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JP 2012-232982 A 2012.11.29 10 (57)【要約】 （修正有）
JP 2012-232982 A 2012.11.29 (57)【要約】 （修正有） 【課題】動物において体重および大きさを調節するための方法および組成物の提供。 【解決手段】約１０％∼約３０％のグリシン、グリシン類似体類またはその組み合わせと 、約７０％∼約９０％の低カロリー食、低脂肪食、低炭水化物食またはそれらの組み合わ せとを含む飼料組成物。グリシン類似体は、下記一般式（Ｉ）のＮ−アルキル化グリシン またはグリシンアミドまたはアミノメチルスルホン酸化合物である［式中、Ｒ１および／ またはＲ２はＨであってもよく、Ｒ１および／またはＲ２はＭｅ、ＥｔまたはＰｒであっ てもよく、Ｒ１および／またはＲ２はＢｎであってもよく、Ｒ１および／またはＲ２は（ ＣＨ２）２∼５であってもよい。 10 【選択図】なし (2) JP 2012-232982 A 2012.11.29 【特許請求の範囲】 【請求項１】 動物において白色脂肪組織を低減する方法であって、動物に約１０％∼約３０％グリシ ンを含む高グリシン食を投与するステップを含む方法。 【請求項２】 高グリシン食がグリシン類似体ｃまたはグリシンとグリシン類似体の組み合わせを含む 、請求項１に記載の方法。 【請求項３】 動物の白色脂肪組織においてアポトーシスを誘導する方法であって、動物に約１０％∼ 約３０％のグリシンを含む高グリシン食を投与するステップを含む方法。 10 【請求項４】 高グリシン食がグリシン類似体、またはグリシンとグリシン類似体の組み合わせを含む 、請求項３に記載の方法。 【請求項５】 動物の白色脂肪組織においてアミノ酸位置１３６のＢＡＤのリン酸化を低減する方法で あって、動物に約１０∼約３０％のグリシンを含む高グリシン食を投与するステップを含 む方法。 【請求項６】 高グリシン食がグリシン類似体、またはグリシンとグリシン類似体の組み合わせを含む 、請求項５に記載の方法。 20 【請求項７】 白色脂肪組織を低減する方法が白色脂肪細胞の大きさを低減するステップを含む、請求 項１に記載の方法。 【請求項８】 動物において体重を減少させる方法であって、動物に約１０％∼約３０％のグリシンを 含む高グリシン食を投与するステップを含む方法。 【請求項９】 体重を減少させる方法が、動物において腹部脂肪含量を低減するステップを含む、請求 項８に記載の方法。 【請求項１０】 30 高グリシン食がグリシン類似体、またはグリシンとグリシン類似体の組み合わせを含む 、請求項８に記載の方法。 【請求項１１】 方法が運動計画、低脂肪食、低カロリー食、低炭水化物食、外科的介入、行動療法、薬 物療法またはそれらの組み合わせなどの補助的減量療法をさらに含む、請求項８に記載の 方法。 【請求項１２】 大きさの減少した動物または体重の減少した動物を作製し、次いで、正常な大きさまた は正常な体重に戻す方法であって、大きさの減少した動物または体重の減少した動物を作 製するために、幼若動物に高グリシン食を投与するステップと、次いで、正常な大きさの 40 動物または正常な体重の動物を作製するために、その動物に正常食を投与するステップと を含む方法。 【請求項１３】 約１０％∼約３０％グリシン、グリシン類似体またはそれらの組み合わせと、約７０％ ∼約９０％の低カロリー食、低脂肪食、低炭水化物食またはそれらの組み合わせとを含む 、動物における減量のための飼料組成。 【請求項１４】 低脂肪食が低飽和脂肪食である、請求項１３に記載の飼料組成。 【請求項１５】 大きさの減少した動物、または体重の減少した動物、または大きさが減少しかつ体重が 50 (3) JP 2012-232982 A 2012.11.29 減少した動物を作製する方法であって、幼若動物に約１０∼約３０％のグリシンを含む高 グリシン食を投与するステップを含む方法。 【請求項１６】 高グリシン食がグリシン類似体、またはグリシンとグリシン類似体の組み合わせを含む 、請求項１５に記載の方法。 【請求項１７】 白色脂肪細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、脂肪細胞に１種以上のグ リシン類似体、またはグリシンとグリシン類似体の組み合わせを投与するステップを含む 方法。 【請求項１８】 10 白色脂肪細胞においてアミノ酸位置１３６のＢＡＤのリン酸化を低減する方法であって 、脂肪細胞に１種以上のグリシン類似体、またはグリシンとグリシン類似体の組み合わせ を投与するステップを含む方法。 【発明の詳細な説明】 【技術分野】 【０００１】 本願は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる２００４年１１月２日に出願さ れた米国出願第６０／６２４，２２８号の利益を主張する。 【背景技術】 【０００２】 20 米国では、成人の６０％が過体重または臨床的に肥満と考えられる臨床的必要条件を満 たし、毎年３００，０００人の死亡をもたらすと推定されている。エーベルハイト(Eberh ardt)ら、アーバン・アンド・ルーラル・ヘルス・チャートブック(Urban and rural heal th chartbook.)２００１、ヘルス(Health)、米国、ハイアッツビル(Hyattsville)（メリ ーランド州）：ＮＣＨＳ．２９６頁、通則、過体重および肥満を防ぎ、低減するための公 衆衛生局長官の実施要請(The Surgeon Gneral’s call to action to prevent and decre ase overweight and obesity)：２００１、Ｒ．Ｍ．米国保険社会福祉省(U.S. Departmen t Health and Human Services)編、２００１参照のこと。２００１年に、米国の公衆衛生 局長官は、過体重または臨床的に肥満である個体の発生および蔓延を防ぎ、低減するため の実施要請を出した。過体重および肥満を防ぎ、低減するための公衆衛生局長官の実施要 30 請：２００１、Ｒ．Ｍ．米国保険社会福祉省(U.S. Department Health and Human Servic es)編、２００１。興味深いことに、この報告書では、この問題に対する薬剤によるアプ ローチの適用または使用については何も触れられていない。しかし、産業的研究機関およ び学問的研究機関の双方による、薬剤によるアプローチの開発は相当興味深いものである 。薬剤によるアプローチは、適用および使用がおそらく容易なために、より大きな服薬遵 守という強力な見込みがあるので魅力的である。 【０００３】 世界中からの疫学的研究により、死亡と肥満症の間には論争の余地のない相関関係が実 証されている。我々の健康目標の達成において、感染症、心疾患、糖尿病および特定の癌 の予防および制御に関して過去５０年以上かけてなされてきた進歩は、肥満症の蔓延の広 40 がりによって大幅に相殺された。２００１年には、小児および十代の少年少女のうち約２ ５％が過体重であり、これは、ちょうど２０年前のパーセンテージの２倍を上回るもので ある。現在、６０％をはるかに上回る成人が、過体重または肥満であるとわかっており、 米国単独で、年に３００，０００人を上回る死亡が、これらの状態に直接的に起因する。 これらの発見は、あらゆる人種、年齢、民族および男女ともにまたがるものであるが、特 定の集団、特に、低い社会経済的集団が、その他のものよりもよりその傾向があることは 明らかである。過体重および肥満を防ぎ、低減するための公衆衛生局長官の実施要請(The Surgeon Gneral’s call to action to prevent and decrease overweight and obesity )；２００１，Ｒ．Ｍ．米国保険社会福祉省(U.S. Department Health and Human Service s)編、２００１。 50 (4) JP 2012-232982 A 2012.11.29 【０００４】 ボディ・マス・インデックス（２５∼２９．９ｋｇ／ｍ2の範囲のＢＭＩ）として定義 される過体重および肥満症（ＢＭＩ＞３０ｋｇ／ｍ2）は、早死に、２型糖尿病、心疾患 、卒中、高血圧症、胆嚢疾患、変形性関節症、睡眠時無呼吸、喘息、種々の呼吸障害、特 定の癌、高い血中コレステロール値、妊娠合併症、高い手術危険度、心理的障害および列 挙するにはあまりにも多いその他の病状と相関している。過体重および肥満を防ぎ、低減 するための公衆衛生局長官の実施要請(The Surgeon Gneral’s call to action to preve nt and decrease overweight and obesity)；２００１，Ｒ．Ｍ．米国保険社会福祉省(U. S. Department Health and Human Services)編、２００１；ＮＨＬＢＩ、成人における過 体重および肥満症の同定、評価および治療に関する臨床ガイドライン(Clinical guidelin 10 es on the identification,evaluation and treatment of overweight and obesity in a dults)、Ｎ．ＮＩＨ，編１９９８、ＨＨＳ、ＰＨＳ、２９∼４１頁。肥満個体では、ＢＭ Ｉが正常範囲（２０∼２５ｋｇ／ｍ2）の人と比べ、すべてのこれらの原因から早死の危 険が５０∼１００％高い。中程度の減量（過剰の全体重の５∼１５％）であっても、少な くともこれらの疾患のいくつか、特に、心疾患について、短期的には危険因子を減少させ る。ＮＨＬＢＩ、成人における過体重および肥満症の同定、評価および治療に関する臨床 ガイドライン(Clinical guidelines on the identification, evaluation and treatmen t of overweight and obesity in adults)、Ｎ．ＮＩＨ，編１９９８、ＨＨＳ、ＰＨＳ、 ２９∼４１頁。現在の証拠から、効果はさらに長期間の利益を有し得ると示唆されている 。同書参照のこと；ＮＩＤＤＫ，減量の健康アウトカムの研究（ＳＨＯＷ）の試み、ＮＩ 20 ＤＤＫ、編２００１、米国国立衛生研究所(Study of health outcomes of weight-loss ( SHOW) trial, NIDDK, Editor. 2001, National Institutes of Health, U.S.A.) 【０００５】 過体重および肥満を防ぎ、低減するための公衆衛生局長官の実施要請(The Surgeon Gne ral’s call to action to prevent and decrease overweight and obesity)では、高ま る一方の貧弱な栄養源への依存および座りがちなライフスタイルの増加を伴う、過去数十 年間のアメリカ人のライフスタイルの変化を重視している。主たる実施要請は、健康的な 食事と定期的な適度な運動を奨励するよう学校および社会全体における教育を推進するこ とである。進行中の過程におけるこの時点で、米国国民の大部分がこの重要なメッセージ について少なくとも大まかな認識は有している可能性が極めて高いと思われる。しかし、 30 肥満症へ向かう最近の傾向は、弱まる兆しを全く見せず、実際、時間とともに悪くなると 予測されている。打開するための主な障壁は、一般市民による、指示された指針に従った 食事および運動に関する遵守の必要性であるのは明らかであるが、これは見込みのない見 通しに相当する。 【０００６】 公衆衛生局長官の２００１報告書の興味深い特徴は、過体重および肥満症を予防および 治療するための薬剤によるアプローチについては何も触れられていないことである。この ようなアプローチは患者の遵守の必要性を低減できる可能性があるので、これは学問的お よび産業的機関双方の間で注目される熱心な領域であることは明らかである。近年、エネ ルギー蓄積の調節および分泌細胞としての両観点から、脂肪組織の役割および機能の理解 40 において、大きな進歩がなされた（フライン(Frayn)ら、インテグレイティブ・フィジオ ロジー・オブ・ヒューマン・アティポーズ・ティシュー(Integrative physiology of hum an adipose tissue)、インターナショナル・ジャーナル・オブ・オベシティー・アンド・ リレイテッド・メタボリック・ディスオーダーズ(International Journal of Obesity an d Related Metabolic Disorders)２００３、２７（８）、８７５∼８８頁によって総説さ れている）。浮かび上がった図式は、自律神経系の活性、物質およびホルモンからなる複 雑な混合物の送達、脂肪細胞によって分泌される自己分泌および傍分泌エフェクターから のフィードバックおよびまた脂肪組織への血管供給を含むために極めて複雑である。また 、脂肪細胞によって分泌されるレプチンおよびアディポネクチンなどの因子は、全般的な 代謝に対する全般的な作用を有する。ゲレミロ(Guerre-Millo)、アディポーズ・ティシュ 50 (5) JP 2012-232982 A 2012.11.29 ー・ホルモンズ(Adipose Tissue hormones)、ジャーナル・オブ・エンドクリノロジカル ・インベスティゲーション(Journal of Endocrinological Investigation)、２００２、 ２５（１０）、８５５∼６１頁、キシダ、ディスターブド・セクリーション・オブ・ミュ ータント・アディポネクチン・アソシエイティッド・ウィズ・ザ・メタボリック・シンド ローム(Disturbed secretion of mutant adiponectin associated with the metabolic s yndrome)、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コニュニケーション ズ(Biochemical Biophysical Research Communications)、２００３、３０６（１）、２ ８６∼９２頁、マイナー(Miner)、ジ・アディポサイト・アズ・アン・エンドクリン・セ ル(The adipocyte as an endocrine cell)、ジャーナル・オブ・アニマル・サイエンス(J ournal of Animal Science)、２００４、８２（３）、９３５∼４１頁、ラビン(Rabin)ら 10 、アディポネクチン：リンキング・ザ・メタボリック・シンドローム・トゥー・イッツ・ カルディオバスキュラー・コンシークエンセズ(Adiponectin: linking the metabolic sy ndrome to its cardiovascular consequences)、エキスパート・レビュー・オブ・カルデ ィオバスキュラー・セラピー(Expert Review of Cardiovascular Therapy)、２００５、 ３（３）、４６５∼７１頁、ハウスクネヒト(Houseknecht)ら、ザ・バイオロジー・オブ ・レプチン(The biology of leptin)、総説、ジャーナル・オブ・アニマル・サイエンス( Journal of Animal Science)１９９８、７６（５）、１４０５∼２０頁、マントゾロス（ Ｍａｎｔｚｏｒｏｓ）、ザ・ロール・オブ・レプチン・イン・ヒューマン・オベシティー ・アンド・ディシーズ(The role of leptin in human obesity and disease)、最近の証 拠の総説、アナルズ・オブ・インターナル・メディシン(Annals Internnal Medicine)、 20 １９９９、１３０（８）、６７１∼８０頁参照のこと。 【０００７】 これから、上記で記載した過体重および肥満症に関する現在の問題の基礎をなす正常な 状態および病理的状態の完全な理解を得るには、極めて統合的な、全体論的アプローチが 必要であることは明らかである。 【発明の概要】 【発明が解決しようとする課題】 【０００８】 研究、農業および話し相手用に、多数の種類の動物が用いられている。このような動物 の飼育および給餌の費用が高い場合もある。より小さな大きさの動物ならば、正常な大き 30 さの動物よりも給餌および飼育する費用も少ない。したがって、大きさの低減した動物お よび／または体重の低減した動物を作成する組成物および方法は、有利であり得る。また 、コンパニオンアニマルにおける肥満症も問題である。肥満症は、寿命の短縮およびヒト に関して上記で記載した同様の疾患および状態のうち多数を引き起こし得る。 【課題を解決するための手段】 【０００９】 一実施形態では、本発明は、動物に約１０％∼約３０％グリシンを含む高グリシン食を 投与するステップを含む、動物の脂肪組織においてアポトーシスを誘導する方法を提供す る。高グリシン食は、グリシン、グリシン類似体またはグリシンとグリシン類似体の組み 合わせ含み得る。 40 【００１０】 本発明のもう１つの実施形態は、動物に約１０％∼約３０％グリシンを含む高グリシン 食を投与するステップを含む動物において脂肪組織を低減する方法を提供する。 【００１１】 本発明のさらにもう１つの実施形態は、動物に約１０∼約３０％のグリシンを含む高グ リシン食を投与するステップを含む、動物の脂肪組織においてアミノ酸位置１３６のＢＡ Ｄのリン酸化を低減する方法を提供する。 【００１２】 本発明のさらにもう１つの実施形態は、動物に約１０∼約３０％のグリシンを含む高グ リシン食を投与するステップを含む、動物において脂肪細胞の大きさを低減する方法を提 50 (6) JP 2012-232982 A 2012.11.29 供する。 【００１３】 本発明のさらにもう１つの実施形態は、動物に約１０∼約３０％のグリシンを含む高グ リシン食を投与するステップを含む、動物において腹部脂肪含量を低減する方法を提供す る。 【００１４】 本発明のもう１つの実施形態は、動物に約１０∼約３０％のグリシンを含む高グリシン 食を投与するステップを含む、動物において体重を減少させる方法を提供する。本方法は 、運動計画、低脂肪食、低カロリー食、低炭水化物食、外科的介入、行動療法、薬物療法 またはそれらの組み合わせなどの補助的減量療法をさらに含み得る。 10 【００１５】 本発明のさらにもう１つの実施形態は、大きさの減少した動物または体重の減少した動 物を作製し、次いで、正常な大きさに戻す方法を提供する。本方法は、大きさの減少した 動物または体重の減少した動物を作製するために幼若動物に高グリシン食を投与するステ ップと、次いで、正常な大きさの動物または正常な体重の動物を作製するために、その動 物に正常食を投与するステップとを含む。 【００１６】 本発明のさらにもう１つの実施形態は、大きさの減少した動物または体重の減少した動 物を作製するために幼若動物に高グリシン食を投与するステップを含む、大きさの減少し た動物または体重の減少した動物を作製する方法を提供する。 20 【００１７】 本発明のさらにもう１つの実施形態は、約１０％∼約３０％グリシン、グリシン類似体 またはそれらの組み合わせと、約７０％∼約９０％の低カロリー食とを含む動物における 減量のための飼料組成を提供する。 【００１８】 本発明のもう１つの実施形態は、約１０％∼約３０％グリシン、グリシン類似体または それらの組み合わせと、約７０％∼約９０％の低脂肪食とを含む動物における減量のため の飼料組成を提供する。低脂肪食は低飽和脂肪食であり得る。 【００１９】 本発明のさらにもう１つの実施形態は、約１０％∼約３０％グリシン、グリシン類似体 30 またはそれらの組み合わせと、約７０％∼約９０％の低炭水化物食とを含む動物における 減量のための飼料組成を提供する。 【００２０】 本発明のもう１つの実施形態は、幼若動物に約１０∼約３０％のグリシンを含む高グリ シン食を投与するステップを含む、大きさの減少した動物、または体重の減少した動物、 または大きさが減少しかつ体重が減少した動物を作製する方法を提供する。 【００２１】 本発明のさらにもう１つの実施形態は、脂肪細胞に１種以上のグリシン類似体またはグ リシンとグリシン類似体の組み合わせ投与するステップを含む、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉ ｎ ｖｉｔｒｏにおいて白色脂肪細胞においてアポトーシスを誘導する方法を提供する。 40 【００２２】 本発明のさらにもう１つの実施形態は、脂肪細胞に１種以上のグリシン類似体またはグ リシンとグリシン類似体の組み合わせを投与するステップを含む、ｉｎ ｖｉｖｏまたは ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて白色脂肪組織においてアミノ酸位置１３６でのＢＡＤのリン酸 化を低減する方法を提供する。 【発明を実施するための形態】 【００２３】 普通のアミノ酸、グリシンは、実験室動物の食餌に加えると体重の用量依存的な減量を 引き起こす効果を有することが発見されている。この効果は、いくつかの齧歯類の系統お よびイヌにおいて観察されている。最適用量および本当に非常に最適の用量では、長期の 50 (7) JP 2012-232982 A 2012.11.29 投与の間、有害な副作用は観察されなかった。グリシンは、ほとんどの哺乳類で、正常な 中間代謝の一部として解糖系から生じるセリンから合成される非必須アミノ酸である。い くつかの精神障害、特に、統合失調症の原因および可能性ある治療におけるその役割に関 して天然および誘導型で広く研究されてきた化合物である（例えば、ワジリ(Waziri)&バ ルア(Baruah)、ア・ハイパーグリシナージック・ラット・モデル・フォー・ザ・パソジェ ネシス・オブ・シゾフレニア：プレリミナリー・ファインディングス(A hyperglycinergi c rat model for the pathogenesis of shizophrenia: preliminary findings)、シゾフ レニア・リサーチ(Schizophrenia Research)、１９９９、３７（３）：２０５∼１５頁、 ワジリ(Waziri)、グリシン・セラピー・オブ・シゾフレニア(Glycine therapy of shizop hrenia)、バイオロジカル・サイキアトリー(Biological Psychiatry)、１９８８、２３（ 10 ２）、２１０∼ｌ頁、ワジリ(Waziri)、グリシン・セラピー・オブ・シゾフレニア：サム ・キャビアーツ(Glycine therapy of schizophrenia: some caveats)、バイオロジカル・ サイキアトリー(Biological Psychiatry)、１９９６、３９（３）、１５５∼６頁、ジャ ビット(Javitt)、グリシン・セラピー・オブ・シゾフレニア(Glycine therapy of shizop hrenia)、バイオロジカル・サイキアトリー(Biological Psychiatry)、１９９６、４０（ ７）：６８４∼６頁、ジャビット(Javitt)、グリシン・モジュレーターズ・イン・シゾフ レニア(Glycine modulators in schizophrenia)、カレント・オピニオン・イン・インベ スティゲイショナル・ドラッグス(Current Opinion in Investigational Drugs)、２００ ２、３（７）、１０６７∼７２頁、ショハム(Shoham)ら、クロニック・ハイ−ドーズ・グ リシン・ニュートリション：エフェクツ・オン・ラット・ブレイン・セル・モルフォロジ 20 ー(Cronic high-dose glycine nutrition: effects on rat brain cell morphology)、バ イオロジカル・サイキアトリー(Biological Psychiatry)、２００１、４９（１０）、８ ７６∼８５頁、ジャビット(Javitt)、マネージメント・オブ・ネガティブ・シンプトンズ ・オブ・シゾフレニア(Management of negative symptoms of shizophrenia)、カレント ・サイキアトリー・レポート(Current Psychiatry Report)、２００１、３（５）、４１ ３∼７頁、ショハム(Shoham)ら、ハイ・ドーズ・グリシン・ニュートリション・アフェク ツ・グリアル・セル・モルフォロジー・イン・ラット・ヒポキャンパス・アンド・セレベ ラム(High dose glycine nutrition affects glial cell morphology in rat hippocampu s and cerebellum)、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ニューロサイコファルマ コロジー(International Journal of Neuropsychopharmacology)、１９９９、２（ｌ）、 30 ３５∼４０頁、ショハム(Shoham)ら、グリシン・アンド・Ｄ−サイクロセリン・アテニュ エート・バキュアス・チューイング・ムーブメント・イン・ア・ラット・モデル・オブ・ ターダイブ・ジスキネジア(Glycine and D-cycloserine attenuate vacuous chewing mov ements in a rat model of tardive dyskinesia)、ブレイン・リサーチ(Brain Research) 、２００４、１００４（１−２）、１４２∼７頁、ツオルニネン(Tuorninen)ら、グルタ マテルジック・ドラッグス・フォー・シゾフレニア：ア・システマチック・レビュー・ア ンド・メタ−アナリシス(Glutamatergic drugs for schizophrenia: a systematic revie w and meta-analysis)、シゾフレニア・リサーチ(Schizophrenia Research)、２００５、 ７２（２−３）、２２５∼３４頁参照のこと）。これらの報告のうちいくつかで、グリシ ン投与の効果は、試験動物または被験体の体重に対して、小さいが有意な影響を有すると 40 記されているが、この観察結果は推測またはさらなる分析の対象とは決してならなかった 。これはおそらくは、観察された効果が比較的小さく、これらの研究に用いたグリシンの 濃度および曝露時間が、本発明者らが有意なまたは著しい減量を誘導するのに必要である と見い出したものよりも通常小さいからであろう。ペッキー(Petzke)ら、（１９８７）は 、グリシンは、その他のアミノ酸、糖および脂肪と比較して相対的に高い発熱効果を有し 、これが酸素取り込みの増加と相関していると報告した。ペッキー(Petzke)＆アルブレク ト(Albrecht)、［ザ・エフェクト・オブ・ニュートリション・オン・ザ・メタボリズム・ オブ・グリシン(The effect of nutrition on the metabolism of glycine)］、ナールン グ(Nahrung)、１９８７、３１（２）、１５７∼７２頁、ペッキー(Petzke)ら、ユーティ リゼーション・オブ・［１∼１４Ｃ］カーボン・オブ・グリシン・オブ・ハイ・グリシン 50 (8) JP 2012-232982 A 2012.11.29 ・ダイエット・フェド・ヤング・アンド・オールド・ラッツ(Utilization of [1-14C] ca rbon of glycine of high glycine diet fed young and old rats)、ズファ(Zfa)、１９ ８７、４２（６）、３２３∼８頁、ペッキー(Petzke)ら、［ザ・エッフェクツ・オブ・オ ーラル・アドミニストレーション・オブ・グリシン・オン・メタボリズム(The effect of oral administration of glycine on metabolism)]、ナールング(Nahrung)１９８７、 ３１（３）、２０７∼１５頁。彼のグループは、実験ラットの成長における用量依存的低 減を記したが、可能性ある機構の生化学的機序を提供できなかった。本発明者らは、以下 に記載するように、この発見を再現することに加え、成体動物が、その食餌にグリシンが 補給されると用量依存的減量を示すことを実証した。グリシンまたはグリシン類似体を使 用して、観察可能な不都合な副作用を伴わずに肥満症と闘うことができる。さらに、グリ 10 シンは、おそらくは、これまでに認識されていない経路を用いて、脂肪細胞においてアポ トーシスを特異的に誘導するよう作用する。 【００２４】 グリシンおよびグリシン類似体 グリシンは容易に入手可能な、非毒性のアミノ酸である。グリシン、グリシン類似体ま たはその組み合わせを本発明の方法において使用できる。脂肪細胞、例えば、白色脂肪細 胞において、アポトーシスを直接的にまたは間接的に誘導するグリシン類似体はいずれも 使用できる。本発明の一実施形態では、グリシン類似体は式Ｉを含み得る。 【００２５】 【化１】 20 【００２６】 例えば、式Ｉでは、Ｒ１および／またはＲ２はＨであってもよく、 Ｒ１および／またはＲ２はＭｅ、ＥｔまたはＰｒであってもよく、 30 Ｒ１および／またはＲ２はＢｎであってもよく、 Ｒ１および／またはＲ２は（ＣＨ2）2∼5であってもよい。 式Ｉは、例えば、以下のスキームによって合成できる： 【００２７】 【化２】 40 【００２８】 その他のグリシン類似体は式IIを含み得る： 【００２９】 (9) JP 2012-232982 A 2012.11.29 【化３】 【００３０】 例えば、式IIでは、Ｒ１および／またはＲ２はＨであってもよく、 Ｒ１および／またはＲ２はＭｅ、ＥｔまたはＰｒであってもよく、 10 Ｒ１および／またはＲ２はＢｎであってもよく、 Ｒ１および／またはＲ２は（ＣＨ2）2∼5であってもよい。 式IIは、例えば、以下のスキームによって合成できる： 【００３１】 【化４】 20 【００３２】 本発明のもう１つの実施形態では、グリシン類似体は式IIIを含み得る： 【００３３】 【化５】 30 【００３４】 式IIIでは、Ｒ１および／またはＲ２はＨであってもよく、かつ、Ｒ３はＨ、Ｍｅ、Ｅ ｔ、ＰｒまたはＢｎであってもよく、 Ｒ１および／またはＲ２はＭｅ、ＥｔまたはＰｒであってもよく、かつ、Ｒ３はＭｅ、 Ｅｔ、ＰｒまたはＢｎであってもよく、 Ｒ１はＨであってもよく、Ｒ２はＢｎまたはＭｅであってもよく、かつ、Ｒ３はＭｅ、 Ｅｔ、ＰｒまたはＢｎであってもよく、 Ｒ１および／またはＲ２は（ＣＨ2）2∼5またはＭｅであってもよく、かつ、Ｒ３はＭ 40 ｅ、Ｅｔ、ＰｒまたはＢｎであってもよい。 式IIIは例えば、以下のスキームによって合成できる： 【００３５】 【化６】 【００３６】 50 (10) JP 2012-232982 A 2012.11.29 高グリシン食 「高グリシン食」とはグリシン、グリシン類似体もしくは類似体類またはその組み合わ せが多い食餌、あるいは高投与量のグリシンサプリメント、グリシン類似体サプリメント またはその組み合わせである。本発明の一実施形態では、グリシン類似体またはグリシン と組み合わせたグリシン類似体は、グリシンのみを含む食餌を投与された場合に得られる ものとほぼ同じ生理的効果を生じる。すなわち、グリシン類似体またはグリシンとグリシ ン類似体の組み合わせは、動物に高グリシン食でグリシンを投与した場合の動物における グリシンの生理学的濃度とほぼ同じである、動物におけるグリシンの生理学的濃度を生じ る。場合によっては、グリシン類似体またはグリシンと組み合わせたグリシン類似体を、 グリシン単独よりも低いパーセンテージで投与して、グリシンを単独で用いる場合と同様 10 の効果を達成できる。例えば、グリシン類似体またはグリシンと組み合わせたグリシン類 似体を、食餌中、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０重量パーセント以上で投 与できる。 【００３７】 グリシンおよびグリシン類似体は、食餌と混合してもよいし、またはその他の経路によ って投与してもよい。サプリメントは液体であってもよいし、半固体であってもよいし、 固体であってもよいし、何らかのその他の形であってもよい。高グリシン食は、約５、６ 、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、 ２５、３０、３５、４０重量％以上のグリシン、グリシン類似体類またはその組み合わせ を含む。本発明の一実施形態では、高グリシン食は、約５％∼約４０％以上、約１０％∼ 20 約４０％、約１０％∼約３０％、約１５％∼約２５％または約２０％∼約２５％のグリシ ンまたはグリシン類似体類またはその組み合わせを含み得る。 【００３８】 本発明はまた、約５％∼約４０％以上、約５％∼約４０％、約１０％∼約３０％、約１ ５％∼約２５％または約２０％∼２５％のグリシン、グリシン類似体類またはその組み合 わせ（すなわち、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、 １７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０重量％以上のグリシン、グリシン類似 体類またはその組み合わせ）と、約６０％∼約９５％（すなわち、約９５、９０、８９、 ８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７５、７０、６５または６０ ％）のカロリーの低い食餌とを含む、動物における体重低減のための飼料組成を提供する 30 。 【００３９】 本発明はまた、約５％∼約４０％以上、約１０％∼約４０％以上、約１０％∼約３０％ 、約１５％∼約２５％または約２０％∼２５％のグリシン、グリシン類似体類またはその 組み合わせ（すなわち、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、 １６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０重量％以上のグリシン、グリシ ン類似体類またはその組み合わせ）と、約６０％∼約９５％（すなわち、約９５、９０、 ８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７５、７０、６５また は６０％）の脂肪の少ない食餌とを含む、動物における体重低減のための飼料組成を提供 する。低脂肪食は、低飽和脂肪食であり得る。 40 【００４０】 本発明はまた、約５％∼約４０％以上、１０％∼約４０％以上、約１０％∼約３０％、 約１５％∼約２５％または約２０％∼２５％のグリシン、グリシン類似体類またはその組 み合わせ（すなわち約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６ 、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０重量％以上のグリシン、グリシン類 似体類またはその組み合わせ）と、約６０％∼約９５％（すなわち、約 ９５、９０、８ ９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７５、７０、６５または ６０％）の炭水化物の少ない食餌とを含む、動物における体重低減のための飼料組成を提 供する。 【００４１】 50 (11) JP 2012-232982 A 2012.11.29 本発明の方法 雄または雌の動物、例えば、ヒトへの高グリシン食の投与は、動物の脂肪組織、特に、 白色脂肪組織においてアポトーシスを誘導し得る。したがって、高グリシン食は、動物に おいて脂肪組織を低減し得るか、脂肪細胞の大きさを減少させ得るか、またはその両方で あり得る。本発明の方法は、動物において、脂肪組織においてアポトーシスを誘導するか 、脂肪組織を低減するか、脂肪細胞の大きさを減少させるか、それらの組み合わせのため に、動物に高グリシン食を投与するステップを含む。 【００４２】 特定の理論に拘束されようとは思わないが、脂肪組織におけるアポトーシスの誘導は、 グリシンの直接効果または間接効果によって引き起こされると考えられる。この作用機序 10 は、ＢＡＤ、Ｂｃｌ−２ファミリーのアポトーシス促進性メンバーに対してこのような食 餌が有する観察された効果によって支持される。ＢＡＤの、細胞死を促進する能力は、位 置１３６でのリン酸化によって阻害される。高グリシン食の投与は、脂肪組織において位 置１３６でのＢＡＤのリン酸化を低減するか排除し、このことは、高グリシン食またはそ の等価物を投与した場合に観察される脂肪組織の喪失がアポトーシスの誘導によって起こ ることを示す。 【００４３】 食餌（すなわち、経口による）またはその他の投与手段のいずれかによる、高濃度のグ リシンの投与により、動物において腹部脂肪含量が低減され得る。さらに、食餌またはそ の他の投与手段のいずれかによる、動物へのグリシンの投与は、動物において減量をもた 20 らし得る。しかし、グリシンを補給した食餌の初期の投与では、体重増加が見られる場合 がある。いずれか特定の理論に拘束されようとは思わないが、この観察結果は、脂肪組織 の喪失および筋肉組織の獲得の結果であり得ると考えられる。 【００４４】 本発明の方法および組成物を用いて、大きさの減少した動物およびまたは体重の減少し た動物を作製できる。例えば、正常な大きさの動物よりも約３％、５％、１０％、２０％ 、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または７５％小さい動物または正常な体重動 物よりも約３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％また は７５％軽い動物。正常な大きさの動物または正常な体重の動物とは、年齢および全身の 健康状態を考慮した上で、動物種についての平均または標準的な体重または大きさの範囲 30 内に入る動物である。 【００４５】 本発明は、動物に高グリシン食を投与するステップを含む、大きさの減少した動物また は体重の減少した動物、または大きさが減少し、かつ、体重が減少した動物を作製する方 法を提供する。大きさの減少した動物のためには、幼若動物に高グリシン食を給餌する。 高グリシン食は毎日投与できる。動物は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス 、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウマ、トリまたは魚で あり得る。 【００４６】 本発明はまた、上記のように大きさの減少した動物を作製し、続いて、その動物を正常 40 な大きさに戻す方法を提供する。この方法は、高グリシン食を幼若動物に投与して大きさ の減少した動物を作製するステップと、次いで、その動物に正常食を投与して正常な大き さの動物を作製するステップとを含む。正常な食餌とは、グリシンを補給していないが、 正常な量のグリシンは含む食餌である。 【００４７】 本発明はまた、高グリシン食を成熟または幼若動物に投与して体重の減少した動物を作 製するステップと、次いで、その動物に正常な食餌を投与して正常な体重の動物を作製す るステップとを含む、体重の減少した動物を作製し、次いで、その動物を正常な体重に戻 す方法を提供する。 【００４８】 50 (12) JP 2012-232982 A 2012.11.29 本発明のさらにもう１つの実施形態は、永久的に大きさの減少した動物または体重の減 少した動物を作製するために幼若動物へ高グリシン食を投与することによって、永久的に 大きさの減少した動物およびまたは体重の減少した動物を作製する方法を提供する。高グ リシン食の投与は、動物の一生を通じて続けてもよいし、または通常、成長の停止と関連 している生理学的プロセスによってさらなる成長が妨げられるまで続けてもよい。 【００４９】 本発明の方法および組成物を用いて、動物、例えば、幼若および成熟動物において減量 させることができる。約３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％ 、７０％または７５％の減量を達成できる。 【００５０】 10 本発明の一実施形態は、上記のように、動物に高グリシン食を投与するステップを含む 、動物において減量させる方法を提供する。動物は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ラッ ト、マウス、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウマ、トリ 、魚または無脊椎動物であり得る。本発明の一実施形態では、動物は健常であり、潜在す る健康障害または健康問題はない。本発明のもう１つの実施形態では、動物は、過体重ま たは肥満症という健康障害だけは有するが、その他の健康障害または健康問題はない。 【００５１】 高グリシン食は、補助的減量療法、例えば、運動計画、低脂肪食、低カロリー食、低炭 水化物食、外科的介入、例えば、胃形成術、胃の分割および胃バイパス、行動療法、薬物 療法（例えば、シブトラミン、メリディア(MERIDIA)（登録商標）（シブトラミンＨＣｌ 20 一水和物）、ゼニカル(XENICAL)（登録商標）（オーリスタット(orlistat)）およびそれ らの組み合わせの使用）、天然ダイエット補助食品または市販の（ＯＴＣ）減量製品およ びそれらの組み合わせとともに投与できる。 【００５２】 低脂肪食は、所与の種の所与の年齢、体重および全身の健康状態に対して、通常推奨さ れる食餌中の脂肪量よりも約３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４ ０％、５０％、６０％、７０％または８０％少ない脂肪を含む食事である。例えば、ヒト における低脂肪食は、約０％、３％、５％、７％、１０％、１３％、１５％、２０％また は２５％の脂肪からなる食事を含み得る。 【００５３】 30 低カロリー食とは、特定の種の所与の年齢、体重および全身の健康状態に対して、通常 推奨されるカロリー量よりも約３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、 ４０％、５０％、６０％、７０％または８０％少ないカロリーを含む食事である。 【００５４】 低炭水化物食とは、特定の種の所与の年齢、体重および全身の健康状態に対して、通常 推奨されるカロリー量よりも約３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、 ４０％、５０％、６０％、７０％または８０％少ない炭水化物を含む食事である。 【００５５】 行動療法は、食事療法および／または運動療法に関する遵守の障壁の克服に役立つ戦略 を含む。このような戦略としては、例えば、食習慣および運動の自己監視、ストレス管理 40 、刺激制御、問題解決（例えば、食事および運動に関連する問題領域の自己補正）、随伴 性管理（例えば、指定の望ましい作用に対する報酬の使用、認識再構築（例えば、現実離 れした目標および不正確な信念の修正）および社会的支援が挙げられる。 【００５６】 グリシンおよびグリシン類似体は、従来の非毒性の製薬上許容される担体、アジュバン トおよび／またはビヒクルを含む製剤を用いて、例えば、経口的に、局所的に、非経口的 に、吸入もしくは噴霧によって、または経直腸的に投与できる。本明細書において、用語 非経口とは、経皮、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内またはくも膜下腔内注射ま たは注入技術などを含む。さらに、グリシンおよびグリシン類似体は、製薬上許容される 担体と混合することができる。グリシンおよびグリシン類似体は、1種以上の非毒性の製 50 (13) JP 2012-232982 A 2012.11.29 薬上許容される担体、賦形剤、着色剤、保存剤、矯味剤、希釈剤、アジュバントまたはそ れらの組み合わせ、また、必要に応じてその他の有効成分と関連して存在し得る。グリシ ンおよびグリシン類似体は、例えば、錠剤、トローチ剤(troches)、トローチ剤(lozenge) 、水性懸濁液または油性懸濁液、分散性散剤もしくは顆粒剤、エマルジョン、ハードカプ セルもしくはソフトカプセルまたはシロップ剤またはエリキシル剤のような、経口使用に 適しているいずれかの形であり得る。 【００５７】 本発明のもう１つの実施形態は、脂肪細胞に１種以上のグリシン類似体類またはグリシ ンとグリシン類似体の組み合わせを投与するステップを含む、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで白色脂肪細胞においてアポトーシスを誘導する方法を提供する。 10 【００５８】 本発明のさらにもう１つの実施形態は、脂肪細胞に１種以上のグリシン類似体類または グリシンとグリシン類似体の組み合わせを投与するステップを含む、ｉｎ ｖｉｖｏまた はｉｎ ｖｉｔｒｏで白色脂肪細胞においてアミノ酸位置１３６でのＢＡＤのリン酸化を 低減する方法を提供する。 グリシンは脂肪細胞に、約５、１０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、 ５００、７５０、１０００μｇ／ｍｌ以上という濃度で添加できる。 【００５９】 本明細書中のどこかで記載されるすべての特許、特許出願およびその他の科学的記述ま たは技術的記述は、参照によりその全文が組み込まれる。本明細書に例示的に記載される 20 本発明は、本明細書に具体的に開示されないいずれかの要素または複数の要素、制限また は複数の制限がない場合にも適当に実施できる。したがって、例えば、本明細書における 各例において、用語「含む」、「本質的にからなる」および「からなる」はいずれも、そ の通常の意味を維持しながら、その他の２種の用語のいずれかと置き換えることができる 。用いてきた用語および表現は、説明の用語として用いられるものであって、制限するも のではなく、このような用語および表現の使用において、示され、記載される特徴または その一部のいずれかの等価物を排除する意図はないが、特許請求される本発明の範囲内で 種々の改変が可能であるということは認識される。したがって、本発明は実施形態によっ て具体的に開示されているが、開示される本明細書における考えの任意選択の特徴、改変 および変法を当業者が用いることができること、およびこのような改変および変法は説明 30 および添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内にあると考えられるとい うことは理解されなくてはならない。 【００６０】 さらに、本発明の特徴または態様が、マーカッシュグループまたは代替物のその他のグ ループ分けの観点で記載されている場合には、当業者ならば、その結果、本発明がまた、 マーカッシュグループまたはその他のグループのいずれかの個々のメンバーまたはメンバ ーの下位グループの観点で記載されているということは認識する。 ［実施例］ 【実施例１】 【００６１】 ラットを無作為に分割し、別個にケージに入れ、水を無制限に、および食餌ＴＤ８０４ ０６食（ハーランテックラッド(Harlan Teklad)、ウィスコンシン州、マディソン）を給 餌した。飼料組成を表１に示す。ＴＤ８０４０６食は、ラクトアルブミン成分中に存在す る約１∼２％のグリシンを有し、無添加食（ｎｏｎ−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｄｉｅ ｔ）と考えられる。 【００６２】 40 (14) JP 2012-232982 A 2012.11.29 【表１】 10 20 30 【００６３】 成体（１８０日齢）雄フィッシャーラットを、飼料に５％または２０％グリシンを含む 食餌または無添加食の各群１０ラットの処理群に無作為に割り当てた。図１参照。動物お よび飼料の重量測定を、示した研究日数で行った。重量測定を行う分析者は、観察が記録 40 されている動物の食餌に関してわからないようにされた。バーは、示した観察日での各群 のラットの体重の±１標準誤差を表す。２０％グリシン食を給餌されたラットは、処理の １４∼３０日間の間、５％グリシン食またはグリシンが補給されていない食餌を給餌され たラットよりも統計的に軽かった。３０日目に、２０％グリシン食を給餌されたラットを 無添加食に戻すと、それらは急速に体重増加し、それらの体重は、無添加食を給餌された ラットのものと同様になった。研究の３２日目以降、対照と２０％グリシン群の動物の体 重の間に統計上の差はなかった。 【００６４】 研究の３０日目に各処理群から５匹のラットを無作為に選択し、安楽死させた。剖検で 各ラットの腹部脂肪含量の測定を行った（図２）。測定を行う分析者は、観察が記録され 50 (15) JP 2012-232982 A 2012.11.29 ている動物の処理群に関してわからないようにされた。データは一元配置分散分析を用い て分析し、ダネットの多重比較試験を用いる事後解析に付した。２０％グリシン食を給餌 されたラットは、５％グリシン食または無添加食を給餌されたものよりも統計的に有意に 少ない腹部脂肪を有していた。 【００６５】 同じ実験を雌成体（１８０日齢）フィッシャーラットを用いて実施した。得られた結果 は、雌では雄においてよりも、減量および腹部脂肪含量の双方に関して、グリシンの効果 が実際には幾分かより明白であったという点を除き、ほぼ同様であった（図３および図４ ）。処理した雌のラットの体重は、回復相の最後までに対照動物のレベルに戻らなかった ということ、また腹部脂肪において観察された減少は雄について観察されたものよりも大 きかったことには注目した。実験の経過中で消費された飼料または水の量においては、群 間で有意差は観察されなかった。 【００６６】 飼料消費測定は、示した研究日数で行った。図５参照。これらのデータは、観察された 減量は飼料摂取の減少によるカロリー制限の結果ではないことを示す。さらに、食餌をｂ ｏｍｂ熱量測定によって分析し（表２参照）、カロリー量に有意な差はないことを実証し たので、観察された体重減少は、飼料のカロリー量の減少の結果ではない。 【００６７】 10 (16) JP 2012-232982 A 2012.11.29 【表２】 10 20 30 【００６８】 研究対象ラットの尾静脈から血液サンプルを採取し、マルチアナライトプロフィール(M ulti-Analyte Profile)試験のためにチャールスリバーラボラトリーズ(Charles River La boratories)に送った。これらの試験の結果は、高グリシン食のラットはその血清トリグ 40 リセリド、ＨＤＬおよびコレステロールレベルにおいて統計的に有意な（ｐ≦０．０５） 低下を示すということを示した。これらの結果は、グリシンを用いて他で実施している研 究による文献の結果と一致する。ハフィディ(Hafidi)ら、グリシン・インテイク・デクリ ーシズ・プラズマ・フリー・ファッティー・アシッズ・アディポーズ・セル・サイズ、ア ンド・ブラッド・プレッシャー・イン・スクロース−フェド・ラッツ(Glycine intake de creases plasma free fatty acids, adipose size, and blood in sucrose-fed rats)、 アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー−レギュラトリー・インテグレイティブ ・アンド・コンパラティブ・フィジオロジー(American Jouranal ofPhysiology Regulato ry Integrative and Comparative Physiology)２００４、２８７（６）、Ｒ１３８７∼９ ３、オースト(Aust)ら、ザ・ヒポリペミック・アクション・オブ・ア・グリシン・リッチ 50 (17) JP 2012-232982 A 2012.11.29 ・ダイエット・イン・ラット(The hypolipaemic ation of a glycine rich diet in rats )、ナールング(Nahrung)１９８０、２４（７）、６６３∼７１頁、スギヤマら、ダイエタ リー・スルファー−コンテイニング・アミノ・アシッズ・アンド・グリシン・アズ・デタ ーミナント・ファクターズ・イン・プラズマ・コレステロール・レギュレーション・イン ・グローイング・ラッツ(Dietary sulfur-containing amino acidsand glycine as deter minant factors in plasma cholesterolregulation in growing rats)、ジャーナル・オ ブ・ニュートリショナル・サイエンス・アンド・ビタミノロジー(Journal of Nutritiona l Science andVitaminology)（東京）１９８５、３１（ｌ）、１２１∼５頁、センティル クマール(Senthilkumar)ら、グリシン・モジュレーツ・ヘパティック・リピッド・アキュ ミュレーション・イン・アルコール−インデュースド・リバー・インジュリー(Glycine m 10 odulates hepatic lipid accumulationin alcohol-induced liver injury)、ポリッシュ ・ジャーナル・オブ・ファルマコロジー(Polish Journal of Pharmacology)、２００３、 ５５（４）、６０３∼１１頁、パーク(Park)ら、ダイエタリー・タウリン・オア・グリシ ン・サプリメンテーション・レデューシズ・プラズマ・アンド・リバー・コレステロール ・アンド・トリグリセリド・コンセントレーションズ・イン・ラッツ・フェド・ア・コレ ステロール−フリー・ダイエット(Dietary taurine or glycinesupplementation reduces plasma and liver cholesteroland triglyceride concentrations in rats fed a chol esterol-free diet)、ニュートリション・リサーチ(Nutrition Research)、１９９９、１ ９（１２）、１７７７∼１７８９頁、ヨシダら、エフェクツ・オブ・アディション・オブ ・アルギニン、シスチン・アンド・グリシン・トゥー・ザ・ボビン・ミルク−シミュレイ 20 テッド・アミノ・アシッド・ミクスチャー・オン・ザ・レベル・オブ・プラズマ・アンド ・リバー・コレステロール・イン・ラッツ(Effects of addition of arginine, cystine, and glycine to the bovine milk-simulated amino acid mixture on the level of pl asma and liver cholesterol in rats)、ジャーナル・オブ・ニュートリショナル・サイ エンス・アンド・ビタミノロジー(Journal of Nutritional Science andVitaminology)（ 東京）、１９８８、３４（６）、５６７∼７６頁、オルソン(Olson)ら、エフェクト・オ ブ・アミノ・アシッド・ダイエッツ・アプォン・セラム・リピッヅ・イン・マン(Effect of amino acid diets upon serum lipids in man)、アメリカン・ジャーナル・オブ・ク リニカル・ニュートリション(American Journal of Clinical Nutrition)、１９７０、２ ３（１２）、１６１４∼２５頁、リゼンコフ(Ryzhenkov)ら、［ヒポリピデミック・アク 30 ティビティー・オブ・グリシン・アンド・イッツ・デリバティブズ(Hypolipidemic activ ity of glycine and its derivatives)]、ボプロシー・メディトシンスコイ・クヒミー(V oprosy MeditsinskoiKhimii)、１９８４、３０（２）、７８∼８０頁、ヤガサキら、エフ ェクツ・オブ・ダイエタリー・メチオニン、システイン・アンド・グリシン・オン・エン ドジェナウス・ハイパーコレステロレミア・イン・ヘパトーマ−ベアリング・ラッツ(Eff ects of dietary methionine, cystine, and glycine on endogenous hypercholesterole mia in hepatoma bearing rats)、ジャーナル・オブ・ニュートリショナル・サイエンス ・アンド・ビタミノロジー(Journal of Nutritional Science and Vitaminology)（東京 ）、１９８６、３２（６）、６４３∼５１頁、エミ(Emi)ら、ミスセンス・ミューテーシ ョン（Ｇｌｙ−Ｇｌｕ１８８）・オブ・ヒューマン・リポプロテイン・リパーゼ・インパ 40 ーティング・ファンクショナル・デフィシエンシー(Missense mutation (GIy - Glul88) of human lipoprotein lipase imparting functional deficiency)、ジャーナル・オブ ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal ofBiological Chemistry)、１９９０、２６５ （１０）、５９１０∼６頁参照のこと。白色脂肪組織（ＷＡＴ）が減少する場合に予測さ れるように、有意な傾向にあるレプチンレベルの低下が観察された。ＷＡＴが減少してい る場合に予測されるように、アディポネクチンレベルは、有意な傾向で増加することが観 察された。このデータは、高グリシン食は、肥満症の病原性についてのこれらのバイオマ ーカーに対して正の効果をもたらすということを実証した。 【実施例２】 【００６９】 50 (18) JP 2012-232982 A 2012.11.29 成体雄ズッカー糖尿病性肥満（ＺＤＦ）ラットを、飼料に２０％グリシンを含む食餌ま たは無添加食の各群３ラットの処理群に無作為に割り当てた。ＺＤＦラットは肥満で、高 脂血症で、インスリン抵抗性である。重量測定を示した研究日数で行った。図６参照のこ と。重量測定を行う分析者は、観察が記録されている動物の食餌に関してわからないよう にされた。バーは、示した観察日での各群のラットの体重の±１標準誤差を表す。データ は一元配置分散分析を用いて分析し、ダネットの多重比較試験を用いる事後解析に付した 。２０％グリシン食を給餌されたラットは、無添加食を給餌されたラットと比較して、研 究の１５日∼３６日まで体重が統計的に有意に減少した。やはり、飼料消費においては群 間で有意差は観察されなかった。剖検で各ラットの腹部脂肪含量の測定を行った（図７） 。２０％グリシン食を給餌されたラットは、５％グリシン食または無添加食を給餌された 10 ものよりも統計的に有意に少ない（ｐ≦０．０５）腹部脂肪を有していた。 【実施例３】 【００７０】 成体雌スプラーグ・ドーリー(Sprague-Dawley)ラットを、飼料に５、１０、１５または ２０％グリシンを含む食餌または無添加食の各群３ラットの処理群に無作為に割り当てた 。図８参照のこと。重量測定を示した研究日数で行った。重量測定を行う分析者は、観察 が記録されている動物の食餌に関してわからないようにされた。バーは、示した観察日で の各群のラットの体重の±１標準誤差を表す。２０％グリシン食を給餌されたラットの体 重は、無添加食を給餌されたラットのものよりも少なかった。データは一元配置分散分析 を用いて分析し、ダネットの多重比較試験を用いる事後解析に付した。２０％グリシン食 20 を給餌されたラットは、無添加食を給餌されたラットと比較して、研究の１５日∼３６日 まで体重が統計的に有意に減少した。 【実施例４】 【００７１】 成体雌スプラーグ・ドーリー(Sprague-Dawley)ラットを、飼料に５、１０、１５または ２０％グリシンを含む食餌または無添加食の各群３ラットの処理群に無作為に割り当てた 。図９参照のこと。飼料消費測定を示した研究日数で行った。測定を行う分析者は、観察 が記録されている動物の食餌に関してわからないようにされた。これらのデータは、観察 された減量は飼料摂取の減少によるカロリー制限の結果ではないということを示す。さら に、食餌をｂｏｍｂ熱量測定によって分析し（表２参照）、カロリー量に有意な差はない 30 ことを実証したので、観察された体重減少は、飼料のカロリー量の減少の結果ではない。 【実施例５】 【００７２】 成体雌スプラーグ・ドーリー(Sprague-Dawley)ラットを、飼料に５、１０、１５または ２０％グリシンを含む食餌または無添加食の各群３ラットの処理群に無作為に割り当てた 。研究の３０日目に各処理群のラットを安楽死させた。剖検で各ラットの腹部脂肪含量の 測定を行った。図１０参照のこと。測定を行う分析者は、観察が記録されている動物の処 理群に関してわからないようにされた。データは一元配置分散分析を用いて分析し、ダネ ットの多重比較試験を用いる事後解析に付した。５％∼２０％と示されたグリシン量を含 む食餌を給餌されたラットは、無添加食を給餌されたものよりも統計的に有意に少ない腹 40 部脂肪を有していた。 【実施例６】 【００７３】 スプラーグ・ドーリー(Sprague-Dawley)ラット、２４日齢に、１５％グリシンおよび８ ５％ＴＤ８０４０６からなる食餌を給餌した。１５％グリシンおよび８５％ＴＤ８０４０ ６を含む食餌を６週間給餌された動物の剖検で、体重以外の肉眼的病変または処理に関連 する異常は何も報告されなかった。血液化学および完全血球数では、１００％ＴＤ８０４ ０６を給餌された対照動物と１５％グリシンおよび８５％ＴＤ８０４０６を含む食餌を６ 週間給餌された動物の間で差異は観察されなかった。高グリシンを補給された食餌を給餌 された１匹の動物から採取した組織の組織病理学検査を実施した。切り取り、加工し、包 50 (19) JP 2012-232982 A 2012.11.29 埋し、薄切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシン染色した組織の顕微鏡検査は、脳、肺 、肝臓、副腎、腎臓、膀胱、心臓、胃、大腸または小腸について顕著な結果は何も示さな かった。要するに、正常な組織像から顕微鏡的変化は何もなかった。 【実施例７】 【００７４】 成体雄スプラーグ・ドーリー(Sprague-Dawley)ラットを、飼料に５％または２０％グリ シンを含む食餌または無添加食の各群３ラットの処理群に無作為に割り当てた。研究の２ ０日目に動物を安楽死させ、剖検で脂肪組織を採取した。脂肪組織から総タンパク質を抽 出した。高グリシン食を給餌されたラットから得た脂肪組織がアポトーシスを受けていた ことを実証するために、対照またはグリシン含有食を給餌された動物の抽出物を、位置１ 10 ３６でＢＡＤをリン酸化する能力についてアッセイした。図１１Ａおよび１１Ｂに見られ るように、データは、（ＷＡＴ）におけるチロシン１３６でのＢＡＤのリン酸化の用量依 存的減少を明確に実証したが、このような減少は褐色脂肪組織（ＢＡＴ）では観察されず 、このことは、高グリシン食は白色脂肪組織においてアポトーシスをもたらすということ を示す。図１２および図１３は、同一動物から得た肝臓組織の抽出物（図１２）または筋 肉の抽出物（図１３）をアッセイした場合には、チロシン１３６でのＢＡＤのリン酸化状 態のこのような減少が全く観察されないことを明確に実証する。 【００７５】 データは、チロシン１３６でのＢＡＤのリン酸化の用量依存的減少を明確に実証し、こ のことは高グリシン食が脂肪組織においてアポトーシスをもたらすことを示す。 20 【００７６】 組織抽出物の、セリン位置１３６でＢＡＤをリン酸化する能力についてのアッセイを以 下のように実施した：ＢＡＤアガロース（アップステート(Upstate)、マサチューセッツ 州、ウォルサム）に１ｍｇの組織抽出物を加えた。ＲＩＰＡバッファー（抗ホスファター ゼおよび抗プロテアーゼを含む）（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］５０ｍＭ、ＮＰ−４ ０ １％、デオキシコール酸Ｎａ ０．２５％、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍ Ｍ、ＰＭＳＦ １ｍＭ、プロテアーゼアレスト(Protease Arrest) １００μｌ、オルト バナジウム酸ナトリウム １ｍＭ、フッ化ナトリウム １ｍＭ）を用いて反応溶液を１ｍ ｌに調節し、３０℃で０．５時間インキュベートした。遠心分離（１２，０００×ｇで５ 秒）によってアガロースビーズを集めた。上清を除去し、氷冷ＴＢＳでビーズを３回洗浄 30 した。４０μｌのサンプルバッファーにＢＡＤアガロースを再懸濁し、５分間煮沸し、遠 心分離した（１２，０００×ｇで５分）。１５％ゲル（Ｔｒｉｓ−グリシン）で７μｌの サンプルを電気泳動した。ウェスタンブロッティングによってタンパク質をニトロセルロ ースメンブランにトランスファーし、４℃で振盪しながらＴＴＢＳ中５％ＮＦＭでブロッ キングした。このメンブランをＴＴＢＳ中２％ＮＦＭで洗浄した。各レーンを、ウサギ抗 ホスホＢＡＤ１３６抗体を（２％ＮＦＭ／ＴＴＢＳ中１：１０００）で用い、室温で２時 間ブロッティングした。このブロットをＴＴＢＳで５分間３回洗浄した。このブロットを ヤギ抗ウサギＨＲＰ（２％ＮＦＭ／ＴＴＢＳ中１：５０００）とともにインキュベートし た。このブロットをＴＴＢＳで５分間３回、ＴＢＳで５分間２回洗浄した。リン酸化され たＢＡＤの可視化は、化学発光基質（ピアス(Pierce)スーパーシグナル(Super-Signal)基 40 質（商標））を用いて達成した。 【００７７】 本発明者らは、観察された生物学的効果をグリシンが誘発する作用機序をさらに解明す るために、ゲル電気泳動における２Ｄディファレンシャル（２Ｄ−ＤＩＧＥ）を用いた。 ２Ｄ−ＤＩＧＥは、異なる生物学的状態から得た組織のプロテオームにおける発現の相違 の迅速な評価を可能にする強力な方法である。パットン(Patton)、ディテクション・テク ノロジーズ・イン・プロテオーム・アナリシス(Detection technologies in analysis)、 ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー・B・アナリティカル・テクノロジーズ・イン・ ザ・バイオメディカル・アンド・ライフ・サイエンセズ(Journal of Chromatography B A nalytical Technologies in Biomedical and Life Sciences)、２００２、７７１（ｌ− 50 (20) JP 2012-232982 A 2012.11.29 ２）、３∼３１頁、ウンル(Unlu)ら、ディフェレンス・ゲル・エレクトロフォレシス：ア ・シングル・ゲル・メソッド・フォー・ディテクティング・チェンジズ・イン・プロテイ ン・エクトラクツ(Difference gel electrophoresis: a single gel method for detecti ng changes in protein extracts)、エレクトロフォレシス(Electrophoresis)、１９９７ 、１８（１１）、２０７１∼７頁、ボン・エッゲリング(Von Eggeling)ら、フルオレセン ト・デュアル・カラー・２Ｄ−プロテイン・ゲル・エレクトロフォレシス・フォー・ラピ ッド・ディテクション・オブ・ディフェレンセズ・イン・プロテイン・パターン・ウィズ ・スタンダード・イメージ・アナリシス・ソフトウェア(Fluorescent dual colour 2D-pr otein gel electrophoresis for rapid detection of differences in protein pattern with standard image analysis software)、インターナショナル・ジャーナル・オブ・モ 10 レキュラー・メディシン(International Journal of Molecular Medicine)、２００１、 ８（４）、３７３∼７頁参照のこと。 【００７８】 対照（図１４）および２０％グリシン処理（図１５）から得た組織から抽出したタンパ ク質の二重標識実験の予備段階の結果が、今後の２Ｄ−ＤＩＧＥ実験に取り組むための調 製において得られた。対照動物の脂肪組織から得たＣｙ３フルオロフォアで標識したタン パク質を図１４に示す。図１５は、食餌中２０％グリシンで処理した動物の脂肪組織に由 来するＣｙ５フルオロフォアで標識したタンパク質を用いて得た結果を示す。黄色の円は 、対照に対するダウンレギュレーションを示すのに対し、赤色の円はアップレギュレーシ ョンを示すことが目視検査によって認識できる。 20 【００７９】 対照食または２０重量％のグリシンを補給した食餌のいずれかを給餌した雌スプラーグ ・ドーリー(Sprague-Dawley)ラットから得た脂肪組織の２Ｄ−ＤＩＧＥ分析。組織サンプ ルを、７×１１０ミニチップリユーザブル・ジェネレータープローブ(mini-Tip Reusable Generator Probe)を取り付けたパワージェン(PowerGen)１．２５モデル ＦＴＨ１１５ ホモジナイザーを用いて氷上でホモジナイズし、全タンパク質抽出（ＴＰＥ）キット（ジ ェノテック(Genotech)、米国、ミズーリ州６３０４３−９９８９、セントルイス、９２− ウェルドンパークウェイ(Weldon Parkway)）を用い、キットに同梱されているプロトコー ルに従ってタンパク質を抽出した。使用に先立つ抽出および保存の間のタンパク質分解を 最小にするために、すべてのバッファーはプロテアーゼアレスト(Protease Arrest)カク 30 テル（ジェノテック(Genotech)、米国、ミズーリ州６３０４３−９９８９、セントルイス 、９２−ウェルドンパークウェイ(Weldon Parkway)）を含んでいた。バイオラッド(Bio R ad)２Ｄクリーンアップキット（カタログ番号１６３−２１３０）を用いて、抽出したタ ンパク質を沈殿させ、Ｃｙ標識バッファー（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、 ４％ ＣＨＡＰＳ、８Ｍ尿素）に再懸濁した。対照動物および処理動物から得た等量のタ ンパク質（５０μｇ）をそれぞれ、製造業者の仕様書に従い、ＤＭＦで希釈した４００ｐ ｍｏｌのＣｙ３またはＣｙ５フルオロフォアで標識した。標識反応は、暗所で３０分間、 氷上で実施し、１ｍＭリジンを添加することによってクエンチした。標識されたタンパク 質の２つの集団を、バイオライト(Biolyte)両性電解質（バイオラッド(BioRad)カタログ 番号１６３−１１１２）および再水和バッファー（バイオラッド(BioRad)カタログ番号１ 40 ６３−２０８３）とともに混合した。次いで、この混合物を再水和したＩＰＧストリップ （バイオラッド(BioRad)カタログ番号１６３−２０９９）上に、室温で一晩載せた。製造 業者の仕様書に従い、再水和したＩＰＧストリップ中のタンパク質をバイオラッド(BioRa d)タンパク質ＩＥＦゲル装置で集中させ、バイオラッド(BioRad)タンパク質スラブゲル装 置で２次元で流した。ゲル中のＣｙ３およびＣｙ５標識タンパク質の可視化は、５３５お よび６２０ｎｍ励起フィルターならびに６００および６７０ｎｍ発光フィルターを用いる ＫＯＤＡＫイメージステーション２０００ＭＭを用いて行った。 【実施例８】 【００８０】 血液および組織（脂肪）中のグリシンの濃度を正確に測定するための高感度アッセイ 50 (21) JP 2012-232982 A 2012.11.29 脂肪組織量の減少に関するグリシンについての薬物動態モデルおよび薬力学的モデルの 開発には、投与されたグリシンの濃度を測定する正確な方法が必要となる。方法は、内因 性グリシンを入れずに、投与されたグリシンの吸着、分布、代謝および排泄（ＡＤＭＥ） をたどることができることが理想である。さらに、開発される方法は、グリシン類似体を 用いるさらなる研究への適用のために容易に改変できなければならない。ＡＬＣ／ＭＳ法 をこの目的に用いることができる。このアプローチによって、投与されたＣ13−グリシン と内因性グリシンのＡＤＭＥの同時検出を可能にする研究におけるＣ13−グリシンの利用 が可能となる。 【００８１】 手短には、この手順は、ＬＣ／ＭＳによる分析に先立つ酸性沈殿によってタンパク質お 10 よび核酸夾雑物が除去されるサンプル精製ステップからなる。ＱＣ−サンプルを調製し、 その後、サンプルマトリックス（すなわち、未処理動物由来の血漿または透析した組織抽 出物）中に既知量のグリシン／Ｃ13−グリシンを含む各研究を開始する。サンプルの酸性 沈殿は、褐色の１．５ｍｌ微量遠心管中で、１００μｌの血漿サンプルに、１００μｌの 、１％メタリン酸を含有する氷冷１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）過塩素酸を添加し、これを氷 上で１０分間インキュベートし、次いで、４℃、１２，０００×ｇで５分間遠心分離する ことによって達成される。次いで、得られた上清を０．２μｍのフィルターを通して濾過 し、サバン(Savant)ＳＣ１１０スピードバック(Speedvac)（または同等物）で真空乾燥さ せる。研究サンプルおよびＱＣサンプルは、分析に付されるまで−８０℃で保存する。分 析に先立って、サンプルを室温に加温し、５０μｌの脱イオン化ＬＣ／ＭＳ等級水（ＬＣ 20 ／ＭＳ−ｄｄＨ2Ｏ）５０μｌで再構成し、ガラス製自動注入装置バイアルに移す。これ を、次いで、マイクロＡＳ（サーモエレクトロン(Thermo Electron)）自動注入装置に載 せる。各サンプル２０μｌを、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）源を介してＬＣＱ ＤＥＣＡ ＸＰイオントラップ質量分析計（サーモエレクトロン社(Thermo Electron Corp.)）と連結しているサーベイヤープラス(Sureyor Plus)ＨＰＬＣシステム（サーモエ レクトロン社(Thermo Electron Corp.)）の５０×２．１ｍｍハイパーカーブ(Hypercarb )（商標）カラム（サーモエレクトロン社(Thermo Electron Corporation)）上に注入する 。クロマトグラフィーによる分離は、１０分でＬＣ／ＭＳ−ｄｄＨ2Ｏ中２０ｍＭペルフ ルオロペンタン酸からＬＣ／ＭＳ−ｄｄＨ2Ｏ中１５％アセトニトリルに、次いで、さら なる１０分でＬＣ／ＭＳ−ｄｄＨ2Ｏ中２６％に、次いで、１０分かけてＬＣ／ＭＳ−ｄ 30 ｄＨ2Ｏ中最終５０％アセトニトリルに勾配を流すことによって達成する。条件を、ＬＣ ／ＭＳ−ｄｄＨ2Ｏ中最終５０％アセトニトリルおよび２０ｍＭペルフルオロペンタン酸 で１０分間維持し、続いて、ＬＣ／ＭＳ−ｄｄＨ2Ｏ中２０ｍＭペルフルオロペンタン酸 １００％に５分間戻し、次いで注入する。 【００８２】 図１６は、代表的なクロマトグラムおよびグリシンの定量化に用いられる標準曲線を示 す。データは、カラムに載せた２４種の一般的なアミノ酸を含む公知の標準およびグリシ ン、プロリン、フェニルアラニン、リジンおよびロイシンについての選択イオンモニタリ ング（ＳＩＭ）を用いて得た。結果は、アッセイは、提案される探索におけるその意図さ れる目的のための必須の感度を有していることを明確に示す。アッセイはＣ13−グリシン 40 を用いてさらに精密化し、確認できる。 【実施例９】 【００８３】 高用量グリシンの単回投与薬物動態プロフィールおよび経口バイオアベイラビリティ 以下の実験計画を用いて、グリシンの薬物動態プロフィールおよび経口バイオアベイラ ビリティを調べることができる。チャールスリバーラボラトリーズ(Charles River Labor atories)から得られる、外科的に埋め込んだ頸静脈カテーテルを有し、２００∼２２５ｇ の間の体重の成体（１８０日齢）スプラーグ・ドーリー(Sprague-Dawley)ラットを使用で きる。１８匹のラットを６匹のラット（３匹の雄３匹の雌）からなる３群に無作為に分割 し、３つの投与群：高（５ｍｇ／ｋｇ）、中（２．５ｍｇ／ｋｇ）および低（０．２５ｍ 50 (22) JP 2012-232982 A 2012.11.29 ｇ／ｋｇ）の各々に無作為に割り当てる。２０重量％グリシンからなる食餌を給餌された 雄ＺＤＦラットから２４時間絶食した後に剖検で得られた血漿サンプルの予備分析は、１ ６．９μｇ／ｍＬレベルのグリシンを示した。実際の定常状態レベルのグリシンは、動物 が絶食している前はおそらくはかなり高い。本発明者らが選択した用量は、約１５０μｇ ／ｍｌ、高用量群、７５μｇ／ｍｌ、中用量群および７．５μｇ／ｍｌ低用量群というピ ーク血漿レベルをもたらすはずである。グリシンをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐ Ｈ７．２に溶解し、まずＩＶボーラスによって投与する。以下の時点で、血漿サンプル（ ０．１ｍｌ）を、クエン酸塩を含有する上端が明るい青色のバキュテイナ(vacutainer)管 （ＢＤ３６３０８０）に吸い込ませる。Ｔ＝０分、Ｔ＝０．５分、Ｔ＝１分、Ｔ＝５分、 Ｔ＝１５分、Ｔ＝３０分、Ｔ＝１時間、Ｔ＝２時間、Ｔ＝４時間、Ｔ＝８時間、Ｔ＝６時 10 間、Ｔ＝２４時間およびＴ＝４時間。各時点で採取した分離血漿を、液体窒素中で急速冷 凍し、分析するまで−８０℃で保存する。動物は７日間回復させ、再度計量し、次いで、 経口経管栄養によって高、中および低投与量のグリシンで処理する。ＩＶボーラス投与に ついて、以下の時点で、血漿サンプル、０．１ｍｌを先に記載したように上端が明るい青 色のバキュテイナ(vacutainer)に吸い込ませる。Ｔ＝０分、Ｔ＝３０分、Ｔ＝１時間、Ｔ ＝２時間、Ｔ＝４時間、Ｔ＝６時間、Ｔ＝８時間、Ｔ＝１６時間、Ｔ＝２４時間、Ｔ＝４ ８時間、Ｔ＝７２時間およびＴ＝９６時間。各時点で採取した分離血漿を、液体窒素中で 急速冷凍し、分析するまで−８０℃で保存する。データをウィンノンリン(WinNonlin)（ 登録商標）バージョン４．１ソフトウェアを用いて薬物動態解析について解析する。これ らの実験に由来する薬物動態モデルを用いて、その後の実験に用いられる連続投与計画を 20 設計する。さらに、このモデルは、さらなる開発のために類似体を選択する際に用いるた めの基本モデルとして役立つ。 【実施例１０】 【００８４】 グリシンの複数回投与薬物動態 本発明者らの予備研究では、グリシンを、試験動物の普通の食餌の一部として経口投与 した。この投与方法は、脂肪組織におけるアポトーシスの誘導に関するグリシンの作用に ついての薬力学的モデルの構築に必要な投与量の正確性および再現性を提供しなかった。 本発明者らは、この研究に取り組むために、観察された薬理効果（すなわち、脂肪組織に おけるアポトーシスの誘導）を本発明者らが正確に示すのを可能にする投与計画を立てな 30 ければならない。高用量グリシンの単回投与薬物動態プロフィールおよび経口バイオアベ イラビリティを定義するための本発明者らの研究において得られる薬物動態パラメータを 用いて、高用量グリシンの連続投与計画を設計する。立てられる計画を用いて、食餌中２ ０重量％、１０重量％および５重量％グリシンからなる食餌を給餌された動物において観 察されたものの±１０％に等しいレベルに試験動物の血中レベルでグリシンを維持する。 各投与群における動物の数およびサンプルのタイミングについての詳細な説明は、先の単 回投与研究から確かめられた薬物動態パラメータおよびにパラメータの変動に基づいて決 まる。しかし、本発明者らは、研究設計は、計画を確証するために投与群あたり１０匹（ ５匹の雄、５匹の雌）未満の動物を必要とすると予想する。本発明者らは、投与計画の設 計において、計画を確証するために用いられるデータを得るためにサンプリングする時点 40 を策定するためにウィンノンリン(WinNonlin)（登録商標）のシミュレーション機能を用 いる。 【００８５】 ウィンノンリン(WinNonlin)（登録商標）ソフトウェアは、投与スケジュールを確証す るための連続投与スケジュールおよびサンプリングスキームの設計においてシミュレーシ ョンを利用するための優れたツールセット提供する。ウィンドウズ（登録商標）用グラフ パッドスタットメート(GraphPad StatMate)バージョン２．００を用いて、各投与群の動 物数が、統計的妥当性を実証するために適切な力を達成するために必要とされるものであ ることを確認する。ウィンドウズ（登録商標）用グラフパッドインスタット(GraphPad In Stat)バージョン３．０６ ３２ビットを用いて統計分析を実施する。ＰＫパラメータお 50 (23) JP 2012-232982 A 2012.11.29 よび血中グリシンの循環レベルが実験的に得られたものと統計上有意には異ならないと実 証される場合に、投与計画は有効であると考える。 【００８６】 研究の最後に、研究動物を安楽死させ、剖検を実施する。抗ＢＡＤｓｅｒ−１３６抗体 を用いる免疫沈降およびウエスタンブロット解析か、親和性捕獲ＬＣ／ＭＳ分析のいずれ かによって、脂肪組織におけるｓｅｒ−１３６でのＢＡＤのリン酸化状態を調べる。パパ ック(Papac)＆シャーロック(Shahrokh)、マス・スペクトロメトリー・イノベーションズ ・イン・ドラッグ・ディスカバリー・アンド・ディバロップメント(Mass spectrometry i nnovations in drug discovery and development)、ファーマシューティカル・リサーチ( Pharmaceutical Research)、２００１、１８（２）、１３１∼４５頁、クリーザー(Creas 10 er)ら、イムノアフィニティー・クロマトグラフィー・コンバインド・オンライン・ウィ ズ・ハイパフォーマンス・リキッド・クロマトグラフィー−マス・スペクトロメトリー・ フォー・ザ・ディターミネーション・オブ・コルチコステロイズ(Immunoaffinity chroma tography combined on-line with high-performance liquid chromatography-mass spect rometry for the determination of corticosteroids)、ジャーナル・オブ・クロマトグ ラフィーA(Journal of Chromatography A)、１９９８、７９４（ｌ−２）、３７∼４３頁 、ギャロ(Gallo)ら、ディベロップメント・オブ・ア・リキッド・クロマトグラフィー／ エレクトロスプレー・タンデム・マス・スペクトロメトリー・メソッド・フォー・コンフ ァーメーション・オブ・クロラムフェニコール・レシデューズ・イン・ミルク・アフター ・アルファ−１−アシッド・グリコプロテイン・アフィニティー・クロマトグラフィー(D 20 evelopment of a liquid chromatography / electrospray tandem mass spectrometry me thod for confirmation of chloramphenicol residues in milk after alfa-1-acid glyc oprotein affinity chromatography)、ラピッド・コミュニケーションズ・マス・スペク トロメトリー(Rapid Communications Mass Spectrometry)、２００５、１９（４）、５７ ４∼９頁参照のこと。また、脂肪組織を、活性アポトーシスのマーカーとしてＴＵＮＥＬ タンパク質について免疫組織化学染色に付す。パブロフスキー(Pavlovsky)＆バグンダ(Va gunda)、［アポトーシス−セレクテッド・メソッズ・オブ・ディテクション・オブ・アポ トーシス・アンド・アソシエイテッド・レギュラトリー・ファクターズ・オン・ティシュ ー・セクションズ・オブ・チューモア(Apoptosis-selected methods of detection of ap optosis and associated regulatory factors on tissue sections of tumors)］、チェ 30 スコスロベンスカ・パトロジー(Ceskoslovenska Patologie)、２００３、３９（１）、６ ∼１０頁、ヒートウォール(Heatwole)、Ｖ．Ｍ．、ＴＵＮＥＬアッセイ・フォー・アポト ーティック・セルズ(TUNEL assay or apoprotic cells)、メソッヅ・イン・モレキュラー ・バイオロジー(Methods in Molecular Biology)、１９９９、１１５、１４１∼８頁、シ ュターデルマン(Stadelmann)＆ラスマン(Lassmann)、ディテクション・オブ・アポトーシ ス・イン・ティシュー・セクションズ(Detection of apoptosis in tissue sections)、 セル・アンド・ティシュー・リサーチ(Cell and Tissue Research)、２０００、３０１（ ｌ）、１９∼３１頁参照のこと。 【００８７】 また、主要な臓器を採取し、毒性の何らかの明白な徴候について観察し、毒性の何らか 40 の明白な徴候が見られる場合にはさらなる分析のために保存する。 【実施例１１】 【００８８】 脂肪組織におけるアポトーシスの誘導による減量を誘導するその能力に関連するグリシン の関連ＰＫ／ＰＤ（薬物動態／薬力学モデル） 薬力学とは、作用部位での薬物濃度と薬理学的反応との間の関係、例えば、その相互作 用に影響を及ぼす生化学的作用および生理学的作用である。シャーゲル(Shargel)＆ユー( Yu)、アプライド・バイオファルマシューティクス・アンド・ファルマコキネティクス(Ap plied Biopharmaceutics and pharmacokinetics)、第４版、１９９９、ニューヨーク、マ グローヒル(McGraw-Hill)、５７３∼６０５頁参照のこと。 50 (24) JP 2012-232982 A 2012.11.29 【００８９】 薬力学モデルの形は、薬物がその薬理作用を発揮する機構に応じて異なる。したがって 、このモデルで得られる情報は、グリシンが脂肪組織においてその生物学的効果をどのよ うに誘発するかに関して有用な情報を提供する。本発明者らは、本交付申請において提案 される研究のための本発明者らの予備段階の研究において、高グリシン食がｓｅｒ−１３ ６でＢＡＤを脱リン酸化状態にすることを実証した。本発明者らは、ｓｅｒ−１３６での ＢＡＤのリン酸化状態を、本発明者らの薬力学モデリングのためのアポトーシスのマーカ ーとして用いることを提案する。本発明者らは、ＢＡＤのリン酸化状態に対する効果に関 するグリシン作用についてのＰＫ／ＰＤ関連モデルを構築する。ＰＫ／ＰＤ関連モデルで は、ＰＤモデルによって用いられる、作用部位での薬物の局所濃度をモデリングするため 10 に、固定した薬物動態パラメータを仮定する。ジャスコ(Jusko)、コルチコステロイド・ ファルマコダイナミクス：モデルス・フォー・ア・ブロード・アレイ・オブ・レセプター −メディエイティド・ファルマコロジック・エフェクト(Corticosteroid pharmacodynami cs: models for a broad array of receptor-mediated pharmacologic effects)、ジャー ナル・オブ・クリニカル・ファルマコロジー(Journal of Clinical Pharmacology)、１９ ９０、３０（４）、３０３∼１０頁、ダイネカ(Dayneka)ら、コンパリソン・オブ・フォ ー・ベーシック・モデルス・オブ・インダイレクト・ファルマコダイナミック・レスポン セズ(Comparison of four basic models of indirect pharmacodynmic responses)、ジャ ーナル・オブ・ファルマコキネティクス・アンド・バイオファルマシューティクス(Journ al of Pharmacokinetics Biopharmaceutics)、１９９３、２１（４）、４５７∼７８頁。 20 本発明者らは単回投与および複数回投与研究から導いた薬物動態モデルを用いて、ＰＫ／ ＰＤ関連モデルの固定ＰＫパラメータを供給する。白色脂肪組織（ＷＡＴ）のｅｘ ｖｉ ｖｏ器官培養を用いて、ＰＫ／ＰＤ関連モデルのＰＤ部分をモデリングする。ＷＡＴのｅ ｘ−ｖｉｖｏ培養を確立するための方法および手順は十分に記載されている。ムスタイド −ムッサ(Moustaid-Moussa)＆フリード(Fried)、カルチャー・オブ・アディポーズ・ティ シュー・アンド・アイソレイティッド・アディポサイツ，イン・アディポーズ・ティシュ ー・プロトコールズ(Culture of Adipose Tissue and Isolated Adipocytes, in Adipose Tissue Protocols)、Ｇ．アイハウド(Aihaud)編、２００１、ヒュマーナプレス社(Huma na Press, inc.)：ニュージャージー州、トトワ、１９７∼２１３頁、リビングストン(Li vingston)ら、インスリン−ディペンデント・レギュレーション・オブ・ザ・インスリン 30 −センシティビティー・オブ・アディポサイツ(Insulin-dependent regulation of the i nsulin-sensitivity of adipocytes)、ネイチャー、１９７８、２７３（５６６１）、３ ９４∼６１頁、バーンスタイン(Bernstein)、インプルーブド・インスリン・レスポンシ ブネス・イン・ラット・アディポーズ・ティシュー・ピーセズ・カルチャード・ウィズ・ チャコール−トリーティド・アルブミン・アンド・オキシジェン(Improved insulin resp onsiveness in rat adipose pieces cultured with charcoal-treated albumin and oxyg en)、ジャーナル・オブ・リピッド・リサーチ(Journal of Lipid Research)、１９８２、 ２３（２）、３６０∼３頁、バーンスタイン(Bernstein)、インスリン・インセンシティ ビティー・アンド・アルタード・グルコース・ユーティリゼーション・イン・カルチャー ド・ラット・アディポーズ・ティシュー(Insulin insensitivity and altered glucose u 40 tilization in cultured rat adipose tissue)、ジャーナル・オブ・リピッド・リサーチ (Journal of Lipid Research)、１９７９、２０（７）、８４８∼５６頁、マロフ(Maloff )ら、ディレクト・エフェクツ・オブ・グロウス・ホルモン・オン・インスリン・アクシ ョン・イン・ラット・アディポーズ・ティシュー・メインテインド・イン・ビトロ(Direc t effects of growth hormone on insulin action in rat adipose tissue maintained i n vitro)、エンドクリノロジー(Endocrinology)、１９８０、１０７（２）、５３８∼４ ４頁参照のこと。これらの実験には単離脂肪細胞とは対照的に、ＷＡＴ器官培養を用いる が、これは器官培養がＷＡＴの複雑な生物学をより十分に反映し、ｉｎ ｖｉｖｏ状態を より反映する効果に対して集中したＰＤモデルをもたらすからである。パパック(Papac) ＆シャーロック(Shahrokh)、マス・スペクトロメトリー・イノベーションズ・イン・ドラ 50 (25) JP 2012-232982 A 2012.11.29 ッグ・ディスカバリー・アンド・ディベロップメント(Mass spectrometry innovations i n drug discovery and development)、ファーマシューティカル・リサーチ(Pharmaceutic al Research)、２００１、１８（２）、１３１∼４５頁。 【００９０】 手短には、体重２００∼２２５ｇの３匹の雄および３匹の雌のスプラーグ・ドーリー(S prague-Dawley)ラットの各々から、安楽死の１０分以内に、後腹膜、鼠径部および生殖腺 脂肪体の外科的切除によってＷＡＴを得る。各動物からおよそ１２∼１５ｇｍのＷＡＴが 得られる。同一の性の動物から得たＷＡＴを、滅菌、室温Ｍ１９９（ギブコ(Gibco)−Ｂ ＲＬ、液体、重炭酸イオン緩衝、グルタミンおよび２５ｍM ＨＥＰＥＳを補給）および ５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含むコニカルプラスチック遠心管中で混合し、粗く分 10 割する（管あたり３ｇ）。物質のすべてのさらなる加工は、フリード(Fried)およびムス タイド−ムッサ(Moustaid-Moussa)（カルチャー・オブ・アディポーズ・ティシュー・ア ンド・アイソレイティッド・アディポサイツ，イン・アディポーズ・ティシュー・プロト コールズ(Culture of Adipose Tissue and Isolated Adipocytes, in Adipose Tissue Pr otocols)、Ｇ．アイハウド(Aihaud)編、２００１、ヒュマーナプレス社(Humana Press, i nc.)：ニュージャージー州、トトワ、１９７∼２１３頁）によって記載されるように、層 流フード中で無菌様式で実施する。ＡＴを、鋭いはさみを用いて５∼１０ｍｇ断片にさら に分割する。組織は細かく分割すると、ＲＴで最大１時間維持できる（他の管の組織が分 割されている間）。この組織は、この重大な時に代謝速度を高めないよう、３７℃には置 かない。次いで、各管の内容物を、約５００ｍｌの瓶の頂部に置かれる（漏斗に貼った） 20 ナイロンメッシュを通して注ぐことによって、ＷＡＴ器官培養物を、脂質の液滴および血 液を含まないよう洗浄する。この後、漏斗上の組織の上に、３７℃で少なくとも３００ｍ Ｌの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の洗浄液を入れる。次いで、洗浄した組織を滅 菌、風袋計測ペトリディッシュに入れ、大きな血塊はいずれも鉗子で取り除く。ＷＡＴ器 官培養物を含む風袋計測したペトリディッシュを無菌を維持するために閉じ、次いで、秤 量する。次いで、鉗子または有孔スプーンを用いて６ウェル組織培養プレートにＷＡＴを 等しく入れる（約０．５ｇ湿潤重量／ウェル）。次いで、新鮮Ｍ１９９（ギブコ(Gibco) −ＢＲＬ、液体、重炭酸イオン緩衝、グルタミンおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを補給）お よび５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを直ちに加え、培養物を、５％ＣＯ2−９５％大気 の雰囲気下、加湿した、３７℃インキュベーター中で４８時間維持して汚染がないことお 30 よび無菌性を保証する。 【００９１】 上記の通りに調製した、雄および雌のスプラーグ・ドーリー(Sprague-Dawley)ラットに 由来するＷＡＴ器官培養物を含む３連のウェルを、新鮮Ｍ１９９（ギブコ(Gibco)−ＢＲ Ｌ、液体、重炭酸イオン緩衝、グルタミンおよび２５ｍM ＨＥＰＥＳを補給）および５ ０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンで３回洗浄する。以下の濃度のグリシンを補給した新鮮Ｍ １９９培地を加えることによって実験を開始する。対照ウェルにはさらなるグリシンを添 加しない新鮮培地を与え、実験ウェルには、５種の等間隔の濃度のグリシンを補給したＭ １９９培地を与え、最大濃度は、連続投与ＰＫ研究の最高投与群の血中グリシンの循環レ ベルの２倍に等しくする。培地は３日の間、毎日補充する。次いで、培養物を回収し、氷 40 冷ＰＢＳで５回洗浄する。先に記載したように、ＬＣ／ＭＳ法によるグリシンの定量化の ためにサンプルを調製する。 【実施例１２】 【００９２】 グリシンの生物活性類似体のスクリーニングのための迅速生化学アッセイ 高レベル（２０重量％）の食餌性グリシンは、有意な減量をもたらす。この減量は、グ リシンの、ＷＡＴにおいてアポトーシスを誘導する能力の結果であり得る。これは、処理 動物のＷＡＴから得たタンパク質抽出物は、セリン位置１３６でＢＡＤをリン酸化する能 力を有していなかったということを実証する予備データに基づいている（図１１、１２お よび１３）。マスターズ(Masters)ら、１４−３−３インヒビッツ・Ｂａｄインデュース 50 (26) JP 2012-232982 A 2012.11.29 ド・セル・デス・スルー・インタラクション・ウィズ・セリン−１３６(14-3-3 inhibits Bad- induced cell death through interaction with serine-136)、モレキュラー・フ ァルマコロジー(Molecular Pharmacology)、２００１、６０（６）、１３２５∼３１頁、 トンプソン(Thompson)＆トンプソン(Thompson)、プッティング・ザ・ラップ・オン・ａｋ ｔ(Putting the rap on akt)、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー(Journal o f Clinical Oncology)、２００４、２２（２０）、４２１７∼２６頁参照のこと。 【００９３】 先に記載したように、他の者が、グリシンが減量を誘導できることを偶然に観察してい る。しかし、これが生じる機構は解明されていないままであった。本発明者らは、グリシ ンは、アポトーシスの誘導を導くＢＡＤのリン酸化状態の調節を介してＷＡＴに対して直 10 接的な生化学的効果を有すると考える。これは、ｓｅｒ−１３６でのＢＡＤのこのような 脱リン酸化が、ＢＡＴにおいては観察されず、ＢＡＴ組織の有意な減少も生じなかったと いう本発明者らの予備実験における観察結果に基づいている。さらに、本発明者らは、脂 肪細胞に分化した、３Ｔ３−Ｌ１細胞の培地中の高濃度のグリシンは、非処理細胞と比較 した場合に、ＴＵＮＥＬの染色の増加を示すということを観察した。ヒートウォール(Hea twole)、ＴＵＮＥＬアッセイ・フォー・アポトーティック・セルズ(TUNEL assay for apo ptotic cells)、メソッヅ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Methods in Molecular Biology)、１９９９、１１５、１４１∼８頁参照のこと。本実施例の目的は、グリシンの 生物活性類似体をスクリーニングするために使用できる迅速バイオアッセイを開発するこ とである。 20 【００９４】 本発明者らは、雌のスプラーグ・ドーリー(Sprague-Dawley)ラットは、食餌中の高グリ シンの効果に対して特に感受性があり、迅速な有意な減量が起こるということを見い出し た。したがって、グリシンの類似体の活性をスクリーニングするために、雌のスプラーグ ・ドーリー(Sprague-Dawley)ラットにおける有意な減量を用いることが可能であろう。し かし、このアッセイには時間がかかり、類似体の大規模合成を必要とし、多数の化合物を スクリーニングするには効率的でないであろう。本発明者らは、分化型３Ｔ３−Ｌ１細胞 株を用いる迅速生物学的ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験およびｓｅｒ−１３６でのＢＡＤのリン酸 化状態の測定を開発することを提案する。ゲイラード(Gaillard)ら、グロウス・オブ・プ レアディポサイト・セル・ラインズ・アンド・セル・ストレインズ・フロム・ロデンツ・ 30 イン・セーラム−フリー・ホルモン−サプルメンティド・メティウム(Growth of preadip ocyte cell lines and cell strains from rodents in serum-free hormone-supplemente d medium)、イン・ビトロ(In Vitro)、１９８４、２０（２）、７９∼８８頁。 【００９５】 このようなアッセイが信頼して用いられるために、本発明者らは、分化型３Ｔ３−Ｌ１ 細胞から得た脂肪細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの脂肪細胞と同様の方法で高グリシンレベ ルに応答することを実証しなければならない。以下の実験は、この目的のために分化型３ Ｔ３−Ｌ１細胞においてＳｅｒ１３６でのＢＡＤの脱リン酸化を用いることの有用性およ び妥当性を実証することを目的とする。 【００９６】 40 ＷＡＴの器官培養について上記に記載された精製プロセスの改変によってＷＡＴ由来の 脂肪細胞が得られる。手短には、ＷＡＴを先に記載したように単離し、以下のさらなるス テップに付して単離脂肪細胞および間質−血管画分を得る。単離脂肪細胞および間質画分 は、分割したＷＡＴを、３７℃で６０分間の、Ｍ１９９培地中１ｍｇ／ｍｌという濃度で のＩ型コラゲナーゼでの消化に付すことによって得る。次いで、コラゲナーゼ処理した組 織を、滅菌ナイロンフィルター（３５０μｍメッシュ）を通して濾過し、滅菌遠心管に入 れる。この懸濁液を５００×ｇで１分間遠心分離し、その結果、脂肪細胞含有画分から間 質−血管画分（ペレット）の分離を生じる。それぞれの細胞画分を、ハンクス平衡塩溶液 でさらに３回洗浄する。次いで、それぞれの脂肪細胞および間質−血管画分を計数し、新 鮮Ｍ１９９培地で希釈し、６ウェル培養プレートのウェルにプレーティングする。細胞を 50 (27) JP 2012-232982 A 2012.11.29 、５％ＣＯ2−９５％大気の雰囲気下、３７℃インキュベーター中で一晩インキュベート する。細胞を観察し、生存力および汚染がないことを保証し、培地に以下の漸増する濃度 のグリシンを補給した新鮮Ｍ１９９培地を添加することによって実験を開始する。対照ウ ェルには、さらなるグリシンを添加しない新鮮培地を与え、実験ウェルには、ＰＤ実験の ために用いたグリシンと同一濃度のグリシンを補給したＭ１９９培地を与える。培地は３ 日の間、毎日補充する。次いで、培養物を回収し、氷冷ＰＢＳで５回洗浄する。細胞を低 張バッファーに曝露することによって溶解し、遠心分離によって清澄化し、溶解物のアリ コートを使用まで−８０℃で保存するために液体窒素中で瞬間凍結する。ＬＣ／ＭＳ法に よってサンプルの細胞内グリシン含量を調べる。ＢＡＤ−Ｓｅｒ１３６についてのＥＬＩ ＳＡか、親和性捕獲ＬＣ／ＭＳ分析のいずれかによって、Ｓｅｒ−１３６でのＢＡＤのリ 10 ン酸化状態を調べる。各サンプル条件の３連のウェルをプレーティングし、活性なアポト ーシスを実証するためにＴＵＮＥＬについての免疫組織化学染色を実施する。本発明者ら は、以下の実験により、グリシンがＷＡＴに由来する脂肪細胞に対して直接的に作用する という決定的な証拠が提供されると考える。 【実施例１３】 【００９７】 グリシンは、分化型３Ｔ３−Ｌ１細胞に由来する脂肪細胞に作用して、ＢＡＤの脱リン酸 化およびアポトーシスを誘導する。 【００９８】 ３Ｔ３−Ｌ１細胞を、標準的な方法論によって、培養液中で増殖させ、脂肪細胞に分化 20 させる。ネグレル(Negrel)＆ダニ(Dani)、カルチャー・オブ・アディポーズ・プレカーサ ー・セルズ・アンド・セルズ・オブ・クローナル・ライン・フロム・アニマル・ホワイト ・アディポーズ・ティシュー，イン・アディポーズ・ティシュー・プロトコールズ(Cultu res of Adipose Precursor Cells and Cells of Clonal Lines from Animal White Adipo se Tissue, In Adipose Tissue Protocols)、Ｇ．アイハウド(Ailhaud)編、２００１、ヒ ュマーナプレス社(Humana Press, inc.)：ニュージャージー州、トトワ、２２５∼２２７ 頁参照のこと。実験の開始に先立って、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞をトリプシン処理し、ｄＤ ＭＥＭ［１ｇ／Ｌのグルコースおよび１１０ｍｇ／Ｌ ピルビン酸Ｎａを含有し、３．７ ｇ／Ｌ 重炭酸Ｎａ、３３μＭビオチン、１７μＭパントテン酸塩、抗生物質（６２ｍｇ /Ｌペニシリンおよび５０ｍｇ／Ｌストレプトマイシンまたは１０ｍｇ／Ｌテトラサイク 30 リン）、１７ｎＭインスリンおよび２ｎＭ Ｔ３および１０％ＦＢＳを補給］で５回洗浄 する。細胞を６ウェル培養プレートのウェルに、８．５×１０3個／ｃｍ2という密度でプ レーティングする。細胞を観察し、生存力および汚染がないことを保証し、培地に以下の 漸増する濃度のグリシンを補給した新鮮ｄＤＭＥＭ培地を添加することによって実験を開 始する。対照ウェルには、さらなるグリシンを添加しない新鮮培地を与え、実験ウェルに は、ＰＤ実験のために用いたグリシンと同一濃度のグリシンを補給したｄＤＭＥＭ培地を 与える。培地は３日の間、毎日補充する。次いで、培養物を回収し、氷冷ＰＢＳで５回洗 浄する。細胞を低張バッファーに曝露することによって溶解し、遠心分離によって清澄化 し、溶解物のアリコートを使用まで−８０℃で保存するために液体窒素中で瞬間凍結する 。ＬＣ／ＭＳ法によってサンプルの細胞内グリシン含量を調べる。ＢＡＤ−Ｓｅｒ１３６ 40 についてのＥＬＩＳＡか、親和性捕獲ＬＣ／ＭＳ分析のいずれかによって、Ｓｅｒ−１３ ６でのＢＡＤのリン酸化状態を調べる。予備実験は、正常血中循環レベルの２倍に等しい 培地中濃度のグリシンは、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞にアポトーシスを起こさせることが陽性 ＴＵＮＥＬ染色によって証明されることを示す。各サンプル条件の３連のウェルをプレー ティングし、活性なアポトーシスを実証するためにＴＵＮＥＬについての免疫組織化学染 色を実施する。 【実施例１４】 【００９９】 グリシン処理が、ＷＡＴおよび分化型３Ｔ３−Ｌ１細胞に由来する脂肪細胞において同等 の生物学的反応を誘発していることを確認するための、２Ｄ−ゲルおよびＩＣＡＴ（同位 50 (28) JP 2012-232982 A 2012.11.29 体コードアフィニティータグ）分析。 【０１００】 ２Ｄ−ゲルおよびＩＣＡＴ分析を用いて、グリシン処理で誘発される差次的に発現され るタンパク質のパターンが、グリシン処理したＷＡＴタンパク質抽出物において見られる パターンと同様であることを実証することによって、分化型３Ｔ３−Ｌ１細胞に由来する 脂肪細胞の有用性をさらに確証する。パットン(Patton)ら、トゥー−ディメンショナル・ ゲル・エレクトロフォレシス；ベター・ザン・ア・ポーク・イン・ザ・ＩＣＡＴ？(Two-d imensional gel electrophoresis; better than a poke in the ICAT?)、カレント・オピ ニオン・イン・バイオテクノロジー(Current Opinion in Biotechnology)、２００２、１ ３（４）、３２１∼８頁参照のこと。 10 【０１０１】 手短には、ＷＡＴおよび３Ｔ３−Ｌ１細胞由来脂肪細胞を、先に記載したように得る。 対照および実験ウェルにおけるグリシンの濃度は、上記で記載したように処理する。分析 のためのサンプルは、先に記載したように調製し、等量のサンプルを、３Ｔ３−Ｌ１脂肪 細胞およびＷＡＴ由来脂肪細胞がグリシン処理に対して生物学的に同等の方法で応答して いることを実証するために、２Ｄ−ゲルおよびＩＣＡＴ分析による分析に付す。ＩＣＡＴ による分析は、グリシンがＷＡＴを形成する脂肪細胞においてアポトーシスを誘導する作 用機序を解明するための開始点を提供し得る。ＩＣＡＴは、グリシンおよび処理細胞間で 定量可能な方法で、どのタンパク質が異なるかを同定できる強力な方法である。ＩＣＡＴ 方法論を図１７に図式的に示す。 20 【実施例１５】 【０１０２】 グリシンの構造類似体のライブラリーの合成および３Ｔ３脂肪細胞アポトーシスを誘導 する能力についての化合物のプレスクリーニング。 【０１０３】 グリシンは容易に入手できる、非毒性のアミノ酸である。グリシン、グリシン類似体ま たはその組み合わせは、ＷＡＴにおけるアポトーシスの誘導によって減量を誘導するはず である。以下の一連のグリシン類似体を合成できる： 【０１０４】 【化７】 30 【０１０５】 Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ、Ｅｔ、Ｐｒ、Ｂｎ Ｒ１＝Ｒ２＝Ｍｅ、Ｅｔ、Ｒｒ Ｒ３＝Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｒ、Ｂｎ Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝Ｂｎ；Ｒ１ Ｒ３＝Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｒ、Ｂｎ Ｒ２＝（ＣＨ2）5 ＝Ｍｅ、Ｅｔ、ＰｒまたはＢｎ 【０１０６】 40 (29) JP 2012-232982 A 2012.11.29 【化８】 【０１０７】 Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ 10 Ｒ１＝Ｒ２＝Ｍｅ、Ｅｔ、Ｒｒ Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝Ｂｎ Ｒ１、Ｒ２＝（ＣＨ2）5 【０１０８】 【化９】 20 【０１０９】 Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ、かつ、Ｒ３＝Ｈ，Ｍｅ Ｒ１＝Ｒ２＝Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｒおよび Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝ＢｎまたはＭｅ Ｒ１、Ｒ２＝（ＣＨ2）5またはＭｅ、Ｒ３ 式Ｉシリーズは、例えば、以下のスキームによって合成できる： 【０１１０】 【化１０】 30 【０１１１】 上記スキームにおいて提案されるアミノスルホン酸類似体は、種々のジアルキルアミン 、例えば、ジメチルアミンをクロロメタンスルホン酸で処理することによって合成する。 40 式IIシリーズは、例えば、以下のスキームによって合成できる： 【０１１２】 【化１１】 50 (30) JP 2012-232982 A 2012.11.29 【０１１３】 上記に示される類似体は、還元剤として水素化シアノホウ素ナトリウムを用いる還元条 件下で、ジアルキルアミンまたは第１級アミンをオキソ酢酸メチルエステルで処理するこ とによって合成する。生成物はクロマトグラフィーによって精製する。式IIIは、例えば 、以下のスキームによって合成できる： 【０１１４】 【化１２】 10 【０１１５】 N（アルキル）またはＮ，Ｎ−ジアルキルグリシンの遊離カルボキシ末端を、ジシクロ ヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下 、アミンを用いてアミド化する。すべての場合において、生成物はクロマトグラフィーに よって精製する。同一性、純度および量は、質量分析、ＮＭＲ、分析的液体クロマトグラ フィーおよび必要に応じていずれかのその他の分析的方法論によって確定する。 【０１１６】 合成された類似体を、Ｓｅｒ−１３６でのＢＡＤの脱リン酸化を促進するその能力につ 20 いての一次スクリーニングに付す。類似体を、グリシンを補給していない対照と同じ濃度 で、培地中グリシンの陽性対照と同じ濃度で、および公知の有効な濃度でスクリーニング する。すべてのアッセイは３連で実施する。すべての可能性ある陽性類似体を反復スクリ ーニングに付す。化学特性を確定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験での同定された陽性化 合物の二次スクリーニングにより、ｉｎ ｖｉｖｏ試験のための良好な薬物候補となる。 【実施例１６】 【０１１７】 幼若動物 図１８および１９はそれぞれ、幼若雌スプラーグ・ドーリー(Sprague-Dawley)ラットの 食餌へのグリシンの添加が、体重増加および成長の用量依存的減少をもたらしたことを示 30 す。グリシンを補給した食餌で４週間処理した動物を、グリシン補給を含まない食餌に切 り換えた（図１８および１９、１０％から０％）。これにより、迅速な成長および体重増 加がもたらされ、その結果、それらは、１ヶ月以内に、群１の対照動物と同様の大きさお よび体重となった。図２０および２１はそれぞれ、幼若雄スプラーグ・ドーリー(Sprague -Dawley)ラットの食餌へのグリシンの添加が、体重増加および成長の用量依存的減少をも たらしたことを示す。グリシンを補給した食餌で４週間処理した動物を、グリシン補給を 含まない食餌に切り換えた（図２０および２１、１０％から０％）。これにより、迅速な 成長および体重増加がもたらされ、その結果、それらは、１ヶ月以内に、群１の対照動物 と同様の大きさおよび体重となった。 【図面の簡単な説明】 40 【０１１８】 【図１】成体雄フィッシャーラットにおける体重に対する、５％グリシン食、２０％グリ シン食および無添加食の効果を示す図である。 【図２】成体雄フィッシャーラットにおける腹部脂肪含量に対する、５％グリシン食、２ ０％グリシン食および無添加食の効果を示す図である。 【図３】成体雌フィッシャーラットの体重に対する、５％グリシン食、２０％グリシン食 および無添加食の効果を示す図である。 【図４】成体雌フィッシャーラットにおける腹部脂肪含量に対する、５％グリシン食、２ ０％グリシン食および無添加食の効果を示す図である。 【図５】成体雄フィッシャーラットにおける飼料消費に対する、５％グリシン食、２０％ 50 (31) JP 2012-232982 A 2012.11.29 グリシン食および無添加食の効果を示す図である。 【図６】雄ＺＤＦラットの体重に対する、２０％グリシン食および無添加食の効果を示す 図である。 【図７】ＺＤＦラット腹部脂肪含量に対する、２０％グリシン食および無添加食の効果を 示す図である。 【図８】雌スプラーグ・ドーリー(Sprague-Dawley)ラットの体重に対する、５％、１０％ 、１５％および２０％グリシン食および無添加食の効果を示す図である。 【図９】スプラーグ・ドーリー(Sprague-Dawley)ラットの飼料消費に対する、５％、１０ ％、１５％および２０％グリシン食および無添加食の効果を示す図である。 【図１０】雌スプラーグ・ドーリー(Sprague-Dawley)ラットにおける腹部脂肪含量に対す 10 る、５％、１０％、１５％および２０％グリシン食および無添加食の効果を示す図である 。 【図１１Ａ−Ｂ】白色脂肪組織および褐色脂肪組織におけるチロシン１３６でのＢＡＤの リン酸化を示す図である。図１１Ａ：レーン１：分子量マーカー；レーン２：陽性対照と してのＡｋｔ−リン酸化ＢＡＤ；レーン３：対照ラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン ４：５％グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン５：２０％グリ シン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ）。図１１Ｂ：レーン１：陽性対照と してのＡｋｔ−リン酸化ＢＡＤ；レーン２：対照ラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン ３：５％グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン４：２０％グリ シン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ）。 20 【図１２】高グリシン食で処理されたスプラーグ・ドーリー(Sprague-Dawley)ラットから 得た肝臓組織におけるＢＡＤのリン酸化を示す図である。レーン１：陽性対照としてのＡ ｋｔ−リン酸化ＢＡＤ；レーン２：対照ラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン３：５％ グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン４：１５％グリシン食を 給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ。 【図１３】高グリシン食で処理されたスプラーグ・ドーリー(Sprague-Dawley)ラットから 得た筋組織におけるＢＡＤのリン酸化を示す図である。レーン１：分子量マーカー；レー ン２：陽性対照としてのＡｋｔ−リン酸化ＢＡＤ；レーン３：対照ラットから得たリン酸 化ＢＡＤ；レーン４：５％グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レー ン５：５％グリシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ；レーン６：１５％グ 30 リシン食を給餌されたラットから得たリン酸化ＢＡＤ）。 【図１４】対照動物の脂肪組織から得たＣｙ３フルオロフォアで標識されたタンパク質の 二重標識実験の結果を示す図である。 【図１５】食餌中２０％グリシンで処理された動物の脂肪組織から得たＣｙ３フルオロフ ォアで標識されたタンパク質の二重標識実験の結果を示す図である。黄色の円は対照に対 するダウンレギュレーションを示すのに対し、赤色の円はアップレギュレーションを示す ことが目視検査によって認識できる。 【図１６Ａ−Ｂ】グリシンの定量化のＬＣ／ＭＳ法の代表的な結果を示す図である。図１ ６Ａ上部出力記録は、カラム上、各々７８．１２５ｐＭのグリシン、プロリン、フェニル アラニン、リジンおよびロイシンについて得られた複合ＴＩＣ（Total Ion Current（全 40 イオン電流））である。中央の出力記録は、グリシンについて抽出したＴＩＣクロマトグ ラムである。下部の出力記録は、ＰＤＡ（Photo Diode Array（フォトダイオードアレイ ））による複合波長モニタリングによって得られたものである。図１６Ｂは、較正曲線を 構築するために、グリシンについての抽出されたＴＩＣのピーク下の面積が用いられた場 合の、グリシンについて得られる標準曲線を示す。較正曲線を構築するために、各較正レ ベルで３連の注入を用いた。 【図１７】（同位体コードアフィニティータグ）プロセスを示す図である。 【図１８】グリシンに対する幼若雌ラット体重の用量反応を示す図である。 【図１９】グリシンに対する幼若雌ラット体長の用量反応を示す図である。 【図２０】グリシンに対する幼若雄ラット体重の用量反応を示す図である。 50 (32) JP 2012-232982 A 2012.11.29 【図２１】グリシンに対する幼若雄ラット体長の用量反応を示す図である。 【図１】 【図３】 【図２】 【図４】 (33) 【図５】 JP 2012-232982 A 2012.11.29 【図７】 【図８】 【図６】 【図９】 【図１０】 【図１１Ａ−Ｂ】 (34) 【図１２】 【図１４】 【図１３】 【図１５】 【図１６Ａ−Ｂ】 【図１７】 JP 2012-232982 A 2012.11.29 (35) 【図１８】 【図１９】 【図２０】 【図２１】 JP 2012-232982 A 2012.11.29 (36) JP 2012-232982 A 2012.11.29 フロントページの続き (51)Int.Cl. ＦＩ テーマコード（参考） Ａ２３Ｌ 1/305 (2006.01) Ａ２３Ｌ 1/305 Ａ２３Ｋ 1/16 (2006.01) Ａ２３Ｋ 1/16 ３０１Ｇ (74)代理人 100114465 弁理士 北野 健 (74)代理人 100156915 弁理士 伊藤 奈月 10 (72)発明者 ヒルマン，ジェフリー，ダニエル アメリカ合衆国 ３２６０８ フロリダ州 ゲインズビル，エスダブリュ トゥウェンティシック ス プレイス ６４２４ (72)発明者 ショージニキ，エリック ダブリュ．ティー． アメリカ合衆国 ３２６０６ フロリダ州 ゲインズビル，エヌダブリュ サーティーナインス アベニュー ５４００ (72)発明者 オラガンティ，ラヴィ，シャンカー アメリカ合衆国 ３２６１５ フロリダ州 アラチュア，ターキー クリーク ５１６ Ｆターム(参考) 2B150 AB03 AB10 DA44 4B018 MD19 MD94 ME14 4C206 AA01 AA02 FA53 GA19 GA22 JA08 MA01 MA02 MA04 MA72 NA14 ZA70 ZB21 20 (37) 【外国語明細書】 2012232982000001.pdf JP 2012-232982 A 2012.11.29