
(
Mode
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4,Dur
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,Cupe
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tラ
Dur
e
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) を接続 し 37℃
ッ ト頚静脈 カテ-テル (
で4
8時間以上静置 し準備 した.
RNA発現解析 のための標本作製
EPOの作用機序 を推測す る目的で,ラッ ト♭筋
梗塞啓環流 モデルの心標本以外 に以下の ヒ トの臓
器 ･細胞 におけ る RNA発現 解析 を行 った.購 入
した ヒ ト冠 動 脈 血 管 内 皮 細 胞 (
HCAEC:Ce
l
l
ラッ トをア トロピン筋注 による前処置後,ケ タ
Appl
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go,CA上 ヒ ト冠 動 脈 血 管 平
滑筋細 胞 (
HCASMC:Ce
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),お よび
ミン筋注 によ り麻 酔 し,気管内挿管 を行い,人工
HCF:Ce
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ヒ ト心臓線維芽細胞 (
呼吸器
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k,MA) を用 いて呼吸管理
培養 を行 わず,その まま RNA を抽 出 した
ヒト
左心室 To
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lRNA (
HI
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V:
Ambi
ot
l
,
Aus
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n了rX) お
(
1
0mUkg,
80
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n) した.右側臥位で左側胸部 よ
よび ヒ ト腎 To
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lRNA (
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e
y:
Ambi
on) は
り開胸 レb臓 を霜 出 し,左前 下行枝 をナ イロン糸
その まま解析 に用いた.
で結致 し,3
0分後 に虚血解除 して再濯流モデル を
EPO お よび EPORの細 胞 当 た りの発現 豊 は極
作成 した,同時 に右 あるいは左内頚 静脈 に頚静脈
めて微量で あるため, 性 コ ン トロールサ ンプル
を得 る 目的 で健康 な男性成 人 2名 (
31才 お よび
3
8才)か ら文章 による同意 のの ちに骨髄 を採 取
カテーテル を挿入 し,浸透圧 ポ ンプを背部皮下に
埋 没 させ た.虚 血 解 除 と同 時 に r
hEPO5
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U/
陽
kg/da
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AEPO5
0
0
I
U/
kg/da
y,また は同容量の
MNC) を分離 し,そ こ
した.骨髄 か ら単核細胞 (
メデ ィウムの持続投与 を開始 し,開胸 し抜管 した.
か ら さ らに PE-標 識 抗 CD34抗 体 (Beck
on
8日後に,2% イソプル ラン吸
心筋梗塞作成の 2
D豆
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入麻酔下で心エ コー (
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ny) を用 い
て既 報 の 手順 に よ り CD3
4陽性 細 胞 を精 製 した
く
cD3
4陽性純度 それぞれ 9
0お よび 95%)
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n) に よ り心
機能 を計測 した.その後開腹 して下大静脈 よ り採
血 したのち心臓 ･牌臓 ･肝臓 を摘出 し重量 を測定
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lRNAの 摘 出 に は ト リ ゾ ル 試 薬 (Li
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新潟 医学 会雑誌
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n) を 用 い , 5l
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c
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ま
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t
a
lRNAか ら ラ ン ダ ム プ ラ イマ - 及 び Ta
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r
a
r
息1 (
Ta
ka
r
a
,
To
k
y
o
,
J
a
p
a
n)を用
PCRキ ッ トVe
いて c
DNAを酌 戴 し,走 駁PCRに用 い た.
ル の うち,L
i
g
h
t
Cy
c
l
e
rに よ る γ-ア クチ ンの 実 測
値が 1
.
0(
約1
.
8× 1
06 コ ピ -/
/
欄 総 RNA) 未満
の サ ンプ 射 ま,R
NAの 質 に 問 題 の あ る不 良 サ ン
プル と して解 析 か ら除 外 した
定量 PL
I
I
i
統言
†
mRNA発現鼠 を各 サ ンプル か ら得 られ た c
DNA
を用 い,既 報 の とお りr
e
a-七
五
meq
u
a
n
t
i
t
a
t
呈
v
e沢でpcR (Q琵T-PCR) 法 に よ って定 義 した 12).衰 1
に QR
T-PCRに 用 い た プ ラ イマ - 配 列 を示 す.
i
n
t
e
r
na
音s
t
a
n
d
a
r
dと して ヒ トPBGDまた は ラ ､
ソド
me
a
n±S
EM で 表 記 し,多群
n
e-wa
yANOV射 こよ っ て 行 い ,引
間の比 較 は o
き続 き B
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勧r
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nTe
s
tに
よ り各群 間の 差の検 定 を行 った.p<0
.
0
5を もっ
豆
各群 の測 定 値 は
て 有意 と した.
γ-ア ク チ ン を 測 定 し た . Q況
T-PCRに は
I
J
i
g
ht
Cy
c
l
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r(Ro
c
he
,I
n
d
i
a
na
p
o
h
s
,I
N) を 用 い ,
9
5℃ 5秒 ,6
0℃ 1
5秒 ,72℃ 1
3秒 を 1サ イ クル
と し計 4
5サ イクル 施 行 した.RNAll
jgあ た りの
各
の
RNAの コ ピー数 を計 算 し,各 指 標 の コ ピ-敬
PBGD (ヒ ト) ま た は γ-ア クチ ン (ラ ッ ト)
の コ ピ ー数 に対 す る比 と して表 示 した.各 サ ンプ
結
果
心機能の解析
拭 lに心 エ コーに よ る解 析 結 果 を示 す .1回心
拍出竃 は左 室 拡 張 末 期 径 (
L
VEDd)と左 等収縮
莱期径 (
L
VES
d)の 関 数 で あ り, 左 室 駆 出率
高 山 :ラ ッ ト心筋梗塞 再環流 をデル に対 す るアシア ロエ リズ ロボエチ ン投 与一
の有 効性
I
Ft
u7
273
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i
t
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町
政
1
2
3
1
1
2
3
1
国 見 心機 能 の解析
8日後 の心 機 能 を心 エ コ-で測 定 した.パ
ラ ッ ト心 筋虚 血 再 環 流 2
ネル A :心拍 数 ,ち :左室駆 出率 ,C :左 室拡 張 末 期径 ,D :左室 収
縮 末期径 ,1:1
1
･
I
帯 ラッ ト (
n=5
)
,2 :心筋梗塞 後 メデ ィウム持続投
与 (
姑 3:5
0
0王
U/
kg/
d
a
yr
hE
PO持続投与 (
5)
,4:5
0
0I
U/
kg/
da
y
r
hAEPO持続投 与 (
5).EP
O よ り AEP
Oの 方が有 意 に強 い心機能改 善
効 果 を示 した .o
ne-wa
yANOVAで 解 析 した あ と (右 上 の p値 ),
盛o
n
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s
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nTe
s
もに よ り各 離 間 の 差 の 検 定 を行
った :車,< 0
.
0
5;*車,
<0.
01;*
*串
,<0.
0
01
.
(
LVEF) は 1回心拍出量を左妾拡張末期容積で除
竃駆 出率等の機能解析 に大 きな影響 を与 える変化
した値 で ある.心拍数 (
HR/
m豆
n) は健 常 ラッ ト
ではなか った.左等駆 出率 (
%)は健常 ラ ッ ト:
(
n =5日 3
89.
0± 5.
6,虚 血再環流 後 メデ ィウム
.
5, メ デ ィ ウ ム 投 与 群 : 42.
6± 2.
3,
90.
7± 1
=
投 与群 (
4日 435.
3± 9.
0,r
hEPO 投 与一
群 (
5):
r
hEPO投 与 群 :53.
2± 54 r
hAEPO投 与 群 :
399.
8± 7.
2,r
b
AEPO投 与群 (
5):397.
8± 1
3.
7
60.
2± 5.
2,左 室 拡 張 末 期 径 (
cm) は健 常 ラ ッ
ど,メデ ィウム投与群 でやや増加 していたが,左
ド:0.
472±0.
02
9,メデ ィウム授与群 :0.
81
0±
4
8
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2
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会維誌
･
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EPO
^EPO
1
2
3
図 2 心F
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J
Hl
l
糊淡2
8H後の心服 を胤 L
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心線で 2/
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桁,F段 心/
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l
T 心前傾避
とした (
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而糊のL
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l
1
7
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L
に対する比率を洲'
,
i
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i
パネル E ′てネル A i
f
:
'
F
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ノト (n- 5).パ1ル B
およびパ イ ル E- 1(
∠
l
) メデ ィウム持続1
'
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j.バイル Cおよびパネル E
/2(
5
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l
l
T
二
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O持続柁 I
),/､
ネル r
)およびパオル 】
二-3(
5
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OよりA
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に倣い心筋樺准郁小
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Aで解析 したあと (
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3
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2
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8±001
5
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3
5±
投 与耶 06
oo
3
8.1
1
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j一
群 .04
4
4± 00
3
6で あ った
メデ ィウム投 J
J肺 と比 較 して EPO l
i
L
r
j即 で は心
機 能 がやや改 粥 したがイ
う意 では なか った 後述 の
とお り EPOf
'
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Ll
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一
郎 で は 多r
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:に よ る心 Fll
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人が あ り.これが心機 能t
l
の イ＼1分 な
て い た可 能性 が あ る
阿fi
lL
二形響 し
方,AEPO粒 I
1肝 では不
意 に 掛I
J
]
な心機 臆 の改 # 効 果が見 られ た
心 筋梗塞 面積 縮小効 果
a
nMa
l
l
oT
Y染 色 憤 本 お よ
図 2に心 馴 娘非 の Az
EPO誘 導体 の造 血作 用
図 3に赤 血球 造【
仙7C進の マー カー と して,r
T
l
L
中
ヘモ グ ロ ビ ン他 お よび順臓 市T
l
Lを示 す ラ ソFお
(
T
l
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l
亡進 に際 して王 に鵬1
J
臓で0)
よびマ ウスでは造l
赤l
l
l
雌 系 の胤外 造L
(
l
L
が槻繁 され る Hb (
g/dl
)測
l
l- 5
) 1
31± 03
.メデ ィ
定I
l
l
1
は惟 荷 ラ ソ ト (
n- 4) 1
28± 03.EPOf
i
Lt
J肝
ウ ム粒 I
j耶 (
(
5
).1
99± 1
,
2
,AEPO授 与群 (
5
) 1
36± 08
で あ り,また順 臓 郡 諒 (
i
,
)はf
W滞 ラ ッ ト●05
3
2
± 00
0
2
. メ デ ィウ ム 投 ,
ji
汗 06
6
1± 001
5
.
EPOI
i
LI
i
J耶
121
0± 01
5
5
.A上PO授 与 群 ●
06
6
9± 00
3
5で あ った EPO投 与酢 で は 掛 I
J
Jな
赤r
l
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r
r
L
O
)
)
t北 が見 られ たが.AEP
O投 与 即 で
の 造 血の ノ
■
L進 は観察 され なか った
この ことか ら
r
l
i
棚比率
び心 筋 横堀 血糊の 測T
t
Jを示 す 心 筋梗韮(
EPO粒 I
j伴 で は 多r
r
E
l
山三
誘 発 に よ る心 貝7
,
.
l
f
の 桝人
(% ) は メ デ ィウ ム 投 I
j肝 (
n- 4) 824±
08
8,EPO 授 与桝 (
5
).76
8± O5
3,AEPO投 与
群 (
5)
):31
7±06
8で あった メデ ィウム投 プ̀
O粒 与 群 では有 意 な心 f
T
J
)
峻 拒 面 材i
の
群 に比 LEP
O投 L
j郡 で はイl
,
i
l
i
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縮 小 は見 られ なか ったが,AEP
な心筋 雌'
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L
L
l糊の鮒小 が軌解 され た
が存在 す ることが想 定 され た
心筋梗塞境界部 にお け る mRNA発現*
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1
す 心崩 似非 .
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Wで は組織 の壌 タヒ
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が破 く mRNAの 解 析 が で きな か ったの で .嶋 '
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部 での解 析 を/
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7
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特異 的 なマ -カ-て あ
4
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5
高山 :ラッ ト心筋梗塞再環流モデル に対す るアシアロエ リスロボエチ ン投 与の有効性
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1
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董
1
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j
J
図 3 EP
O誘導体の造血作用
ラッ ト心筋虚血 再環流 28日後の血 中ヘモグロビン値 (
パ ネル A) お よび牌
重量 (
パ ネルB,髄外造血) を示す.1:正常 ラッ ト (
n-5
)
,2:心筋梗塞後
メデ ィウム持続投与 (
4),3 :r
hEPO持続投 与 (5),4 :r
hAEPO持続 投 与
(
5).EP
O投 与によって赤血球造血の先進 が観察 され るが,AEPOには造血作
用 が 認 め られ な い .o
ne-wa
yANOVAで 解 析 し た あ と (右 上 の pl
直),
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tによ り各群 間 の差の検定 を行 った :
*
*
.<0.01 ;**車.<0.001.
る COX6
Aの 発現 量 は,メデ ィウム投 与群 ,EPO
び心筋 に発現 し,発現細胞 自身 に対す る保 護摩周
投 与群 お よび AEPO 投 与群 で ほぼ等 しか ったの
NOS発現 最の分布 には有意差 が見 られ
を持つ.e
で,この 3群 の他 のマ- カ-の比較 に心筋屋の影
な か っ た が ,AEPO 投 与▲
群 で Bc
l-2と 同 様 に
響 を考 えな くて よい.また組織 に浸潤 してい る白
eNOSの発現墓 が高 い ことか ら,これ も AEPO に
血球量 の マ-め-で ある CD45の発現量 は,有意
よ る直 接 または間接 の作 用 で あ る可 能性 が あ る.
差 は出なか った ものの,メデ ィウム投与群 や EPO
L-6が eNOSの発現 を抑制す ることが知 ら
また I
投 与群 に比 L AEPO 投 与群 で は正常 ラ ッ ト程 度
れ て い るが
に低 い値 を取 った ことか ら,白血球 に由来す るマ
L-6の影響 で ある可能性 がある.
ない ことは I
1
3),EP
O 投 与群 で
eNOSの発現 が少
ーカ-の解釈 に影響 を与 える.
心 不全 に呼 応 して発現 の 上昇す る BNPの分布
は,図 1の心機 能 の分布 とは関連せず,図 3の血
正常 ヒ ト心腹細胞成分 における mRNA 発現
EPO/EPO受容体 システムの心 にお け る生理 的
中ヘモグロビン値 の分布 と 致 した ことか ら,多
な意義 を理解す る目的 で,正常 ヒ ト心の各種細胞
血症 による心負荷の増大 を反映 した もの と推測 さ
n- 2,図 5).EPO
での mRNA発現 を解析 した (
一
巨 2は主 に白血球 や心筋 に発現す る抗 ア
れた.Bc
お よび EPORは他 の分 子 に比 し生 理 的発現 巌 が
ポ トーシス因子 で ある.AEPO 投 与群 では白血球
少 ないため ,mRNA発現 量 が少 ない場合の評価 が
巨2の発現 量
マ - カーが少 ない に も拘 わ らず Bc
問題 とな る.骨髄 では未熟 な造血前駆細胞 か らの
が多い ことか ら,心筋での Bc
卜 2発現 が誘導 され
EPO 分泌 によるオ - ト/パ ラタ リンシステ ムの存
た ことが推測 され た,
I
L-6の発 現 は BNPの発現 の分布 と日
日
一
致 した
在 が知 られてい るので
1
4),正常人骨髄
CD3
4陽性
細胞 を陽性 コン トロ-ル と して比較 した.
ことか ら,や は り多血症 による心負荷 の増大 を反
NOSが発
血 管 内皮 お よび心 筋 の細 胞 内 には e
映 した もの と推測 され た.eNOSは血管 内皮 お よ
現 してお り,細胞保護作用 に寄与す る 15).また抗
48
6
新潟 医学 会錐誌
tり＼(
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1
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第1
2竣巻
第 9を
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]
三
j
J
図 4 心筋梗塞境 界部における mRNAの発現 農
壬
を
8日後の心臓 を摘 出 し中心線 で 2分 断 し,中心線 よ り心基部
ラ ッ ト心筋虚血 再環流 2
側へ向 けた連続 切片 を作成 し,心筋梗塞境 界部か ら RNA を抽 出 した.各 RNA コ ピn- 4)
,2 :
数の γ-アクチ ン RNA コピー数 に対す る比 を解析 した.1 :正常 ラッ ト (
心筋梗塞 後 メデ ィウム持続投 与 (
3),3 :r
hEPO持続投 与-(
3)
,4 :r
hAEPO持続投
与 (
5)
.心筋特 異的マ- カ-の COX6
A発現 毅には差がな く,浸潤 した自血球のマ-カ
- CD45の発現 墨 では EPO投 射 二比 LAE王
)
0校 与で少 ない傾 向 が見 られ た.心不 全
マ-カ - BNPは EPO投 与でg)み 賢 しい 上
膏摘 ミ
見 られ,多血症 による心 不全の発症 が
群で は CD4
5発現 当
麦が少 ないに も拘 わ らず,白血球 お よび心
推測 され た.AEPO投 与･
筋 に主 に発現 してい る銑 アポ ト-シス囚f
-Be
t
-2の強 い発現 が見 られ,心筋の Bc
l
12
誘導作用 があることが推測 され た.EPO投 与一
群で I
L-6の誘導 が見 られ たが,EPO に
よる直接作用か心 不 全による誘導 かはわか らない.血管 内皮および心筋 に発現 してい
る細胞保護作用の ある e
NOSは,AEPO投 与一
群で発現の 多い傾向が見 られ た
高汗‖ ラット心筋梗塞再環流モデルに対するアシアロエ リスロボエチン投 与の有効性
4
8
7
アポ トー シス因子 の 1つ で あ る Be
i-2は血 液 細
体 に対す る親 和 性には差 がない と思 われ るが,β
胞 お よび心筋細胞 に発現 して い ることが知 られ て
Cの
リガン ド結 合部位 周 辺 には酸性 ア ミノ酸 残 基
HLV) お よび
い る 碑 .主 に心 筋 か らな る左 書 く
wSXWSモチ - フ
が ク ラス ター を形成 す る部位 (
HCAEC) に eNOSが発現 して
冠動 脈血 管 内皮 (
の近俸 ) と塩 基性 ア ミノ酸 残基 が ク ラ ス ター を形
おを
つ,他 の 細 胞 に は発 現 して い な か った. また
成 す る部位 (
前 者 よ り膜 寄 り) が存 在 し,AEPO
HLV ･HCASMCお よび骨 髄 細 胞 に BC卜 2が 発
の糖 鎖 は 前者 に EPO の糖 鎖 は筏 酎 二結 合 す る 可
現 して お り,他 の細 胞 に は発 現 して い なか った.
能性 が あ り,これ に よ って WS
XWSモチ - プを介
この ことか ら mR
NA発現 巌 の解 析 に信 頼 性 が あ
した細胞 内への情報 伝 達 に差 が生 じる可能性 が指
ることが推測 され る.
摘 され る 1
8
)
造血系 未分化細 胞 に 重
し-6受容 体 が発現 してい
我 々の 今回の検討 で は,心筋細 胞に EPORが発
ることが知 られて い るが,心 臓成 分で は冠動 脈血
現 してい るか ど うか は明 らかで はなか った,造 血
管 平滑 筋 細 胞 凋 CASMC) お よび心 線 維 芽 細 胞
のみ な らず心 臓 の 発 生 にお いて も EPOfEPORシ
(
HCF) に恒 常 的 に I
L-6が 発現 して お り,一 方
ステ ム は必 須 で あ り 頼 ,胎 児期 に お け る心 筋 細
I
L-6受 容 体 は HLV に わ ず か に 発 現 して い た.
胞 の増殖 には心 外膜 か ら分泌 され るエ リス ロポエ
EPO は HCAECお よび HCASMCで骨髄 CD34陽
チ ンと レチ ノ イン酸 が必 要 で あ る 20). EPO投 与
性 細 胞 に匹 敵 す る発現 壷 が み られ,HL
V お よび
は虚 血性 心 筋 障害 を改 善 す るが 3
)
,その機序の 1
HCFでの測 定 値 は低 く,発 現 して い な い可 能 性
が高 い.また腎臓 に は EPO の恒 常 的 な 発現 は見
られ なか った.心臓細胞成 分 にお け る EPORの恒
常 的 な発現 は微 量 で あ る.この こ とか ら HCAEC
お よび HCASMCにおいて お そ らくパ ラタ リンと
EPORが発現 してい る ことを免疫 染 色法 に よって
して発現 して い る EPO の心 内 にお け る標 的細 胞
示 して い る 21),成 体 ラ ッ トを用 い た研 究 で も心
種 は不明で あ った.
筋 細 胞 に EPORが発 現 して い る とい う もの が あ
つ と して,EPO投 写が虚 血 に よって誘導 され る心
筋 細 胞 の アポ トー シス を心 筋 の Ak卜 依 存性 シグ
ナル経 路 を介 して阻 害 す る こ とが報 告 され て お
り, この 中 で 新 生 児 ラ ッ トの 心 室 心 筋 細 胞 に
るが,彼 らは 免疫 染 色 法 お よび定 性 的 RT-PCR
考
察
法 に よって示 して い る 22).彼 らが RT-PCRに用
いたサ ンプル は ラング ン ドル フ還流 法 に よ って心
肝臓 での連 やかな代謝 を受 け,血 中濃度が上昇
臓 か ら得 られ た もの で あ り,心 筋 細胞以外 の成 分
しないため造血活性 を欠 く AEPO が,なぜ この よ
を混 じて い る可能性 が あ る.元来 ,EPORは他 の
うな強 力 な心 筋 保 護 摩 周 を持 つ の か は不 明 で あ
サ イ トカ イン受容 体 と比 較 して,は るか に少 ない
る.造血系 に発現 して い る EPORl量体 は EPO の
量 しか発現 してお らず,抗 EPOR抗 体 を用 いて細
存在 円ニホモ 2敬体 を形成 して Ja
k2/s
t
at
5経路 を
胞 を染色 す る ことには国難 が あ ったが,ま してや
介 して細 胞 内 へ シグ ナ ル を伝 え る. これ に対 し
そ発現 巌 の 少 な い非 造 血 系 細 胞 で は
さ らに EPOI
EPO感 受性 の非 造 血 系組 織 に は EPORとサ イ ト
免疫 染色法で判断 す る ことには 慎重 を要 す る.こ
カ イン受容体共通 β鎖 (I
? C,
CD1
31)のヘ テ ロ 2
れ に対 し,EPO の作 用 が心 筋 での Akt一経 路 お よ
鼠 体 と して存 在 し,や は り J
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5の リン酸 化
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を介 した活性 化 が行 われ る 1
7
)
.EPO の糖 鎖 末 端
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,精 製 した心 筋 細 胞 お よび 心 臓 線 維
ル -プは 芝
は シアル酸 で終 止 し,3つ の N型糖鎖 と 1つ の
0型糖 鎖 はいず れ も末 端 が強 く陰 性 に荷電 す る
芽 細胞 か らそれ ぞれ抽 出 した蛋 白 をサ ンプル と し
た We
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ot解析 に よ って,EPOR蛋 白が心 筋
が,AEPO で は ガ ラク ト- スが霧 出 して陽性 に荷
細 胞で はな く線維芽細胞 に発現 して い る ことを明
電 す る.EPO と AEPO は i
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oで は 同等 の赤 芽
らか に した 24). EPO は線 維 芽 細 胞 に例 日
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球増殖 活性 を示 す ことか ら,両者 の EPORそれ 自
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3らかの液性 国子の 分泌 を介 して心筋 の J
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新潟 医学会錐誌
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第
9号
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図 5 ヒ ト組織 ･細胞での RNA の発現
各パ ネルの カラムの うち,1:左軍 ,2 :冠動脈 血管 内皮 ,3 :冠動
陽性細胞 ,7 :腎臓.
心筋 ) と内皮 に発現 して い る.パ ネル
パ ネル A :eNOSは 左室 (
a :Bc
l
-2は 血液 細 胞 と左等 お よび 平滑 筋 に発現 して い る,パ ネル
C :IL-6は平滑 筋 と線維 坪細胞 に発現 してい る.パ ネル D :I
L6受
容 体 は造 血前駆 細胞 に発現 している,心筋細胞 に もわず かに発現 して
Oは造血 前駆 細 胞 ･内皮 お よび平
い る可能性 が あ る.パ ネル E :EP
滑 筋 に発現 してい る.パ ネル F :EPO受容体 は骨髄 細 胞 に発現 して
い る.心臓 におけ る発現 墨は少ない
高山 :ラッ ト心筋梗塞 再環流 モデルに対す るアシアロエ リスロボエチ ン没 年の有効性
4
8
9
経 路 を 活 性 化 す る と結 論 づ け て い る .実 際 ,
血 に反 応 して EPO を産 生 ,分 泌 す る細 胞 が何 で
EPORc
ondi
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lKO を用 い た心筋梗 塞 再環流 モ
あ るか を調べ る必要 が ある.
デル実験 で も,EPOの心 筋 へ の作 用 には s
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3の
リン酸 化 が係 わ ってい ることが示 されてい る 25)
EPORシステ ムが重要 な
心 臓 とな らんで EPO/
働 きを してい る臓 器 に率枢 神経 が あ る.中枢神経
EPO が心 線 維 芽 細 胞 に作 用 して 分泌 され る心
で も虚 血 に反応 して EPO お よび EPORの 発現 が
筋保護性 サ イ トカイ ンは何 か とい うことが新 たな
克進 す るが,それ ぞれ 発現 して い る細胞 に関す る
問 題 とな る.心 筋細 胞 に は I
L-6
Rが 発現 して お
信頼 の おけ る研究 は意 外 と少 ない.少 な くと も純
り,I
L-6は CD1
2
6
/GP1
30へ テ ロ受 容 体 を介 し
化 した細 胞 の i
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oの反 応 に関 して は,神 経 細
て GP1
3
0の 活 性 化 に よ り s
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3を リン酸 化 す る.
胞 ･血 管 内皮 お よび ミクログ リアは酸 化 ス トレス
GP1
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0は 1
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負 荷 の培養 条件 で外 来 性 EPO に反 応 して い るの
通 β鎖 で あ り,これ らいず れの サ イ トカイ ンに よ
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t
3の リン酸化 は起 こる.また,AEPO に
って も s
は強 い血管新生作 用 が あるが,これ は AEPO が線
維芽細胞 か らの は -6分泌 を活性 化す る ことによ
違 い ない 27).また虚 血 反応 性 に EPO の 発現 が克
る間接作 用 で ある と考 え られ る 2
6
)
, しか も,EPO
の心筋 梗塞 改 善作用 には,心臓虚 血部位 での 血管
が報 告 され たのです ら,2
0
08年 にな ってか らで あ
る2
8
)
新生 効 果 が重 要 な働 きを してい た 5). AEPOの心
EPO は赤 血 球 系 細 胞 の生 存 に必 須 の 因子 で あ
で,これ らが EPORを発現 してい る ことはほぼ間
進 す るの は主 に海 馬 ･内包 ･皮質 お よび 中脳 で あ
るが,具 体 的 な分泌 細 胞 の 正確 な特 定 には注 意 を
資す る.実際,腎臓 にお け る EPO分泌細胞 の 同産
L-6分泌 を介 した間接 作 用 で
筋保護 作 用 も再 び I
り,腎 は貧 血 ･低 酸 素 応 答 性 に EPO を分 泌 す る
あ ることは十 分 に考 え られ る.今回の研究 で は心
が恒 常 的 に は EPO を分 泌 して い な い こ とか ら,
筋梗塞後早 期の I
L-6の発現 を調べていないので,
恒 常 的 な造 血 において は赤 血球 系細胞 の生存 を保
L-6は本質的
これ につ いて は不明で あ る.また,王
証 す るため に骨髄 内 での EPOのパ ラタ リンシス
に は急 性 期 に分 泌 され ,組 織 保 護 お よび 血 管 新
生 ･肉芽形成 な どの治癒機 転 に大 きく係 わ るマ ス
テ ムが存在 す るこ とが推測 され る,実際 に,赤 芽
球
系
前
駆
細
胞
(
CD34陽性 細 胞 の一 部 ) それ 自身
タ-サ イ トカ イ ンの 1つ で あ るが,慢 性 的 な I
L6の発現 は本 来病 的 な現 象で あ り,慢 性 炎 症性貧
が EPO を分泌 す るよ うで あ り 2
9
)
,今 回 の検 討 で
血 ･関節 炎 ･心肥大 な どの不適切 な生体反応 を惹
発 現 して い た.これ を EPO 発現 細 胞 の陽性 コ ン
起 す る.
ところで心 臓 を形 成 す る主 な細 胞 は心 筋細 胞 ,
も骨 髄 CD3
4陽性 細 胞 が一 定 の EPO を恒 常 的 に
NA
トロ-ル と して,ヒ ト心臓 の各種細胞 での mR
発現 を観 察 した結 果,冠動 脈血管 内皮 お よび平滑
血管 内皮細胞,血管 平滑筋細胞 お よび筋線維 芽細
筋 細 胞 が心 臓 にお け る EPO産生 細 胞 で あ る可 能
胞 を含 む線維 芽細胞群 で あ り,他 にマ ク ロフ ァー
性 が示 唆 され た.血 管 内 皮 お よび平 滑 筋 は EPO
ジや肥 満細胞 お よび 毛細血管周 囲 に分布す る白血
分泌 を介 して心筋 を保護 す るには都 合の良 い 解剖
球 が存在 す る.全 身の貧血 または低酸素 血症 に呼
学 的 な位置 にあ る.虚 血 に陥 った骨 格 筋組織 ･心
応 して 腎臓 か らの EPO分 泌 が起 こるが,心 臓 に
臓 あ るい は中枢 神 経 で発現 す る EPO が AEPO で
限局 した心筋虚 血 の場合 は これ に該 当せず,心臓
あ るか否 か に興味 が招 たれ る.今後 ,プ ロテオ ミ
内での EPO/
EPORパ ラタ リンシステ ムの存 在 が
クス解 析 法 を用 い て,パ ラタ リン EPO の糖 鎖 解
想 定 され る.上 記 の よ うに心 筋 虚 血 に反 応 して
析 を行 う予定 で あ る.
EPORの発現 が増強 す る心 線維芽細胞 が,同 じく
虚 血 に反 応 した細 胞 の 分泌 す る EPO に よって刺
結
語
激 され,何 らかの液性 因子 を介 して心 筋保護僅 用
を発現 す る こ とが想 定 され るが 24),心 臓 内 で虚
EPO に は直 接 また は間接 作 用 と して の 心 筋 保
4
9
0
新潟 医 学 会雑誌
第
1
2
凍巻 第 9号
護作用があ り, 一部 の 施 設 で は 急 性 心 筋 梗 塞 の薬
物 療 法 と して EPO 投 与 が 試 み ら れ て い る.非 造
血性 EPO 誘 導 体 の AEPO に は ぬ 然 型 EPO よ り
もは るか に強 力 な心 筋 梗 塞 治 療 効 果 が認
め られ
た .今 後 ,臨 床 へ 抗沌転用 が 期 待 され る .
謝
辞
本 研 究 に お い て ご指 導 を賜 りま した第 巾
内田学教室
相 澗兼 房教 授,鳥羽 健講師 , 塙 晴 雄 講師 ,お よび保 健 学
科 基 礎 生 体情 報学 講座
伸
澗 幹 雄 教 授 に深 謝 い た しま
す . また,共同 で研究 を行 った第 二外科学教等 の磯 肝 学
先 生 お よび盲
覚見 冬樹先生に心 よ り深 謝 いた します.
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