1998年 - 公益財団法人 東京都医学総合研究所

特定領域研究
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蛋自分解のニューバイオロジー』ニュース
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第 8号〈平成 10年 11月発行〉
文部省科学研究費特定領域研究『細胞肉蛋自分解』事務局
目次
(1)
巻頭言
(2)
平 成 10年度特定領域研究班・会議日程
(3)
活動および関連事業
l 班員名簿発行
2 特定領域ニュース誌“ぷろておりしす"発行
3 出版案内
4 学会 ・集会案内
5 第 3回「細胞内蛋自分解」ワークショップ報告
(4)
学会・集会報告
1 蛋白研セミナー:蛋 白質社会の不可逆的 リモデリング
2 FEBSミーティグ傍聴記
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4 第 3回「病態と治療におけるプロテアーゼとインヒビター研究会J
5 日本遺伝学会シンポジウム :蛋白質分解による細胞機能制御
(5)
ミニレビュー
1 神経線維腫症 2型 (NF2) 蛋白質のカノレパイン分解による新し
い腫蕩発生機構
2 Notch研究の進展
3 Wnt
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sのシグナル伝達研究の進展
4 カドへリン・カテニン接着機構とカテニン分解機構の関係
(6)
トピックス
l ユビキチン様蛋白質NEDD8による c
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新しい修飾システム
(7)
海外留学中研究者からの最新情報
ウィーンでサイエンス "阻m とはこうしたもの"
(8)
掲示板コーナー
伝言板、その他インフォメーション
(9)
編集後記
(10) 発表論文の概要紹介:巻末添付
1・
•
(1)巻頭言
本平成 10年で 「蛋白分解のニューバイオロジー」の班は 3
年目になり、終わに近づきました。此の研究班の特徴は、これ
迄の「プロテアーゼ」 に関する数々の研究班と異なる力点が意
識的に取り上げられていると思います。それは、フ。
ロテアーゼ
そのものよりも「蛋自分解が重要に関与する生物現象の解明」
が意識して取り上げられている点であります。関与するプロテ
アーゼで分類すると、此の 3年間でプロテオゾームーユービキ
チン系が 4 0 %、リソゾーム関連が 3 0 %、カルパイン関連が
15%、セリン・メタロ・アシドープロテアーゼを合わせて約
15%でありました。此の数字は旧きもの、新しいものという
よりも、我が国におけるプロテアーゼ研究のブームの歴史的推
移を示しているとも見る事が出来ます。一つには、それらのプ
ロテアーゼ研究の輸入された年代とこれらを裏打ちしている新
しく台頭して来た生物現象が組合わさって大きな影響を与えて
a代謝との関連でカルパ インが
いると言えます。先ず筋生理 c
多く研究されました。更に細胞周期や免疫関連で、フ。
ロテオゾー
ムが多く取り上げられ、システィーンフロテアーゼ系ではアポ
トーシスとの関連が新たな関心を呼んでいます。 また膜結合プ
2
-
ロテアーゼ、群はプロセッシングプロテアーゼとして、これから
多くの研究が進むことでしょう 。初期の頃のプロテアーゼその
ものの研究の上に乗って、次のステップとしてプロテアーゼ、
プロテオリシスを手段とし、研究目的を生物現象の解明に求め
る姿勢が実現しているのが此の班の特徴と思います。
さて、サイエンスという学問は歴史的体系の上に成り立って
いるものです。先人の積み上げた正しい学的体系の上へ上へと
構築されていくものであります。歴史的背景の無いノイエスな
どは無いので、歴史的構築の延長線上に、如何に新しい知を独
創的概念を付け加えるかが重要と言えます。即ち、[温故知新]
こそが科学者の進むべき道と信じています。新しい「流行り 」
の研究に乗るのが尊いのでは無く、強い個性的研究により「ブー
ム」を創造することが尊ばれるべきと考えます。
現在の日本の深刻な経済不況は、政治が悪かった為でも、経
済政策の失敗でもないと思います。 日本国民の一人一人に、特
に学者には大きな責任があると思っています。今の日本人には
「
安く、非常に良い」ものを産生する力は皆無であると 言えま
す。労力は高価で、賛沢で怠惰、流行りには乗りたがるが独創
的、知的財産を大切にはしません。 日本がかつて経済大国を作
3
-
り上げた時代のように 「
良き歯車」であれば良い時代は終わり
ました。現在日本の経済不況を救うのに最も必要なのは独創的、
知的財産の蓄積であると信じています。 日本は科学的にも後進
国であると考えています。典型的一 例をあげれば、米園、ロシ
アではとっくに人を宇宙に出している時代にペンシル型ロケッ
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;3人と米国の宇宙ロ
トに成功したと言って騒ぎ、今でも 2人
ケットに乗せてもらって有名になり、新聞は騒ぐ、等はほんの
一例であります。医学・生物学でも同様で、あり、人ゲノムの決
定・重要なベクタ一、モデル動物・特殊細胞等々は大半が輸入
であり、地力では後進国であると言わざるを得ません。此の班
には大きなエネルギーがあるのが特徴なので、此の班が独創的
な知的財産を生むモデルグループとなり、日本の後進性を脱却
する原動力になることを願っています。
平成 10年 10月下旬
特定領域研究 (
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細胞内蛋自分解」総括班メンバー
勝沼信彦徳島文理大学健康科学研究所教授
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(2)平成 10年度重点研究班・会議日程
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PriorityAreas(IntracellularProteolysis)from theMonbusho
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日時:平成 10年 11月 24日(火)午後 1時
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会場:東京ガーデンパレス・錦(2階)
干1
13・0034東京都文京区湯島 17
5 電話 :03・3813・6211
JRお 茶 の 水 駅 下 車 徒 歩 5分
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第 3回文部省科学研究費「蛋自分解のニューバイオロジー」
シンポジウム
“プロテオリシス:生理機能と病態の多面的アプローチ"
主催:文部省科学研究費特定領域研究「細胞内蛋白分解(略称) J総括班
領域代表者:鈴木紘一 (東大・分生研)
日時:平成 10年 12月 7日(月)午後 1時
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.
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， 5時
会場:東京ガーデンパレス・高千穂 (2階)
干1
13・0034東京都文京区湯島 1
75 電話:03・3813・6211
JRお 茶 の 水 駅 下 車 徒 歩 5分
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0 領域代表者挨拶
東大院・薬〉
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0 名取俊二 (
「昆虫の発生・生体防御とプロテアーゼ」
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0 瀬原(藤沢〉淳子 (
都臨床研〉
「膜結合型メタロプロテアーゼーディスインテグリン、
メルトリンの形態形成における役割」
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0 深水昭吉(筑波大・応用生物〉
「
プ ロテアーゼカスケードと血液脳関門修復機構」
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0 大隅良典(国立基生研〉
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「酵母を用いた自食作用の分子機構の解析」
山本健二 (九大・歯)
「カテプシン Eとカテプシン Dの新しい機能と病態」
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0 副代表者挨拶
問い合わせ先:木南英紀 (順天堂大・医〉
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-
3 第 2回 班 会 議
日時:平成 10年 12月 8日(火) -9日(水〉
場所:東京ガーデ、ンパレス
4 平 成 10年 度 : 第 2回 総 括 班 会 議
日時:平成 10年 12月 7日(月) 11:00---12:30
場所:東京ガーデ、ンパレス
議題: 1
. 経過報告
2
. 本年度の研究組織と活動計画，総務，研究・企画など
3
. 来年度の活動計画
4
. その他
総括班メンバー
鈴 木 紘一
木南
東京大学分子細胞生物学研究所教授:領域代表・第一班班長
英紀 1
)
慎天堂大学医学部教授:領域副代表・第二班班長
岩 永 貞 昭 九 州 大 学 名 誉 教 授 : 研 究 評 価 ， チ ェ ッ ク ・レビ、ュー
大 島 泰 郎 東 京 薬 科 大 学 生 命 科 学 部 教 授 : 研 究 評 価 ， チ ェ ッ ク ・レピ、ュー
勝沼
信彦徳島文理大学健康科学研究所教授:研究評価，チェック ・レビ、
ュ
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志 村 令 郎 生 物 分 子 工 学 研 究 所 所 長 : 研 究 評価，チェック・レビ、ュー
中西
重忠京都大学大学院医学研究科教授:研究評価，チェック ・レビ、ュー
村上和雄筑波大学応用生物化学系教授:研究評価，チェック・レビ、ュー
矢崎 義 雄 東 京 大 学 医学部教授:研究評価，チェック・レビ、ュー
矢原一郎
東京都臨床医学総合研究所副所長:研究評価，チェック ・レビ、
ュー
川島
誠一 東 京都臨床医学総合研究所部長:研究企画，調整
田中
啓二
東京都臨床医学総合研究所部長:研究企画，調整
石浦章一東京大学大学院総合文化研究科教授:研究企画，調整
上野隆
順天堂大学医学部講師:研究企画，調整
7
-
(3)活動および関連事業
1 班 員 名 簿 ( 平 成 10年 度 〉 発 行 : 平成 10年 6月作成
2 重点ニュース誌“ぷろておりしす"発行
本ニュース誌は班員閣の連絡事項のみならず、ミニレビ、ュー・トッピクス
等、蛋自分解に関する最新の情報を満載して年 3回発行します。また、班員
以外にも積極的に配布して、本重点研究の進捗状況などを宣伝してゆきたい
と考えています。したがって、班員以外の定期配布を希望する研究者にも無
料で送付しますので、送付先を事務局(研究代表者鈴木紘一研究室〉に連絡
するようにお薦め下さい。
3 出 版 案 内 : (本重点研究の期間:平成 8，
.
.
.
.
.
.11年度に発行された蛋自分解関
連の出版物を毎号記載しますので情報をお寄せ下さい)
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組織培養
特集号“プロテアソ ーム" 1996年 3月号(編集:田中啓二
〉
細胞工学特集号“ユビキチンとプロテアソーム" 1996年 7月号(監修:
田中啓二)
蛋白質核酸酵素“プロテオリシス :蛋白質分解の分子機構とバイ オロジー"
1997年 10月臨時増刊号 (
編集:鈴木紘一、木南英紀、 田中啓二〉
実 験 医 学 特 集 “ プロテアーゼと疾患" 1997年 11月号(編集:
鈴木紘一)
細胞工学特集号“ユビキチンシステムと細胞周期制御" 1999年 5月号
発行予定(監修:田中啓二)
4 学会・集会案内
圏内学会
(
1
) 第 21回 日本分子生物学会年会 ワー クショップ:
r
タンパク質のプロ
セッシングと局在化」平成 10年 12月 16 (水) ""19日 (土)
パシフィコ横浜(田中啓二、市山
新〉。
(
2
) 平成 10年度国立遺伝学研究所研究会: r
新展開するユビキチン
ワールド 」平成 11年 3月 18日 (木) ""19日(金)
国立遺伝学研究所(静岡県三島市谷田 1111) (
横沢英良、山尾文明)
(
3
) 第 25回日本医学会総会シンポジウム : r
プロテアーゼバイオロ
ジー 」平成 11年 4月 2日 (金)"
"4日 (日〉、東京国際フォーラム
東京(田中啓二、鈴木紘一〉
9・
国際学会
(
1
)
"MechanismsofTumorGrowthandInvasionmediatedby
Proteases"November5
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1998，
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1998，
Proteasome:A NewWorldofP
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平成 11年度日本生化学会春期シン ポジウム: I
蛋自分解酵素による
生物活性の制御とその医学的応用 」 平成 11年 5月 19日(水)-
21日(金〉、
鳴門 (
松田佳子他〉
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)
5 第3回「細胞内蛋白分解」ワークショップ
去る平成10
年 7月8・10日、神戸・六甲山ホテルにおいて第3回「細胞内蛋自分解」
ワークショップが開かれた。今回は、 7月 8日夕刻に現地に集合し、夕食後、特別企
画のポスタープレゼンテー ションによる研究成果発表が行われた。この形式での発
表は今回が初めてで、分野・方法論ともに多岐にわたる計24
題の演題が集まった。
蛋自分解の基礎的なメカ ニズムに関する発表では、基礎生物学研究所 ・水島昇先生
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nシステムについて興味深い
から、ユビキチン化に相当する新しし、p
報告があった。水島先生らは、酵母の実験系からオー トファジーに必須な遺伝子
(APG)を単離 ・同定し、そのうち APG12およびAPG5遺伝子産物が、新しし、p
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nシステムを構成していることを明らかにした。この過程にはさらに、
APG7 およひ~APG10遺伝子産物がユビキチンリガーゼ様の機能で関与している可能性
があり、このうち APG7遺伝子産物に関する解析についても、 I
J
頂天堂大学 ・医学部 ・
生化学教室の谷田以誠先生から報告があった。細胞死の基本的なメカニズムに関し
ては、大阪大学医学部 ・神経機能解剖の嘉糠洋陸先生から、線虫で細胞死に関わる
遺伝子として同定されていた Ce
d4
が、ショウジョウバエ由来の培養細胞株で内在性
1
1
-
のC
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eを活性化し，細胞死を促進するというデータが示された。また、国立精神神
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3に特異的な抗体を作成し、
経センターの藤田恵理子先生らは、活性化された C錨 p
C
部 p
出 e
3の発現と活性化の時間的 ・空間的ノ守
この抗体を用いて神経系の発生過程で;
ターンにずれがあることを発見し、 C
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eの発現だけで・なく、その C
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eの活'性化
刺激の存在が神経系の形成過程において重要であることを示された。その他、リソ
ゾーム酵素の生体機能・病態への関与、カノレパイン・カ jレパスタチンの発現調節と
さまざまな細胞電害との関係、種々の蛋白質に特異的な活性化(あるいは不活性化)
プロテアーゼの探索などに関しても多くの発表があった。ポスターによる発表は、
口演形式の発表とは異なり時間を気にすることなく議論することができるため、夜
遅くまで会場の至る所で活発に討論を行う姿が見られ、合宿形式で行うこのような
ワークショップに非常に適した企画であると感じられた。
一夜明けて2日目、 7月9日には、午前にミニシンポジウム、午後に特別講演とい
うプログラムで、蛋自分解をめぐるさまざまな話題についてじっくりと各演者の方
に講演していただいた。午前のミ ニシンポジウムでは5名の班員の先生が最新の実験
0
データを示 しなが ら「蛋白質のリ モデリ ングと細胞機能 」というテーマのもとに 3
分ずつの持ち時間で話された。 まず、東京大学 ・生物生産工学センターの田之倉優
先生は、 20年近く前に単離されていながら、その生化学的な解析が進んでいなかっ
たクロコウジカビ由来の非ペプシン型酸性プロテアーゼに関して、結晶解析法や
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y法を用 いてその活性中心の構造と基質特異性を解析した結果を報告さ
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型プロテアーゼで
れた。次に、群馬大学 ・生体調節研究所の竹内利行先生は、 K
ある f
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が胃粘膜上皮の増殖帯の上部に特異的に発現することを報告し、この上皮
を構成する細胞カち子化する際に f
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が重要な役割を果たしている可能性を示された。
続いて、熊本大学 ・医学部微生物学教室の前田浩先生は、ウイルス ・細菌感染によ
る炎症反応によってマク ロファージ ・好中球等の細目包から放出されるN併℃謝産物が、
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)を活性化
これらの細胞から同時に分泌されるさまざまな m
することを示し、このような活性化過程が炎症の病態を増悪させている可能性を示
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唆された。また、京都大学・大学院医学研究科の岩井一宏先生は、鉄代謝に関係す
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)のうち、 IRP2
が細胞内で鉄イオン
依存的にユビキチン化され分解されることを示し、現在この過程に特異的なユビキ
チンリガーゼの単離・同定をめざしているところであることを報告された。午前の
シンポジウムの最後には、九州大学・理学部化学教室の伊藤明夫先生が、ミトコン
ドリア前駆体蛋白のプロセッシングペプチダーゼ(MPP)の分子進化と機能分化に関
して概説され、さらにその触媒部位・活性中心の同定や基質特異性の解析に関する
最新のデータを示された。
昼食に続く午後の特別講演では、
「蛋白分解研究の活性化をめざして」という
タイトルのもと、班員以外から 4名の先生をお招きして、 1時間ずつそれぞれの専門
の領域について概説していただいた。最初に、京都大学 ・大学院医学研究科・薬理
学教室の成宮周先生に は、低分子量G蛋白質のひとつのサブファミリーである Rhoを
めぐる研究の最近の進歩について話していただし、た。問10は細胞の運動・形態維持
等の調節を行う重要な蛋白 であるが、成宮先生は GTP結合型即10の下・流のシ グナリ
ングカスケードを構成する機能分子として、 p160ROCK、p140
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の形成・細胞分裂といっ
ついて概説され、これらがそれぞ、れf
た過程にどのように関与しているのか、最新のデータを示しながら解説された。次
に、東京大学・医科学研究所の勝木元也先生には、動物レベルでの遺伝子操作技術
の進歩・発展について、これまでの歴史、そしてこれからの展望も含めて概説して
いただいた。個体レベルでの遺伝子操作は、外来遺伝子を卵細胞に導入することに
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c動物の作成から始まり、その後ES細胞が樹立されたことにより遺伝子
よる仕組s
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相同組換えで特定の遺伝子座を破壊することができるようになり (
作成)、さらに現在では第3世代の技術として破壊した遺伝子座にさらに人工的に改
n
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c
k
i
n動物の作成ができるところまで進歩した。この
変した遺伝子を再導入する k
ような遺伝子導入技術の進歩と、動物の配偶子 ・匪の凍結保存法の進歩を基盤にし
13-
て、勝木先生のグループでは目下、ヒト疾患モデル動物の系統的作成およびその凍
結匪・配偶子ノくンクの構築を進めているとのことであった。 3番目には、大阪バイオ
サイエンス研究所の垣塚彰先生に、最近神経変性疾患発症の分子機構として注 目さ
れているトリプレットリピート病のうち、 CAGリピートがその原因となっている一
連の疾患について概説していただいた。 CAGリピート病は、遺伝子上のトリプレッ
トリピートコードが実際に蛋白(ポリグルタミン)に翻訳されるという点で他のト
リプレットリピート病とは異なっており、その異常蛋白が神経細胞の変性・細胞死
に関与していると考えられている 。垣塚先生は、この異常蛋白が細胞内のどの場所
で機能障害を誘起するのかについて最新のデータを示しながら話された。最後に、
東京大学・大学院医学研究科の井原康夫先生に、アルツハイマー病における神経細
胞死について、病理学の立場からその病態の本質が何であるのかを解説していただ
いた。アルツハイマー病では神経原線維変化とアミロイドが沈着した老人斑のふた
つが特徴的な病理所見として知られている。井原先生は、痴呆という臨床症状の程
度とよく相関するのは神経細胞死の程度であり、この神経細胞死に深く関係する病
理所見はアミロイド沈着よりむしろ神経原線維変化の程度の方ではなし、かという考
えを述べられた。以上の講演のあと、立食形式の懇親会が聞かれたが、その会場に
おいてもさらに引き続き活発な討論が続けられた。
0日は、本年度より新たに班員 とな られた 16
名の先生に、この特定領
最終日 7月1
域研究の課題研究に関する研究の背景と今後の研究計画についでお話しいただいた。
紙面の都合上、すべての発表に関して詳しく報告することはできないが、今年は細
胞内シグナル伝達に関わる分子の分解機構に関係する研究が多く見受けられた。京
都大学・ウイルス研究所の柳川伸一先生や京都大学・医学研究科の永淵昭良先生が
発表されたWntシグナル伝達で重要な役割を果たし、かつ細胞接着装置とも密接に
関係する β-カテニンの分解機構の重要性およびその解析、京都大学・医学研究科の
黒岡尚徳先生が話された細胞分化に関係するシグナル伝達において重要な働きをし
分子の細胞内ドメインを切り出す酵素の同定、そして東京工業大学 ・生
ている Notch
1
4
-
命理工学部の宮津恵二先生が進めておられる HGFのシグナル伝達過程で形成される
Hrs-Hbp
複合体の分解機構の研究などである。また、東京都臨床医学総合研究所・
細胞生物学研究部門の藤沢(瀬原〉淳子先生の筋細胞の分化・形態形成における膜
結合型メタロプロテアーゼの関与に関する発表も興味深かった。詳しくは前号(第
7号〉の「ぷろておりしす」に寄せられた総説を見ていただきたいが、藤沢先生は
筋細胞の分化に関与する分子として、メタロプロテアーゼ・ディスインテグリンファ
ミリーに属するメルトリンを同定され、現在その機能解析を進めている。これらの
研究は、研究対象としてプロテアーゼがまずあってそこから仕事が始まったという
のではなく、むしろ他の生命現象の解明を進めていくうちに対象としている蛋白の
細胞内分解やその過程に関わるプロテアーゼが重要な意味を持ってきたことを示唆
し、まさに本研究班のめざす方向に合致していると感じられた。その他、従来から
活発に進められている新規プロテアーゼの探索・機能解析、プロテアーゼと疾患モ
デル・病態との関係に関しても新しい切り口の研究が紹介され、今後の成果が期待
された。
以上3日間の研究発表は、その対象・方法、そしてそれらの結果すべてにおいて
非常に多岐にわたり、蛋自分解という過程が生命現象のあらゆる局面において重要
であるということを実感させられた。(大阪大学医学系研究科:渡部
1
5
-
剛〉
(4)学会・集会報告
1 蛋白研セミナー「蛋白質社会の不可逆的リモデリング」の報告
平成 10年 6月 29-30日の 2日間、大阪大学・蛋白質研究所にて、蛋白研
セミナ ーが上記のタイトルで開催された。本セミナーは、プロテオリシスの問題を
新しい視点からとらえたいとしづ世話人の意図で企画された。プロテオリシスの特
性は不可逆性にあると考えることができる。いろいろな生命現象がリン酸化-脱リ
ン酸化のような可逆的な機構によって広範囲に制御されていることは言うまでもな
し
、
。 一 方で、プロテオリシスを介する生命現象の制御に関する最近の爆発的な研究
から、第一に、プロテオリシスの持つ不可逆性としづ特性が生命現象のプ ロセスを
一方向に決定づけていること、第二に、プロテオリシスは、
「ものごと」のおわり
でなく、蛋白質相互のネットワークの再構築、即ち、リモデリングをもたらしてい
ることが、浮かび上がってきている。そのような視点で-プロテオリシスをとらえ、
それらのキーワードをもりこんで、蛋白質社会の不可逆的リモデリング、という聞
き慣れないセミナーのタイトルとなっているが、このタイトルの一つ一つの言葉の
意味を深く味わえば味わうほど、プロテオリシスの新しい生物学的意義が見えてく
るのではないだろうか。セミナ ーは 4つのセクションに分かれて行われたが、ファ
ジーなタイ トルのセミナーにもかかわらず、多くの聴衆の参加のもとに、終始、活
発な討 論がなされた。
A
第 1部では、プロテオリシスシステムの基盤として働くプロテア ーゼに関する
5つの話題がとりあげられた。田中啓二 (都臨床研)は、ユビキチンープロテアソー
ムシステムの全体像の説明のあと、血管形成へのプロテアソ ームの関与、 ODC
を用
いたプ ロテアソ ー ムの活性制御機構、プロテアソームアクチベータ ーPA28に関して
最新の知見を述べた。さらに、今後の解明すべき研究課題(ユ ビキチ ンリガーゼ回、
脱ユビキチン化酵素、ユビキチン様分子、プロテアソームの分子形態など 〉につい
1
6
-
て指摘した。ユビキチンプロテアソームシステムについてモデルが先行しているき
らいがあるが、生化学をベースにしたきっちりした研究が必要であることを実感し
た。鈴木紘一 (東大分生研)は、カルパイン ・スー パ ーファミリー (
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，aザpiω1calp泊 1
) の全体像の説明のあと、組織特異的カル
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パインの中で、特に病態と関連する p94について、 p94の各モチーフの意味、 p94に結
合するコネクチンの発見とコネクチンが結合する意味、 p94の変異と基質フォドリン
の分解との関係など、詳細な研究成果について述べた。 p94の個体レベルでの役割や、
発生 と関連するカルパインあるいはa
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p
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c
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lc
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nの機能についても興味がつきない。
長田重一(阪大院医)は、アポトーシス、特に、 Fasl
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s系を介するアポトー
シス、そのカスケードを構成するカスパーゼ、群とそれらのノックアウ トマウスでの
結果についての概説のあと、最近彼らが明らかにした、カスパーゼ、カスケ ードの下
CADについて、それらの単離のストラ テジーや
流で機能する CADとその阻害蛋白質I
両者の関係等を明快に述べた。C
A
D
I
I
C
A
Dの発現がすべての臓器で起こっているの
か、カスパーゼカスケ ードの引き金はなにか、不可逆的リ モデリ ングの例 であるプ
ログラム細胞死におけるカスパーゼファミリーの機能など、まだまだ未知の部分が
多い。木原章雄(京大ウイルス研)は、微生物由来の ATP依存性プロテアーゼに関
する概説のあと、膜結合性プロテアーゼ FtsHによる膜蛋白質の分解機構について、
彼ら自身の詳細な実験結果に基づくモデルを紹介した。細胞膜におけるプロテオリ
シスは、発生における Not
c
hのプロセシングや神経変性疾患における 異常蛋白質の蓄
積の例のように、生命現象の進行やその破綻において極めて重要であるにも関わら
ず、まだまだ未開拓な研究分野である。 FtsHのきれいな結果をお手本にしての研究
が望まれる。徳永文稔(姫路工大〉は、小胞体における蛋白質の品質管理機構につ
いて、特に、糖鎖のプロセシ ング阻害剤を用いた詳細な研究成果について述べた。
また、シャペロンの関与についても言及した。最近、品質管理機構につい て研究の
進展が著しい。分解はすべてプロテアソームの仕事と考えて良いのか、品質管理シ
ステムを構成している役者はもうそろっているのか、このシステムは単に小胞体で
1
7
-
フォールディングがうまくし、かなかった蛋白質を壊すだけのシステムなのか、いろ
いろの疑問がわいてくる。
第 2部では、細胞周期制御機構がとりあげられた。細胞は、増殖して分裂する
ことで自らを複製し、生命活動を維持している。この細胞周期を進行させる機構と
して、可逆的機構(リン酸化と脱リン酸化)に加えて、プロテオリシスを介する不
可逆的機構が重要であり、いまやこの不可逆的機構の研究が細胞周期研究の愁眉の
課題となっている感がある。東江昭夫(東大院理)は、次々と単離した細胞周期制
御に関わるプロテアソームサブユニットについて詳細に説明した。そして、最近単
離されたLeslに関する研究成果から、細胞周期のそれぞれのステージで機能してい
る26Sプロテアソ ームのサブユニット構成が異なると推論した。 26Sプロテアソーム
のヘテロジェナイティの問題は今後の重要な研究課題であると考えられる。山尾文
明(国立遺伝研)は、ユビキチンシステムやユビキチン様分子についての概説のあ
!M
期でのユビキチン依存的分解に関与する、従来報告されていた E2とは異な
と
、 G2
る真の E2(UbcP4) について、また、 G1サイクリン分解に関与するE3複合体SCFに
ついて、研究成果を述べた。ユビキチンをとりまく世界はどんどん広がる気配であ
る。従来からの考えがどんどん変革されて、その先にど‘んな役者が演ずる舞台が待っ
ているのであろうか。本当の舞台を早くみたいという欲求に駆られる。戸所一雄
(理研〉は、 M期で機能する E3複合体APCの制御機構に関する最新の研究成果を報
がリン酸化を介して正 (
P
l
kによる)にも負 (PKAによる〉にも制御さ
告した。 APC
れている(リン酸化部位が異なる)ことや、 APCの基質認識の特異性を決めている
Cdc20ファミリ一、それらと s
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で‘機能する遺伝子産物との関
係などを述べた。いまやM期の制御はAPCに集約される感がある。
第 3部では、不可逆的リモデリングがまさにおきている、細胞間相互作用の様々
の例がとりあげられ、その分子機構が議論された。横沢英良(北大院薬〉は、受精
と卵の活性化におけるプロテアソームの役割について述べた。受精は、 二 つの異な
る生殖細胞が相互作用することにより新しい細胞の形態を生み出す、まさに不可逆
1
8
-
的リモデリングの良い例である。マボヤの受精の場合に、精子のプロテアソームは
細胞表面に存在し、卵黄膜蛋白質のユビキチン依存的分解に関与することを示唆す
る研究成果が報告されたが、細胞外で機能するユビキチンープロテアソームシステ
ムの最初の例となろう。また、精子の刺激を受けた卵では細胞分裂が再開され、そ
の時に、カルシウムシグナルで制御されるプロテアソームが働くことが報告された
が、細胞分裂制御におけるプロテアソームレベルでの制御の比重がまだ未知数であ
る。瀬原(藤沢〉淳子(都臨床研〉は、細胞分化におけるメタロプロテアーゼ・デ、イ
スインテグリンファミリーの機能、特に筋肉分化におけるメルトリンの役割につい
て、詳細な納得させられる研究成果を述べた。細胞分化にプロテオリシスが関与す
るとすれば、そこではまさに不可逆的リモデリングがおきている。メルトリンを構
成する各ドメインの解析結果の説明もなされたが、すべてのドメインの機能がまだ
判明していない。また、マウスにはかわいそうであるが、非常に小さいメルトリン・
ノックアウトマウスは生まれるだろうか。佐藤博(金沢大がん研)は、細胞浸潤と
形態形成における膜型マトリックスメタ口プロテアーゼの役割について述べた。が
ん細胞が浸潤する時に基底膜の分解に働くゼラチナーゼ(ガン細胞に付着している〉
とガン細胞自身が産生するその活性化因子(膜型マトリックスメタロプロテアーゼ〉
との関係はし、かに巧妙なことか。また、その因子が正常細胞での形態形成にも関与
するとしづ。その時にはメタロプロテアーゼのターゲットは何であろうか。片桐晃
子(ニッピ・バイオマトリックス研)は、細胞接着におけるユビキチンープロテア
ソームシステムの役割について述べた。免疫担当細胞での接着因子LFA-1/
ICAM-1を
介するシ夕、、ナル伝達が結果する接着と凝集のシステムを開発し、それをうまく利用
してプロテアソームの関与をきれいに証明した。蓄積が観察されるマルチユビキチ
ン化蛋白質の解析から、プロテアソームのターゲットが明らかになるのが待ち遠し
昭良(京大院医〉は、カテニンの安定化機構について説得力ある研究成果
い。永沸l
を述べた。カテニンは、細胞接着装置の一員としてばかりでなく、発生(形態形成〉
におけるシグナル分子として機能していることから、カテニンをとりまく研究環境
1
9
-
はまさにホットな領域となっている。 βカテニンのAPCによる安定化とリン酸化を
介する分解との制御のバランス、 αカテニンのカドへリンによる安定化機構や未知
の生理機能など、興味が尽きない。このセクションでとりあげられた発生・分化の
現象は、時間軸が一方向的であり、不可逆的である。そこでは、役者である蛋白質
たちの攻め合いを通しての細胞や組織のリモデリングがおきている。プロテオリシ
スが大いに役割を果たす舞台であることに間違いない。
第 4部では、高次生命現象として、脳神経機能の話題がとりあげられた。脳神経機
能の研究は国家的プロジェクトでもあるが、脳神経機能は不可逆的リモデリングの
代表的イベントでもある 。畠中寛(阪大蛋白研〉は、 ニューロンのアポトー シスに
ついての概論のあと、ニューロン死を抑制する生存シグナルについての詳細な研究
成果について述べた。形態形成ととらえられる、シナプス形成に伴う予定ニューロ
ン死において、生存シグナルと死のシグナルとの微妙なバランスがどのように制御
されているのだろうか。内山安男(阪大院医)は、神経細胞死におけるリソソーム
カテプシン群の役割について述べた。カテプシンインヒビターを巧みに使って、カ
スパーセカスケ ー ドが主導する神経細胞死の裏で、カテプシン類が生と死の重要な
役割をはたしている姿が浮かびあがってきた。神経細胞死において、それらはどん
な比重で役割を果たしているのだろうか。遠藤昌吾(理研〉は、アメフラシの記憶
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BMP-lとTGF-β カスケード、の役割について述べた。記
におけるプロテアーゼt
憶の蓄積を計測できるモデルを巧みに用いて、 d
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p
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y法による BMP-lの発
見と、その研究の発展の成果としてのTGF-β の関与の証明、そして、それらの登場
人物をもとにした記憶のモデルが紹介された。記憶を保証する神経の可塑性におい
て、プロテオリシスが示す不可逆性との聞を埋める機構はなんであろうか。西道隆
臣(理研)は、神経変性におけるプロテアーゼの役割について、脳内における ペプ
チドの寿命との関連で述べた。アルツハイマー病における βアミロイドの蓄積を説
明する仮説として、脳内にペプチドを注入し、その代謝産物の構造を決めていくと
いう地道であるがきっちりした方法を用いて、 N末端のピログルタミル化がアミノ
2
0
-
ぺプチダーゼ抵抗性(即ち、寿命の延長)を代謝産物に与えることで蓄積に至ると
しづ仮説が説明された。病態と蛋白質(あるいはペプチド〉の翻訳後修飾との関係
に興味がつきない。
このセ ミナーに出席されたある先生が、このセ ミナーはタイトルが良かったと
言われた。ある演者の先生は、講演を依頼された時、最初、セミナーのタイ トルを
見て、これは何だと思ったけど、趣旨説明を読んで納得したとしづ 。各演者の先生
方がタイトルを意識されてお話しいただいたのが、このセミナーが成功した (自己
満足であるが〉理由ではないかと思う。各先生方に感謝申 し上げます。以上、プロ
テオリシスを介する不可逆的リ モデリングに関する研究のさらなる発展を願って、
独断と偏見に満ちた報告とします。
(北大院薬・横沢英良〉
22
5周年記念 FEBSM
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i
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gに参加して
はじめに
2
5周年記念 FEBSM
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gは1
9
9
8
年7
月 5日から 1
0日まで、デンマークのコペ ン
ハーゲ、ン、国際会議 ・展示場 B
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aC
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e
rにて開催されました 。主催する今年の会長
i
s (以下全て敬称略)で、総演~数908題、
は、デンマーク・アールフス大のJ.E.Cel
参加者リストがなかっ たので正確な参加者数は不明なのですが、 2
0
0
0人は優に越え
ていたと思われます。プリナリーレクチャ - 7題、ポピュラーレクチャ ー 3題、そ
して 4
1分野に亘る1
6
7
題のシンポジウムと 731題のポスター発表が5日の期間内に行
0日のセレモニーでは、この「ぷろておりしすJ
われました。初日の5日と最終日の 1
諸文の中にしばしば登場なさるス ロヴェニアの V
.Turkが主催者側のチェアマンを
つとめておられました。なお、ヨ ーロ ッパ各国の生化学会に属するメンバーのミー
テイングであるため、日本からの参加者は多くはありませんでしたが、演題数は 13
題、参加人数はおよそ 30
人くらいであったかと思われます。 3日目以外は、 1日にひ
2
1
-
とつずつプリ ナ リー レクチャ ーがあり、主にそのあとシンポジウムが始められまし
た。ポスタ 一発表は9時から 5
時半までの掲示で 1
時半から3時までが討論時間でした。
幅広い領域を網羅 しているミーテイングなので、筆者にとっては、広範な知識を学
ぶ絶好 の機会だ ったのですが、やはり体力と知力不足(?)のせいか、狭い範囲の
分野にとどまって しまいました。本稿ではこ のうち、基礎 ・臨床両側から反響を呼
Ma
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び、常に盛況、活況を呈している「ぷろておりしす」に関与する分野の "
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たつのシン ポジウムで、どのような話題がとりあげられたか、ご紹介させていただ
きます。
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月8日(
4日目 )
の午前中に M油 i
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onのセッショ
7
ンが聞かれま した。まず、はじめに F.Blasi (イタリア ・ミラノ大 〉が、腫痕細胞
や尿中に高レベルに存在し、再発診 断のマーカーとして考えられている uPAR(ウロ
/
CD87について、その分子構造と mi
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を中心とした機能制
キナーゼリセプタ ー )
御がどのように関わっているかを報告しました。百日咳毒素によって uPAR
/
CD8
7の
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i 性が抑えられることから 、Gタンパクとの関与を示唆し 、また
関わる r
uPARのどの部分が r
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gr
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on機能に関与して いるのかを調べ、 uPARのDI
D2
D3の
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ma
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構造のうち、 Dlはmi
g
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ionと関わりがなく、D2
D3の部分が重要であることを
示唆しました。
次に 、ポスタ ー演題から選ばれた N.Behrendt (デンマーク ・フィンセンラボ
ラトリ)が、 Prourok
inaseuPARcomplexと特異的に関わる新しい 高分子膜 タンパ
クについて話しました。この膜タンパクを U937細胞から単離してマススペクトロメ
トリ等で分析したところ、マウスで見つかっている機能不明の膜構成タンパ クと似
ていることを見出 したと報告しました。このタンパクがP
A(プラスミノーゲンアク
チベーター)
系を介する分解の基質や、接着で役割を果たしている細胞外タンパクの
-22
-
結合に働いているものと推測し、この膜タンパクが浸潤におけるタンパク分解に重
要な関わりを持つ可能性を強調していました。
3
番目に G.Murphy (英国 ・イー ストアングリア大)が、 MMP(マトリックスメ
タロプロテイナーゼ)の役割解析への分子的アプローチという 演題で報告しました。
Aを合成する転写レベル、潜在型から活性型への変換、
恥品?の活性発現制御は、mRN
陥1pの特異的阻害因子である百MPによる活性調節といった少なくとも 3段階で行わ
れていますが、このように厳格にコントロールされている MMPの活性発現制御の中
2) の活性化および調節機構を中心に話しました o
でも、ゼラチナ ーゼA 作品0 ・
TIMPには 1から 4までの型があることがわかってきていますが、 TIMP2によって MT
(膜型)-~仏tlP によ るプ ロゼ、ラチナーゼAの活性化が抑制されることを報告しました。
4番目に、この 25周年記念 FEBSM
e
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i
n
gで-賞を受けた若き C.Lopez-Otln(スペ
3(MMP-13)の
イン・オヴィエド大)が、最近ヒト乳癌から同定されたコラゲナーゼ発現調節について、アメリカ仕込みと思われるよどみのない精力的な話し振りで、
聴衆を惹きつけました。皆から盛んに「コングラチュレーション! !Jを受けてい
て、はて?なんだろう??若くして教授にでもなったのかしら、それともデンマー
クに別荘でも買ったのかしら、それとも結婚でも決まったのかしら、それにしては
FEBSの重鎮達が会う度に言っている 、と同行の先生と噂をしていましたら、受賞と
しづアカデミックなことだったので-す。ですが、その日の講演は、白いノーネ クタ
イのシャツにジーパンで行われました(ヨーロッパも段々アウトロ一風の研究者が
増えてきているのかなと思いました)。コラゲナーゼー3は、胎児の成育に際し骨化す
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eや o
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tで例外的に見られる生理的で限局された発現
る時、肥大した c
と比して、乳癌、軟骨肉腫、頭頚部の扇平上皮癌などの悪性腫蕩やリュウマチなど、
様々な病的状態、で過剰発現されることが見出されました。乳癌でコラゲナーゼー3の
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k
i
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eは、乳癌細胞からリリースされる I
L
-lとTGF-β であり、こ
発現に関与する Cyt
れらに呼応してストロマ細胞で・コラゲナーゼ・3
が発現されることを、彼らが突き止
めたとのことでした。このストロマ細胞で・産生されるプロコラゲナーゼJが、腫蕩
2
3・
で産生されるプラスミノーゲン・ PA
系からできるプラスミンまたはストロマ自身の
MT陥1pによって活性型コラゲナーゼJになり、浸潤能を発揮していく可能性を示
しました。 ヒトコラゲナーゼー3を過剰に発現したトランスジェニックマウスでは、
D恥侶Aで処理した後、乳癌が急速に増殖するので、コラゲナーゼ・3は腫蕩増殖を促
進するプロテアーゼであると推測していました。なお、コラゲナーゼー3は卵巣か ら
の卵の遊離に関与する可能性も述べ、更にこの発現を調べることによって、乳癌や
頭頚部の扇平上皮癌などの悪性度の診断に使える可能性もあると言及しました。
このセッションの最後に、デンマーク生化学会きつての有名な K.Danφ(デ ン
マーク・フィンセンラボラトリ)の登場でした。個人的な偏見に満ちているとご叱
責を受けそうですが、 筆者にとってとても思い入れのある名前なのです。 ポスドク
の頃からこの先生のレビ、
ューや論文を、血栓止血線溶系および癌の浸潤などの分野
で、度々、読ませていただいたものです。自分の目と耳で間近に見、聞くことがで
きて感激でした。律儀な昔風の学者の雰囲気を漂わせ、にこやかで背の余り高くな
齢、英語(日本語説りの英語ですら上手 く喋
い優しそうな方で、デンマーク靴りの 5
れない筆者の述べるべき 言葉ではありませんが、自分のことは棚に上げて)を操り
ながら、細胞外タンパク分解におけるストロマ細胞の関与と機能重複について、整
が生み出すプラスミンと h
仏1Psの聞に、マ
然と話を進めて行かれました。彼は、 uPA
トリックス分解に関して、機能的に重複があるかどうかを検討していました。倉
I
j
傷
の修復には uPM
品
。s
の系が必須と考え られているのでこの系に注目し、 P
l
g
(プラス
ミノーゲン)欠損マウスを用い、民仏1Ps
の広範囲阻害剤、ガラルジンを処理し、どの
ような条件で創傷修復に変化が見 られるかを検討していました。その結果、野生マ
ウスにガラルジンを処理し MMPs
を阻害 した場合 は、無処理の P
l
g
欠損マウスで見 ら
れる創傷修復の遅れと同様の遅れが認められましたが、 一方で、 P
l
g
欠損マウスをガ
ラルジンで処理すると、創傷修復過程は止められ、不完全のままであったと報告 し
ました 。創傷修復期間のマトリックス分解過程においては、プラスミンと幾つかの
メタロプロテイナーゼの間で機能的に重複があることを示していると解釈していま
2
4
-
した。北欧および中欧は、元々血栓関係の研究が盛んであるせいか、ポスタ一発表
にも PA・プラスミンの分野など、凝固線溶関係の研究報告が多く見受けられました。
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月9日(
5日目)に I
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nのセッションが開かれました。4
演
.A.Belozersky
題に加えて2演題がポスタ ーから選ばれていましたが、このうち M
(ロシア・モスクワ州立大)が発表予定だった、グロプリン分解のメカニズムの演題
が取り消され、 5演題となりました。
Hershko(イスラエ
まず、分野違いの筆者も名前だけはよく存じ上げている A.
ル・テクニオン・イスラ エル工科研)が、 細胞周期制御におけるユビキチンを 介した
タンパク分解の役割について、話題を提供しました。ユビキチン化に関与する酵素
E3:ユビキチンリガーゼ(サイクロソーム)は、不活性型がリン酸化されて活性型に
なること、これがサイクリンBの分解に働いて M期の中期から後期への進行に作用す
ることなど、細胞周期研究およびユビキチン研究両面に大きく寄与した最近の結果
のまとめを総説的に話し ました。
2
番目に D.
H.W
o
l
f(ドイツ・シュトウットガルト大)が、タンパク分泌経路の入
り口である ER(小胞体)関与のタンパク分解について、酵母の系で最先端と思われる
話を展開しました。折り畳みがうまく行かな いなどによる欠陥分子の逆行輸送につ
いて、 ERの膜に局在する ω
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PY)を基質モデルとして、その
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mを用いての実験を提示し、この逆行輸送はタンパク透過チャンネル
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6
1
pに依存していること、また分子シャペロン BiPとチャンネルモジュレータS
e
c
6
3
pも関与している可能性が示されました。分解の過程では、 U
b
c
6とU
b
c
7、更に
e
r
3や H吋 3
が関与すること、加えてUb
c
6
とU
b
c
7を欠いている場合
新しく見出された O
はCpyの逆行輸送、分解が不完全であることを示し、 c
y
t
o
p
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m
へ逆行輸送された
Cpyがユビキチン化され、 2
6
Sプロテアソームの働きによって分解されることをを示
しました。 <この話題に関しましては、ぷろておりしす第5号の「海外留学中研究者
2
5
-
からの最新情報」に、徳永文稔先生が専門家の香り高く詳細に書いていらっしゃい
ます >。
3
番目に M.C.Rechsteiner(デンマーク・コペンハーゲン大)が、 265プロテア
ソームという間口も奥行きも広く深そうな演題名で(分子動態と生理機能と解釈され
個存在
ますが)、その構造と機能解析について報告しました。 26Sプロテアソームに6
する ATP錨 cと、彼らが同定したポリユビキチン結合サブユニット S5aを含む幾つか
のタンパクの相互関係を、構造と機能面から解析し、特に非 ATPaseサフ ユニット S2
o
はA
τ'
Pa
s
e
サフーユニット S4のN末、および S7のC末に結合することなどを示しました。
4番目に B.Zhivotovsky(スウェーデン・カロリンスカ研究所)が、アポトーシ
スにおけるプロテアーゼと題して、精力的に話を展開しました。まずアポトーシス
に関与すると考えられるプロテアーゼとして、まず第一にカルパインを挙げ、その
後エラスターゼやストロメライシンなど次々と列挙し、それらの総括を簡単に説明
してから、カスパーゼに絞り込んで話が進みました。カスパーゼ、ファミリーの分類
と特徴から始まり、局在、プロカスパーゼの活性化機序に及び、 Bcl-2の分解後、チ
トクローム cがミトコンドリアより放出され、 APAF-1を介してカスパーゼの活性化
が起きること、カスパーゼの活性化カスケードの増幅まで総論的な話に終始し、講
義風で大変勉強になる発表でした。
最後はW.Dubiel(ドイツ・フンボルト大)が、プロテアソームの 195制御サブ
ユニットに関わる新しい複合体の特徴について報告しました。この新タンパク複合
体を彼らはシグナロソームと呼び、この 450KDa
分子が、 JAB1(
J
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gp
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)および T
つの異なるサブユニットからなっていることを示しました。単離したシグ
なくとも 8
J
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nのN末活性化ドメイン S
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6
3、S
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r
7
3をリン酸化するキナー
ナロソームはIκBα やc
ゼ活性をもつことを報告し、シグナロソームと 26Sプロテアソームは同じ細胞内分
布を示すので、この両者がシグナルトランスダクションにおいてどのように協同作
用をしているのか、現在検討中であるとして発表を終えました。
2
6
・
終わりに
BSM
回 t
i
n
gのなかでも、プロテオリシスに関するこの2つのシンポジウ
今回の FE
ムは特に聴衆も多く集まり討論も活発であったようです。この分野から今年の受賞
があったことも示しているように、今後の展開が益々活発になってし 1く感触を得た
大変有意義なミーテイングでした。プロテオリシスの複雑な制御、難解な調節、生
理機能への関与等を少しでも深く、か弱い頭で理解するために、活発なミ ーテイン
グにまた参加したいと願っております。
ミーテイングの中身とは関係ありませんが、ポスター会場のパネ ルは、す っとピ
ンが入って抜けない程良いコルクで、日本で登場する、堅くてぐらぐらゆらゆらす
る壊れかけた塀のようなパネルと違って、とても使いよかったです。日本の会場も
早く扱いやすいパネ ルにして欲しいと思います(パネルごと倒れそうになった こと
もあるので)。
アカデミックな話題の後のデザー トに、雑感を少々つけ加えさせていただきま
す。東京ディズニーランドにも行ったことのない筆者は、夕食後ぶらりとチボリ公
園に入って、これがあの有名な遊園地かと眺めてきましたが、目を回 して 次の日の
勉強に支障が出るといけないので、一度乗ってみたかった空飛ぶじゅうたんにも乗
らず、ぐっと我慢して新しい知見の習得に備えました。私はベルギーでポ スドク時
代を過ごしているので、ヨーロッパの夏の気候には多少慣れているように思ってい
たのですが、今年のデンマーク(北欧全体〉は異常に厳しい涼しさ(寒さ〉だった
ようで、暑い日本から行った体と装いでは太万打ちできませんでした。どんなに心
頭滅却すれば、と歯を食いしばって頑張っても寒さは限りなく肌に突き刺さり、遂
に「スウエ ーターマーケッ ト
」 なるお庖で、脱脂していない獣の残り香高い分厚い
セーターを買ってしまい、曇天の風吹きすさぶコペンハーゲ、ンの日々を凌いだのでありました。こんな気候の折りの夕暮れ、会場である国際会議場Be
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からコ
ペンハーゲン中心部まで‘
のおよそ 10kmにも及ぶ寒風荒れるパス道路を、徒歩でチャ
27
・
レンジしました。行けども行けども街中央の駅付近に釜える重厚な件まいの建造物
に辿りつかず、溜息をつきながら、でもあきらめてパスに乗るようなことをせず、
道端の花や草と交流しながらひたすらてくてく歩いて何とか帰り着けました。この
ことは、何故か今までとこれからの私の研究生活を描いているような気がし、益々
新幹線状態に突入し、鏑を削る領域に参加しながら屈折している私にとって、慰め
と小さな希望となりました。たとえ亀の歩みでも、後発隊が <新幹線のぞみ >で走
り抜けていってしまっても、各駅停車で小さな目標まで何とか辿り着きつつ、一駅
ずつ前に進んでいこうと、かぼそく誓ったことは明るい思い出となりました。物価
s
b
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r
gの黄金色に目を細めて、有意義で充実
の高さに目を丸くしながら、 TuborgやCar
したミーティングを終えました。(都臨床研:芦野洋美〉
3 TheXthGordonConferenceonP
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TheirI
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第 10回ゴード ンカンファレンスが本年 7月 5日 1
0日
、 NewHampshire，New
LondonのColbySawyerC
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で-開催された。今回は、参加希望の申込が多く、参加
人と限定されていたため、かなりの人に参加を辞退していただいたようで、
人数が 150
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nのDr.CharlωCraikの苦労が窺えた会であった。この
その調整役を行った C
会は第 10回を迎えたが、今後の世界のプロテアーゼ研究の流れを、各セッションタ
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eとP
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そのものの研
イトルが示しているように思える 。すなわち P
究から 一歩踏み出して、その応用研究、すなわち生理機能の解明の 1つの道具と し
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eを使用している点が特徴的で、 P
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e研究は今後益々広がりを見せるこ
てP
とを予想さ せるに十分な会であった。本文の最後に Speakerとタイトルを示すが、具
体的に各セッションについて述べてみたい。
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"では、 HIVに変わって C型肝
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炎ウイルスに世界の目は集まっていることを強く印象づけた。 HIVp
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を用いたAIDS治療の成功がし、かに大きな刺激をこの方面の研究に与えているか見せ
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eは抄録は作らずできるだけ Hotなデータ
つけられた思いであった。 GordonC
を発表するたてまえになっているが、企業秘密に関するこの分野では、むしろ食事
の 時 の 会 話 が 刺 激 的であ った。 S
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s"では、Ma
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紅白に関する研究発表が活発で‘南米に近いアメリカでは大き
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rの有効性が焦点となっていた 。また
な研究フィールドで、 C
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sの原因菌、寄生虫
世界中で現在関心の高ま っている Vancomycin耐性菌と P
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e阻害剤による治療の有効性や寄生虫と肥満細胞との関連に注目し
のc
た発表が印象に残った。
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、 このセ ッションの中で D
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yはヘノ fリンと結合した形で主に血管壁に存在 し
、
Thrombin
をはじめとした血液凝固因子群を調節を行っていることを詳細に報告して、
へパ リンの重要性をあら ためて浮きぼりにした。S
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では、 主に U
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yや 20SP
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eの構造と機能相関にまで踏
み込んだ研究の紹介があった。 20Sp
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活性を比較的 選択的に阻害
する新しいいくつかの 仕i
pe
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dev
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，1167等が臨床研究に まで発展して、強い抗日端息作用のあることを示し
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ていた。生体濃度のZn
基づく創薬の試みがさらに進展するものと思われる。
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足のゆくものであった。日本のこのような学会との大きな違いは、製薬会社の研究
グループが活発に発表し大学の研究室と実質的かっ深い交流のあることをうかがわ
せる点である 。学会報告としては、抄録集がないため私の手帳に書き留めておいた
ものを今になって読み直し、何を話していたか思い出しながら 書 いたため正確でな
い点も多々あると思う 。書きながらせっか くの情報も何と早く忘れてしまうことか
と情けなく、なかばあきらめなが ら書いた次第です。ともあれ、 7月のさわやかな風
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s，
(徳島大学酵素センター:木戸博〉
4 病態、と治療におけるプロテアーゼとインヒビター研究会
平成 10年 8月 21、 22日両日、名古屋国際会議場にて第 3回病態と治療に
おけるプロテアーゼとインヒビター研究会が行われた(世話人は微生物化学研究所
の青柳高明先生、事務局は名大・医・産婦の水谷栄彦先生〉
。 シンポジウム、ポス
ターあわせて 99演題が集まり、 300人近 くの研究者たちによる活発な討論が行
われた。この会議は、プロテアーゼインヒビターの臨床応用という大きな柱がある
ため、生化学会、分子生物学会に見られない演題が多く、しかも産官民共同のたて
3
2
-
まえ通り、広い視野からの基礎・臨床を越えた議論が飛ひ'交った。
基調講演は田中(都臨床研〉によるプロテアソームの総論で、この複雑な蛋自
分解系の問題点をわかりやすく説明していただいた。御本人はユビキチンの話をし
たそうだったが、本題がプロテアソームなのでプロテオリシスについて突っこんだ
討論が行われた。 E 3や脱ユビキチン酵素がなぜ多様なのか、ユビキチン類似蛋白
質の生理意義に関する まとめは勉強になった。よくわから なかったのは、プロテア
ソーム阻害剤がアポ トーシスを誘導したり、逆に阻害したりする機構で、もちろん
個々の説明は納得すべきものであったが、総括的には依然として真相は薮の中とい
う感じであった。ラクタシスチンが血管新生を抑制するデータには感動した。
続いて行われたシンポジウム「循環器系疾患」では、プロテアーゼとインヒビ
ターがヒ トの生体の中でし、かに多様に働いているかを再認識するような内容であ っ
た。藤森(成田赤十字病院〉は動脈硬化におけるプロテアーゼの役割をまとめた。
内皮に発現する品仏1pの話よりも、血管内視鏡による心臓冠動脈造影所見に圧倒され
た。冠動脈に細い内視鏡を入れ、私たちの血管内の動脈硬化の進行具合を直接見る
ことができるのである。横にいた田中氏が「本当に入れるの? どこから ?Jと驚
いていた。第一製薬の国忠は、抗凝固作用を目指して抗凝固因子Xa薬剤の話をした。
後でも問題になったが、 Xaを抑えた方がいいのか、トロンビンを抑えた方がいいの
かについては、議論があるようである。キニノゲン欠損ラットの話をした馬嶋(北
里大)は、カリクレイン・キニン系が腎臓でのナトリウム排池の見張り役であること
を示した。大阪医大の塩田は、心筋症ハムスターにおけるキマーゼ、の働きを述べた。
面白かったのは、ラッ卜、ラビットのキマーゼは、ヒト・犬・ハムスター のキマー
ゼとは基質特異性が異なり、アンジオテンシンーIをアンジオテンシン I
Iにしないで
不活性断片に変える、という話である。実験動物で結果が違うのだ。最後の水谷は、
妊娠高血圧について問題点を指摘した。正常分娩と帝王切開では、血中アンジオテ
ンシンーI
I
やブラジキニン量が違うなど、普段聞いたこともない話に聞き入った。こ
れとは別に、胎盤性ロイシンアミノペプチダーゼのクローニングや、これが妊婦血
3
3
-
清で増えるシスチンアミノペプチダーゼ(
C
A
P
)
やインスリン感受性アミノペプチダー
ゼと同ーのものであり、 GLUT4などと挙動を共にするなどという話は、私が十年ほ
ど前に CAP
を精製してし、たこともあって、その後の進歩に瓶、た。
続いての口頭講演は、ポスターの中からいくつか選ばれたもので、それぞれ興
味深い話が続いた。全部は紹介できないが、私の個人的な好みでし 1 くつか感想を述
べたい。ここでも陥.fPの話がいくつか出たが、どうも製薬会社の特許がからんでい
るのか、新しいデータになると奥歯にものがはさまったような言 い方が多かった。
アシルペプチド ヒ ドロラーゼ、阻害剤 (
A
c
-Le
u-CMK)によるアポトーシス誘導(山口、
昭和薬大、阻害剤はこの酵素だけを阻害 しているのだろうか )、プロカテプシン L
が低濃度でガンの p
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g
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nf
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o
rとして働く (
石堂、順天堂大、本当 ?)、前々か
PP分解酵素の精製 (松本、神戸大、この 6
8
k
D
a
酵素の本体が知りた
ら言われている A
しゅ、 L
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欠損株の性質(岡元、力d
十￨大、Ar
gg
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i
nの方が大切そうだが〉、
・
I
L
・6
による筋蛋白質分解促進 (
辻仲、大阪大、筋肉にどれほどI
L
・6
受容体が出ている
のだろうか)、骨格筋力ルパイン p94の世界で-初めての精製(金原、東大、誰かこの
p
9
4
'こ効く阻害剤を知りませんか)、そしてアミノ グアニジンによる白内障防止 (
猪
股、都老人研、 NOSを阻害 すると逆に細胞内カルシウムが低下するという声あり 〉
など、多彩な演題と観客との攻防に皆も楽しんだ。
次の日のポスタ ー講演は、会場が広いこともあって、 1人 6分の説明はわかり
やすいという 声が多かった。一番楽しんだのは、座長をしていた名市大の佐々木先
生ではなかっただろうか。午後のワークショ ップは、
「炎症・免疫」というテーマ
キニ ンの遊離 (
今村、熊本大〉、好酸
で 6演題が行われた。 エラスターゼによる E球の基底膜通過にキマーゼが関与している話 (岡田、東北大 )、コンビュータによ
るカテプシン阻害剤のデザイ ン (勝沼、徳島文理大)、急性すい炎時にサイトカイ
ン産生が見 られ、それがエラスターゼ阻害 剤で抑え られること (
柴田、熊本大)、
F
a
sが効 くのは肝障害 時 (
須田、 金沢大)、 GVHD
時 (
八木田、 I
J
憤天堂大 〉などの演
題が続いた。臨床応用できるプロテアーゼインヒビターが多 いことに驚いた。
34-
この会は、企業からの協賛と会員からの会費で運営されている研究会で、これ
で 3回目になる。会場は名古屋に固定されているせいか、暑いことを除けば、いろ
いろな分野の人たちと議論ができる良い機会である。
i
ぷろておりしす」読者の皆
さんも、 一度おでかけになられてはいかがだろうか。来年も、同時期に同じ場所で
開催される予定である。(石浦章一:東大・院・総合・生命)
5 遺伝学会シンポジウム「蛋白質分解による細胞機能の制御」
10
月23日より 25日まで北海道大学にて開催された第70回日本遺伝学会において、
「蛋白質分解による細胞機能の制御」のシンポジウムを筆者と東江昭夫(敬称略、以
下同じ)で企画した。近年の分子生物学会の巨大化に伴い、従来の伝統的ではあるが
比較的小さなサテライト的な学会の弱小化、ないしは変化を感じている。かつては
分子生物学の分野の研究者が席巻した遺伝学会も最近ではそれの包含する分野ない
しは研究者に著しい変化と偏りを生じている。これらの現象は一概にマイナスとは
言い難いが、いくつかの学会においてある種の弊害、ないしは問題が生じているこ
とも指摘されてきている。したがって単に目来の学会への懐古趣味ではなく、この
ことへの問題提起と分子生物学の遺伝学会への回帰を喚起することを目的のーっと
した。そのために分子生物学的に昨今の蛋白質分解への関心の高いこと はこれを題
材にするに充分な根拠となった。さらに鈴木特定領域の研究成果の流布が目的に含
まれたのも 当然である 。結果として以下の7名の Speakerによったが、いずれも鈴木
特定領域のメンバーあるいはそのクゃループに関係する方々である。本特定領域をカ
バーするもっと広い先生方を招鴨したかったのだが、いかんせん3時間程度のシンポ
ジウムではそれはかなわなかった。
各演題の細かな内容は特定領域の斑会議での発表やポスターなどで報告された
ものと重複する部分もあるので簡単に記するにとどめたいが、おおむね以下のよう
3
5
-
な内容で、使用可能な時間制限をいっぱし 1に使つての 3時間半の講演、討論であった。
SCFG
凶による Glサイクリン C
l
n
2の選択的か
遺伝学研究所の岸努(演題(以下同じ) i
っ時期特異的ユビキチン化J)は出芽酵母の細胞周期に関わる SCF
ユビキチンリガー
Box
蛋白質で-ある Gπ1
がユビキチン経路
ゼの遺伝学的解析を行い、 SCFと結合する F
に関与し、 Gl
サイクリンのユビキチン化における基質特異性とタイミングを決める
分子的実態であることを示す自身の研究経過と結果を展開した。東京薬大の安田秀
晴乳類細胞のタンパク質のユビキチン化、 s
u
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l
化の 解析J)は、培養細胞で
世(i
nv
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o系を確立した結果、 APCによるサイクリンのユビキチ
のサイクリン分解系の i
h
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c
tドメインを有する因子について報告した。あわせて、
ン化を促進する蛋白質で;
p
5
3のユビキチン化における:MD品位因子の関与、 SUMO-l修飾系を見事な i
nv
i
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o
解析
系で示した。東大、東江昭夫(i
プロテアゾームの遺伝学 J)は出芽酵母におけるプ
ロテアプーム制御サブユニット群の同定とそれらの聞の相互作用の解析に遺伝学的
手法を駆使して、その具体的な成果によって遺伝学的解析の有効性を示した。熊本
エネルギー依存的蛋白質分解に関わる AAAファミリ -ATPase群 J)
は
大の小椋光(i
群と 自身の大腸菌同Hに立脚しつつ、 AAAファミリ プロテアソームの制御ATPase
ATPas曜を概説し、蛋白蛋白相互作用の制御におけるそれらの役割を論じた。北大、
横沢英良( i
受精、発生制御と蛋白質分解J)は精子と卵の相互作用(精子の卵黄膜へ
の結合と通過)における精子プロテアソームの機能、卵の細胞分裂過程におけるカル
シウムシグナルによるプロテアソームの活性化を論 じた。科学技術振興財団加藤プ
ロジェクトの逢坂文男(i
ユビキチン様蛋白質N
e
d
d
8による C
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yの新規修飾機
構 J)はユビキチン類似の蛋白質N
edd
8
がやは りユビキチン系と類似のしかしこれと
は平行して区別され得る反応系をもって、これまた興味深い機能に関わっていると
想像されて いる 一群の C
u
l
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n
蛋白質を修飾することを見事と言うべ き精鰍なデータで
証明した。これは必ずしも蛋白質分解に直結するものではないが、上述の SCF
の構
u
l
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n
蛋白質で-あることからも興味を 5
1く。最後に都臨床研の田中
成因子のひとつがC
啓二(i自己と非自己の免疫識別とプロテアソーム J)は、ガンマ型インタ フエロン
3
6
-
の誘導する 3種のサブユニットに置換された"免疫プロテアソーム"がその活性化因子
PA2
8とともに内在性抗原から阻ICクラス Iリガンドを正確に切り出す機構を、抗原
エピトープ内のプロリン残基がプ ロテアソームによるランダムな分解を防いでいる
として演出してみせた。
小さな学会でのマイナーな分野でのシンポジウムだけに、当初は参加者がない
のではと危慎もしたが、実際には満席とはし、かなくとも常時かなりの参加人員であっ
た。演者の先生方の研究成果への興味がその第一義なのだが、同時に細胞機能制御
における蛋白質分解の役割にたいする昨今の関心の高まりを反映しているものと思
われる。
(国立遺伝研:山尾文明)
3
7
-
(5)ミニレビュー
1神 経 線 維 腫 症 2型 (NF2) 蛋白質のカルパイン分解による新し
い腫蕩発生機構
はじめに
神経線維腫症 2型 (NF2) の病因遺伝子産物マーリンは腫蕩抑制蛋白質であり、
多くの髄膜腫・聴神経鞘腫の神経系良性腫蕩で変異を受けている 。遺伝性NF2
家系
では変異と腫蕩発生の相関(浸透度〉が極めて高く、この腫蕩発生はマーリンの機
能に強く依存していることがわかる。しかし、遺伝子変異が腫蕩の約半数程度にし
か検出されないことは、マーリンの機能を不活性化する別の機構があることを予感
させる。今回、 NF2
遺伝子異常のない腫蕩細胞で、カルシウム依存性プロテアーゼ
(カルパイン〉に よる NF2蛋白質の過剰分解による不活性化機構を証明したり。カ
ルパイン依存性蛋白質分解が直接に腫蕩発生に関わる最初の例と考えられた。
-神経線維腫症 2型
神経線維腫症 2型 (
n
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o
s
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st
y
p
e2:NF2) は約 4万人にひとりの発生
頻度をもつ常染色体優性遺伝病である 2，
3
)。この疾患の特徴としては、髄膜腫・聴
患者に加えて、
神経鞘腫などの神経系良性腫蕩を高率に発生することである。 NF2
一般集団に散発性に発生した髄膜腫・神経鞘腫は成人の中枢神経系腹蕩の約 30%と
大きな部分を占めている。 NF2
遺伝子はヒト 22
番染色体 (22q12) に位置し、マーリ
m
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i
n
) またはシュワノーミン (
s
c
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n
o
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) と呼ばれる 5
9
5アミノ酸残基の蛋
ン(
白質をコードしている 4，
5
)。アミノ酸配列から、バンド:
'
4
.
1スーパーファミリーに属
e
z
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n
) ・ラディキシン(r
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x
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n
) ・モエシン (
m
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i
n)などの ERM
するエズリン (
蛋白質群に相向性を持っている 。これらのメンバーは、アミノ基末端側の約 30kDa
のERM
相同領域で細胞膜蛋白質に結合し、カルボキシル基末端側の α"ヘリックスに
3
8
-
富む領域で細胞骨格蛋白質と結び付くと考えられるの。竹島らはERM相同領域に対
p
1
6
5，
p
1
4
5，p
1
2
5，
p
8
5，p
7
0
) を見い出している 7
)。
する 5つの結合蛋白質 (
NF2
遺伝子の変異は約 5
0・ 80%のNF2
腫蕩、 1
5・35%の散発性髄膜腫、 2
0・60%の散
発性神経鞘腫に見い出されており、他には乳癌・大腸癌・中皮腫などが挙げられる
2
)。これらの遺伝子の変異には、以下のような特徴が知られている。第一に、ナン
センス変異・フレームシフト変異・スプライス変異の頻度が高く、新しく生じた停
止コドンのためにアミノ基末端側の半分位の蛋白質が合成される。しかも、このよ
うな不完全なマーリン蛋白質は腫蕩組織では全く検出されないことから、生合成の
後に速やかに分解されていると考えられる。一方、ミスセンス変異は極めて少ない。
第二の特徴は、ほとんどの NF2
患者に腫蕩が発生する という高い浸透度であり、髄
膜腫・神経鞘腫の発生はマーリンの腫蕩抑制機能の喪失に高度に依存していること
を示している。それにも関わらず、約半数の散発性の髄膜腫・神経鞘腫には変異が
見い出 されていない。しかも、マーリン蛋白質が髄膜腫・神経鞘腫でほとんど検出
t
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-R
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o
vらは、 2
2
例の神経鞘腫
されないことが数多く報告されている。 S
の中で 1
2
例で、 NF2
遺伝子の両アレルが不活性化されていないがマーリンが検出さ
)。そこで、我々はマー リンの翻訳後調節、特に蛋白質分解が
れないことを示した 8
マーリンの不活性化に関連するのではなし、かとしづ仮説を立てた。
.カルシウム依存性プロテアーゼ (カノレパイン)
マーリンの蛋白質分解機構を調べてみると、カ ノレパインに よって特異的に行わ
れることが判明した。カルパインはカルシウム依存性システインプロテア ーゼであ
り、多くのファミ リーメンバーの総称で‘ある 9・1
1
)。ほとんどの組織・細胞で恒常的
に発現するものとして μーカルパインと m-カルパインがあるが、活性化に必要なカル
シウム濃度を除いては生化学的に違いは見られない。前者は μ M
、後者はmMレベル
のカルシ ウム濃度でmVl仕oで-活性化を受ける。どちらのカルパインも分子量 80kDa
と30kDaのヘテロ 2量体であり、 3
0kDa
のサブユニ ッ トは共通である 。活性部位は
39-
8
0kD
a
のサフゃユニットに存在するが、両サブユニットともにカルボキシル基末端側
にカルモジュリン類似のカルシウム結合領域をもっ。この酵素は細胞内カルシウム
濃度が上昇すると細胞膜に結合し、自己消化することで活性化されることが知 られ
ている 。正常および病的な状態において、カルパインはカルシウム濃度の変動に対
する細胞性レセプターとして働いているようである 。実際に、カノレパインは細胞骨
格・細胞膜蛋白質、キナーゼやフォスファターゼなどの酵素、転写因子などの基質
を限定分解することで、バイオモデ、ュレーターとして機能すると考えられている 。
-ヵルパインによるマーリン蛋白質の加 v
i
t
r
oで-の分解
マーリンの分解機構を調べるために、ヒト初期培養線維芽細胞を各種の特異的
なプロテアーゼ祖害剤を用いて 24時間処理した。カルボキシル基末端に対する抗マー
リン抗体を用いたウエスタンブロット解析では、システインプロテアーゼ阻害剤
(
E64d) とカルパイン阻害剤 (
c
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x
y
l
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l
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a
l:Z
L
L
a
l
)1
2
)の処理で‘約
70kDaの完全長のマーリンが蓄積した。これは、本蛋白質がカルパインによって'恒
常的に細胞内分解されていることを示唆している。対照的に、プロテアソーム阻害
剤(ラクタシスチン、 MG132)やライソソーム阻害剤(クロロキン)は影響を与え
なかった。
nv
i
t
r
o
翻訳システム
マーリンがカルパインの基質であることを証明するために、 i
3
5
S
]メチオニン標識マーリンまたは悪性グリオーマ由来の U-251MG;
細胞
で合成した [
の細胞質 (S100) 分画の中に含まれるマーリンを、精製したカルパインとともに反
応させた。マーリンは μ-カルパインと m-カルパインの両者で、カルシウム濃度およ
L
La
l
によって特異的に阻害された。
び反応時間に依存的に分解された。この分解は Z
融合蛋白質として
次に、マーリンのカルボキシル基末端側からの各種欠失体を GST
大腸菌で合成して、 m-カルパインによる分解反応を行った。その結果、マーリンの
3
9までをもっ蛋白質ではカルパイン分解を受けるが、コ
アミノ基末端側からコドン 3
ドン 288までしか持たない場合は分解を受けなかった。すなわち、カルパイン分解部
4
0
-
位がコドン 288
から 339の間にあることが判明し、この部分はERl¥僻目同領域と α
-ヘリ ッ
クスに富む領域のドメイン聞の境界に当っていた。リ コンビナントのマーリン蛋白
質をm-カルパインで限定分解して、その分解産物のカルボキシル基末端のアミノ酸
シーケンスを施行した 1
3
)。その結果、 コドン 295とコド ン299にあるロイシン残基の
アミノ基側で切断されていることが明らかになった。
-カルパインによるマー リン蛋白質の細胞内分解
エピトー
マーリ ンの細胞内分解の解析を有利にするために、アミノ基末端側にHA
プを融合したマーリン蛋白質(完全長のマーリ ンおよびカルパイン切断部位(コド
細胞で
ン295・299)を欠失したムマーリン〉を晴乳細胞発現ベクターを用いて COS-7
発現させた。細胞内のカルパインを活性化するために、 5μM
のカルシウムイオノフ ォ
mM
のカルシウム濃度を含む培養液の中で30分間まで経
ア(イオノマイシン)とlO
エピトープに対する抗体を用いたウエスタンブロット解析で、
時的に処理した。H A
HA完全長マーリンはイオノフォア処理後 15・ 30分で顕著に減少して、それに対応
LLalによっ
して約 35kDaのカルボキシル基末端側の分解産物を認めた。この分解はZ-
て特異的に阻害 された。一方、 HA
ムマーリンがイオノマイ シン処理後でも分解を
受けなかったことは、欠失した領域が細胞内でもカノレパインの切断部位であること
を示した。
-髄膜腫・聴神経鞘腫におけるマーリン蛋白質の欠如とカルパインの活性化
NF2遺伝子の変異とマーリン蛋白質の解析が24
例の髄膜腫・聴神経鞘腫でなされ
た。内訳は、 NF2患者由来の髄膜腫 (
3
例)、散発性の髄膜腫 (6例〉、 NF2患者由
来の聴神経鞘腫 (
1
3例〉、散発性の聴神経鞘腫 (
2
例)であり、陰性対照として悪性
nv
i
t
r
oの転写および翻訳システムを用いた蛋白
グリオーマ細胞を用いた。最初に、 i
質翻訳停止テスト (
p
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o
n憾 の で NF2
遺伝子変異を解析した 1
4
)。簡単に
Aを抽出して逆転写反応を行い、わプロモーターを付けた
は、腫蕩組織からmRN
4
1・
NF2cDNA
をPCR増幅した。大腸菌抽出液の中でNF2mRNAを転写して、ウサギ網状
35S
赤血球ライセート中で[
]メチオニン標識マーリンを得た。結果として、解析した
腫蕩の 70.8% (
17
!
2
4{71j)に翻訳停止した短いマーリンが見られ、残りの 7例 (
3
{
7
1
j
の
散発性の髄膜腫、 NF2患者由来の髄膜腫(1例)と聴神経鞘腫 (
3例) )では完全長
マー リンが合成された。後者の7例ではNF2mRNA
が発現し、その cDNAシーケンス
上も NF2
遺伝子変異が認められなかったので、細胞内では完全長のマーリンが生合
成されているものと予想される。しかしながら、ウエスタンブロット解析を行うと、
髄膜腫と聴神経鞘腫ではマー リンが全く検出されなかった。対照の悪性グリオーマ
細胞はマーリンを発現していた。次に、生理的な細胞内カルシウム濃度で反応する
μカルパインの活性化状態を調べた。 80kDa
の不活性型、 78kDaの中間型、 76kDa
の活性化型の 3つのフォ ームがあり、いずれもアミノ基末端側の自己消化によって
活性化されることが知られている 。この 6例の内に 4例で、中間型および活性化型 μ
ーカルパインが認められ、悪性グリオーマ細胞ではカルパインの活性化は全く見られ
なかった。
-散発性髄膜腫における活性化型カルパイン
髄膜腫の腫蕩組織を活性化型 μーカルパインを特異的に認識する抗体を用いて免
疫組織化学染色を施行した。この抗体は不活性型および中間型には交文反応はない
5
)。活性化型 μーカルパインが腫蕩細胞およびその初期培養細
ことが判明している 1
胞の細胞質に強く染色された。 一方、腫蕩組織の中の間質性非腫蕩細胞、グリオー
マ組織およびU・251MG
細胞では検出されなかった。対照として、 U-251MG細胞をイ
オノマイシンで処理すると、細胞質に活性化型 μ-カルパインが検出された。これら
の結果は、腫蕩細胞の中でカノレパインシステムが恒常的に活性化されていることを
示した。
最後に、腫蕩細胞の中で・マーリンが実際にカルパイン分解を受けていることを
La
l
で処
証明するために、髄膜腫の初期培養細胞と対照の線維芽細胞を経時的に Z-L
4
2
-
理してカルパインを阻害した。髄膜腫細胞ではマー リンが処理後 6時間で速やかに
著増したのに対して、線維芽細胞ではほぼ同レベルに増加するのに 24時間を必要
とした。これは、マー リンがカルパイン分解で不活性化されていることを明示した。
国マーリンのカルパイン分解の意義
マーリンがカルパインによって分解されることは、多くの細胞骨格関連蛋白質
がカルパインの基質であることと 一致している。現在のところ、マー リンの正確な
蛋白質機能は不明であるが、おそらく細胞死や細胞老化に関わっているものと考え
られる。そのため、マー リンが不活性化された細胞は司守E
化を獲得するのであろう 。
また、本蛋白質がカルパインで制御されることは、カルシウムシグナル経路の中で
機能することも示唆している。共焦点レーザー顕微鏡を用いて免疫細胞染色を行う
カルパインの細胞内局在が比較的一致しているので、細胞内で相
と、マーリンと μ互作用は可能であると予想される。カルパイン分解部位はERM相同領域と αーヘリッ
クスに富む領域のドメイン間の境界に当り、その切断部位のアミノ基側に NISY
配列
が見られる。インテグリン β3サブユニットなどの蛋白質では、カjレパイン切断部位
モチーフが見い出されている 1
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相同領域を含む約 35kDaの
に近接して NXXY
分解産物が認められたが、翻訳停止変異で合成された不完全なマーリンが腫蕩細胞
内で全く検出できないことからも、マーリンの分解産物は極めて不安定な存在であ
ることがわかる。翻訳停止変異およびカルパインによる過剰分解のいずれにおいて
も、結果的にマーリンの不活性化に至ると考えられる。このように、マーリンのカ
ルパイン分解はその蛋白質機能の停止を導くと思われる。
カルパインの活性は細胞内おそらくは局所のカルシウム濃度で決められるが、
基質側のリン酸化状態がカルパイン分解への感受性に影響するという報告がある 。
内皮細胞性アクチン結合蛋白質、血小板コータクチン、コネキシンー32、タウ、ニュ ー
ロフィラメントなどで知られている 1
7
)。マーリンがそのセリン残基の恒常的なリン
酸化を受けるので、同様にリン酸化で・カルパイン分解が調節されているのかも知れ
4
3
-
ない。実際、リン酸化によってマーリンの細胞内局在が変化するような結果も得て
しる。腫蕩細胞の中でマーリンがカルパインによって溜尺的に分解されることには、
何らかの細胞性因子が関与することが予想される。
遺伝子に変異がない腫蕩でマーリンのカルパ
髄膜臆と聴神経鞘腫において、 NF2
イン分解が過剰に活性化されていた。最近、腫蕩発生のプロセスに蛋自分解システ
ム、とりわけユビキチンープロテアソーム経路が関わっていることが報告された。ヒ
トパピロ ーマウイルスの感染細胞で-の腫蕩抑制蛋白質p53や乳癌 ・大腸癌でのサイク
8
2
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)。マー リンのカ ルパイン分解は、腫
リン依存性キナーゼ、阻害蛋白質p27で‘ある 1
蕩発生とカノレパイン依存性分解が 直接結び付いた例であった。このような蛋白質の
過剰分解による不活性化の概念に対して、蛋自分解変異 (p
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う名称を提案した。
NF2に関連した腫蕩は病理学的には良性で比較的ゆっ くりと増殖することから、
その本態は細胞死の抑制、すなわち不死化の状態にあると考えられる 。 しかし、臨
床医学的には、外科手術が困難であったり再発を繰り返すために重篤な疾患である 。
腫蕩・の細胞増
我々のデータは、カルシウムブロッカーやカルパイン阻害 薬剤がNF2
殖の抑制や再発の防止などの治療目的に応用できる可能性を示唆している 。英国で
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(熊本大学医学部腫筋医学講座:中尾光善)
2 Notch研究の進展
1
.Notch受容体の役割
Notchは、ショウジョウバエから崎乳類に至るまで幅広く保存されている 1回膜
貫通型細胞表面受容体分子であり、発生過程において細胞間相互作用に極めて重要
な役割を果たしていることが、ショウジョウバエや線虫の遺伝的解析により知られ
ている。これまで;Notch受 容 体 に は シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ で 1種 類 、 線 虫 で 2種 類
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胞表蛋白質の存在が報告されている 。
リガンドとの結合により Notchを介してシグナルが伝えられると、細胞の分化は
抑制され、未分化な状態が維持される。 具体的には、 c
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C12 (C2C12は
Notch1・3を内在的に発現している。)を共培養すると、筋管形成が抑制される (
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ことが、我々や他の研究室によって明らかにされてきた。 またNotch
からのシグナル
は、筋形成 (
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sなど、非常に広範囲にわたって細胞の分化に抑制的に働いて、細胞を未
分化な状態にとどめておくことが知られている。
2
. Notch受容体のドメイン構造
生物種によってNotch
受容体の大きさは異なるが、マウスNo
t
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1は、 2531アミノ
4
6
-
酸からなり分子量は約 300kD
である。 Notch受容体はいくつかの特徴的なドメイン構
造を持ち、生物学的活性にそれぞれ重要な役割を担っ ていると考えられている 。細
胞外領域にはEGF様リピートがあり、この領域がリガンドとの結合部位であると予
想されている。 EGF様 リ ピ ー ト と 約 20ア ミ ノ 酸 の 膜 貫 通 領 域 の 聞 に は LN
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2
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h) リピートと呼ばれるシステイン残基に 富む領域が存在する 。この
(LIN
LNリピートはNotch
受容体の活性化を負に制御していることが、ショウジョウパエ
や線虫を用いた遺伝的解析から明らかになっている。
Notch
細胞内領域を単独で・細胞に発現させると c
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とから、細胞内領域に Not
が予想された。実際、異種閣の Notchで・高度に保存されたアンキリン (ANK)リピート
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p
e
を示すとしづ報告や、ヒトでは、
を細胞に発現させるだけで‘c
Notch3のANKリピートの変異が、脳卒中や痴呆を引き起こす CADASILという疾患の
原因であることが最近突き止められたことからも、このドメインがNotchシグナル伝
達に極めて重要であることが推測される 。また膜貫通領域 とANKリピートの聞には、
Notchシグナル系の下流に位置する DNA
結合蛋白質RBP-J (
シ ョウジョウバエSu(H)
のmamma
l
i
a
nhomolog) に直接結合する RAM(RBP-Ja
s
s
o
c
i
a
t
e
dm
o
l
e
α
l
l
e
) ドメインと呼
ばれる約 100アミノ酸の領域が存在する (3) 0 RAMドメインの種間の保存の度合い
はANKリビートに比べ低いが、 RBPJとの結合に必須のアミノ酸は種を越えて保存
されている。 ANKリピートより C末側は、種間の保存の度合いが分子の中で最も低
領域が存在する。またANKリピートと PEST
領域の間には、ショ
く
、 C末端には PEST
領域が存在す
ウジョウバエNotchと晴乳類 Notch1で、のみ、グルタミン残基に富むOPA
るが、その機能についてはいまのところわかっていない。
3
. Notchシク。ナノレ活性化の分子機構
リガンドがNotchに結合するとどのようにシグナルが細胞内に伝わるのかは、長
い間不明であった。しかし、この問題もショウジョウバエや線虫を用いた遺伝的解
4
7
-
析の結果、 Notchシグ、ナルの下流分子が次々に見つかったことによって大きな発展が
H
a
i
r
l
e
s
s，
d
e
l
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e
x，
d
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s
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v
e
l
l
e
d，
もたらされた。特にショウジョウバエでは、 Su(H)，
E
(
s
p
l
)c
o
m
p
l
e
x，
g
r
o
u
c
h
oと
し 1った Notchシクゃナルの下流に位置する分子が数多く 同定
が、我々の研究室で
され、それら分子の中の 1つである Su(H)のmammalianhomolog
Jkと呼ばれ、また CBFlと呼ぶこともある。)である
同定された RBP-J (以前はRBP研究に参入すること
ことが判明するに至り、我々も偶然、いや運命的に(?)Notch
になった。前述したように Notchは RBP-Jに直接結合するが、膜表面受容体である
Notchと
、 DNA
結合蛋白質であり核内に存在する RBP-Jがどのように細胞の中で相互
作用するのかについては、大別して次(1とめの 2つのモデルが提唱されている。
(
1
)T
e
t
h
e
r
i
n
gmodel (RBPJ
/
S
u
(
H)t
r
a
n
s
l
o
c
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t
i
o
nmodel)
これは以前主流をしめていた説であるが、現在は殆ど誰も(初めに提唱した人
細胞内領域と結合して細胞膜の内
達も〉信じていない。 RBP-Jβu(H)は、通常 Notch
側に保持され、 Notch
がリガンドと結合して細胞内領域に構造変化が生じると、結合
がはずれて核に移行するといったような、 J
AK/
STATシグナル系に似た機構である 。
これはショウジョウバエのNotchとSu(H)を、それぞれ過剰発現して再構成した系を
もとに提唱されたものであり (4) 、いまとなっては、 o
v
e
r
e
x
p
r
e
s
s
i
o
nの実験は常に
a
r
t
i
f
a
c
tを観察している危険性をはらんでいることのよい例である。
(
2
)P
r
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t
e
o
l
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s
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s/c
l
e
a
v
a
g
emodel (Notch-RAMICt
r
a
n
s
l
o
c
a
t
i
o
nmodel)
こちらは現在主流の モデルであ り、状況証拠としては、数多くの実験結果がこ
のモデルを支持している。 Notchの nul変異がSu(H)の o
v
e
r
e
x
p
r
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s
s
i
o
np
h
e
n
o
t
y
p
eではな
くSu(H)のn
u
l
l
変異と同l;， p
h
e
n
o
t
y
p
eを示すこと、内在性のRBPJ
/
Su(H)が細胞膜付近に
J
見出されないこと、 RBP-J
/
Su(H)は単独で;
'
i転写活性化能がないこと、ショウジョウ
e
a
s
tのGAlADNAb
i
n
d
i
n
gドメインを挿入すると、リガン ド
バエNotchの細胞内領域に y
(
D
e
l
t
a
)依存的に GAlAb
i
n
d
i
n
gs
i
t
eに依存した転写活性化が観察されること (
5、 6
)な
4
8
-
どが挙げられる。我々は GAlAを用いて、実際にマウス Notch1のANKリピートと
PEST
領域の間に、転写活性化ドメインが存在することを明らかにした (7) 。これ
h細胞内領域には核移行シグナルがあること、及び、
No
t
c
h
細胞内領
らのことと、 Notc
i
n
d
i
n
gs
i
t
eに依存した下流遺伝子の転
域は RBP-Jと複合体を形成したときに、 RBP-Jb
写を活性化させること(1、 7) などから考えて、
リガンドと結合することにより
Notch細 胞 内 領 域 は プ ロ テ ア ー ゼ に よ る 切 断 を う け て 核 へ 移 行 し 、 核 内 の
RBP-J/
Su(H)に結合し、下流遺伝子の転写を活性化するというモデルが提唱され、こ
れは、最近明らかになった SREBPの活性化の機構と、類似点が多い。
(4)Notchを切断するプロテアーゼ
現在殆どの人達が (2) のモデルを信じ、それを証明すべく激しい競争が世界中
で行われている。いまのところ、 Notchを切断するプロテアーゼは3種類あると考え
られており、 Notchシグナル系における役割について以下に述べる。
a
. F
u
r
i
n(
s
u
b
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l
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s
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l
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)
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sG
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l
g
in
e
t
w
o
r
kに お い て 、 細 胞 外 ド メ イ ンの RQRR (マウス N
o
t
c
h
1の
1
6
5
1
1
6
5
4
)を切断し、 p180(細胞外領域)伊120(細胞内領域)の機能的ヘテロ・ダイマー
の、細胞膜表面への発現に必須で、あると考えられる (8、9)。
b
. K
u
z
b
a
n
i
a
n
ショウジョウバエの遺伝解析で見つかった変異で(10) 、この遺伝子産物は
AD
馴(ディスインテグリン・メタロプロテアーゼ)ファミリーに属する。線虫でも
相同遺伝子 (SUP-17)が存在し、ショウジョウバエ同様Notchシグナル系の構成分子
であることが明らかになっている 。当初は機能的ヘテロ・ダイマーの細胞膜表面へ
の発現に必須であると考えられていたが、その役割については今後の解析を待たね
ばならない。No
t
c
h分子のどの部位を切断するのかも、まだ決定されていない。
c
. 第 3のプロテア ーゼ
研究の最大のトピックスである。このプ
このプロテアーゼの同定が現在のNotch
4
9
-
ロテアーゼの存在は、膜貫通領域も含むNotch細胞内領域のコンストラクト (NaEと呼
ばれる)でも分化抑制能、及び転写活性化能を示すこと、この NaE蛋白質は
p
r
o
t
e
o
l
y
s
i
sを受け、細胞内領域のみの蛋白質に近い分子量に分解されること (1
1) か
ら予想された。この分解は MG132によって阻害される為、プロテアソームの関与が
示唆されるが、一方では l
a
c
t
a
c
y
st
i
nで
阻害されないという結果もあり、はっきりした
結論はまだ出ていない。また最近NaEの切断部位が決定され (
12)、ごく微量の切断
産物が、細胞膜から核に移行して転写を活性化させることが明らかになり、これま
で‘内在性の Notchの細胞内領域が、リガンド刺激によって核内で検出されなかった理
由が説明可能になった。
5
.今後の展望
Kuzb
組 i
a
nはプロテアーゼドメインを細胞外領域にもつことから、世界中(我々も
含めて)が探している第 3のプロテアーゼ、は、プロテアーゼドメインを膜貫通領域、
或いは細胞内領域にもつようなものであると推測される。また、非常に強力な、ショ
ウジョウパエ・線虫の遺伝解析を駆使しでも単離されないことから、第 3のプロテ
アーゼ、はf
u
巾のように、 Notchシグ、ナル系に特異的なものではないのかもしれない。
第 3のプ ロテアーゼを同定する 手がかりとしては、あまり有力なものはみあたらな
しゅく(私だけかもしれないが・・.)、この班で勉強させて頂き、少しでも今後の研
究に役立てたいと願う次第である。
率盤
1
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1
9
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)Development，
124，
4133-4141
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2
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9
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Y-M.
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Y
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1
9
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e
l
l，
94，
4
2
3
4
2
6
.
(京都大学:黒岡尚徳)
3 Wnt/Winglessのシグナル伝達研究の進展
はじめに
動物の初期発生や形態形成過程では、多様な細胞間相互作用が細胞の運命決定
や分化の制御に重要な役割を果たしている。 Wnt蛋白質はその様な細胞間相互作用
を仲介するシグナル分子であり、種を越えて良く保存された大きな遺伝子ファミリー
s
o
p
h
i
l
a
や Xenopusそしてマウスを用いた遺伝学・分子生
を構成している。最近、防o
物学的解析により Wntシグナル伝達経路の構成員が明らかにされ、さらにこのWnt経
)。また癌抑制遺
路は線虫からヒトに至るまで良く保存されていることも示された 1
伝子産物 APC
蛋 白質や カドヘリン結合蛋白質 βー
C
a
t
e
nI
n
がWn
t/W
i
n
g
1
e
s
s
(
W
g
)のシグナ
ル伝達に必須であることが発見され、 Wnt遺伝子研究は発癌との関係においても注
目を集めている 。
Wnt
/W
g経路の 主要な構成員であ る β-カテニン /
Arm
a
d
i
l
l
o(
Arm)は、 Wntシグナル
の無い状況では、速やかな蛋 自分解に より、その細胞質内濃度は低く保たれている
が
、 この βーカテニ:，.;/
Arm蛋白質の特異的分解は、 βーカテニ:，.;/
Arm蛋 白質の N末端
部分に存在するアミノ酸配列の特異的リン酸化により調節されていることが明らか
となった。リン酸化された βーカテニン/
Arm蛋 白はU
b
i
q
u
i
t
i
n
化され、 P
r
o
t
e
a
s
o
m
eによ
り分解される。更にこの リン酸化された β-カテ ニ
:
，
.
;/
Arm蛋白に作用すると考えら
蛋白 Supemumerary1
i
m
b(
S
l
i
m
b
)も見出された。こうした現象の発見によっ
れる F-box
て
、 Wnt
/W
gシグナル伝達経路における特異的蛋白分解の重要性が注目されるに至っ
5
1
-
たので‘ある。
1. Wnt
遺伝子ファミリー
1982
年Nusseらはマウス乳癌ウイルスによる乳癌の発生にかかわる癌遺伝子とし
1を発見し 2
)、さらにそのDr
osoph
日時目同体が怪の体節構造の形成にかかわって
て加t
いるセグメントポラリティー遺伝子Wingless (Wg) と同一である事を見いだした。
Mc
Mah
onらがマウスの i
n
t
1の相同体をクローニングし、またXenopusで-も次々に相同
n
t
1相同体遺伝子ファミリーは Wgとi
n
t
1にちなんで Wnt
体が確認され、これらの i
(ウィント〉と命名された 1
)。Wn
t
タンパク質は約 4 0kDaの N末にシグナル配列
を持つ分必性糖蛋白質である。 Cysを多く含み、その 22ヶの Cysの位置は全ての
Wntに保存されていることか ら
、 Wntは特徴ある強固な高次構造を持っていると考え
蛋白質のほ
られる。 Wntは各Wnt，こ特異的な発現パターンを示すが、分泌された Wnt
とんどは細胞外基質に結合し、その産生細胞からの距離に応じた濃度勾配を形成し
て、いわゆる形態形成因子 (Morphogen) として働いているものと考えられている 。
Wnt
の生物活性については線虫、Dr
osop
h
i
l
a
や Xenopusそしてマウスを用いた個体・
細胞レベルでの膨大な量の研究があり、それらの研究から、 Wntは動物の初期発生
や形態形成過程で-多種多様な機能を持っている 事が明らかになっている。最も解析
の進んでいるのは Dr
o
s
o
p
h
i
l
a
のWgで、初期医における分節化、中枢神経発生、麹肢
の形態形成、中腸マルピギー管、複眼、心臓の器官形成などの局面で働いているこ
)
。一方マウス Wntに関しては、
とが発生遺伝学的研究により明らかにされている 3
McMahonらにより作製された各種 Wn
t
遺伝子ノックアウトマウスの表現型より、
Wnt-1は中脳の形成に、 Wnt
7
aは肢芽の腹背軸に沿ったパタ ー ン形成に、 Wn
t
・3
aは前
肢より後方の体節中脹葉誘導に、そして Wnt・4が腎臓の形成に働いていることが明ら
・1
やWgなどを発現さ
かにされているの。また Xenopus初期怪の腹側で;XWnt-8やWnt
せると 2次体軸が形成され、双頭のオタマジャクシが生ずる事から 、特定の Wntに
はオーガナイザーの誘導を行う Nieuwkoopセンターとしての活性があるものと 考え
5
2
-
られている 5
)。
2
. Wn
t/Wgシグナル伝達経路
標的細胞の中で・の Wnt
経路の模式図で・ある 6
)。分泌された Wntはその受容
図は Wnt
体F
r
i
z
z
l
e
dに結合し、シグナノレを D
i
s
h
e
v
e
l
1
e
d(
D
sh
)に伝達する。 F
r
i
z
z
l
e
dは N末にシグナ
)
0 Ds
hは多
ル配列をもち、さらに 7回膜貫通ドメインを備えた膜タンパク質で・ある 7
70kDaの主に細胞質に存在するリン酸化蛋白
機能のシグナル仲介分子で、分子量65・
質である 8
)。Dshは、分子の中央部に蛋白間相互作用にかかわると考えら PDZドメイ
i
z
z
l
e
dとの間を仲介しているものと考えられ
ンを含み、下流のエフェクタ一分子と Fr
e
r
r
r
h
rキナーゼ、Glycogens
y
n
t
h
a
s
ek
i
n
a
s
e3・β(GSK3・β)
る。次に、活性化された DshはS
の機能を抑制する。 GSK3β は本来 βカテニン/
Armを負に制御しているので、 Wnt
シグナルは βーカテニン/Armを GSK3・
βによるこの負の制御から解除することになる。
実際に生じる現象は、 Wnt、ングナルにより β-カテニン/
Arm蛋白質の細胞質内のレベ
ルが著しく上昇することである。蓄積した β-カテニン/Arrnの一部は、 HMGboxを持
e
l
l
s
p
e
c
i
f
i
c仕 組s
c
r
i
p
t
i
o
nf
a
c
t
o
r
)に結合 し9
)、Wnt
の標的遺伝子群、
つ核内転写因子Tcf(Tc
g
r
a
i
l
e
d(
E
n
)
や Ul仕a
b
i
t
h
r
o
l
a
x(Ubx)，S
i
a
r
n
o
i
sの転写の活性化を行うと考えられ
例えばEn
/W
gシグナル伝達経路の概略であるが、図 1にはそれに加え β
ている。これがWnt
・カテニンは αー印刷加、 C
a
d
h
e
r
i
nと複合体を形成し C
a
d
h
e
r
i
nによる細胞接着の機能も
担っている事も示しである。
3
. Wntシグナルによる β-カテニ'.//Arm蛋白質の分解制御の分子機構
この約 1年半の聞に、 Wntシグナルによる
3カテニン/Arrn蛋白質の分解制御の
n分子の同定とその機
分子機構の研究には大きな進展があった。それは図に示すAxi
能の解析10，
11，
1
2
)、U
b
i
q
u
i
出、 Proteasome
系の作用機序の解13，
1
4
)、そして Fb
o
x
蛋白
Supemumeraryl
i
m
b(
S出l
b
)の発見1
5
)が相次いだからである。 s-カテニ'.//Arrn蛋白質
βによる特異的リン酸化の標的になり得る S江文xxsrrの
の N-末端部分には GSK3・
5
3
-
繰り返し配列 (SYLDSGIHSGXX啄 XPSLSG，太文字は後述する 6アミノ酸モチー
Arm蛋白 はU
b
i
q
u
i
t
i
n
化さ
フ)があり、 GSK3-β によってリン酸化された β-カテニン/
r
o
t
e
a
s
o
m
eにより分解されると考えられていた。しかし、試験管内では β-カテ
れ
、 P
ニン/
Arm蛋白質は GSK3・βの良い基質とはならないことも良く知られていた、 し
かし、Axi
n分子の登場がこの疑問を解いてくれた。 Ax
i
n
蛋白質は50
年ほど前か ら
知られていたマウスの体軸形成異常の遺伝子、 Fusedの遺伝子産物 として発見された
1
0
) 。また一方、同じAx
i
n
分子が GSK3-β あるいは β・カテニンに結合する蛋白の
two
h
y
b
r
i
ds
α
e
e
n
i
n
gからも見出されたのである 1
1，
12) 0 Ax
i
n蛋 白質は分子量約
100kDaで
、 N末端から、癌抑制遺伝子産物APC蛋白質を結合する RGS(
r
e
g
u
l
a
t
o
ro
f
G
p
r
o
t
e
i
ns
i
g
n
a
l
i
n
g)ドメイン、 GSK3・
β結合領域、 βカテニン結合領域さらに C
末端
部分に DIX ドメイン(Dshの N末端部分と相同な領域)を持っている。従って、図に
n
(まWntシグナル伝達経路の構成員を引き寄せるドッキング蛋白であり、
示す様にAxi
GSK3・
βによる βー
カテニン/
Arm蛋白質のリン酸化を著しく促進する。また APC
変異
を持つ大腸癌細胞株SW480では、正常細胞に比べ細胞質内に βC
a
t
e
n
i
n
が高濃度に蓄
C
a
t
e
n
i
nレベルが著 し
く 低下す
積しているが、そこに野生型APCを発現させると、 β-
ることから、 APCは β-Cateninの分解に働くと考え られていた。大腸癌で発現してい
るC-末端部分を欠く APC変異体はAxi
n蛋白質と結合 しない ことか ら
、 APCの β
i
n蛋白質の関与が考えられている 1
6
)。結局
C
a
t
e
n
i
nの分解促進の機能にもAx
Wnt
、
F
r
i
z
z
l
e
d、Ds
hと伝達されたシグナルは、何らかの機構で GSK3・
βの機能を抑制し、
そのため β-カテニン/
Ar
m 蛋白質はリン酸化を受けず、 U
b
i
q
u
i
t
i
n
/
Pr
o
t
e
a
s
o
m
e蛋自 分解
c
f
のc
o
a
c
t
i
v
a
t
o
rとなるものと 考え
系から逃れて、細胞質内に蓄積し、核内転写因子T
られる 。
最近、各種の P
r
o
t
e
a
s
o
m
eの阻害剤による処理によって細胞質内 sC
a
t
e
n
i
nの蓄積が
生ずる事、 β-カテニン蛋白の上記した GSK3-β のリン酸化配列の S
e
r
が s-カテニン
白1
化に必須で‘ある事 、またそのリン酸化標的アミ ノ酸配列の中には I
KBに
のUbiqui
14)。従っ て
、 β・
カ
も存在する DSG中XSなるモチーフが存在する事が見出された 13，
5
4
-
テニ:，;/Armおよび~IK-B は共に蛋白中の特定のアミノ酸配列のリン酸化により分解の
引き 金がヲ ￨
かれている事が明らかになった。さらに、この IK-Bの特異的リン酸化を
行う IK-Bk
i
n
a
s
e
が同定された。従って β-カテニン/
Armのリン酸化における GSK3-β
とIK-Bk
i
n
a
s様の k
i
n
a
s
eとの相互作用・共同作用の可能性も考えられる。さらに
D
r
o
s
o
p
h
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l
a
ではF-box-WD40リピートを持つ蛋白 Supemumerary出 l
b(
S
l
i
m
b
)
が見出され
変異体で‘はArmの蓄積が生じる 1
5
) 。既に S
l
i
m
bの脊椎動物の相同体は
ており、 Slimb
かTRCP(β ー
T
r
a
n
s
d
u
c
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nr
e
p
回 t
c
o
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t
a
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n
i
n
gp
r
o
t
e
i
n)である事も知られており 1
7
)、今後、
ノックアウ トマウスの表現型に興味が持たれる 。出芽酵母の細胞周期で働く F-box蛋
、 SCFU
b
i
q
u
t
i
nL
i
g
a
s
e複合体の中で、リン酸化された基質を結合するレセ
白CDC4は
8
)ことを考えると、 S出 l
bもリン酸化された βー
カテニン
プターとして機能している 1
/
Armのレセプターとして機能しているものと推測される。
終わりに
gシグナル伝達経路について、特に特異的蛋白分解が関与するステッ
以上、 Wnt/W
プの研究の現状を概説した。本稿ではふれなかったシグナル伝達経路の構成員の性
質については、他の総説 19)を参照されたい。最近、 Wn
t
シク。ナル伝達異常と 発癌
との関係が注目されているが、 APCや β-Cateninの変異が見出された大腸癌では、結
局
、 sC
a
t
e
n
i
n・T
c
f
4複合体が癌遺伝子c
mycの転写活性化を誘導し、発癌に至った
事が報告された 20) 。今後ともこのシグナル伝達経路が様々な生物系や実験手法を
tシグナル伝達異常に伴う遺伝疾患など
用いてより詳細に検討され、近い将来、 Wn
についても研究が進展するものと期待される。
玄盤
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4カドヘリン・カテニン接着機構とカテニン分解機構の関係
私はこれまでカドヘリン・カテニン複合体による細胞間接着機構について、 主
に αカテニンの機能解析を中心にして研究を進めてきました。ここでは最近進めて
いる βカテニンの機能解析に必要な実験系の開発について紹介させていただきます。
そして、何故細胞間接着機構の研究者が全く関係がないように思われるタンパク質
分解の研究班に入れていただくことになったのか、理解していただきたいと思 って
おります。
αカテニンと βカテニン
αカテニンは、細胞接着分子力ドヘリンの結合因子 として単離されたヴインキュ
リンと相向性を示す、分子量 102kDの細胞質因子です。ヴインキュリンは細胞
間及び細胞基質問接着部位に濃縮し、カドへリンやインテグリンなどの細胞接着分
子とアクチン系の細胞骨格系との相互作用に必要と考えられています。最近、 αカ
テニンもヴインキュリンと同様カドヘリンとアクチン系の細胞骨格との相互作用に
おいて機能し、カドヘリンの細胞接着性の調節や上皮細胞における接着装置複合体
の形成に機能 していることが示されました。 β カテニン(ショウジョウバエで、の相
同分子はアルマジ ロ〉も αカテニン同様カドヘリン結合因子として単離された分子
量 90kD前後の細胞質因子です。アルマジロは、 当初セグメントポラリティー遺
伝子のーっとして単離され、 Wntシグナルの細胞内伝達に機能すると考えられて
いました。最近、ショウジョウパエにおいてアルマジロはショウジョウバエカドへ
リンと複合体を形成して細胞間接着においても機能しうることが、また脊椎動物に
おいて βカテニンは W ntシグナルの細胞内情報伝達においても機能しうることが
示され、動物種を越えて異なった二つの機能を果たしていると考えられるようにな っ
てきました。現在、カドヘリン分子 C末のカテニン結合領域に βカテニンが直接結
合し、さら に βカテニンの N末付近の領域に αカテニンが直接結合することにより
5
8
-
カドへリン・カテニン複合体が形成されることが明らかにされています。
βカテニンの分解機構
近年、 βカテニンタンパク質の分解機構が非常に大きな注目を集めています。
これは、 βカテニンの安定化が、 Wntシグナル伝達機構だけでなく、ヒトの発癌
においても重要な役割を果たすことが示されてきたからです。細胞質に存在する β
カテニンは通常ユビキチン・プロテアソーム系により速やかに分解されています。
この分解には、 GSK3β とよばれる Wntシグナル伝達系に属する分子によって
βカテニンのアミノ末端近くの特定のセリン・スレオニン残基がリン酸化されるこ
とが必要です。近年、このリン酸化にはさらにアキシンと呼ばれる新規タンパク質
や癌抑制遺伝子である APCが関与していることが示されています。 Wntシグナ
ル伝達機構を持つ細胞において、 Wntのシグナルがその受容体(現在のところフ
リッツルドと考えられている〉を介して細胞内に伝わると、さらにディシェブルド
としづ細胞質因子を介して GSK3β を不活化すると考え られています。その結果
βカテニンのリン酸化は抑制され、カドヘリンに結合していない βカテニンも分解
されず安定に細胞質に存在することになります。細胞質の β カテニンはさらに LE
F-l/TCF (ショウジ ョウノくエのホモログ はノfンゴリン 〉と呼ばれる HMGグ
ρ
ループに属する DNA結合タンパク質と複合体を作り核に移行し、さまざまな因子
の転写を調節することにより Wntシグナルが最終的に核に伝えられると考えられ
ています。このように、 βカテニンの分解の制御は Wntシグ ナル伝達系において
P
重要な役割を果たし ています。さらに、この分解に必要な β カテニンの リン酸化に
癌抑制遺伝子 APCが関与していることから、 βカテニンの分解制御は発癌にも関
わっていることが予想されていました。実際、ある種の癌細胞においては GSK
-3β によりリン酸化される βカテニン内のセリン又はスレオニン残基に変異が生
じ
、 βカテニンが安定に細胞質および核に発現していることも明らかにされていま
す
。 Wntシグナルを活性化すると細胞の接着性が変化するという報告もいくつか
5
9-
はなされています。しかし、カドへリンに結合した βカテニンはWntシグナルが
ない状況においても安定に存在し、プロテアソ ーム系による分解から保護されてい
ることから、当初細胞接着における βカテニンの機能を考える時この分子の分解機
構はほとんど無視して構わないと考えていました。
カドヘリン・カテニン系の機能解析
我々のグループは、 αカテニンや β カテニンがカドヘリンを介した細胞接着に
おいて果たす役割を解明したいと考え、研究を進めています。接着関連分子の機能
解析を進めるためには、その分子を発現していない細胞に正常型や変異型分子を導
入、しそれぞれの形質転換細胞の表現型を調べることにより、最終的にその分子の
機能を明らかにするというのが常道です。実際、これまでカドへリンを発現してい
ないマウス L細胞に正常なカドヘリンやその変異型分子を発現させることにより、
カドヘリンの機能解析が進められました。同様にして、 αカテニンを発現していな
いヒト癌細胞に正常な αカテニンやその変異型分子を発現させることにより、 αカ
テニンの機能についても解析が進んできました。しかし残念なことに、 β カテニン
の欠損細胞については現在のところ報告がありません。唯一知られているのは分子
の一部が欠損した β カテニンを発現しているヒト癌由来の細胞株ですが、これは完
全な β カテニン欠損細胞でないうえに細胞の扱いが難しいため、解析には適してい
ません。 βカテニンの E S細胞におけるノックアウトについては報告がされていま
すが、そこから得られる βカテニン欠損怪は非常に初期の時期に致死となります。
また、致死以前の脹の内部細胞集塊からの βカテニン欠損細胞株の単離も試みられ
ているらしいのですが、あまり思わしくない結果であることが風の噂として伝わっ
てきています。ちなみに、ショウジョウパエにおいても卵の段階でアルマジロ (s
カテニン)を欠損させると卵の形態がむちゃくちゃになり、致死に至ることが報告
されています。実際、 βカテニンはある種の細胞の生存そのもに必須なのではない
かと個人的には疑っています。このような状況下で βカテニンの接着における役割
6
0
-
を解析するもう一つの方法として我々が αカテニンの機能解析に用いている Eカド
ヘリンと αカテニンの融合タンパク質の系が考えられます。数年前に我々は、 αカ
テニンをカテニン結合領域を除いた Eカドへリンに結合させた融合タンパク質をカ
ドヘリンを発現していないし細胞に導入すると、この分子は細胞接着分子として機
能できることを明らかにしました。現在もさまざまな領域に欠損を持つ α カテニン
を含む融合タンパク質を用いて αカテニンの機能解析を進め、 αカテニン欠損細胞
を用いた解析からは得られない多くの情報を得ています。そこで Eカドヘリンー β
カテニン融合タンパク質を作成し、それをマウス L細胞に発現させることにより β
カテニンの機能解析を行うことを考えたわけです。ここで、当初カドへリンを介し
た細胞接着には関係しないであろうと考えられた βカテニンの分解機構が、大きな
問題点として浮かび上がってきました。
変異型 βカテニンによる βカテニン分解機構の抑制
L細胞においては、カドへリンが存在しない場合、ユビキチン系を介して βカ
テニンが速やかに分解されてしまうことが報告されています。 Eカドへリンー β カ
テニン融合タンパク質を発現させた場合も、この融合タンパク質はやはり速やかに
分解されてしまいました。この分子を用いて β カテニンの細胞接着における機能解
析を進めるには、まず βカテニンの分解機構を理解し、それを限害する必要が生じ
ました。方法としては二つ考えられます。 一つは、融合タンパク質その物に変異を
加え分解されない形にすること。もう 一つは、 βカテニンの分解系を阻害して融合
タンパク質を安定化させることです。後者に関してはユビキチン系その物を破壊す
れば可能ですがその場合、細胞に与えるダメージが大きすぎるため、実際には使え
ません。先に述べたように、 βカテニン特異的な分解機構としては、 Wntシグナ
ル伝達機構とそれと共役して働いていると考えられるアキシン、 A P Cを介した分
解機構があります。これらの βカテニン分解機構を特異的に抑えられることが出来
るかどうかについては、この重点領域に入れていただいたおかげで、徐々に解析が
6
1
・
進みつつあります。その結果、ある種の変異型 βカテニンを用いることにより、正
常な βカテニンの分解を特異的に抑える方法が確立しつつあり、 Eカドヘリンー β
カテニン融合タンパク質を特異的に安定化させる可能性が見えてきました。しかし
ながら、この方法で融合タンパク質を安定させるだけでは β カテニンの機能解析は
進まないことが、これから述べる理由により明らかになりました。
Eカドヘリンー非分解型 βカテニン融合タンパク質
融合タンパク質を安定化させるもう 一つの方法である、融合タンパク質その物
を分解されない形にすることについては、これまでの分解機構の解析から、より簡
単に行うことが可能でした。つまり、分解に必要な GSK-3β によるリン酸化部
位を変異させる、または APCとの結合領域を欠損させることにより、容易に融合
タンパク質は安定化したのです。ところが、思いもかけない問題点が浮かび上がっ
てきました。まず、 GSK-3β によるリン酸化部位を変異させた融合タンパク質
を L細胞に導入すると、分子は安定に発現し，細胞表面にもでてくるのですが、細胞
の接触部位に均一に局在するのではなく、多くの小さな凝集体を作ったのです。ま
た、このような融合タンパク質を発現した L細胞は全く細胞間接着活性を示しませ
んでした。その細胞を APC抗体により染めてみたところ、その凝集体の局在は A
P Cの局在と完全に一致しました。つまり、この融合タンパク質は分子内の APC
結合領域を介して A P Cに捕捉されてしまっていると考えられました。この APC
結合領域はカドヘリンとの結合にも使われている領域てすので、正常なカドヘリン・
カテニン複合体においては、 A P Cとの結合はカドヘリンによって妨げられている
と考えられます。
それならば A P C結合領域を削った融合タンパク質であれば機能するであろ う
と考えたのですが、ここで別の問題点が明らかになりました 。 APC結合領域を欠
損した融合タンパク質を L細胞に発現させた場合、予想どおり分子は安定化しかっ
細胞間接触部位に局在しました。しかし、何故かこの融合タンパク質を発現した細
6
2
-
胞は細胞間接着活性を示しませんでした。その原因として考えられたのは、元来 β
カテニンと結合すべき αカテニンが結合していないのではないかということでした。
そこで αカテニンの発現を調べたところ、驚いたことに、 αカテニンは β カテニン
に結合 できないのではなく、 αカテニンタンパク質その物が細胞にほとんど発現し
β 認識部位に変異
ていないことが分かったので-す。ちなみに、先ほどの GSK-3
を持つ融合タンパク質を発現している細胞でも、やはり αカテニンタンパク質はほ
とんど検出されませんでした。
αカテニンの安定化機構
αカテニンの細胞内での発現にカドヘリンが必要であることは、 L細胞にカド
へリンを発現させる 実験から示されていました 。元々 L細胞は多量の αカテニン m
RNAを発現しているのですが、タンパク 質の発現は少ししか検出されません。そ
こにカドヘリンを発現させると、カドヘリンの発現量に応じて αカテニン タ ンパク
質の発現量が増えるのです。これについては、 αカテニンは βカテニンと結合する
ことが知られていたので、まず発現したカドヘリンに βカテニンが結合して安定化
し、さらにこの安定化した βカテニンに αカテニンが結合 して安定化すると考えて
いました。しかし、先ほど述べたように、 Eカドヘリンー非分解型 βカテニン融合
タンパ ク質を発現させても(も ちろんこの融合 タンパ ク質には αカテニ ン結合領域
は含まれています)
、 αカテニンタンパク 質の発現量が増大しないことが示されま
した。つまり、 単に βカテニンが存在するだけでは αカテニ ンは安定化できないこ
とが示 された訳です。実はこのことは、 Wntシグナル機構を活性化し βカテニン
の発現量が上が っても αカテニ ンの タンパク量 は増大しないことからも 予測する べ
きことでした。ここで、これまで解析が進んできた βカテニンの分解機構だけでな
く
、 αカテニンの安定化についても解析の必要性が生じてきました。
6
3
-
αカテニン分解機構の可能性
αカテニンの安定化においては、 αカテニンの分解を抑制する可能性と、 αカ
テニンタンパク質の合成を促進している可能性が考えられます。逆に言えば、カド
ヘリンが存在しない場合には αカテニンタンパク質が合成された後に速やかに分解
されている可能性と、 αカテニンのタンパク質合成その物が抑制されている可能性
が考えられます。この点については今後の検討が必要ですが、 αカテニン分子内に
タンパク質分解に関与すると考えられる PEST配列が存在することから、おそら
くはカドヘ リンが存在しないと αカテニンは分解されてしまうのであろうと考えて
います。その分解機構については今の所全く分かっていません。ただ予備的実験の
結果から、 αカテニンの分解にはプロテアソーム系は関与していないであろうこと
が示唆されています。最初に述べてきたように、 βカテニンの分解機構は Wntシ
グナル伝達機構および発癌機構に重要な役割を果たしていることが示されています。
αカテニンについては、その分解機構が何らかの生理的な役割を果たしている可能
性については、 これまでのところ何も示されていません。カ ドへリ ン ・βカテニ ン
と複合体を作らない αカテニンは不要であるから分解されてしまうのか、それとも
αカテニンの分解も βカテニンの分解と同様何らかのシグナル伝達に関与している
のか興味がもたれるところです。この点を理解するためには、 αカテニンの分解機
構の解析が必要になります。この解析は同時に、 αカテニンを安定に発現させる方
法を明らかにすると考えられ、先に示した Eカドヘリンー βカテニン融合タンパク
質の系と合わせることにより、 βカテニンの機能解析にも繋がると考えています。
最後に
以上、 βカテニンの機能解析を進めるために始めた研究が βカテニンの分解機構の
研究に進んでいった過程と、混沌とした βカテニンの機能解析の過程で αカテニン
の安定化機構と いう新しい問題点が提起されてきたこと、を理解していただけたの
ではなし 1かと思いま す。近年、本特定領域研究に属する多くの班員の方々の研究を
6
4
-
中心に、タンパク質の分解機構についての理解が非常に深まりつつあります。その
中で、ここでお話ししたような接着関連因子など分解される側の構造タンパク質か
らの解析を進めること は
、 蛋白質分解が生体内で果たす役割をより深く理解する糸
口になるのではないかと期待しています。 (京大・医・分子細胞情報
6
5
-
永沸j昭良 〉
(6) トピックス
1ユビキチン様蛋白質 NEDD8による c
u
l
l
i
n
/
C
d
c
5
3
pfamily
蛋白質群の新しい修飾システム
ユビキチ ンと構造的に類似した蛋白質群の存在は以前から知られていましたが、
ユビキチンープロテアソーム系の華々しい研究の進展とは対照的に、それらの生物
学的意味は殆ど理解されていなく、世間の注目を浴びることも多くはありませんで
した。しかしながら、 19 9 7年に晴乳動物ユビキチン様蛋白質の 一つである
SUMO-lが
、 RanGAPlの翻訳後修飾を行うことによって核輸送系を制御しているこ
と (1)
、 SUMO-lの出芽酵母ホモローグである Sm
t
3
pの修飾、ンステムは、新しいEl
様蛋白質 (Aoslp
/Ub
a
2
pヘテロ ダイマー〉と E2
様蛋白質 (
Ubc9p) によって構成され
ており、従来のユビキチン経路とは全く独立して機能すること (2)、が明らかに
されると、ユビキチン様蛋白質が一躍脚光を浴びるようになりました。ユビキチ ン
による基質蛋白質の修飾は、その C末端のグリシン残基 (Gly76)を介して行われま
a
u等の他のユビキチン様蛋 白質にもこのグリシン残基は保
すが、 NEDD8、UCRP、 f
存されています。そこで、当然湧いてくる疑問が、 SUMO-l以外のユビキチン様蛋
白質も修飾分子として機能するか、また、真核生物には何種類のユビキチン関連経
路が用意されているかということです。
NEDD8
修飾システムの発見
筆者らの研究室では ヒト 完全長cDNA
バンクを作製し (3)、ウサギ網上赤血球
ライセート中で翻訳合成後、翻訳産物を一次元、もしくは二次元電気泳動にかけて、
分子量と等電点を測定すると共に、新しい翻訳後修飾を探索しておりました。そん
な中、ヒト [35S]-NEDD8をウサギ網状赤血球ライセート中で翻訳合成後、SDS-PAGE
によって翻訳産物を分離した際に、遊離型のヒト [
3
5
S
]・NEDD8 (分子量8kDa) に加
6
6
-
n
えて、分子量100、 66、30 kDa
のバンドが出現すること、そして更に SDS-PAGE前
の還元剤処理によって、 66、30kDaの二本のバンドは消失することを見い出しまし
た。現在、ユビキチン経路の E1、 E2、及び一部のE3は、ユビキチンとチオエステ
ル結合(還元剤感受性)を形成し、基質蛋白質はユビキチンとイソペプチド結合
(還元剤非感受性)を形成することが明らかとなっ ています 。従って、この実験結
果から、 NE
DD8はユビキチ ンの様な修飾分子として機能することと、NEDD8に対す
るE1、E2様蛋白質と基質蛋白質(つまり NEDD8修飾システム)の存在が予見されま
した。そこで筆者らは、この NEDD8修飾システムを明らかにするために、
GST
NEDD8アフィニティークロマトグラフィーを行い、ウサギ網状赤血球ライセー
トから NEDD8と結合する蛋白質群の精製を試みました。アフィニティーカラムから
の溶出は還元剤 (
DTT
) と還元型グルタチオン(リガンドが溶出〉の二段階で行い、
NEDD8と還元剤感受性の結合を形成する蛋白質と、還元剤非感受性の結合を形成す
る蛋白質を別々に溶出しました。精製された蛋白質の音防子アミノ酸配列を決定して、
その情報をもとにヒト cDNAライブラリ ーか らスクリーニン グを行なった結果、以下
に示すNEDD8
修飾システムの構成因子を同定することに成功しました。
(
i
)NEDD8
活性化酵素 (E1様蛋白質) :APP-BP1とhUBa3のヘテロダイマーであ
り、各々はE1のN末端と C末端領域に高い相同性を持っていました。 APP-BPlは既知
の蛋白質であり、家族性ア jレツハイマー病の原 因遺伝子の一つであるアミロイド前
駆体蛋白質 (βAPP) の細胞内ドメインと相互作用する蛋白質として単離されてい
ます (4) 0 hUba
3
はDNA
データノくンク中の酵母Uba
3
pと高い相同性を示しました。
APP
BP1/h
Uba3ヘテロダイマー中の hUba3が
、 NEDD8とDπ感受性の結合を形成しま
した。 (
i
i
)NEDD8
結合酵素 (E2様蛋白質) :出芽酵母E2ファミリーの中の Ubc12pと
高いホモロジーを持っており (hUbc
12と命名〉、 NEDD8とU汀感受性の結合を形成
しました。 (
u
i
)c
u
l
l
i
n
4
A:c
u
l
l
i
n
!
Cdc
53pファミリー(後述)の一員である ω
l
l
i
n
4
A
のC
末端領域が NEDD8とDTT非感受性の結合を形成し、その結合様式から c
u
l
l
i
n
4
Aは
NEDD8の基質蛋白質であることが示唆されました。また、 一分子のNED
D8の付加が
6
7
-
c
u
l
l
i
n
4
Aに対して起こり、ユビキチンのような多重鎖の形成はウサギ網状赤血球ラ
i
)、(
i
i
)、(
i
u
)の因子は全てユビキチン、
イセート中では観察されませんでした。 (
SUMO
lとは結合しなく、 NEDD8に特異的であり、その結合には NEDD8のC末端の
グリシン残基(ユビキチンの Gl
y76に相当〉が必須でした。
以 上 の 実 験 結 果 と ユ ビ キ チ ン 経 路 と の 類 似 性 か ら 考 え て 、 NEDD8が
APP-BPl
/
h
Ub
a3ヘテロダイマー (El様蛋白質)よって活性化されて、 hUbc12(E2様
蛋白質)を経て基質蛋白質である ωl
lin-4A
に転移される新しいユビキチン関連経路
の存在が強く示唆されました。
真核生物に普遍的である NEDD8
修飾システム
筆者らは晴乳動物の系を使って NEDD8修飾システムの存在を明らかにしました
が (5)、出芽酵母についてもユビキチン様蛋白質Rublpが新しいEl様蛋白質、 E2
様蛋白質を経て Cdc
53p (
c
u
l
l
i
nホモロ ー グ)を修飾することが報告され (
6、 7) 、
驚くことに RublpのEl、E2様蛋白質はNEDD8のそれらのホモローグでありました。
a
b
i
d
o
p
si
s
) でも、 Au
x
i
n (植物ホルモン〉に応答しなく正常
また、以前から植物(Ar
な発育ができない変異株の原因遺伝子としてAXRl (APP-BPlホモローグ)が単離さ
3pホモローグと共に、植物 Rublpホモロー
れていましたが、 AXRl蛋白質は植物Uba
グの活性化に関与していることが報告されました(8) 0 NEDD8とRublpは高い相
向性を持っており (59%同一アミノ酸〉、 NEDD8
/R
ublp
修飾システムは、晴乳動物、
植物、酵母と広く保存され、 真核生物に普遍的なシステムだと考えられます。
/R
ublp
これらのことから、真核生物には、ユビキチン、 SUMO-lβmt3p、NEDD8
といった修飾分子のために、少なくとも 3種類の独立したユビキチン関連経路が存
在していることが明らかとなりました。また、最近水野らによって、ユビキチンと
相向性を持たない蛋白質が修飾分子として機能し、ユビキチン経路に類似した独 自
の修飾システムを持つことが示されて (9)、これら修飾分子の多様性が注自され
ています。
6
8
-
NEDD8
修飾システムの基質である c
u
l
l
i
n/
Cdc53pf
a
m
i
l
y蛋白質群
筆者らは、 NE
DD8
修飾システムの基質蛋白質として c
叫l
加4A
を同定しま したが、
-l、之、 3、-4A
、-4B、・
5) 、出芽酵母では
現在、ヒトでは少なくとも 6種類 (CUL
3種 類 (CUL
Ncdc53、-B、 -C) のc
u
l
l
i
n
が存在することが、 DNAデータベースでの
検索結果から明らかとなっています。c
u
l
l
i
nにおける機能解析は出芽酵母Cdc53p (
ヒ
l
l
i
n
l，こ相当 〉で最も進んでおり、 Cd
c
53pは
、 Skp旬
、 Cdc34p(
E
2
)、Fbox
蛋
トではω
白質 (
Cdc4p、Gロ
旬、 Met30p等〉と複合体を形成して、ユビキチン系のE3として機
能することが明らかとなっています。この E3複合体は SCFと呼ばれ、 CDKインヒビ
S
i
c
1p) 、p
r
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RC(
p
r
e
r
e
p
l
i
c
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i
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ecompl
ex) の形成に関与している Cdc
句、酵母 Gl
ター (
サイクリン (Cln旬、同2p)等を選択的に認識して、蛋自分解による細胞周期進行制
l
i
n
2においても、日ong
加B、E
longinC、 pVHL
御を行っています(10)。ヒト cul
(
癌抑制遺伝子産物〉 と複合体を形成していることが報告されており、 pVHLは細胞
u
l
l
i
n
sに関
周期からの離脱に関与していることが示唆されています (1 0) 。他の c
してはその機能は不明でありますが、最近cu
l
l
i
n
4
Aに関しては乳癌細胞で高頻度に
遺伝子増幅もしくは過剰発現がおこっていることが報告されて、腫療形成にその機
能が深く関わっていることが示唆されています(11) 。このように c
u
l
l
i
n
sは細胞
周期進行を中心に幅広い現象を制御していると推測されますが、 筆者らの研究グルー
l
i
n
4
A.以外のω
l
l
i
n
sもNEDD8による修飾を受けるかどうかを検討しました。
プは次に cul
その結果、ウサギ網状赤血球ライセート中では、ヒト c
u
l
l
i
n
・
1、
・2、3、-4B、
・5が い
。
ずれも NEDD8による特異的な修飾を受ける ことが明らかとなりました(投稿中 〉
ul
l
i
n
sの活性調節を通じて、多様な現象を
従って、 NEDD8修飾システムは、恐らく c
制御していることが推測されます。
NEDD8
修飾システムの重要性
NEDD8による基質蛋白質の修飾は、真核生物にとってどの程度の重要性を持っ
ているので しょうか?ハムスターの温度感受性変異株t
s
4
1は
、 非許容温度下では肌明
6
9
-
に入ることなく、 S期を繰り返すという表現型を示しますが (1 2)、この温度感
受性は、 NEDD8活性化酵素である APP-BP1遺伝子の変異によるものであると 言われ
ています (1 3) 。また、分裂酵母の hUBa3ホモローグは生存に必須な遺伝子でし
た(筆者ら未発表データ)。植物においては、先述したように APP-BP1ホモローグ
(AXR1) 遺伝子の変異株は植物ホルモン Auxinに応答しなく、正常な発育ができな
DD
縮性化酵素 (APP-BP1/hUba3ヘテロダイマー〉
くなります(8)。このような NE
u
l
l
i
n
s等の基質蛋白質がNEDD8による修飾を受けなくなった
の変異株の表現型は、 c
結果、基質蛋白質の機能が十分果たせなくなったために生じたと推測され、 NEDD8
による修飾の重要性が伺えます。
おわりに
NEDD8
/R
ub1p
修飾システムは、その構成因子が明らかとなったばかりでありま
す。将来、基質に対する NEDD8
化の分子レベルでの効果や、 NEDD8化が何のシグナ
ルを感知して、どの様なタイミングで起こるかが明らかにな って行くと思われます。
現在ユビキチン経路は、E3や基質蛋白質におこるリン酸化によって調節を受けてい
ることが知られていますが、今後NEDD8による ω
l
l
i
nの修飾はユビキチン経路の新し
い制御機構としても、更に注目を浴びていくだろうと思われます。
“本研究は東京都臨床医学総合研究所の川崎博史先生(現 ・横浜市立大学木原生物
学研究所)、田中啓二先生との共同で行なわれました。"
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Abe，
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(ERATO加藤たん白生態プロジェクト:逢坂文男〉
7
1
-
(7)海外留学中研究者からの最新情報
ウィーンでサイエンス_，，" Kimとはこうしたもの"
日本の一年がNHKの紅白歌合戦でくれるように、ウィーンではヨハン・シュト
ラウスのオペレッタ「こうもり」が音楽の都の一年を締めくくる。国立オペラ座で
は 9月から 6月のシーズン中は日替わりで毎日オペラやバレエが上演され、中でも
モーツアルトのオペラは人気が高く、
「フィガ ロの結婚J i
∞s
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n加 悦J iドン・
ジョバンニ J i
魔笛」等には一流の歌手が揃えられる。さらに、ウィーン・フィル
ハ ーモニー・オーケストラ の本拠地である楽友協会では:ClaudioAbbado、Lor
i
n
Maazel
、Riα訂 doMutiら著名な指揮者の下で定期的にコンサートが催され、クラシッ
ク音楽のファンならずともその演奏の質と音響効果に圧倒される。 1782年にモー
ツアルトとコンスタンツェが結婚式を挙げたシュテファン寺院はオース ト
リ ア最大
のゴシック寺院で、ウィーンの象徴として街の中心に位置している。現在IMPの所
出は、シュテファン寺院から徒歩二分のところに居を構えて
長を務める KimNぉ my
いる。英国出身の彼においては、ロンドンのLe
i
c
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s
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rs
q
u
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r
eでは石油で-も掘り当てな
い限りその周辺に住むことは不可能であったろうが、ウィーンでの彼のサイエンス
における数々の重大な発見は、彼をしてバルコニーからシュテファン寺院の塔を間
近に見る生活を可能にしたようである。
その Kim
が運営する IMP (R凶 紅 白 I
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mによってウィ ー ンの市街地に設立された基礎研究が目的
薬会社 Boe
の研究所で、現在約 130人 (テタニシャン 25人
、 PhDの学生 37人、ポ スドク
31人 〉によって構成されている。研究者に比べてスタッフの数が多く、研究のサ
ポート体制がし っかりしており、運営のための年間予算が約 15mドル とかなり潤
沢であることから見ても、研第環境としづ 意味ではEMBL
やICRFなどの他のヨーロッ
7
2
-
パの有名な研究所と比べても遜色はないように思われる。
研究グループは現在 12からなり、研究材料もヒトの培養細胞、マウス、チキ
ン、カエル、ハエ、線虫、酵母と多岐にわたり、それぞれの生物種の特徴を生かし
h
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中:
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)。私がボスドクとして所属する
た研究がなされている (
K加の研究室では最も単純な酵母を実験材料として用い、最も複雑な‘我々自身'
のことを知ることを目的に研究を行っている。現在のラボのメンバーは K加を 含め
16人(ポスドク 9人、学生 5人、テクニシャン 1人〉、合計 12カ国から集まっ
ていて、英語を母国語とするのは Kimとアメリカ人のポスドク l人だけなので、ラ
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、Arn
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、BrokenE
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ボでのコミュニケーションの手段として E
3種類が使われている。ラボの中で、はそれぞれのテーマが少しずつ重なっていて、
同じ部屋で実験しているのでお互いに議論しあい、刺激されることが多い。 Kim自
身ラボのメンバーの一つ一つの実験を把握しており、時には技術的なことまでアド
バイスしているほどなので、彼が議論の中心にいることが少なくないし、それは
品1
Pの所長になってからも変わらないようである。
阻 mは一度掘り当 てた油田に長く興味を持つことなく、常に次の油田を探してい
i
c
lの蛋白質分解がCdc34に制御されていることを
るようである。 CDKインヒビター S
遺伝的に示した後、彼の興味は HOの転写因子へと移り、娘細胞特異的に局在する
Ashl蛋白質を発見してからはサイクリンの蛋白質分解へ、更に APCを発見後の現在
は染色体分離の分子機構へと移っている。従って現在行われている研究テ ーマは主
に (1)ASHlmRNAの細胞内局在を決定する因子の同定、
明
、
(2) APC
活性制御の解
(3)染色体分離の分子機構の解明に分けられるが、古 いテーマほどそのテー
i
c
l及 びSFCについて働くものは 3年前に絶えていない。
マで-働く人数が減少し、 S
このようにK加の研究対象への興味は多岐にわたっているが、研究へのスタンスは
"
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yつ こ と
一貫 している。まず、生物普遍的な現象にこだわり、酵母特異的な (
には興味を持たない。研究課題に取り組む前に、常にそれが生命現象において重要
かを考える。サイクリンの分解が細胞周期の進行に重要でなければ、サイクリンが
7
3
-
ユビキチン化により分解されようとそれに関わる酵素を同定しようとはしなかった
であろう。生命現象に重要であっても、問題を解決する手段として偶然性に左右さ
れるようなアプローチはしないし (ye泊 t
のTwo-hybridスクリーニングは彼の嫌うア
プローチの一つ〉、アプローチの方法が見つからなければ、特にその問題にこだわ
ることはない。また、変異株を用いるのは野生型の蛋白質の機能を類推する手段に
留め、変異株の表現型自体の解析はしない。論文として発表された結果でも、正確
な実験結果に基づいた論理的な解釈がなされていなければ、必ずよりよい方法を用
いて実験を繰り返し、自らの仮説と整合性があるかを調べる、等々。
阻 mが発表する論文の評価に比して、 Kim自身の人柄に関して(特にアメリカで〉
あまり好意的な評判はないようである 。おそらくそれは、彼のサイエンスに取り組
む正直すぎる面ー他者の不正確な実験やそれに基づいた唆昧な解釈に対する容赦の
ない批判ーに起因するところが大きいと思われる。しかしながら、 K加のサイエン
スに対する厳しい姿勢は常に自分のラボのメンバーにも向けられているもので-あり、
彼は我々の書く論文の最も厳しいレフェリーである。また、ラボのメンバー自身も
Kimの批判をおおむね歓迎しているようで、ラボセミナーでも自分がスピーカーで
ない限りそれを楽しんでいる風でもある。
最後に Kimと格闘した末に得た筆者の研究成果を簡単に紹介しておく 。
細胞が効率よくサイクリン依存性のセリン/
スレオニンキナーゼ (CDK) を負に制御
する分子機構として、サイクリンのユビキチン化による蛋白質分解が 1991年に
c
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lGlo
包e
r (彼は現在IMPのグル ープリーダーの 1人 )らにより発見され、その
Mi
ユビキチン化に関する遺伝子がスイス人のStefanI
r
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e
r (彼は筆者のスキー友達で
あり、彼がドイツにポジションを持ってからもよく一緒にスキーに出かけている 〉
らによってクローニングされた。有糸分裂後期において M期サイクリンのユビキチ
ン化を促進すると考えられる蛋白質複合体(An
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gComplex，
APC) は
、
同時に分裂中期においては P
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l蛋白質のユビキチン化に伴う染色体分離に関与して
いることが、白naCohen-Fix (米、カーネギ研究所)らによって証明されている 。筆
74-
者は、博士研究員としてK加のグループに加わり、どのようにして同じ蛋白質複合
体 (APC) が異なった基質 (Pdsl、M期サイクリン)を識別し細胞周期の異なった
時期にそのユビキチン化を引き起こすのかという問題に取り組んだ。筆者は Pdsl蛋
W Dリピート蛋白質〉が必須で
白質の分解には APCの他に異なる因子Cdc20蛋白質 (
P
o
l
oキナーゼ〉が必須であ
あり、 M期サイクリンのユビキチン化には Cdc5蛋白質 (
ることを明らかにし、 APCの基質特異性がその共因子によって制御されていること
蛋白質と Cdc5蛋白質は、 APCの制御因子であるだけでな く
、
示した。さらに、 Cdc20
それ 自身が基質であることを発見し、 APCの活性制御を考える上で新たなコンセプ
トを提供した。 αc20蛋白質はAPCと直接結合し Pdsl蛋白質分解及び染色体分離に重
変異株が染色体分離に欠損があり M期中期で増殖を停止する
要であることは、 cdc20
変異株は、分裂酵母の c
u
t
変異株のような表
ことで明らかである 。それでは何故吋c20
によって負に制御さ
現型を示さないのであろうか?出芽酵母では細胞質分裂はCDK
れていると考えられていて、 cdc20変異株が M期サイクリンの分解にも欠損を持つこ
複合体自身が直接 M 期サイクリンの分解を行わな
とがその理由である。 APC-Cdc20
し1ことはAn
g
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r
i
k
aAm
on (米、ホワイトヘッド研究所)らによって示されているので、
一つの可能性として、 APC-Cdc20複合体が M期サイクリンの分解を負に制御する因
複合体の基質で子を基質として持つことが考えられる。 Pdsl蛋白質は、 APC-Cdc20
あることから、その候補と考えられるが、 cdc20pdsl二重変異株は細胞周期の M期後
期で増殖を停止し、依然として M期サイクリンの分解は行われないことが分かった。
現在我々は、 cdc20pdsl二重変異株の復帰変異株を取得することで、 M期サイク リン
の分解の負の制御に関わる APC-Cdc20複合体の新たなる基質を得ることを目指して
いる。そのような因子の同定はまた、なぜ細胞が常に染色体分離の後に細胞質分解
を行うのかを分子レベルで解明することへとつながると期待している。
(IMP、ウィーン、オース トリア:白山昌樹)
7
5
-
(8)掲示板コーナー
【シンポジウムの案内: 1】
第 13回 臨 床 研 国 際 カ ン フ ァ レ ン ス
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“ユビキチンとプロテアソーム:蛋白質分解の新しい世界"
期日: 1998年 11月 25日
，
.
.
.
.
，
.
.27日 (3日間〉
会場:日暮里サニ ーホール (東京都荒川区東日暮里 5-50-5)
主 催 : 東 京都臨床医学総合研究所(オーガナイザー:田 中啓二)
FinalProgram
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TEL: +81-(0)3-3823-2101(
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FAX: +81-(0)3-3823-2237
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“ぷろておりしす伝言板"
世に受け入れられない仮説も自由に発表できるコーナー 。
このコーナーでは、
技術的な問題への質問コーナーとしても利用して頂くと共に、回答コーナーを設け
対処したい。また新しい有用な情報があれば、班員に知らせたい。
“AAAス ー パ ー フ ァ ミ リ ー タ ン パ ク 質」 ホ ー ム ペ ー ジ 開 設 の お 知 らせ"
「ぷろておりしす」でもたびたび紹介させていただいている AAAファミリータ
ンパク質、 AAAプロテアーゼのインターネットホームページを開設いたしましたの
で、お知らせします。 AAAタンパク質については、ドイツ、チュービンゲン大学の
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hによ って、 国際版のAAAホームページが作られています が、その内容は
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の比較と系統樹が主体であり、入門的な記述や特に機能に関する記事 ・図
スーパーファ
版が不十分であることなどをカバーするためと、特に日本における AAA
ミリータン パ ク 質 の 研 究 の 発 展 を 願 っ て 設 置 し ま し た 。 ア ドレスは:
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です 。本重点の班員の方々にも多
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少なりとも関連する情報が盛り込まれておりますので、ご覧いただき、御意見をい
ただけましたらと思います。ホームページの 1ページ目にはAAA
スーノマーファミリー
タンパ ク質のイントロダクションがあり、これは民伍NUの「代表的AAAタンパク質
代表的AAA
タンパク質とその機能」では、プロテアソー
とそ の機能 」に続きます。 i
ム、メタロプロテアーゼ、膜融合、ペルオキシソームなどに関わる AAA
タン パ ク質
について概説しています o MENUには、このほか、出芽酵母のAAA
タンパク質、古
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のAAA
タンパク質、真正細菌のIAAA
タンパク質、総説、ミニレビ、ュ一、
細菌 (
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サイト、 シンポジウム・ワークショ ップなどの各ページへのリンクがあ りま
タンパク質に関する様々な話題について短く
す。このうち、ミニレビューではAAA
まとめたものを掲載していきますが、現在のところ、本誌 「ぷろておりしす」に掲
タンパク質に関連するものを編集担当者 の許可
載された ミニレビ、
ューの中から AAA
を得て転載しております。今後内容につきましては充実 していきたいと思います。
(小椋光:熊本大学・医)
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s)国際蛋白質分解委員会が発展的に解消
して 1PSになることが決定。 1999年 9月に第 1回国際会議を開催すると共に、会
長・運営委員などを会議参加者で決定する。それまでの臨時代表は、 Dr
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，NewYork
. 本書は本重点研究代表者である鈴木
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0月 に 東 京 で 開 催 し た 第 10回 1
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m 国際会議 (1COP)での主要講演者の総説を成書に編集
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1・
したものである。現在の蛋白質分解の世界が網羅的に整理されており、初心者のみ
ならずこの領域の研究者の座右の書として利用されるべき好書である。
(ぷろ ておりしす 事務局)
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. 本書は昨年徳島で開催された FAOBMB
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この会議の詳細については
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本誌第 2号p
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9の学会報告記を参照)の講演要旨を拡大して総説にまとめたものであ
る。本書は "Ph
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"ProteaesamdImmunology，
" "Proteasesand
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"の 4章から構成されており、最新の研究成果が網羅されている 。一読を勧
めたい。
(ぷろておりしす事務局〉
「
新聞・ニュースから」のコーナー案内
本重点ニュースでは「新聞・ニュースから」のコーナーを設けますので、新聞・
ニュース等において本重点研究班班員の記事が目にとまりました ら、自薦でも他薦
でも結構ですので事務局にお知らせ下さい。ご存知のように研究成果を 国民に還元
することは重要であります。研究概要を国民に広く知って頂くためには、研究成果
が新聞・ニュースなどのマスメディアに報じられることは、文部省にお いて強く推
奨されているところであり、また研究評価としても高く位置づけられています。従っ
て、本重点班員の活躍の指標ともなりますので積極的に新聞・ニュースに登場する
(ぷろておりしす事務局 〉
ことが期待されます。
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のフライ・ヴェ 1レ財団のの一ツ・ミュンヘン市の Z222
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O﹃丘四円。。E 玄包乞一四﹁︿3t氏の浄財を基金
を受賞した。同財団の司Z冨。一として、カリクレイン・キニ
ン 系とその関連分野の研究娠
ユZはテキサス 大学 一
ご 0 2司
ヘルス・サイエンス ・
セ ンタ一興を目的として股立された.
角田
一れた.
一に関連した研究業績が解備さ
一徳痛物質のキニン が生成する
一ことを苑見したことと、それ
一菌の感染局所において、この
一とキニン系に闘する研究.細
一菌感染におげるプロテア 1ゼ
一与することが知られている。
一前田教授の授賞理由は、細
一で、銀近では血圧維持にも闘
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﹃偶教授が 受賞し た。 一 は 、 生 依 内 で 察 痛 や 炎 症時の
間財団は、一九八八年、ドイ一浮腫を引き起こすシステム
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十五回国際キニン学会で、日
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須の﹃均関連遺伝子も特定
で酵素でタンパク質を分
構成成分を分解する過程が一の中に運び入れる。 この中
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栄華飢餓状態に陥ると、一進行には十四個の遺伝子が
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科学新聞
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第 2725号
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一 品昇 ・日本学術振興会特別
配恥一研究員らの研究グループが り込んで分解する﹁ヘテロ 命の永続性に関する新たな一もある。世界的に注目され
即 一 成 功。研究成果を二十四日 ファジー﹂に対し、自己の 発見で、非常に重要。これ一る発貝だろう。
中
8
3
-
タンパク質分解
(8)編集後記
“ぷろておりしす"は、特定領域研究「細胞内蛋自分解」のニュース誌であり、班
員聞の連絡・情報交換などを主目的に発行されているものでありますが、
「日本の
プロテオリシス研究の活性化を目指す」と言う意図も担って編集に取り組んでいま
す。今回は第 8号です。従来の重点研究、即ち特定領域研究 (A) は、減少の一途
を辿り、ミニ重点とも言うべき特定領域研究 (B) が大幅に増加する運命にあるら
しい。実際、平成 10年度の科研申請においては、特定領域研究 (B) に1
5
0を超え
る応募があったとのことである。特定領域研究 (B) は、十数名の小さな計画班員
のみで構成されるので、組織するのが手頃であることが応募が大幅に増加した要因
になったと思われる。しかし、問題点も少なくない。例えば、特定領域研究 (B)
には公募がない。このことは、日本の科学研究の将来を考えると、問題無しとは言
えなし、かも知れない。と言うのは、この制度が定着すると、 一つには実績中心主義
が横行し必然的に若い野性的な研究者の支援に障害をきたすことに繋がる。若い柔
軟な可能性に夢を託す研究の路を閉ざして、科学に未来があるであろうか?昨今の
生命科学研究には「金」がかかるのは事実である。文明の成熟は「時」と「金」を
無尽蔵に浪費した結果として成し遂げられるものであり、さしづめ生命科学は正に
成熟した文明の落とし子みたいなものである。実際、開発途上国に生命科学などが
発展した例はない。言い換えれば、独創性を育むには、可成りの金を溝に捨てる覚
悟が要るということである。管理型社会を投影した特定領域研究 (B) の世界が蔓
延するのに抵抗する手段はないものであろうか?本誌も特定領域研究 (A) が採択
されているからこそ、その存在基盤が保証されているのである。研究費の制限の故
に、犬も歩けば棒に当たる式の手法がサイエンスの常道として蔓延すれば、科学未
来は暗いものとなろう。何よりも、有望な若い研究者の育成に組離をきたしはしな
し1かとの危慎に襲われる。
“実力者"は、特定領域研究 (A) の継続に“政治力"
を発揮すべきではないであろうか?特定領域研究 (B) の充実に異議を唱える訳で
はないが、特定領域研究 (A) の没落を真撃に憂いたい。これは、本誌の継続性に
勤しむ編集子のみの嘆きであろうか?さて、最後に恒例により、投稿を呼びかけま
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す。日本語の原稿は細明朝体、英語の原稿はTim凶で‘作成し、 e
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84-
田中・川島〉
(10)発表論文の概要紹介
班員各位の研究進捗状況を把握する目的で随時発行(巻末添付)。いずれもオフセッ
ト印刷しますので、 1ページ一杯に巧く記載して下さい。但し、図書・総説は除き
原著論文に限定します。班員の自信作を数多く集めたいと考えていますので、
“
ぷ
ろておりしす事務局"に送って下さい。研究成果を班員相互に素早く伝達する必要
性からゲラ刷りの段階でも結構ですので、迅速に作成して頂きたいと考えています。
さて、今回この欄に班員以外の先生から掲載を依頼されました。本誌は本来、班員
相互の情報交換と相互扶助(?)を計ることを基本的な目的に発行していますが、
「日本の蛋白質分解研究」の裾野を開拓する主旨からも、班員以外の研究者達にも
送付していますし、これまでも班員以外の多数の方々よりミ ニレビ、
ュ 一等の執筆に
ご協力頂きました。従って、この「発表論文の概要紹介」の欄についても、 班員
以外にも広く門戸を解放したいと思っています。この欄への投稿は自分の研究を国
内津々浦々に宣伝する絶好の機会ですので、多くの「班員」および「蛋白分解研究
者」からの掲載原稿の提出を強く希望します。
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邸時の基質蛋白質を同定するために、 yeast twohybrid法に改良を加えた。 Caspasesは切断されて作ら
れた大小 2つのサプユニットが四量体となって活性型
酵素となるため、本法では両サプユニットを別々のプ
ロモーター制御下において発現させ、小サプユニット
をLexADNA 結合領域と融合させた。さらに yeast
内での酵素ー基質複合体の安定性を確保するために、
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てヒト胸腺及ぴマウス胎児ライブラリ ー をスクリーニ
ングすることにより、ゲルソリンを含む複数のクロー
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部位には casp回 e・3 の良い基質となる DxxD 配列が
1823，
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、"Two-Hybridzyme"と命名された。
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活性型 casp出 e・3 により切断され、ゲルソリンの切断
尚、本法は Science誌で紹介され(Science281: 1822・
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ンを得た。いずれのクローン由来蛋白質も invitro で
存在していた。このことは、本法の有用性を示してい
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