九州工業大学学術機関リポジトリ"Kyutacar"

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化学物質の生分解性評価における試験法の性能比較およ
びアニリン分解菌迅速検出法の開発に関する研究
茅島, 孝和
2013-09
http://hdl.handle.net/10228/5205
Rights
Kyushu Institute of Technology Academic Repository
博士学位論文
化学物質の生分解性評価における試験法の性能比較および
アニリン分解菌迅速検出法の開発に関する研究
平成 25 年 9 月
九州工業大学大学院生命体工学研究科
茅島孝和
目
第１章
緒
次
言 ·············································································· 1
１．１
生分解性試験の概要 ·························································· 1
１．２
化審法生分解性試験（OECD テストガイドライン 301C）の課題········· 3
１．３
研究目的········································································· 5
第２章
易生分解性試験の性能比較···················································· 7
２．１
背景および目的································································ 7
２．２
調査方法········································································· 8
２．３
調査結果········································································· 9
２．３．１
抽出されたデータ数 ················································· 9
２．３．２
植種源に関する解析 ················································· 9
２．３．３
植種源以外の試験条件の比較 ····································· 10
２．３．４
301C とその他の試験法との分解度の比較····················· 12
２．３．５
301C で生分解されにくい物質群の解析························ 17
２．３．６
下水処理場汚泥の分解活性のばらつき ························· 24
２．４
まとめ············································································ 25
Appendix 1
第３章
Search results of ready biodegradability test data ····················· 26
アニリン分解菌迅速検出法の開発··········································· 87
３．１
背景および目的································································ 87
３．２
実験材料および方法 ·························································· 90
３．２．１
活性汚泥および DNA 抽出 ········································· 90
３．２．２
菌株······································································ 92
３．２．３
プライマーおよびプローブ ········································ 92
３．２．４
qPCR の実施 ··························································· 95
３．２．５
MPN 法によるアニリン分解菌数の測定························ 97
３．２．６
３．３
BOD の測定···························································· 98
結果および考察································································ 98
３．３．１
プライマーおよびプローブの特異性 ···························· 98
３．３．２
α-Ad 遺伝子の相対コピー数とアニリン分解菌数との相関···102
３．３．３
α-Ad 遺伝子の相対コピー数とアニリン分解活性との相関···104
３．４
まとめ············································································106
Appendix 2
Results of the homology search for bacterial proteins with similar amino
acid sequences to that used for designing the primers and probe····107
第４章
今後の展望 ········································································119
４．１
301C 汚泥の改良における研究成果の活用方法························119
４．２
検討課題·········································································120
４．２．１
過去の試験結果との整合性 ········································120
４．２．２
アニリン以外の物質に対する影響 ·······························121
４．２．３
菌叢解析 ································································122
４．３
第５章
ロードマップ···································································122
総
括 ··············································································123
引用文献 ·······················································································125
公表論文 ·······················································································130
謝
辞 ··························································································131
第１章
１．１
緒
言
生分解性試験の概説
現在、日本で流通している化学物質は工業的に製造されているものだけでも
約 5 万種に及ぶといわれ、その用途や種類も多岐多様にわたっている。これら
化学物質の多くは私たちの生活をより豊かにし、また便利で快適な生活を維持
する上でなくてはならないものである。一方で、化学物質は製造、流通、使用
および廃棄という過程の中で、大気、水、土壌といった環境中に放出されるリ
スクがある。化学物質が環境中に放出された場合、熱分解、光分解、加水分解、
酸化還元等の物理化学的分解および微生物による生分解を受けるが、これらの
中で最も寄与が大きいのが生分解といわれている。環境汚染物質として知られ
るポリ塩化ビフェニル（PCB）、トリクロロエチレン（TCE）、ペルフルオロオク
タンスルホン酸（PFOS）に代表されるように、環境中で生分解を受けにくい化
合物（難分解性化合物）は長期間にわたり環境中に残留し、人の健康や生態系
に悪影響を及ぼす恐れがあるため、環境への影響を評価する上で化学物質が有
する生分解性を評価することは非常に重要である。
上記の理由から、世界各国の化学物質管理に係る法規制において、上市の前に生
分解性評価を行うことが義務付けられており、日本の化学物質の審査及び製造等の
規制に関する法律（化審法）においても生分解性評価が求められている。Table 1 に経
済協力開発機構（Organisation for Economic Co-operation and Development、OECD）の
テストガイドラインに採択されている試験法を示す。生分解性試験には目的に応じて
様々な種類があるが、化審法で要求される試験は易生分解性試験（ Ready
biodegradability test）の一つである 301C に相当する。易生分解性試験は、化学物質
で順化していない微生物を用い、かつ化学物質に対する微生物の割合が小さい条件
で行うため、この試験において生分解性が認められた化学物質は“易生分解性
（Readily biodegradable）”に分類され、環境中で容易に生分解されると評価される 1)2)。
1
Table 1 OECD Test Guidelines for evaluating the biodegradability of chemicals
Type
Guideline No. and Name
Ready
biodegradability test
301A
301B
301C
301D
301E
301F
310
DOC Die-Away Test
CO2 Evolution Test (Modified Sturm Test)
Modified MITI (Ⅰ) Test a
Closed Bottle Test
Modified OECD Screening Test
Manometric Respirometry Test
CO2 in Sealed Vessel Test
Inherent
biodegradability test
302A
302B
302C
304
Modified SCAS Test
Zahn-Wellens／EMPA Test
Modified MITI (Ⅱ) Test
Inherent Biodegradability in Soil
303
307
308
Simulation Test – Aerobic Sewage Treatment
Aerobic and Anaerobic Transformation in Soil
Aerobic and Anaerobic Transformation in
Aquatic Sediment Systems
Aerobic Mineralisation in Surface Water
Simulation Tests to Assess the Biodegradability of
Chemicals Discharged in Wastewater
Simulation test
309
314
Others
a
306
311
Biodegradability in Seawater
Anaerobic Biodegradability of Organic
Compounds in Digested Sludge
Applied in Chemical Substances Control Law (CSCL) of Japan.
易生分解性試験は生分解性評価のスクリーニング試験に位置づけられ、その簡便
さから世界各国の化学物質管理に係る法規制において広く実施されている。一方、本
質的生分解性試験（Inherent biodegradability test）、シミュレーション試験（Simulation
test）等は高次試験に位置づけられる。これらは、易生分解性試験において易生分解
性ではない結果が得られ、かつ、環境リスクをより詳細に評価する必要がある場合に
のみ実施されることが多いため、易生分解性試験に比べて実施例は少ない。以上のこ
とから、化審法で要求される 301C を含む一連の易生分解性試験は、化学物質の生分
解性を評価する最もポピュラーな試験法となっている。
2
１．２
化審法における生分解性試験（OECD テストガイドライン 301C）の課題
易生分解性試験では、下水処理場の活性汚泥や二次放流水、その他の環境試料
（河川水）等、試験データの利用目的に応じて微生物源（植種源）を選択できる試験法
が多い。一方、化審法における生分解性試験（301C）は特徴的に、ラボスケールで培
養された活性汚泥（301C 汚泥）の使用に限定される。301C 汚泥は、国内で唯一、著
者が所属する一般財団法人化学物質評価研究機構において調製し、化審法生分解
性試験を実施する全国の試験機関に供給している。
301C 汚泥の調製方法の概要を Fig. 1 に示す。試験法通知 3)に従い、年間 6 回、全
国 10 か所から下水処理場汚泥、環境水等（Fig. 2）を採集して等量混合し、グルコース
及びペプトンを栄養源とする合成下水（Synthetic sewage）を添加しながら約 1 か月間
培養したものを試験に供する。試験における使用期間は 2 か月間であり、使用開始後
も合成下水を添加しながら毎日管理を行う必要がある。これは、301C 汚泥のロット間
のばらつきを抑制し、かつ使用期間を通じて分解活性を一定に維持することを目的と
しており、試験の再現性ならびに過去に取得された試験データとの整合性を確保する
狙いがある。このため、化審法制定（1973 年）以来、301C 汚泥の調製方法について大
幅な変更はなされていない。
(a)
(b)
10 sources (Fig. 2)
・Mixing in same volume each
・Filtration (No. 2 filter)
Filtrate
←0.1% Synthetic sewage daily
・Cultivation at 25ºC for 28 d
301C sludge
Fig. 1. Preparation method (a) and visual appearance (b) of 301C sludge. Synthetic sewage is
prepared by dissolving glucose, peptone, and potassium dihydrogen phosphate in
dechlorinated water and adjusted at pH7.0±1.0.
3
Shinano river
Kiso river
Hiroshima bay
Lake biwa
Dokai bay
WWTP (plant B)
WWTP (plant D)
Yoshino river
WWTP (plant C)
WWTP (plant A)
WWTP：Wastewater Treatment Plant
Fig. 2. Sampling sites of sources for 301C sludge.
301C 汚泥の課題として、近年の環境浄化に伴い分解活性が過去と比較して低
下傾向にあり、過去の試験結果との不整合や試験成功率の低下が指摘されてい
る。また、他の試験法では生分解されても 301C では生分解されない物質（ビス
フェノール A、ペンタエリスリトール等）が報告されている 4)。この差が生じる
要因として、他の易生分解性試験で主に使用される下水処理場汚泥と比較し、
301C 汚泥は分解活性が低い可能性が指摘されており、国際的な試験データの相
互受け入れおよび環境リスク評価への影響が懸念されている。
上記より、平成 23 年度経済産業省委託研究化学物質安全確保・国際規制対策
推進等「化学物質の試験方法開発等」の検討委員会において、過去の試験結果
や他の易生分解性試験との関連性に配慮しながら、中長期的に 301C 汚泥の調製
方法を根本的に見直すことが望ましいとする専門家の意見が示されている 4)。
4
１．３
研究目的
前述の背景から、本博士論文研究では、将来的に 301C 汚泥の改良を行うための
基礎研究として次の二つの研究（研究Ⅰ及びⅡ）に取り組んだ。
第２章（研究Ⅰ）では、易生分解性試験の性能比較を行った。国際協調の観点か
ら、301C 汚泥を改良する上で、301C の特性や他の易生分解性試験との性能の違い
を理解する必要がある。これまで、いくつかの物質について 301C で得られた試験デ
ータと他の易生分解性試験で得られた試験データを比較した例はあるものの、網羅的
に解析して試験法間の性能の違いを明らかにした報告はない。
そこで、国内外で取得された易生分解性試験データから、301C と他の易生分解性
試験の両方の試験データがある物質を網羅的に抽出して比較することにより、具体的
にどういう物質群で試験結果に違いを生じやすいか等、試験法間の性能の違いにつ
いて調べた。
第３章（研究Ⅱ）では、301C 汚泥の改良に役立つ新たなツールとしてアニリン分解
菌迅速検出法の開発を行った。301C 汚泥の改良においては、試験の成功率を高め
るため、使用期間を通じて分解活性を安定に維持できる培養条件を確立することが期
待される。301C を含む多くの易生分解性試験では、植種源の有効性を評価するため
の指標物質としてアニリンを使用し、アニリン分解度が一定の基準を満たすことが求め
られる（301C の場合：生物化学的酸素要求量（BOD）に基づく分解度が 7 日後 40%以
上かつ 14 日後 65%以上）。使用期間を通じてこの基準を満たす最適な培養条件を確
立するためには、301C 汚泥が有するアニリン分解活性をリアルタイムにモニターし、そ
の変動要因を明らかにする必要がある。しかし、従来の BOD 測定では 2 週間の培養
を必要とすることから、アニリン分解活性をリアルタイムに評価することができない。また、
これまでの研究において、大内山らは最確数法（Most Probable number (MPN) 法）に
より求めたアニリン分解菌量と BOD 測定で得られる誘導期（BOD 曲線の立ち上がり）
に相関があることを明らかにしたが、MPN 法は培養に 1 か月以上かかり、操作も煩雑
である 5)。
5
そこで、活性汚泥が有するアニリン分解活性を迅速かつ簡便に評価することを目的
として、アニリンの生分解に関与する酵素のうち、脱アミノ反応を触媒する酵素の一つ
である α-アニリンジオキシゲナーゼ（α-Ad）をコードする遺伝子に着目し、活性汚泥中
の多様なアニリン分解菌を網羅的に検出する定量的 Real-Time PCR 法（qPCR 法）の
開発を行った。
第４章では、第２章および第３章に記述した、易生分解性試験の性能比較および
アニリン分解菌迅速検出法の開発で得られた研究成果を踏まえ、301C 汚泥の改良に
向けた本研究成果の活用方法、今後の検討課題およびロードマップを示した。
第５章では、以上の内容を総括した。
6
第２章
２．１
易生分解性試験の性能比較
背景および目的
2013 年 4 月現在、OECD テストガイドラインでは、易生分解性試験として 301
シリーズ（A～F）の 6 試験と 310 の計 7 試験が採択されており、化審法に定め
る試験法は 301C に相当する（Table 1）。これらの試験法は同じエンドポイント
（易生分解性の有無）を与える試験法としてラインナップされているため、国
際的な試験データの相互受け入れにおいて横並びに取り扱えることが望ましい。
しかしながら、各試験法は、分解度の測定原理、適用可能な化合物の種類、試
験物質濃度、微生物濃度、利用可能な植種源など、試験条件がそれぞれ異なっ
ており、四級炭素を有する化合物については試験法間で結果が異なることが報
告されている（Table 2）。また 301C では、合成下水により順化培養を行った活
性汚泥（301C 汚泥）を使用するため、他の試験法と比較して生分解を受けにく
い物質が多いことが指摘されており、実際に、Table 2 に示す四級炭素を有する
化合物については、いずれも 301C で易生分解性を示す結果が得られていない。
以上より、将来的に 301C 汚泥の改良を行うためには、301C の特性と他の易
生分解性試験との性能の違いを理解し、国際調和に配慮した培養条件を確立す
ることが望ましい。しかし、前述の四級炭素を有する化合物のように試験法間
で結果が異なる物質はいくつか報告されているが、その結果の乖離が試験法間
のどういう違いで生じるか、明確な原因は明らかにされていないのが現状であ
る。また、多種多様な化学物質に対する生分解能の違いを理解するためには、
試験データの網羅的な解析が必要と考えられる。
そこで本章では、国内外で取得された易生分解性試験データを検索できるデータ
ベースを活用し、301C と他の易生分解性試験の両方の試験データがある物質を網羅
的に抽出した。そして、両試験法で得られた試験結果を比較することにより、生分解能
の違いに影響を与える試験条件の違い、試験結果に差を生じやすい物質群の特定な
7
ど、301C と他の易生分解性試験との性能の違いを明らかにした。
Table 2 Results of ready biodegradability test on quaternary carbon compounds
301
CAS No.
Name
310
A
B
C
D
E
F
80-05-7
Bisphenol A
N.D.
No
No
No
N.D.
Yes
N.D.
115-77-5
Pentaerythritol
N.D.
N.D.
No
N.D.
Yes
N.D.
Yes
80-54-6
2-(4-tert-Butylbenzyl)
propionalaldehyde
N.D.
N.D.
No
N.D.
N.D.
Yes
N.D.
Yes: Readily biodegradable
２．２
No: Not readily biodegradable
N.D.: No data
調査方法
301C とその他の易生分解性試験の両方の試験データがある単一化合物を調査
対象とした。データ収集の方法は下記のとおりである。
国際的に利用可能な複数のデータベースから化学物質の性状及び有害性デー
タを一括して検索できる eChemPortal（URL: http://www.echemportal.org/）および
IUCLID CD-ROM（Edition 2 - 2000）を情報源とし、その他の易生分解性試験デ
ータを収集した。eChemPortal で検索した結果、情報源となるデータベースは
ECHA CHEM（European Chemicals Agency’s Dissemination portal with information
on chemical substances registered under REACH）および OECD SIDS IUCLID
（OECD
Existing Chemicals Screening Information Data Sets（SIDS）Database）の 2 種類で
あった。301C のデータに関しては、独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE）
が提供する J-CHECK（http://www.safe.nite.go.jp/jcheck/top.action?request_locale=ja）
を情報源とし、詳細な情報については試験報告書を調査した。
8
２．３
調査結果
２．３．１
抽出されたデータ数
Appendix 1 に抽出されたデータを示す。データベース検索の結果、抽出され
たデータ数は合計 805 であった。なお、同一物質で複数の試験データが存在す
るケースがあるため、物質数としては 441 となる。
ただし、下記①～⑤に該当するデータは、現行法とは異なる試験条件で実施
されている、試験結果の信頼性が乏しいなど、試験法間の性能を比較する上で
障害となる可能性があるため、解析対象から除外した。データ除外後、解析対
象としたデータ数は 467（物質数 315）となった。
① 古い試験法（301A：修正 AFNOR 法、301B：Strum 法）で実施されたデータ
② 試験結果の信頼性が低いデータ（Reliability が 3（not reliable）または 4（not
assignable）に該当するデータ）
③ 植種源が不明もしくは不明瞭なデータ
④ 試験物質で植種源を順化したデータ（OECD テストガイドラインで易生分
解性試験における順化は認められていない）
⑤ 試験法で規定された培養期間（28 日間）で実施されていないデータのうち、
易生分解性評価に影響する恐れのある長いもしくは短い培養期間で得ら
れたデータ
２．３．２
植種源に関する解析
Table 3 に植種源ごとのデータ数（物質数）を示す。301C 以外の易生分解性試験で
使用されている植種源は、下水処理場汚泥が大半（約 90%）を占めることが分かった。
301C 以外の試験では、データの利用目的に応じて植種源の選択が任意である
（OECD テストガイドラインの記載が曖昧な試験法もある）が、二次放流水や環境水な
どは微生物量が少なく下水処理場汚泥に比べて生分解され難いため、利用頻度が少
ないと考えられる。
9
Table 3 Number of data by inocula source
Number of data by inocula source
Test
Method
a
WWTP
sludge
WWTP
secondary
effluent
Others
(environmental
water etc.)
Total
301A
37
2
6
45
(39)a
301B
114
1
0
115
(103) a
301D
121
15
3
139
(115) a
301E
40
14
7
61
(49) a
301F
92
0
0
92
(83) a
310
15
0
0
15
(14) a
Total
419
32
16
467
(315) a
The numbers in parentheses show the numbers of chemical substances contained in total data.
２．３．３
植種源以外の試験条件の比較
Table 4 に易生分解性試験における植種源以外の主な試験条件の比較を示す 1)2)。
試験結果に大きな影響を与える因子として、植種源の種類以外に、唯一の炭素
源となる試験物質（化合物）の濃度と、試験系に添加する植種源の濃度（微生
物の濃度）の二つの濃度条件が挙げられる。しかし、301A、301B、301D および
301E の濃度条件には範囲があり一定ではない。また 301F については、微生物活
性が試験物質による阻害を受けないより低い濃度で試験を実施することが認め
られているため、化合物濃度は必ずしも一定であるとは限らない。さらに 310
については、試験濃度が溶存有機炭素濃度で規定されているため、化合物濃度
としては炭素含量に左右されて一定ではない。易生分解性試験の中で唯一、301C
10
のみが化合物濃度（100 mg l-1）および微生物濃度（30 mg l-1）が一定である。実
際に、抽出したデータを確認したところ、301C 以外の試験法では試験濃度（化
合物濃度）が一定ではないことが分かった（Appendix 1）。
このように試験法によって濃度条件が必ずしも一定ではなく、またデータベ
ースにおいて 301C 以外の試験法における微生物濃度は不明である。さらに、２．
３．２で述べたように、301C 以外の試験法では植種源の選択が任意であること
から、一概に、どの試験法の生分解能が高く、どの試験法の生分解能が低いと
する断定的な結論を導くことは避けるべきであろう。
Table 4 Test conditions of ready biodegradability tests
Test
method
Measurement
for evaluating
biodegradability
Test
Inocula
concentration
concentration
10–40
≤ 30
(mgDOC l-1)
(mgSS l-1)
10–20
≤ 30
301A
DOC removal
301B
CO2 evolution
301C
BOD
301D
BOD
2–5
0.05–5
(mg l-1)
(ml l-1)
301E
DOC removal
10–40
0.5
(mgDOC l-1)
(ml l-1)
301F
BOD
100
30
310
CO2 evolution
-1
(mgDOC l )
(mgSS l-1)
100
30
-1
(mg l )
-1
(mg l )
(mgSS l-1)
(mgSS l-1)
20
4
(mgDOC l-1)
(mgSS l-1)
11
Test
period
(d)
Temp.
(ºC)
Suitability for compounds
Poorly
soluble
Volatile
Adsorbing
28
22 ± 2
－
－
＋/－
28
22 ± 2
＋
－
＋
28
25 ± 1
＋
＋/－
＋
28
20 ± 1
＋/－
＋
＋
28
22 ± 2
－
－
＋/－
28
22 ± 2
＋
＋/－
＋
28
20 ± 1
＋
＋
＋
２．３．４
301C とその他の試験法との分解度の比較
２．３．３で記述したように、各試験法における濃度条件が必ずしも一定ではないた
め、濃度条件から試験法間の性能の差を論ずることは難しい。一方で、濃度オーダ
ーに顕著な差はないと見た場合に、２．３．２で明らかとなった、301C とその
他の易生分解性試験における植種源の違い（ラボスケールで順化培養された
301C 汚泥と下水処理場汚泥の違い）において何らかの傾向が認められれば、試験
法間の性能の差が植種源の違いに特徴付けられる可能性がある。そこで、301C
以外の易生分解性試験について下水処理場汚泥を使用したデータ（283 物質、419
データ）に絞り込み、301C で得られた分解度とその他の易生分解性試験で得られた
分解度との比較を行った。
易生分解性試験において無機化の指標となる分解度は、BOD に基づく分解度
（301C、D 及び F）、CO2 の発生量に基づく分解度（301B 及び 310）および溶存
有機炭素（DOC）の除去に基づく分解度（301A 及び E）の 3 種類に分類できる
（Table 4）
。情報源において、分解度（%）は個別の値もしくはそれらの平均値
で示されており、単一の値が記載されている場合は平均値である（Appendix 1）。
試験法間の分解度の比較において、データごとに固有のプロットを導くため、
Appendix 1 では別途、平均分解度（%、整数値）を表示した。なお、分解度（%）
が不等号や範囲で表記されているなど、単純計算で平均分解度が算出できない
場合は、次のように取り扱った。>=X%または<=X%の場合は X%、>X%の場合
は(X+1)%、<X%の場合は(X-1)%、>X%および>Y%の場合は{(X+1)+(Y+1)}/2%、
X-Y%と範囲で示されている場合は(X+Y)/2%、平均生分解度が 100%を超える場
合は 100%とした。
Fig. 3 に 301C で得られた分解度とその他の易生分解性試験で得られた分解度との
比較を示す（分解度は平均分解度を使用）。プロットされたデータはいずれも分散が
激しく、相関式を導くことは困難であった。そこで、易生分解性のパスレベル（BOD ま
たは CO2 発生量に基づく分解度：60%以上、DOC 除去に基づく分解度：70%以上）を
12
境界とし、易生分解性の評価が一致する領域（領域 α）と一致しない領域（領域 β）に
分け、試験結果の一致率（全データに占める領域 α の割合）を算出した。その結果、
301C とその他の易生分解性試験における試験結果の一致率は平均 73%であった
（Table 5）。
一方、Fig. 3 で示す対角線（点線）より上にプロットされるデータの割合、すなわち
301C で得られた分解度以上に高い分解度を示したデータの割合は、いずれの試験
法においても 50%以上（平均 71%）であった（Table 5）。さらに、試験法によらず、X 軸
付近にプロットされるデータ（301C 以外の試験法で低分解度のデータ）は少なく、Y 軸
付近にプロットされるデータ（301C で低分解度のデータ）が非常に多いことが分かっ
た。
以上より、結果的に易生分解性の評価が一致するデータの割合は比較的高い一方
で、301C よりもその他の易生分解性試験の方が生分解を受けやすい傾向にあること
が明らかとなった。また、プロットされるデータの傾向（X 軸付近にプロットされるデータ
が少なく、Y 軸付近に多くのプロットが出現する傾向）がいずれの試験法においても共
通していること、また一部例外があるものの 301F の濃度条件および適用可能な化合
物が 301C とほぼ同じであること（Table 4、Appendix 1）を考慮すると、301C とその他の
易生分解性試験の性能の差は、植種源である 301C 汚泥と下水処理場汚泥の違いに
強く依存している可能性が示唆された。
13
Region α: Agreement in evaluation of ready biodegradability.
Region β: Disagreement in evaluation of ready biodegradability.
Region γ: Low percentage (less than 10%) in 301C and high percentage (over 60% or 70%) in the other test.
Fig. 3a. Comparison of percentage biodegradation between 301C and 301A.
Fig. 3b. Comparison of percentage biodegradation between 301C and 301B.
14
Region α: Agreement in evaluation of ready biodegradability.
Region β: Disagreement in evaluation of ready biodegradability.
Region γ: Low percentage (less than 10%) in 301C and high percentage (over 60% or 70%) in the other test.
Fig. 3c. Comparison of percentage biodegradation between 301C and 301D.
Fig. 3d. Comparison of percentage biodegradation between 301C and 301E.
15
Region α: Agreement in evaluation of ready biodegradability.
Region β: Disagreement in evaluation of ready biodegradability.
Region γ: Low percentage (less than 10%) in 301C and high percentage (over 60%) in the other test.
Fig. 3e. Comparison of percentage biodegradation between 301C and 301F.
Fig. 3f. Comparison of percentage biodegradation between 301C and 310.
16
Table 5 Comparison of percentage biodegradation between 301C and other test method
Agreement rate of test result
with 301C result (rate of region α)
Rate of %biodegradation
equal to or higher than 301C result
Number / Total
%
Number / Total
%
301A
24/37
65
34/37
92
301B
88/114
77
81/114
71
301D
90/121
74
70/121
58
301E
24/40
60
33/40
83
301F
69/92
75
65/92
71
310
11/15
73
13/15
87
Total
306/419
73
296/419
71
Test method
２．３．５
301C で生分解されにくい物質群の解析
２．３．４における分解度の比較により、301C とその他の易生分解性試験の性能の
違いは、301C 汚泥と下水処理場汚泥の違いに強く依存し、301C 汚泥の方が生分解
されにくい傾向が明らかとなった。そこで、易生分解性の評価において異なる結果を
導きやすい物質群、とりわけ下水処理場汚泥で生分解されやすく、301C 汚泥で生分
解されにくい物質を特定するため、Fig. 3 に示す領域 γ（301C における分解度：10%
以下、301A および 301E における分解度：70%以上、301B、301D、301F および 310
における分解度：60%以上）に該当する物質を調査した。
なお、試験物質が微生物に対する阻害性を有する場合、301C の試験条件下で分
解活性を阻害し、領域 γ にデータが出現することが予想された。そこで、301C で得ら
れた BOD 測定データを調べ、生分解区（試験物質と植種源を添加した試験液）で得
られた BOD 値と対照区（植種源のみを添加した試験区）で得られた BOD 値とを比較
した。生分解区で得られた個々の BOD 値が対照区の BOD 値（微生物による基礎呼
17
吸量）よりも低い物質は、301C で呼吸阻害性を示した可能性がある物質とみなした。
調査の結果、領域 γ に該当するデータは 41 データ、32 物質であった（Table 6）。
このうち、301C で呼吸阻害性を示した可能性がある物質は 11 物質であった。例え
ば、ジンクピリチオン（No.16）は抗菌剤として知られており、最小発育阻止濃度（MIC）
は Escherichia coli で 4.5 mg l-1、Pseudomonas aeruginosa で 13.0 mg l-1 との報告が
ある 6)。これらの濃度は、301C の試験濃度（100 mg l-1）と比べて顕著に低いことから、
301C の試験条件下で微生物活性が阻害されたと考えられる。同様に、呼吸阻害性を
示した他の物質については 301C で微生物活性が阻害されて領域 γ に出現した可能
性がある。
一方、301C で呼吸阻害性を示さなかった物質は 21 物質であり、試験法によらずリ
ン、窒素および分岐状炭素を有する化合物が多く出現することが分かった。試験結果
に差を生じやすいことが明らかな四級炭素を有する化合物については、No. 52、No.
167、No. 359 および No. 421 の 4 物質が該当し、これらは分岐状炭素を有する物質に
分類した。その他の易生分解性試験で高い分解度を示し（本質的な生分解性を有し）、
かつ 301C の濃度条件下で微生物活性が阻害されていなければ、301C においてもあ
る程度の分解度を示すはずである。それにもかかわらず 301C で 10%以下の低い分解
度しか示さなかったことは、上記の物質群が 301C 汚泥で特徴的に生分解されにくい
物質群であることを示唆する。
さらに、領域 γ 周辺（Y 軸付近）にプロットされる物質の構造を解析したところ、リンを
含有する化合物の全般、窒素を含有する化合物のうち二～四級アミンの構造を有す
る化合物、分岐状炭素を含有する化合物のうち四級炭素を有する化合物が多いこと
が分かった。これらに分類される物質について、301C で得られた分解度とその他のす
べての試験法で得られた分解度とをプロットしたところ、一部の例外を除き、領域 γ を
含む Y 軸付近に多くプロットされることが確認された（Fig. 4）。
18
Table 6 List of compounds corresponding to region γ
No.a
Structural formula
N
16
S
O
Zn
O
S
N
CH3 O
52
HOCH2 C
Classification
Nitrogen
compound
CH3
C O CH2
CH3
C CH2OH
CH3
Branched
carbon
compound
Respiration
inhibitory
in 301C
No
COOCH2CH(CH2)3CH3
Branched
carbon
compound
CH2
CHSO3Na
No
COOCH2CH(CH2)3CH3
C2H5
O
97
Nitrogen
compound
H3CNHCNHCH3
Test
concentration
(mg l-1)
301B
26.5
301B
30.2
301A
34
301D
3
301F
107
310
19
301A
50
Yes
C2H5
68
Test
method
No
301B
105
O(CH2)3CH3
Phosphorus
compound
O P O(CH2)3CH3
Yes
3.68
301E
37
301E
53.3
O(CH2)3CH3
OC2H4OC4H9
110
O P
OC2H4OC4H9
OC2H4OC4H9
130
CH3
HO H
+
ClCH2CCH2 N CH3
-
Cl
Phosphorus
compound
No
301B
18.4
Nitrogen
compound
No
301E
20
Branched
carbon
compound
No
301B
35
CH3
CH3
167
HOH2C C CH2OH
CH3
a
Substance number shown in Appendix 1.
19
Table 6 (continued)
No. a
168
Structural formula
NH2C2H4NHC2H4OH
Nitrogen
compound
Respiration
inhibitory
in 301C
Test
method
Test
concentration
(mg l-1)
301F
64
301F
61
301D
2
301F
100
Yes
Branched
carbon
compound
No
Nitrogen
compound
No
301A
41
Nitrogen
compound
No
301A
33
Nitrogen
compound
No
301E
41
Nitrogen
compound
Yes
301D
6
Nitrogen
compound
Yes
301B
20
N CH2CH3
Nitrogen
compound
No
301B
28
(CH3CH2CH2CH2)3N
Nitrogen
compound
No
301B
26
Nitrogen
compound
No
301D
2
OH
HO
188
3
CH2CH2OH
191
Classification
H3 C
N
CH2CH2OH
198
C2H5
C2H5
207
N CH2CH2OH
O
CH3
HC N
CH3
222
CH2CH2NH2
HN
CH2CH2NH2
224
H2N C N N C NH2
O
O
237
238
241
CH2CH3
CH3CH2
H3C
N C S Na
H3C
a
S
Substance number shown in Appendix 1.
20
Table 6 (continued)
No. a
266
Structural formula
CH2
NH
C O
(CH2)10
H
N
278
N
H
Respiration
inhibitory
in 301C
Test
method
Test
concentration
(mg l-1)
Nitrogen
compound
No
301B
20.9
Nitrogen
compound
No
301F
7.9
Cyclo ring
compound
No
301A
30
Cyclo ring
compound
Yes
301F
34
Nitrogen
compound
No
301E
26
Nitrogen and
branched
carbon
compound
No
301F
100
Chloride
compound
Yes
301D
1.9
Branched
carbon
compound
Yes
301D
2.4
Classification
CH2OH
288
CH2OH
289
NH2
CH3
330
CH3
CH2CHCHO
359
H3C C CH3
CH3
Cl
367
Cl
CH3
381
OH
H3C
a
CH
CH3
Substance number shown in Appendix 1.
21
Table 6 (continued)
No. a
Structural formula
Respiration
inhibitory
in 301C
Test
method
Chloride
compound
Yes
301D
Aromatic
compound
Yes
301A
52
Nitrogen
compound
No
301F
100
301F
25
301F
100
Classification
Test
concentration
(mg l-1)
OH
395
CH 3
4.5
Cl
OH
H3C
400
CH3
CH3
S
405
421
N
CH3
HO
OH
C
CH3
425
H2N
CH2
NH2
O
O P O
434
O
CH2CH(CH2)3CH3
CH2CH3
a
Branched
carbon
compound
No
Nitrogen
compound
Yes
301B
30
Phosphorus
and
branched
carbon
compound
No
301B
30
Substance number shown in Appendix 1.
22
% Biodegradation by the other tests
% biodegradation by the other tests sss aa
100
80
γ
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
% Biodegradation
biodegradationbyby
301C
%
301C
Phosphorus compounds
Nitrogen compounds (secondary, tertiary, and quatemary amines)
Quatemary carbon compounds
Fig. 4. Plots for hardly-biodegradable compounds in 301C.
リン、窒素及び分岐状炭素を含む化合物が 301C 汚泥で生分解されにくい理由と
して以下のことが考察される。一般的な下水処理場では、環境中の富栄養化につな
がるリン及び窒素の除去能を高めた運転管理がなされている。一方で、301C 汚
泥はグルコース及びペプトンを主な栄養源とする合成下水で順化培養するた
め、下水処理場汚泥（種汚泥の一つ）の有するリン及び窒素の除去能が次第に
低下し、これらの元素を含む化合物の資化性が乏しくなると考えられる。また、
分岐状炭素を含有しないグルコース及びペプトンを栄養源とすることで、分岐
状炭素を有する化合物の資化性も乏しくなると考えられる。
23
２．３．６
下水処理場汚泥の分解活性のばらつき
２．３．４および２．３．５において、301C とその他の易生分解性試験との
性能の違いに植種源の違いが影響していることが明らかとなった。しかし、301C
以外の試験法間で共通して下水処理場汚泥を使用した場合に、果たして同じ試
験結果を導くものであろうか。例えば、四級炭素を有する化合物であるビスフ
ェノール A（No. 421）について、301B および 301D では易生分解性ではない結
果が得られているが、試験濃度がそれよりも高い（微生物阻害の影響を受けや
すい）301F において易生分解性の結果が得られている（Table 2）
。ビスフェノー
ル A 以外にも、植種源が同じ下水処理場汚泥であっても試験法内もしくは試験
法間で異なる試験結果が得られている物質は少なくない（Appendix 1）。
OECD テストガイドラインでは、易生分解性試験で使用する下水処理場汚泥
として、主に家庭排水を受け入れる下水処理場の返送汚泥の使用が推奨されて
いる。しかし、データベースには汚泥を採集した下水処理場および流入排水の
質などに関する情報は収載されておらず、OECD テストガイドラインで推奨さ
れる汚泥が使用されているかは不明である。また一般的に、下水処理場によっ
て家庭排水を受け入れている割合には差があり、工業排水を比較的多く受け入
れている処理場もある。流入排水の質が異なれば汚泥の分解活性も異なるはず
であり、実際に、第３章（研究Ⅱ）において下水処理場によって分解活性（ア
ニリン分解活性）が大きく異なることを明らかにしている。
以上より、301C 以外の試験法間で試験結果を比較する際には、下水処理場汚
泥の分解活性のばらつきに留意する必要がある。
24
２．４
まとめ
第２章（研究Ⅰ）において 301C とその他の易生分解性試験の性能比較を行い、
以下のことを明らかにした。
・301C 以外の易生分解性試験において、試験に使用される植種源は約 90%が下
水処理場汚泥である。
・301C ではその他の易生分解性試験と比較して生分解されにくい傾向にあり、
その傾向は植種源の違い（301C 汚泥と下水処理場汚泥の違い）に強く依存し
ている。
・301C ではリン、窒素及び分岐状炭素を有する化合物が生分解されにくい傾向
にある（Fig. 5）。これは、301C 汚泥がグルコースおよびペプトンを栄養源と
する合成下水で順化培養されるため、下水処理場汚泥と比較してこれらの物
質群に対する資化性が乏しいためと考えられる。
Fig. 5. Hardly-biodegradable compounds in 301C.
25
26
78-04-6
14324-55-1
9
10-1
1461-22-9 Stannane, tributylchloro-
8
Zinc, bis(diethylcarbamodithioato-S,S'), (T-4)-
Dibutyl[(maleoyl)dioxy] tin
Dibutyltin oxide
Dodecanoic acid, 1,1'(dibutylstannylene) ester
Zinc, bis(dimethylcarbamodithioatoS,S')-, (T-4)-
818-08-6
Acetyl chloride, chloro-
Acetyl chloride, chloro-
7
79-04-9
4-2
Acetyl chloride, chloro-
77-58-7
79-04-9
4-1
Benzoyl chloride
6
98-88-4
3
Stearic acid chloride
137-30-4
112-76-5
2
Benzenesulfonyl chloride
5
98-09-9
1-2
Benzenesulfonyl chloride
79-04-9
98-09-9
1-1
CAS name
4-3
CAS No.
No.
O
C2H5
N C S
S
O
C4H9
Sn
C4H9
C2H5
O
C4H9
Sn
O
O
OCC11H23
2
2
Zn
O
Cl
C4 H9
OCC11H23
O
Sn
C4H9 Sn
C4H9
S
CH2 C Cl
O
CH2 C Cl
O
CH2 C Cl
O
COCl
N C S Zn
C4H9
C4H9
O
(CH2)16 C Cl
C4H9
H3C
H3C
Cl
Cl
Cl
H3C
SO2Cl
SO2Cl
Structural formula
0
9
0
0
48
0
65
65
65
84
83
83
83
1
0
8
0
0
47
0
4
4
4
86
85
90
90
2
0
8
0
0
53
-
-
-
-
-
82
-
-
3
0
8
0
0
50
0
34
34
34
85
83
87
87
ave.
% biodeg. (%)
301C
28
28
28
28
28
14
21
21
21
14
28
14
14
Test
period
(d)
○
○
○
○
○
○
○
○
○
301B
301F
301F
301F
301F
301B
301E
301D
301E
301D
301F
301D
301B
Use for
comparison Test
analysis
method
(Fig.3)
42.5
37.7
27.3
2
22.2
42.5
5
5
47
2.4
-
-
25
7.7
3.2
-23
0
22
7.7
100
100
73
95
>70
>65
92
8
3
0
0
22
8
100
100
73
95
71
66
92
Test
Average
% biodeg.
concentration
% biodeg.
(%)
-1
(%)
(mg l )
28
28
39
28
28
28
-
-
7
20
28
28
29
Test
period
(d)
Appendix 1 Search results of ready biodegradability test data yes
no
no
yes
yes
no
no
Ready
biodegradability
Others
WWTP
sludge
WWTP
sludge
Others
WWTP
sludge
Others
WWTP
sludge
Type
-
-
no
-
no
-
-
Adaptation
Inocula sourse
2
1
1
2
1
2
2
Reliability
1979
1989
2010
2004
2010
2004
1992
Year
ECHA
CHEM
ECHA
CHEM
ECHA
CHEM
ECHA
CHEM
ECHA
CHEM
ECHA
CHEM
OECD SIDS
IUCLID
Database
第３章
３．１
アニリン分解菌迅速検出法の開発
背景および目的
１．２で述べたように、301C 汚泥は、近年の環境浄化に伴い分解活性が低下
傾向にあり、過去の試験結果との不整合や試験の成功率の低下が指摘されてい
る。また、Fig.6 に示すように、301C 汚泥は合成下水による培養期間が長くなる
につれて BOD 測定におけるアニリン分解の立ち上がり（誘導期（Lag time））が
遅くなり、培養後期に試験の成功率が著しく低下する傾向がある。環境浄化に
伴う分解活性の低下が誘導期の遅れを早めているため、301C 汚泥を試験に使用
できる期間が短くなってきている。このような状況から、2012 年 4 月に試験法
通知 3)が改正され、301C 汚泥の年間の調製回数が 4 回から 6 回に変更（使用期
Percentage biodegradation of BOD (%)
間は 3 か月から 2 か月に短縮）されている。
100
Cultivation duration of
activated sludge:
Lag time
80
1 month
2 months
3 months
60
Criteria:
After 7 days, >40%
After 14 days, >65%
40
×
20
0
0
2
4
6
8
10
Incubation time (day)
12
14
Fig. 6. Typical BOD curves of aniline by using 301C sludge.
87
しかしながら、301C 汚泥の使用期間の短縮は応急措置であり、さらなる環境
浄化が進んだ場合には、最終的には試験の有効性基準をまったく満たさなくな
る懸念がある。また、国際的な試験データの相互受け入れの観点で、他の易生
分解性試験との整合性の確保はより一層困難になると予想される。以上のこと
から、１．２で述べたように、301C 汚泥の調製方法を根本的に見直すことが望
ましいとする専門家の意見が示されている。
上記の背景を踏まえ、301C 汚泥の改良においては、使用期間を通じて試験法で求
められる活性レベルを安定に維持できる培養条件の確立が求められている。最適な
培養条件を確立するためには、301C 汚泥が有するアニリン分解活性をリアルタイムに
モニターし、現在の培養条件における分解活性の変動要因を明らかにする必要があ
る。しかしながら、従来の BOD 測定は 2 週間の培養を必要とすることから、アニリン分
解活性をリアルタイムに評価することはできない。また、これまでの研究において、大
内山らは最確数法（MPN 法）により求めたアニリン分解菌量と BOD 測定で得られる誘
導期との間に相関があることを明らかにしたが、MPN 法は培養に 1 か月以上かかり、
操作も煩雑である
5)
。そこで筆者は、活性汚泥が有する分解活性を迅速かつ簡便に
評価できる手法の開発が必要であると考えた。
近年、環境微生物の検出・定量に関する様々な研究分野において、分子生物学的
手法である定量的 Real-Time PCR 法（qPCR 法）が広く利用されている 7)～10)。qPCR 法
は、107 ～108 の幅広いダイナミックレンジで信頼性の高い定量を実現するとともに、
MPN 法のような古典的な細菌定量法と比較して、迅速かつ簡便な手法である。特に、
TaqMan システムによる qPCR 法は、二つのプライマー（Forward および Reverse プライ
マー）に加えて、標的となる DNA 配列に特異的に設計されたプローブの分解に基づく
検出を行うため、特異性が非常に高い。Harms らは、都市下水処理場の活性汚泥中
に存在する亜硝酸酸化細菌 Nitrosomonas oligotropha を検出・定量するために、
amoA 遺伝子をターゲットとした手法を報告している
11)
。しかしながら、これまでに
qPCR 法を用いてアニリン分解菌を検出・定量する手法は報告されていない。
88
アニリンおよびその誘導体は、除草剤、医薬品、染料のような化学製品の合成原料
として広く使用されており、かつては、工業および農業活動を通じて環境中に放出さ
れていた歴史がある 12)。それらは、人、魚、水生無脊椎動物、細菌などに対して、低濃
度においても高い毒性および変異原性を示すため
13)～15)
、重要な環境汚染物質と考
えられてきた。
このような背景から、多くの研究者らはアニリンおよびその誘導体の環境運命に注
目した 16)17)。環境中におけるアニリンの除去は、主に細菌による生分解により達成され
るため 18)、様々な環境試料から種々のアニリン分解菌が単離されている 19)～21)。いくつ
かの研究グループは、単離されたアニリン分解菌（例えば、グラム陰性菌として
Pseudomonas sp.22) 、Acinetobacter sp.23)24) 、Frateuria sp.25)26) 、Delftia sp.27) ～ 29) 、
Burkholderia sp.30)など、グラム陽性菌として Rhodococcus sp. 31)など）について、
アニリンの生分解経路（Fig. 7）において関与する分解酵素とその遺伝子を明らかにし
ている。特に、アニリンの脱アミノ化に関与する酵素の一つである α-アニリンジ
オキシゲナーゼ（α-Ad）に関する知見は非常に豊富であり、国際的に利用可能
なデータベースでそのアミノ酸配列および DNA 配列が入手可能である。
- Ortho-cleavage pathway COOH
COOH
O
COOH
O2
NH2
Catechol 1,2-dioxygenase
OH
OH
NH3
Aniline
O
Catechol
Catechol 2,3-dioxygenase
O2
OH
α-Aniline dioxygenase
COOH
CHO
NAD+ NADH
- Meta-cleavage pathway -
Fig. 7. Catabolic pathway of aniline.
89
OH
COOH
COOH
そこで本章では、アニリン分解菌の α-Ad 遺伝子に着目し、活性汚泥中の多様なア
ニリン分解菌を迅速かつ簡便に検出・定量する qPCR 法の開発を行った。そして、本
手法が生分解性試験における分解活性の評価に適用可能であるか検証した。
３．２
実験材料および方法
３．２．１
活性汚泥および DNA 抽出
日本国内 8 か所の下水処理場から活性汚泥（反応槽汚泥もしくは返送汚泥）を採取
した（Table 7）。Plant B は主に工業排水を受け入れる下水処理場、その他は主に家庭
排水を受け入れる下水処理場である。このうち Plant A–D の返送汚泥は、301C 汚泥
の種汚泥である（Fig. 2）。採取した活性汚泥は、実験に供するまで 1～2 日間、エアレ
ーションを行って好気条件を維持した。また、MPN 法によるアニリン分解菌数の測定
（３．２．５参照）に供した Plant A および B の活性汚泥については、JIS K0102-2012
14.1 項に従って懸濁物質（MLSS）濃度を測定した。
各活性汚泥からの総 DNA の抽出は次のとおり行った。懸濁状態の活性汚泥を適
当量分取し、4000 g で 15 分間、遠心分離した。得られた沈殿物 250 mg から、
NucleoSpin Soil kit (MACHEREY-NAGEL GmbH, KG, Germany)を用いて総 DNA を
抽出した。さらに、抽出した総 DNA を NucleoSpin gDNA Clean-up kit
(MACHEREY-NAGEL GmbH, KG)を用いて精製した。精製後、総 DNA 抽出物の
最終液量を 50μL に調整し、紫外吸収スペクトルの測定により純度に問題がな
いことを確認した（A260/A230 ≧2.0 および A260/A280 ≧1.8）。上記のように
抽出した総 DNA は、使用するまで-70℃で冷凍保管した。なお、開発した qPCR
法の BOD 測定による有効性確認（３．２．６参照）においては、DNA 抽出に
おけるばらつきを考慮し、1 サンプルにつき n=3 で DNA 抽出を行った。
90
Table 7
Activated sludge samples used in this study
c
MLSS (mg l-1)
Verification method
for the qPCR datad
Plant
Prefecture
Sampling date
Sludge type
Aa
Fukuoka
Dec 2011
Aeration-tank sludge
2170
MPN
Dec 2011
Return sludge
4440
MPN
Feb 2012
Aeration-tank sludge
1570
MPN
Mar 2012
Return sludge
4850
MPN
Jun 2012
Return sludge
-
BOD
Feb 2012
Aeration-tank sludge
2860
MPN
Mar 2012
Return sludge
5610
MPN and BOD
Bb
Ibaraki
Ca
Osaka
Jul 2012
Return sludge
-
BOD
Da
Tokyo
Jul 2012
Return sludge
-
BOD
Ea
Fukuoka
May 2012
Return sludge
-
BOD
Fa
Fukuoka
Jun 2012
Return sludge
-
BOD
Ga
Aichi
Jun 2012
Return sludge
-
BOD
Ha
Hokkaido
Jul 2012
Return sludge
-
BOD
a
Domestic wastewater treatment plant.
Industrial wastewater treatment plant.
c
MLSS, mixed liquor suspended solids.
d
Conventional methods (MPN, Most Probable Number; BOD, Biological Oxygen Demand)
used to verify the data obtained by qPCR in this study.
b
91
３．２．２
菌株
３．２．１で採取した活性汚泥より次の 4 菌株を得た。MPN 法によるアニリン分解菌
数の測定（３．２．５参照）における陽性反応チューブよりアニリン分解菌 3 菌株を、陰
性反応チューブよりアニリン非分解菌 1 菌株を単離した。単離した菌株は、16S rRNA
遺伝子配列に基づく同定を行った。同定結果を Table 10 に示す。
Pseudomonas putida (NBRC No. 102093) および and Rhodococcus zopfii (NBRC
No. 100606) は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE）の Biological
Resource Center (BRC, NITE) より購入した。また、Escherichia coli BW25113 株は、
九州工業大学大学院生命体工学研究科前田研究室より入手した。
３．２．３
プライマーおよびプローブ
本研究で使用したプライマーおよびプローブを Table 8 に示す。
α-Ad 遺伝子検出用のプライマーおよびプローブの設計は次のように行った。
まず、 α-Ad のアミノ酸配列および DNA 配列を NCBI データベース
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）で網羅的に検索した。そして、検索により得られ
たアニリン分解菌（Table 9）の α-Ad アミノ酸配列について、CLUSTAL W
(http://www.genome.jp/tools/clustalw/)を用いた多重アライメントを行い、アライメ
ント結果（Fig. 8）を基にアニリン分解菌を検出するためのプライマーおよびプ
ローブを設計した。
また、活性汚泥中の全細菌を検出するために、16S rRNA 遺伝子検出用のユニ
バーサルプライマーおよびプローブを使用した。
α-Ad 遺伝子検出用および 16S rRNA 遺伝子検出用の各プローブは、5'末端に
6-FAM （ 6-carboxyfluorescein ）を、 3' 末端に NFQ-MGB （ non-fluorescent
quencher–minor groove binder)をそれぞれ結合させて蛍光標識化した。
92
Table 8
Primer and probe sets used in this study
Amplicon
Target
Name
Function
Sequence (5′−3′)
α-Ad
2fC
F primer
GAYAAYGCNGGNGAYGGNTAYC
4rB
R primer
NCGNCCNGGYTGNGGNC
p3-2
Probea
ACWSNGTCATCGACCAGCGCCC
340f
F primer
TCCTACGGGAGGCAGCAGT
781r
R primer
GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT
515r
Probea
CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC
16S rDNA
a
size (bp)
Reference
231
This study
441
32)
Labeled with a reporter dye (6-carboxyfluorescein) attached to the 5′-end and a quencher dye
(non-fluorescent quencher–minor groove binder) attached to the 3′-end.
Table 9
Microorganisms encoding α-aniline dioxygenase gene for designing primer and probe sets
Genus and species
Strain
Gram stain
Accession No.
Reference
Rhodococcus sp.
AN-22
Positive
BAI63575
NCBIa
Burkholderia sp.
JS667
Negative
ACO92656
30)
Delftia acidovorans
7N
Negative
BAD61049
27)
Frateuria sp.
ANA-18
Negative
BAC82526
25)
Acinetobacter sp.
GXA7
Negative
AAW66669
NCBIa
P. putida
UCC22
Negative
BAA12807
NCBIa
a
Not published but available in the National Center for Biotechnology Information (NCBI)
protein database.
93
Fig. 8. Multiple alignment of amino acid sequences of α-aniline dioxygenase: AN-22, Rhodococcus sp.
AN-22; JS667, Burkholderia sp. JS667; 7N, Delftia acidovorans 7N; ANA-18, Frateuria sp. ANA-18;
GXA7, Acinetobacter sp. GXA7; UCC22, P. putida UCC22. Five conserved regions containing the three
regions used for designing the primers and TaqMan probe are indicated by dotted boxes.
94
３．２．４
qPCR の実施
qPCR の条件を下記に示す。リアルタイム PCR 装置は StepOne Real-Time PCR
System (Applied Biosystems, USA)を使用した。qPCR 測定は、各サンプルにつき
n=3 で実施した。
PCR reaction mix (1 tube)
TaqMan Fast advanced master mix (2x)
10 μL
Forward primer (10 mM)
1.8 μL
Reverce primer (10 mM)
1.8 μL
TaqMan probe (13.3 mM)
0.37 μL
Nuclease free water
4.03 μL
DNA Template
2 μL
Total
20 μL
PCR cycle conditions
Temp.
Time
UNG incubation
50℃
02:00
Polymerase activation
95℃
10:00
PCR (40 cycles)
95℃
00:15
60℃
01:00
PCR のサイクル数に対して蛍光強度（対数値）をプロットし、蛍光強度の中間値付近
に任意の閾値を設定した。この閾値と蛍光強度の交点におけるサイクル数を Ct 値
（Threshold cycle value）とした。各活性汚泥サンプルにおける α-Ad 遺伝子および 16S
rRNA 遺伝子のコピー数は、qPCR により得られた Ct 値を α-Ad 遺伝子の検量線
（Fig. 9）および 16S rRNA 遺伝子の検量線（Fig. 10）の各回帰式に代入して求め
95
た。そして、活性汚泥中の細菌全体に占めるアニリン分解菌の存在割合を求めるた
め、α-Ad 遺伝子の相対コピー数（16S rRNA 遺伝子のコピー数に対する比）を算
出した。
1000000000
100000000
Copy numberaaaaaaa
10000000
1000000
100000
10000
y = 26785266228.907 e
1000
-0.552 x
2
R = 0.998
100
10
1
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Ct value
Fig. 9. Calibration curve for the α-aniline dioxygenase gene (Copy number vs. Ct value).
1000000000
100000000
Copy numberaaaaa
10000000
1000000
100000
-0.613 x
y = 36567055707.866 e
2
10000
R = 0.998
1000
100
10
1
0
5
10
15
20
25
Ct value
Fig. 10. Calibration curve for 16S rDNA (Copy number vs. Ct value).
96
30
なお、α-Ad 遺伝子および 16S rRNA 遺伝子の検量線を作成するための標準
DNA 溶液は次のように作成した。本研究で単離したアニリン分解菌株の一つで
ある Acidovorax sp.より DNA を抽出し、それを生理食塩水に溶解させることによ
り 247.2 ng μl-1 の標準 DNA 原液を得た。標準 DNA 原液中の α-Ad 遺伝子および
16S rRNA 遺伝子のコピー数は、以下の計算式よりおのおの 9.39 × 108 copy μl-1
と計算される（Acidovorax sp.のゲノム 1 mol には α-Ad 遺伝子および 16S rRNA
遺伝子がそれぞれ 1 mol ずつ含まれるためコピー数は同じである）。
Copy number of DNA standard (copy μl-1) =
DNA concentration (ng μl-1) × 10-9
23
Genomic M.W. of Acidovorax sp. × 6.02 × 10
Genomic molecular weight of Acidovorax sp. = 4.8 (Mbp) × 330 (bp-1) × 106
このように得られた標準 DNA 原液を生理食塩水で 10～106 の範囲で多段階に希
釈することにより、α-Ad 遺伝子および 16S rRNA 遺伝子の両方の検量線を作成
するための標準 DNA 溶液を得た。
３．２．５
MPN 法によるアニリン分解菌数の測定
Plant A および B より採取した活性汚泥（Table 7）について、大内山らが報告
した MPN 法 5)に従って活性汚泥中のアニリン分解菌を n=2 で計数した。培養期
間は 34 日間とした。各サンプルで得られたアニリン分解菌数を各 MLSS 濃度で
除して、活性汚泥 1mg（乾燥重量）あたりの個体数（細胞数）を求めた。
なお、Plant A から採取した活性汚泥の陽性反応チューブおよび陰性反応チュ
ーブより、アニリン分解菌 3 菌株およびアニリン非分解菌 1 菌株をそれぞれ単
離した（３．２．２参照）。
97
３．２．６
BOD 測定
Plant A–H から採取した活性汚泥（Table 7）について、閉鎖系酸素消費量測定
装置を用い、301C の試験条件（アニリン濃度 100 mg l-1、活性汚泥濃度 30 mg l-1）
を参考にアニリンの BOD 測定を行った。得られた BOD 曲線からアニリン分解
の誘導期を確認した。
３．３
結果および考察
３．３．１
プライマーおよびプローブの特異性
α-Ad アミノ酸配列の多重アライメントの結果、6 つ以上のアミノ酸の配列が
一致する領域が 5 か所確認された（Fig. 8）。一般的に PCR の増幅効率が良いと
される塩基数は 180～240 bp 前後（アミノ酸数 60～80）であることを考慮し、
二つのプライマーおよびプローブの塩基配列を設計するためのアミノ酸配列の
領域を決定した。そして、塩基配列の異なる数種類のプライマーおよびプロー
ブ候補の組み合わせの中から、PCR 増幅効率が最も高かった Forward プライマ
ー（2fc）、Reverse プライマー（4rB）およびプローブ（p3-2）の組み合わせを α-Ad
遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブとした（Table 10）。
設計した配列の特異性を確認するため、アニリン資化性が明らかな菌株より
DNA を抽出し、PCR 増幅の有無を確認した。その結果、アニリン資化性を有する
菌株（Acidovorax sp., Rhodococcus sp., Gordonia sp., Pseudomonas putida）で増幅が
認められた一方、アニリン資化性を有さない菌株（ Rhodococcus zopfii,
Pseudomonas sp., Escherichia coli）では増幅が認められなかった（Table 10）。さら
に、Pseudomonas putida を除く菌株についてアガロースゲル電気泳動により増幅
産物の確認を行った結果、陽性対照（P1–3）の菌株において目的産物の塩基サ
イズ（231 bp）に相当するバンドが認められた（Fig. 11）。以上より、設計した
プライマーおよびプローブの特異性が示された。また、陽性対照の菌株のうち
Rhodococcus sp.および Gordonia sp.はグラム陽性の菌株、Acidovorax sp.および
98
Pseudomonas putida はグラム陰性の菌株であることから、設計した配列は幅広い
アニリン分解菌の検出に有効であることが示唆された。
Table 10
Results of PCR amplification test
Genus and species
Gram stain
Lane No.
of agarose gel
electrophoresis
Aniline
Assimilability
PCR amp.
test result
Acidovorax sp.
Negative
P1
+
+
This study
Rhodococcus sp.
Positive
P2
+
+
This study
Gordonia sp.
Positive
P3
+
+
This study
P. putida
Negative
(Not analyzed)
+a
+
NBRCb
R. zopfii
Positive
N1
−a
−
NBRCb
Pseudomonas sp.
Negative
N2
−
−
This study
E. coli
Negative
N3
−a
−
Kyutechc
Source
a
Presumed by previous report.
Purchased from the National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Biological
Resource Center (NBRC).
c
Supplied by the Department of Biological Functions and Engineering, Graduate School of
Life Science and Systems Engineering, Kyushu Institute of Technology, Japan (Kyutech).
b
M
P1 P2
P3
N1 N2 N3
＋
＋
－
300 bp
200 bp
100 bp
＋
－
－
Fig. 11. Agarose gel electrophoresis of PCR products. Lanes P and N contain the PCR products
of the three strains of aniline-degrading bacteria as a positive control and those of the three
strains unable to assimilate aniline as a negative control, respectively (Table 10). Lane M
contains a molecular size marker (100 bp DNA ladder, TAKARA BIO, Shiga, Japan).
99
さらに、標的とした α-Ad の特異性を調べるため、α-Ad と他のジオキシゲナーゼ
（トルエンジオキシゲナーゼ、カテコールジオキシゲナーゼおよびベンゼンジ
オキシゲナーゼ）のアミノ酸配列に基づく系統解析を行った。その結果、系統
樹上の α-Ad の結合距離は、
異なるアニリン分解菌の間で互いに短い一方で、α-Ad
と他のジオキシゲナーゼとの結合距離は非常に長いことが分かった（Fig. 12）。
このことは、α-Ad のアミノ酸配列が異なるアニリン分解菌の間でかなり類似し
ている一方で、他のジオキシゲナーゼのアミノ酸配列とは大きく異なることを
意味する。
また、プライマーおよびプローブの設計に使用したアミノ酸配列と相同性の
高い細菌由来のタンパク質を BLAST（Basic Local Alignment Search Tool、
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）で検索した。その結果、プライマーおよびプローブ
の各配列ともにアニリン分解菌由来の α-Ad と高い相同性を示すことが確認され
た（Appendix 2）。
これらの結果は、前述の PCR 増幅試験の結果を強く支持する。
100
101
Fig. 12. Phylogenetic relationships of α-aniline dioxygenases and other dioxygenases. The phylogenetic tree was constructed using
MEGA software version 5.1. The amino acid sequences were retrieved from the National Center for Biotechnology Information (NCBI)
database. α-Aniline dioxygenases are indicated by the dotted box: (●), used in the multiple alignments.
0.5
Aniline dioxygenase Rhodococcus sp. AN-22.
Putative aromatic hydrocarbon dioxygenase large subunit Gordonia rubripertincta NBRC 101908.
Aniline dioxygenase alpha-subunit Acinetobacter sp. GXA7.
Aniline dioxygenase alpha-subunit Acinetobacter sp. YAA.
Large subunit of aniline dioxygenase Delftia acidovorans 7N.
Large subunit of dioxygenase Comamonas testosteroni.
Terminal dioxygenase large subunit Delftia tsuruhatensis.
Aniline dioxygenase terminal oxygenase component (alpha subunit) Burkholderia sp. JS667.
Large subunit of terminal dioxygenase P. putida UCC22.
Large subunit of terminal dioxygenase in aniline dioxygenase Frateuria sp. ANA-18.
Toluene dioxygenase Burkholderia ambifaria IOP40-10.
Toluene dioxygenase P. putida F1.
Catechol dioxygenase Burkholderia sp. 383.
Catechol 1,2-dioxygenase Frateuria sp. ANA-18.
Benzene dioxygenase partial Rhodococcus sp. UBZ6.
Benzene dioxygenase partial Burkholderia sp. BZ1.
Benzene dioxygenase partial Bacillus subtilis.
３．３．２
α-Ad 遺伝子の相対コピー数とアニリン分解菌数との相関
開発した qPCR 法により実際に活性汚泥中のアニリン分解菌のポピュレーシ
ョンを評価できるか調べるため、採集時期の異なる Plant A および B の活性汚泥
（反応槽汚泥もしくは返送汚泥）より抽出した DNA について qPCR を実施し、
α-Ad 遺伝子の定量結果と、従来法である MPN 法で得られたアニリン分解菌数
との相関を調べた。その結果、qPCR で得られた α-Ad 遺伝子の相対コピー数は、
MPN 法で得られた活性汚泥 1 mg（乾燥重量）あたりのアニリン分解菌数（細胞
数）と良好な相関（R2＝0.865）を示した（Fig. 13）。この結果から、本 qPCR 法
は、異なる活性汚泥におけるアニリン分解菌のポピュレーションの比較に有効
Relative copy number of α-Ad gene assaa
であることが示された。
0.06
0.05
0.04
y = 0.0046Ln(x) - 0.0302
2
R = 0.865
0.03
0.02
0.01
0
-0.01
100
1000
10000
100000
1000000
10000000
100000000
Number of aniline-degrading bacteria
-1
(cell mg )
Fig. 13. Relationship between the relative copy number of the α-aniline dioxygenase gene by
quantitative real-time PCR assay and the number of aniline-degradaing bacteria measured with
the Most Probable Number method for activated sludge samples. The activated sludge samples
were collected from one domestic WWTP (plant A) and one industrial WWTP (plant B) in
Japan (Table 10): (●), aeration-tank sludge from plant A; (■), return sludge from plant A; (○),
aeration-tank sludge from plant B; (□), return sludge from plant B.
102
また、qPCR で得られた α-Ad 遺伝子の相対コピー数は、採取時期や採取した
汚泥の違い（反応槽汚泥および返送汚泥）によらず、同一処理場において近似
した値が得られた：Plant A で平均 0.0039（標準偏差：0.0011）、Plant B で平均 0.0472
（標準偏差：0.0091）であった。Plant B の平均値が Plant A の平均値の約 12 倍
高く、また同一処理場における値の変動が少ないことは、Plant A の活性汚泥に
比べて Plant B の活性汚泥の方がアニリン分解菌のポピュレーションが定常的に
高いことを示唆する。
Plant A は家庭排水の割合が 100%である一方、Plant B は工業排水の割合が 90%、
家庭排水の割合が 10%であり、流入排水の質が処理場間で大きく異なる。Plant B
の工業排水は主に石油化学プラントからの排水であり、アニリン誘導体等、芳
香族アミン化合物が多く含まれている。α-Ad 遺伝子を有する細菌は、アニリン
だけでなくメチルアニリン、クロロアニリン、ジフェニルアミンならびにそれ
らの誘導体に対する資化性を有する 21), 30) ,33)～38)。したがって、Plant B ではこれ
ら芳香族アミン化合物を含む工業排水の定常的な流入による順化が生じており、
活性汚泥中にアニリンおよびその誘導体を資化する細菌が定常的に多く含まれ
ていると考えられる。
これらのことは、本手法がアニリンを資化する細菌だけでなく、環境汚染物
質であるアニリン誘導体を資化する細菌の検出にも有効であることを示唆して
おり、本手法の環境モニタリングへの応用が期待できる。
103
３．３．３
α-Ad 遺伝子の相対コピー数とアニリン分解活性との相関
開発した qPCR 法について生分解性試験に用いる活性汚泥の評価に適用でき
るか調べるため、国内 8 か所の下水処理場から採取した活性汚泥（Table 7）を
用いて、qPCR による α-Ad 遺伝子の定量結果と、生分解性試験条件下における
アニリン分解活性との相関を調べた。その結果、qPCR で得られた α-Ad 遺伝子
の相対コピー数は、BOD 曲線におけるアニリン分解の誘導期（Lag time）と良
好な相関（R2＝0.7181）を示した（Fig. 14）。大内山らは、アニリン分解の誘導
期はアニリン分解活性に強く依存し、アニリン分解菌の存在割合と明確な相関
があることを報告している 5)。よって、本手法で得られる α-Ad 遺伝子の相対コ
0.05
y = -0.0112x + 0.0564
B
0.04
2
R = 0.7181
0.03
% biodegradation of aniline
Relative copy number of α-Ad gene
aaaaaa
ピー数からアニリン分解活性を評価できる可能性が示された。
0.02
0.01
F
(a)
Pattern X
(high activity)
80
60
E
G
C
40
20
H D
Pattern Y
(low activity)
Lag time
A
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Incubation time (d)
0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
Lag time (d)
Fig. 14. Relationship between the relative copy number of the α-aniline dioxygenase gene by
quantitative real-time PCR assay and the lag time of aniline degradation on the BOD curves for
activated sludge samples. The activated sludge samples were collected from eight WWTPs (plants
A–H) in Japan (Table 7). Figure (a) (inset) shows the typical BOD curves of aniline degradation by
activated sludge: pattern X, high activity; pattern Y, low activity.
104
また、qPCR で得られた α-Ad 遺伝子の相対コピー数は、工業排水系の Plant B
が 0.0399 で最も高く、その他の処理場（家庭排水系）の平均値（0.0194）の 2.1
倍であった。Plant B の誘導期（1.8 日）は家庭排水系における誘導期の平均値（3.3
日）の約 1/2 であったことから、qPCR で得られた値の差は概ねアニリン分解活
性の差に換算できると考えられる。
なお、家庭排水系の下水処理場間で qPCR の結果に有意差が認められ、最も値
が大きかった Plant F の値（0.0276）は、最も値が小さかった Plant A の値（0.0114）
の 2.4 倍であった。このことは、同じ家庭排水系の下水処理場であってもアニリ
ン分解活性が大きく異なることを意味する。一方、家庭排水系の下水処理場の
うち、Plant G の流入排水には約 40%の工業排水が含まれているため、qPCR の
値は他の処理場と比較して高い値が得られると予想された。しかし、実際に Plant
G で得られた値は 0.0182 とさほど高くなく、家庭排水系の平均値（0.0194）と
大差はなかった。Plant G の周辺には繊維工場が多く、採取した返送汚泥が青く
着色していたことから、流入排水には染料が多く含まれていると推察される。
返送汚泥の青い着色は、Plant G に流入した染料が生分解よりも汚泥への吸着に
よって除去されていることを示唆しており、仮に染料中にアニリンや芳香族ア
ミンの構造を有する成分が含まれていても基質としてあまり利用されておらず、
アニリン分解菌の増殖に必ずしも好ましい環境ではないと考えられる。
以上のことから、下水処理場汚泥が有する分解活性は処理場によって大きく
異なり、その差は流入排水の質の違い、具体的には、基質として利用可能な有
機物の種類とその組成の違いに大きく依存していると考えられる。
105
３．４
まとめ
第３章（研究Ⅱ）においてアニリン分解菌迅速検出法の開発を行い、以下の
成果が得られた。
・α-Ad 遺伝子を標的とし、様々なアニリン分解菌を網羅的かつ特異的に検出で
きる qPCR 用のプライマー及びプローブを設計した。
・qPCR より得られた α-Ad 遺伝子の相対コピー数（16S rRNA 遺伝子のコピー数
に対する比）は、MPN 法で得られたアニリン分解菌数ならびに BOD 測定で
得られたアニリン分解の誘導期（アニリン分解活性）と良好な相関を示した。
・以上より、生分解性試験に用いる活性汚泥の評価に本手法が適用可能である
ことが示された。
・本手法は、MPN 法、BOD 測定等の長期間の培養を必要とする手法と比較して、
活性汚泥の評価にかかる時間を劇的に短縮できる。
・本研究において、下水処理場によって活性汚泥が有するアニリン分解活性が
大きく異なることを明らかにした。
・本手法は、アニリン分解菌だけでなく環境汚染物質であるアニリン誘導体を
資化する細菌の検出にも有効であり、新たな環境モニタリングツールとして
の応用が期待できる。
106
107
29.1
29.1
29.1
29.1
29.1
25.7
25.7
25.7
Aniline dioxygenase terminal oxygenase component (alpha subunit) [Burkholderia sp. JS667]
Terminal dioxygenase large subunit [Delftia tsuruhatensis]
Large subunit of aniline dioxygenase [Delftia acidovorans]
Large subunit of dioxygenase [Delftia acidovorans]
Large subunit of terminal dioxygenase [P. putida]
hypothetical protein ACD_79C00816G0002 [uncultured bacterium]
Aspartate carbamoyltransferase [Natranaerobius thermophilus JW/NM-WN-LF]
>sp|B2A2U7.1|PYRB_NATTJ RecName: Full=Aspartate carbamoyltransferase; AltName:
Full=Aspartate transcarbamylase; Short=ATCase >gb|ACB86315.1| Aspartate
carbamoyltransferase [Natranaerobius thermophilus JW/NM-WN-LF]
Aspartate carbamoyltransferase [beta proteobacterium KB13] >gb|EDZ65166.1| Aspartate
carbamoyltransferase [beta proteobacterium KB13]
ACO92656.1
AAX47241.1
BAD61049.1
AAO38208.1
BAA12807.1
EKD27198.1
YP_001918903.1
ZP_05082479.1
29.1
29.1
29.1
29.1
29.1
29.1
29.1
Putative aromatic-ring-hydroxylating dioxygenase alpha subunit [Gordonia alkanivorans NBRC
16433] >dbj|GAA11620.1| putative aromatic-ring-hydroxylating dioxygenase alpha subunit
[Gordonia alkanivorans NBRC 16433]
Large subunit of dioxygenase [Comamonas testosteroni] >gb|AEX00570.1| DcaA1
[Comamonas testosteroni]
DcaA1 [Delftia acidovorans] >gb|AEX00486.1| DcaA1 [Delftia acidovorans]
Protein DcaA1 [Comamonas testosteroni] >gb|AEX00425.1| DcaA1 [Comamonas testosteroni]
DcaA1 [Delftia acidovorans] >ref|YP_006961868.1| CaoA1 [Delftia acidovorans]
>gb|AEA41912.1| CaoA1 [Delftia acidovorans] >gb|AEX00655.1| DcaA1 [Delftia acidovorans]
Dichloroaniline dioxygenase large subunit [Variovorax sp. SRS16]
Putative aromatic hydrocarbon dioxygenase large subunit [Gordonia rubripertincta NBRC
101908] >dbj|GAB83329.1| Putative aromatic hydrocarbon dioxygenase large subunit
[Gordonia rubripertincta NBRC 101908]
ZP_08764694.1
AEO20097.1
YP_006961487.1
YP_006961403.1
YP_005351573.1
YP_005352103.1
ZP_11240095.1
25.7
25.7
29.1
29.1
29.1
29.1
29.1
25.7
29.1
29.1
29.1
29.1
29.1
29.1
29.1
87%
87%
100%
100%
100%
100%
100%
87%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
89
89
7.3
7.3
7.3
7.3
7.3
89
7.3
7.3
7.3
7.3
7.3
7.3
7.3
Appendix 2a
Results of the homology search for bacterial proteins with similar amino acid sequences to that used for designing the forward primer (entry query: DNAGDGYH)
Max.
Total
Query
Accession
Description
E value
score
score
coverage
AAW66669.1
Aniline dioxygenase alpha-subunit [Acinetobacter sp. GXA7]
29.1
29.1
100%
7.3
BAA13012.1
Aniline dioxygenase alpha-subunit [Acinetobacter sp. YAA]
29.1
29.1
100%
7.3
Rieske (2Fe-2S) domain-containing protein [Nocardioides sp. JS614] >gb|ABL80349.1| Rieske
YP_922036.1
29.1
29.1
100%
7.3
(2Fe-2S) domain protein [Nocardioides sp. JS614]
Large subunit of aniline dioxygenase [Rhodococcus sp. AN-22] >dbj|BAI63575.1| Aniline
BAH56716.1
29.1
29.1
100%
7.3
dioxygenase [Rhodococcus sp. AN-22]
BAH90222.1
Ring hydroxylating dioxygenase alpha subunit [uncultured bacterium]
29.1
29.1
100%
7.3
BAC82526.1
Large subunit of terminal dioxygenase in aniline dioxygenase [Frateuria sp. ANA-18]
29.1
29.1
100%
7.3
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Max.
identity
100%
100%
108
YP_004550482.1
EHK76254.1
EJL42467.1
YP_004609823.1
NP_387271.1
NP_104980.1
ZP_08991632.1
YP_004140430.1
ZP_11314045.1
peptidase M23 [Sinorhizobium meliloti AK83] >ref|YP_005715075.1| Peptidase M23
[Sinorhizobium meliloti BL225C] >ref|YP_006841834.1| Peptidase M23 [Sinorhizobium meliloti
Rm41] >gb|AEG05832.1| Peptidase M23 [Sinorhizobium meliloti BL225C] >gb|AEG54868.1|
Peptidase M23 [Sinorhizobium meliloti AK83] >emb|CCM69008.1| Peptidase M23
[Sinorhizobium meliloti Rm41]
Peptidase M23 [Mesorhizobium ciceri biovar biserrulae WSM1271] >gb|ADV10380.1| Peptidase
M23 [Mesorhizobium ciceri biovar biserrulae WSM1271]
Peptidase M23 [Mesorhizobium australicum WSM2073] >gb|EHB70052.1| Peptidase M23
[Mesorhizobium australicum WSM2073]
Filament-A [Mesorhizobium loti MAFF303099] >dbj|BAB50766.1| Filament-A precursor
[Mesorhizobium loti MAFF303099]
Signal peptide protein [Sinorhizobium meliloti 1021] >emb|CAC47744.1| Hypothetical signal
peptide protein [Sinorhizobium meliloti 1021]
Peptidase M23 [Mesorhizobium opportunistum WSM2075] >gb|AEH85729.1| Peptidase M23
[Mesorhizobium opportunistum WSM2075]
Putative signal peptide protein [Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020]
Membrane-bound metallopeptidase [Rhizobium sp. CF080]
Rieske (2Fe-2S) domain-containing protein [Bacillus azotoformans LMG 9581]
>gb|EKN64313.1| Rieske (2Fe-2S) domain-containing protein [Bacillus azotoformans LMG
9581]
25.7
25.7
25.7
25.7
25.7
25.7
25.7
25.7
25.7
25.7
25.7
25.7
25.7
25.7
25.7
25.7
25.7
25.7
87%
87%
87%
87%
87%
87%
87%
87%
100%
91
91
91
91
91
91
91
91
91
Appendix 2a (continued)
Results of the homology search for bacterial proteins with similar amino acid sequences to that used for designing the forward primer (entry query: DNAGDGYH)
Max.
Total
Query
Accession
Description
E value
score
score
coverage
Peptidase M23, partial [Mesorhizobium amorphae CCNWGS0123] >gb|EHH09122.1| Peptidase
ZP_09090234.1
25.7
25.7
87%
91
M23, partial [Mesorhizobium amorphae CCNWGS0123]
Peptidase M23B [Nitratireductor pacificus pht-3B] >gb|EKF18768.1| Peptidase M23B
ZP_11125825.1
25.7
25.7
87%
91
[Nitratireductor pacificus pht-3B]
Peptidase M23B [Nitratireductor indicus C115] >gb|EKF41890.1| Peptidase M23B
ZP_11156033.1
25.7
25.7
87%
91
[Nitratireductor indicus C115]
Peptidase M23B [Nitratireductor aquibiodomus RA22] >gb|EIM73753.1| Peptidase M23B
ZP_10236215.1
25.7
25.7
87%
91
[Nitratireductor aquibiodomus RA22]
Rieske (2Fe-2S) iron-sulfur domain protein [Bacillus sp. 1NLA3E] >gb|EHP27726.1| Rieske
ZP_09599168.1
25.7
25.7
100%
91
(2Fe-2S) iron-sulfur domain protein [Bacillus sp. 1NLA3E]
M23 peptidase domain-containing protein [Polymorphum gilvum SL003B-26A1]
YP_004305877.1
25.7
25.7
87%
91
>gb|ADZ72571.1| M23 peptidase domain protein [Polymorphum gilvum SL003B-26A1]
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
88%
100%
88%
100%
100%
100%
100%
Max.
identity
109
23.1
23.1
Filament-A precursor [Mesorhizobium alhagi CCNWXJ12-2] >gb|EHK58307.1| Filament-A
precursor [Mesorhizobium alhagi CCNWXJ12-2]
ZP_09291716.1
23.1
23.1
23.1
Rieske (2fe-2S) iron-sulfur domain-containing protein [Asticcacaulis excentricus CB 48]
>gb|ADU13805.1| Rieske (2Fe-2S) iron-sulfur domain protein [Asticcacaulis excentricus CB 48]
2-Halobenzoate dioxygenase [Burkholderia sp. 2CBA]
4-Diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase [Moorea producens 3L] >gb|EGJ35181.1|
4-Diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase [Moorea producens 3L]
Hypothetical protein PDENDC454_05691 [Paenibacillus dendritiformis C454]
>gb|EHQ63351.1| hypothetical protein PDENDC454_05691 [Paenibacillus dendritiformis C454]
YP_004087956.1
ZP_08425437.1
AAP70014.1
ZP_09675413.1
23.1
23.1
23.1
23.1
23.1
87%
100%
87%
100%
100%
579
576
573
570
567
Appendix 2a (continued)
Results of the homology search for bacterial proteins with similar amino acid sequences to that used for designing the forward primer (entry query: DNAGDGYH)
Max.
Total
Query
Accession
Description
E value
score
score
coverage
Peptidase M23B [Sinorhizobium meliloti SM11] >gb|AEH80526.1| Peptidase M23B
YP_005721787.1
25.7
25.7
87%
91
[Sinorhizobium meliloti SM11]
Peptidase M23B [Sinorhizobium medicae WSM419] >gb|ABR61842.1| Peptidase M23B
YP_001328677.1
25.7
25.7
87%
91
[Sinorhizobium medicae WSM419]
peptidase M23 [Hyphomicrobium sp. MC1] >emb|CCB68096.1| Peptidase M23
YP_004678660.1
25.7
25.7
87%
91
[Hyphomicrobium sp. MC1]
Cell cycle protein [Paenibacillus lactis 154] >gb|EHB65693.1| Cell cycle protein [Paenibacillus
ZP_09000519.1
24.4
24.4
100%
229
lactis 154]
Short-chain dehydrogenase/reductase SDR [Terriglobus saanensis SP1PR4] >gb|ADV84841.1|
YP_004184835.1
24
24
100%
306
Short-chain dehydrogenase/reductase SDR [Terriglobus saanensis SP1PR4]
Hypothetical protein CAAU_2343 [Caloramator australicus RC3] >emb|CCJ34427.1|
ZP_10507092.1
24
24
100%
308
Hypothetical protein CAAU_2343 [Caloramator australicus RC3]
Hemolysin-type calcium binding protein, partial [Verminephrobacter aporrectodeae subsp.
ZP_08875672.1
23.1
23.1
100%
525
tuberculatae At4]
ZP_03512446.1
Putative metalloendopeptidase protein [Rhizobium etli 8C-3]
23.1
23.1
87%
540
ZP_03520698.1
Putative metalloendopeptidase protein [Rhizobium etli GR56]
23.1
23.1
87%
567
86%
75%
86%
75%
75%
86%
86%
75%
75%
75%
88%
100%
100%
100%
Max.
identity
110
29.5
29.5
29.5
29.5
29.5
29.5
29.5
29.5
Ring hydroxylating dioxygenase alpha subunit [uncultured bacterium]
Large subunit of terminal dioxygenase in aniline dioxygenase [Frateuria sp. ANA-18]
Putative aromatic hydrocarbon dioxygenase large subunit [Gordonia rubripertincta NBRC
101908] >dbj|GAB83329.1| Putative aromatic hydrocarbon dioxygenase large subunit [Gordonia
rubripertincta NBRC 101908]
large subunit of dioxygenase [Comamonas testosteroni] >gb|AEX00570.1| DcaA1 [Comamonas
testosteroni]
DcaA1 [Delftia acidovorans] >gb|AEX00486.1| DcaA1 [Delftia acidovorans]
Protein DcaA1 [Comamonas testosteroni] >gb|AEX00425.1| DcaA1 [Comamonas testosteroni]
DcaA1 [Delftia acidovorans] >ref|YP_006961868.1| CaoA1 [Delftia acidovorans]
>gb|AEA41912.1| CaoA1 [Delftia acidovorans] >gb|AEX00655.1| DcaA1 [Delftia acidovorans]
Dichloroaniline dioxygenase large subunit [Variovorax sp. SRS16]
Putative aromatic-ring-hydroxylating dioxygenase alpha subunit [Gordonia alkanivorans NBRC
16433] >dbj|GAA11620.1| Putative aromatic-ring-hydroxylating dioxygenase alpha subunit
[Gordonia alkanivorans NBRC 16433]
Aniline dioxygenase terminal oxygenase component (alpha subunit) [Burkholderia sp. JS667]
Terminal dioxygenase large subunit [Delftia tsuruhatensis]
Large subunit of aniline dioxygenase [Delftia acidovorans]
BAH90222.1
BAC82526.1
ZP_11240095.1
YP_005352103.1
YP_006961403.1
YP_005351573.1
YP_006961487.1
AEO20097.1
ZP_08764694.1
ACO92656.1
AAX47241.1
BAD61049.1
BAH56716.1
29.5
29.5
29.5
29.5
29.5
29.5
ZP_11314045.1
YP_922036.1
29.5
29.5
Rieske (2Fe-2S) iron-sulfur domain protein [Bacillus sp. 1NLA3E] >gb|EHP27726.1| Rieske
(2Fe-2S) iron-sulfur domain protein [Bacillus sp. 1NLA3E]
ZP_09599168.1
Rieske (2Fe-2S) domain-containing protein [Nocardioides sp. JS614] >gb|ABL80349.1| Rieske
(2Fe-2S) domain protein [Nocardioides sp. JS614]
Rieske (2Fe-2S) domain-containing protein [Bacillus azotoformans LMG 9581]
>gb|EKN64313.1| Rieske (2Fe-2S) domain-containing protein [Bacillus azotoformans LMG
9581]
Large subunit of aniline dioxygenase [Rhodococcus sp. AN-22] >dbj|BAI63575.1| Aniline
dioxygenase [Rhodococcus sp. AN-22]
29.5
29.5
Aniline dioxygenase alpha-subunit [Acinetobacter sp. GXA7]
Aniline dioxygenase alpha-subunit [Acinetobacter sp. YAA]
AAW66669.1
BAA13012.1
29.5
29.5
29.5
29.5
29.5
29.5
29.5
29.5
29.5
29.5
29.5
29.5
29.5
29.5
29.5
29.5
45.4
29.5
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
5.3
5.3
5.3
5.3
5.3
5.3
5.3
5.3
5.3
5.3
5.3
5.3
5.3
5.3
5.3
5.3
5.3
5.3
Appendix 2b
Results of the homology search for bacterial proteins with similar amino acid sequences to that used for designing the reverse primer (entry query: QRPQPGRE)
Max.
Total
Query
Accession
Description
E value
score
score
coverage
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Max.
identity
111
26.9
26.1
26.1
Putative penicillin-binding protein 2 [Prevotella veroralis F0319]
Hypothetical protein RGE_28460 [Rubrivivax gelatinosus IL144] >dbj|BAL96185.1|
Hypothetical protein RGE_28460 [Rubrivivax gelatinosus IL144]
Hypothetical protein LH128_15756 [Sphingomonas sp. LH128] >gb|EJU12060.1| Hypothetical
protein LH128_15756 [Sphingomonas sp. LH128]
Hypothetical protein PMI02_00159 [Novosphingobium sp. AP12] >gb|EJL35327.1| Hypothetical
protein PMI02_00159 [Novosphingobium sp. AP12]
EEX18007.1
YP_005437684.1
ZP_10873773.1
ZP_10743886.1
YP_003486463.1
ZP_07292038.1
ZP_09996623.1
CCK31779.1
ZP_09677959.1
YP_003112743.1
Hypothetical protein AthiA1_08084 [Acidithiobacillus thiooxidans ATCC 19377]
Formyltetrahydrofolate deformylase [Streptomyces davawensis JCM 4913]
Formyltetrahydrofolate deformylase [Streptomyces hygroscopicus ATCC 53653]
>gb|EFL20407.1| Formyltetrahydrofolate deformylase [Streptomyces himastatinicus ATCC
53653]
Formyltetrahydrofolate deformylase [Streptomyces scabiei 87.22] >emb|CBG67892.1| Putative
formyltetrahydrofolate deformylase [Streptomyces scabiei 87.22]
Hypothetical protein HMPREF9694_05520 [Klebsiella oxytoca 10-5250]
Peptidyl-tRNA hydrolase, partial [Paenibacillus popilliae ATCC 14706]
XRE family transcriptional regulator [Catenulispora acidiphila DSM 44928] >gb|ACU70902.1|
transcriptional regulator, XRE family [Catenulispora acidiphila DSM 44928]
Peptidyl-tRNA hydrolase [Paenibacillus dendritiformis C454] >gb|EHQ60776.1| Peptidyl-tRNA
hydrolase [Paenibacillus dendritiformis C454]
26.9
Penicillin-binding protein 2 [Prevotella sp. oral taxon 306 str. F0472] >gb|EID33218.1|
Penicillin-binding protein 2 [Prevotella sp. oral taxon 306 str. F0472]
ZP_09967131.1
EHT05195.1
GAC42450.1
26.9
Hypothetical protein RER_42570 [R. erythropolis PR4] >dbj|BAH34965.1| Conserved
hypothetical protein [R. erythropolis PR4]
YP_002767704.1
26.1
26.1
26.1
26.1
26.1
26.1
26.1
26.1
26.1
26.9
26.9
Hypothetical protein BN6_07870 [Saccharothrix espanaensis DSM 44229]
Hypothetical protein RhP14_05244 [Rhodococcus sp. P14]
CCH28116.1
ZP_11104353.1
26.9
Transcriptional regulator, Fis family [R. erythropolis SK121] >gb|EEN86945.1| Transcriptional
regulator, Fis family [R. erythropolis SK121]
ZP_04385751.1
26.1
26.1
63.8
26.1
26.1
26.1
26.1
26.1
26.1
26.1
26.1
26.9
26.9
26.9
26.9
26.9
26.9
87%
87%
87%
87%
87%
87%
87%
87%
87%
87%
87%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
65
65
64
65
63
62
60
61
58
58
47
36
36
36
36
36
36
Appendix 2b (continued)
Results of the homology search for bacterial proteins with similar amino acid sequences to that used for designing the reverse primer (entry query: QRPQPGRE)
Max.
Total
Query
Accession
Description
E value
score
score
coverage
AAO38208.1
Large subunit of dioxygenase [Delftia acidovorans]
29.5
29.5
100%
5.3
BAA12807.1
large subunit of terminal dioxygenase [P. putida]
29.5
29.5
100%
5.3
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
88%
88%
88%
88%
88%
88%
Max.
identity
100%
100%
112
24.4
Putative ATP adenylyltransferase [Azoarcus sp. BH72] >emb|CAL94144.1| Putative ATP
adenylyltransferase [Azoarcus sp. BH72]
YP_933031.1
EGC19357.1
EGW46648.1
YP_003813528.1
Putative penicillin-binding protein 2 [Prevotella melaninogenica D18] >gb|EFC72932.1|
Putative penicillin-binding protein 2 [Prevotella melaninogenica D18]
Putative penicillin-binding protein 2 [Prevotella melaninogenica ATCC 25845]
>gb|ADK96017.1| Putative penicillin-binding protein 2 [Prevotella melaninogenica ATCC
25845]
Penicillin-binding protein 2 [Prevotella multiformis DSM 16608]
Hypothetical protein HMPREF0666_02139 [Prevotella sp. C561]
ZP_05062487.1
ZP_06408412.1
tRNA nucleotidyltransferase [gamma proteobacterium HTCC5015] >gb|EDY85611.1| tRNA
nucleotidyltransferase [gamma proteobacterium HTCC5015]
ZP_09516278.1
YP_003266659.1
ZP_01770504.1
24
24
24
24
24
24
24
23.5
24.4
26.1
Acyl-CoA synthetase [Mycobacterium rhodesiae NBB3] >gb|AEV70754.1| Acyl-CoA
synthetase (AMP-forming)/AMP-acid ligase II [Mycobacterium rhodesiae NBB3]
YP_004997969.1
Cellobiohydrolase A [R. opacus M213]
Hypothetical protein BURPS305_0401 [Burkholderia pseudomallei 305] >ref|ZP_03454897.1|
Conserved hypothetical protein [Burkholderia pseudomallei 576] >ref|YP_002896102.1|
Hypothetical protein GBP346_A1388 [Burkholderia pseudomallei MSHR346]
>ref|ZP_04904689.1| Hypothetical protein BURPSS13_P0032 [Burkholderia pseudomallei S13]
>ref|ZP_04950478.1| Hypothetical protein BURPS1710A_1690 [Burkholderia pseudomallei
1710a] >gb|EBA44892.1| Hypothetical protein BURPS305_0401 [Burkholderia pseudomallei
305] >gb|EDS87701.1| Hypothetical protein BURPSS13_P0032 [Burkholderia pseudomallei
S13] >gb|EEC33275.1| Conserved hypothetical protein [Burkholderia pseudomallei 576]
>gb|ACQ95970.1| Conserved hypothetical protein [Burkholderia pseudomallei MSHR346]
>gb|EET07497.1| Hypothetical protein BURPS1710A_1690 [Burkholderia pseudomallei 1710a]
Hypothetical protein [Haliangium ochraceum DSM 14365] >gb|ACY14766.1| hypothetical
protein Hoch_2221 [Haliangium ochraceum DSM 14365]
Hypothetical protein OS124_11363 [Oceanicola sp. S124]
26.1
Signal transduction histidine kinase [Novosphingobium pentaromativorans US6-1]
>gb|EHJ60465.1| Signal transduction histidine kinase [Novosphingobium pentaromativorans
US6-1]
ZP_09192909.1
EIM43043.1
26.1
Hypothetical protein CYB_0462 [Synechococcus sp. JA-2-3B'a(2-13)] >gb|ABD01455.1|
Conserved hypothetical protein [Synechococcus sp. JA-2-3B'a(2-13)]
YP_476718.1
24
24
24
24
24
24
24
23.5
24.4
24.4
26.1
26.1
26.1
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
87%
100%
100%
87%
87%
87%
318
318
318
318
312
308
308
294
234
226
67
66
66
Appendix 2b (continued)
Results of the homology search for bacterial proteins with similar amino acid sequences to that used for designing the reverse primer (entry query: QRPQPGRE)
Max.
Total
Query
Accession
Description
E value
score
score
coverage
75%
75%
75%
75%
88%
88%
75%
86%
88%
73%
100%
100%
100%
Max.
identity
113
29.5
29.5
29.5
29.5
29.5
Rieske (2Fe-2S) domain-containing protein [Nocardioides sp. JS614] >gb|ABL80349.1| Rieske
(2Fe-2S) domain protein [Nocardioides sp. JS614]
Large subunit of aniline dioxygenase [Rhodococcus sp. AN-22] >dbj|BAI63575.1| Aniline
dioxygenase [Rhodococcus sp. AN-22]
Large subunit of terminal dioxygenase in aniline dioxygenase [Frateuria sp. ANA-18]
Putative aromatic hydrocarbon dioxygenase large subunit [Gordonia rubripertincta NBRC
101908] >dbj|GAB83329.1| Putative aromatic hydrocarbon dioxygenase large subunit [Gordonia
rubripertincta NBRC 101908]
Putative aromatic-ring-hydroxylating dioxygenase alpha subunit [Gordonia alkanivorans NBRC
16433] >dbj|GAA11620.1| Putative aromatic-ring-hydroxylating dioxygenase alpha subunit
[Gordonia alkanivorans NBRC 16433]
Ring hydroxylating dioxygenase alpha subunit [uncultured bacterium]
YP_922036.1
BAH56716.1
BAC82526.1
ZP_11240095.1
ZP_08764694.1
BAH90222.1
24.4
24.4
Aldo/keto reductase [Algoriphagus sp. PR1] >gb|EAZ79327.1| Aldo/keto reductase
[Algoriphagus sp. PR1]
Hypothetical protein AoriK_02305 [Actinomyces oris K20]
Hypothetical protein WG8_0431 [Paenibacillus sp. Aloe-11] >gb|EHS59478.1| Hypothetical
protein WG8_0431 [Paenibacillus sp. Aloe-11]
ZP_07721774.1
ZP_08125291.1
ZP_09771907.1
YP_006961403.1
YP_005351573.1
24.4
24.4
24.4
26.1
General stress protein 69 [Cecembia lonarensis LW9] >gb|EKB49227.1| General stress protein
69 [Cecembia lonarensis LW9]
ZP_11070139.1
Large subunit of dioxygenase [Comamonas testosteroni] >gb|AEX00570.1| DcaA1 [Comamonas
testosteroni]
DcaA1 [Delftia acidovorans] >gb|AEX00486.1| DcaA1 [Delftia acidovorans]
Protein DcaA1 [Comamonas testosteroni] >gb|AEX00425.1| DcaA1 [Comamonas testosteroni]
26.1
Terminal dioxygenase large subunit [Delftia tsuruhatensis]
Large subunit of aniline dioxygenase [Delftia acidovorans]
Large subunit of terminal dioxygenase [P. putida]
RTX toxin [P. syringae pv. avellanae str. ISPaVe013]
AAX47241.1
BAD61049.1
BAA12807.1
EKG36301.1
YP_005352103.1
26.9
26.9
26.9
26.9
Aniline dioxygenase terminal oxygenase component (alpha subunit) [Burkholderia sp. JS667]
ACO92656.1
26.9
26.9
29.5
29.5
Aniline dioxygenase alpha-subunit [Acinetobacter sp. GXA7]
Aniline dioxygenase alpha-subunit [Acinetobacter sp. YAA]
AAW66669.1
BAA13012.1
24.4
24.4
24.4
24.4
24.4
26.1
26.1
26.9
26.9
26.9
26.9
26.9
26.9
29.5
29.5
29.5
29.5
29.5
29.5
29.5
100%
100%
100%
100%
100%
87%
87%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
230
230
230
165
155
67
67
36
36
36
36
36
36
5.3
5.3
5.3
5.3
5.3
5.3
5.3
Appendix 2c
Results of the homology search for bacterial proteins with similar amino acid sequences to that used for designing the TaqMan probe (entry query: HSVIDQRP)
Max.
Total
Query
Accession
Description
E value
score
score
coverage
75%
75%
75%
73%
88%
100%
100%
88%
88%
88%
88%
88%
88%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Max.
identity
114
YP_003868774.1
23.5
23.5
23.5
Cobalamin biosynthesis protein [Burkholderia phymatum STM815] >gb|ACC71380.1|
cobalamin biosynthesis protein CobD [Burkholderia phymatum STM815]
ISXo7 transposase [Polaromonas naphthalenivorans CJ2] >gb|ABM39020.1| ISXo7 transposase
[Polaromonas naphthalenivorans CJ2]
YP_001858426.1
YP_983941.1
23.5
23.5
23.5
23.5
23.5
Cobalamin biosynthesis protein [Burkholderia terrae BS001] >gb|EIM96736.1| Cobalamin
biosynthesis protein [Burkholderia terrae BS001]
2'-5' RNA ligase [Halomonas sp. KM-1]
CRISPR-associated protein Cas4 [Thermoanaerobacter siderophilus SR4] >gb|EIV99633.1|
CRISPR-associated protein Cas4 [Thermoanaerobacter siderophilus SR4]
Tetratricopeptide repeat protein [Klebsiella sp. OBRC7] >gb|EHS99518.1| Hypothetical protein
HMPREF9686_01380 [Klebsiella oxytoca 10-5242] >gb|EJU29481.1| Tetratricopeptide repeat
protein [Klebsiella sp. OBRC7]
CRISPR-associated protein Cas4 [Thermoanaerobacter ethanolicus JW 200] >gb|EGD50818.1|
CRISPR-associated protein Cas4 [Thermoanaerobacter ethanolicus JW 200]
Cobalamin biosynthesis protein CobD [Burkholderia sp. BT03]
23.5
ZP_10253421.1
EJL52315.1
ZP_08213142.1
ZP_10890528.1
ZP_10305084.1
ZP_10776589.1
YP_002775581.1
24
24.4
Signal transduction protein with a C-terminal ATPase domain [Paenibacillus polymyxa E681]
>gb|ADM68236.1| Predicted signal transduction protein with a C-terminal ATPase domain
[Paenibacillus polymyxa E681]
YP_003944631.1
30S ribosomal protein S16 [Bifidobacterium longum subsp. longum JDM301] >gb|ADG99842.1|
30S ribosomal protein S16 [Bifidobacterium longum subsp. longum JDM301]
Hypothetical protein BBU29805_K15 [Borrelia burgdorferi 29805] >gb|ACO38552.1|
Hypothetical protein BBU29805_K15 [Borrelia burgdorferi 29805]
24.4
Integral membrane sensor signal transduction histidine kinase [Paenibacillus polymyxa SC2]
>ref|YP_005958023.1| Histidine kinase,histidine kinase, HAMP region [Paenibacillus polymyxa
M1] >gb|ADO54390.1| Integral membrane sensor signal transduction histidine kinase
[Paenibacillus polymyxa SC2] >emb|CCC83316.1| Histidine kinase,histidine kinase, HAMP
region [Paenibacillus polymyxa M1]
YP_003660672.1
24.4
24.4
24.4
24.4
signal transduction protein with a C-terminal ATPase domain [Paenibacillus terrae HPL-003]
>gb|AET58673.1| signal transduction protein with a C-terminal ATPase domain [Paenibacillus
terrae HPL-003]
DcaA1 [Delftia acidovorans] >ref|YP_006961868.1| CaoA1 [Delftia acidovorans]
>gb|AEA41912.1| CaoA1 [Delftia acidovorans] >gb|AEX00655.1| DcaA1 [Delftia acidovorans]
Dichloroaniline dioxygenase large subunit [Variovorax sp. SRS16]
Large subunit of dioxygenase [Delftia acidovorans]
YP_005074896.1
AEO20097.1
AAO38208.1
YP_006961487.1
23.5
23.5
23.5
23.5
23.5
23.5
23.5
23.5
23.5
24
24.4
24.4
24.4
24.4
24.4
24.4
87%
100%
100%
100%
100%
87%
100%
87%
87%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
421
421
421
421
409
408
406
406
339
313
232
232
232
230
230
230
Appendix 2c (continued)
Results of the homology search for bacterial proteins with similar amino acid sequences to that used for designing the TaqMan probe (entry query: HSVIDQRP)
Max.
Total
Query
Accession
Description
E value
score
score
coverage
86%
75%
75%
75%
75%
86%
75%
86%
86%
88%
73%
73%
73%
75%
75%
75%
Max.
identity
115
23.1
23.1
Putative acetyltransferase [Sphingobium sp. AP49] >gb|EJK85245.1| Putative acetyltransferase
[Sphingobium sp. AP49]
Hypothetical protein MED193_21179 [Roseobacter sp. MED193] >gb|EAQ47747.1|
Hypothetical protein MED193_21179 [Roseobacter sp. MED193]
ZP_01055256.1
23.1
23.1
23.1
23.1
ZP_10541502.1
CCK24929.1
ZP_07819309.1
NP_105980.1
Hypothetical protein Mesop_0219 [Mesorhizobium opportunistum WSM2075]
>gb|AEH84714.1| Conserved hypothetical protein [Mesorhizobium opportunistum WSM2075]
Hypothetical protein mll5290 [Mesorhizobium loti MAFF303099] >dbj|BAB51766.1| mll5290
[Mesorhizobium loti MAFF303099]
Ribosomal-protein-alanine acetyltransferase [Eremococcus coleocola ACS-139-V-Col8]
>gb|EFR30728.1| Ribosomal-protein-alanine acetyltransferase [Eremococcus coleocola
ACS-139-V-Col8]
Hypothetical protein BN159_0550 [Streptomyces davawensis JCM 4913]
23.1
Hypothetical protein MEA186_35604 [Mesorhizobium amorphae CCNWGS0123]
>gb|EHH02285.1| Hypothetical protein MEA186_35604 [Mesorhizobium amorphae
CCNWGS0123]
ZP_09092231.1
YP_004608808.1
23.1
Hypothetical protein [Mesorhizobium ciceri biovar biserrulae WSM1271] >gb|ADV09389.1|
Hypothetical protein Mesci_0216 [Mesorhizobium ciceri biovar biserrulae WSM1271]
YP_004139439.1
23.1
23.1
23.5
23.5
Hypothetical protein MesauDRAFT_3618 [Mesorhizobium australicum WSM2073]
>gb|EHB69011.1| hypothetical protein MesauDRAFT_3618 [Mesorhizobium australicum
WSM2073]
Hypothetical protein MJ3_12799 [Salimicrobium sp. MJ3] >gb|EKE30554.1| Hypothetical
protein MJ3_12799 [Salimicrobium sp. MJ3]
Hypothetical protein MC7420_548 [Microcoleus chthonoplastes PCC 7420] >gb|EDX77411.1|
Hypothetical protein MC7420_548 [Microcoleus chthonoplastes PCC 7420]
Conserved hypothetical protein [Flavobacteria bacterium BBFL7] >gb|EAS19833.1| Conserved
hypothetical protein [Flavobacteria bacterium BBFL7]
ZP_08992039.1
ZP_05024848.1
ZP_11144714.1
ZP_01201771.1
23.1
23.1
23.1
23.1
23.1
23.1
23.1
23.1
23.1
23.1
23.5
23.5
87%
75%
75%
75%
75%
75%
75%
75%
75%
75%
87%
87%
557
554
553
548
544
544
544
544
544
517
430
427
Appendix 2c (continued)
Results of the homology search for bacterial proteins with similar amino acid sequences to that used for designing the TaqMan probe (entry query: HSVIDQRP)
Max.
Total
Query
Accession
Description
E value
score
score
coverage
ISXo7 transposase [Polaromonas naphthalenivorans CJ2] >ref|YP_981109.1| ISXo7 transposase
[Polaromonas naphthalenivorans CJ2] >ref|YP_981628.1| ISXo7 transposase [Polaromonas
YP_980661.1
naphthalenivorans CJ2] >gb|ABM35740.1| ISXo7 transposase [Polaromonas naphthalenivorans
23.5
23.5
87%
423
CJ2] >gb|ABM36188.1| ISXo7 transposase [Polaromonas naphthalenivorans CJ2]
>gb|ABM36707.1| ISXo7 transposase [Polaromonas naphthalenivorans CJ2]
Late competence protein [Planococcus antarcticus DSM 14505] >gb|EIM07305.1| Late
ZP_10207767.1
23.5
23.5
87%
424
competence protein [Planococcus antarcticus DSM 14505]
86%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
86%
86%
86%
86%
Max.
identity
116
26.9
26.9
26.9
26.9
26.9
26.1
26.1
Rieske (2Fe-2S) domain-containing protein [Nocardioides sp. JS614] >gb|ABL80349.1| Rieske
(2Fe-2S) domain protein [Nocardioides sp. JS614]
Large subunit of aniline dioxygenase [Rhodococcus sp. AN-22] >dbj|BAI63575.1| Aniline
dioxygenase [Rhodococcus sp. AN-22]
Large subunit of terminal dioxygenase in aniline dioxygenase [Frateuria sp. ANA-18]
Putative aromatic hydrocarbon dioxygenase large subunit [Gordonia rubripertincta NBRC
101908] >dbj|GAB83329.1| Putative aromatic hydrocarbon dioxygenase large subunit [Gordonia
rubripertincta NBRC 101908]
Putative aromatic-ring-hydroxylating dioxygenase alpha subunit [Gordonia alkanivorans NBRC
16433] >dbj|GAA11620.1| Putative aromatic-ring-hydroxylating dioxygenase alpha subunit
[Gordonia alkanivorans NBRC 16433]
Putative acetyltransferase [Sphingobium sp. AP49] >gb|EJK85245.1| Putative acetyltransferase
[Sphingobium sp. AP49]
Rieske (2Fe-2S) iron-sulfur domain protein [Bacillus sp. 1NLA3E] >gb|EHP27726.1| Rieske
(2Fe-2S) iron-sulfur domain protein [Bacillus sp. 1NLA3E]
BAH56716.1
BAC82526.1
ZP_11240095.1
ZP_08764694.1
ZP_10541502.1
ZP_09599168.1
27.4
27.4
26.9
26.9
27.4
27.4
27.4
YP_922036.1
AEO20097.1
AAO38208.1
AAW66669.1
BAA13012.1
YP_006961487.1
DcaA1 [Delftia acidovorans] >gb|AEX00486.1| DcaA1 [Delftia acidovorans]
Protein DcaA1 [Comamonas testosteroni] >gb|AEX00425.1| DcaA1 [Comamonas testosteroni]
DcaA1 [Delftia acidovorans] >ref|YP_006961868.1| CaoA1 [Delftia acidovorans]
>gb|AEA41912.1| CaoA1 [Delftia acidovorans] >gb|AEX00655.1| DcaA1 [Delftia acidovorans]
Dichloroaniline dioxygenase large subunit [Variovorax sp. SRS16]
Large subunit of dioxygenase [Delftia acidovorans]
Aniline dioxygenase alpha-subunit [Acinetobacter sp. GXA7]
Aniline dioxygenase alpha-subunit [Acinetobacter sp. YAA]
27.4
Large subunit of dioxygenase [Comamonas testosteroni] >gb|AEX00570.1| DcaA1 [Comamonas
testosteroni]
YP_005352103.1
YP_006961403.1
YP_005351573.1
29.9
29.9
29.9
29.9
29.9
Ring hydroxylating dioxygenase alpha subunit [uncultured bacterium]
Aniline dioxygenase terminal oxygenase component (alpha subunit) [Burkholderia sp. JS667]
Terminal dioxygenase large subunit [Delftia tsuruhatensis]
Large subunit of aniline dioxygenase [Delftia acidovorans]
Large subunit of terminal dioxygenase [P. putida]
BAH90222.1
ACO92656.1
AAX47241.1
BAD61049.1
BAA12807.1
26.1
26.1
26.9
26.9
26.9
26.9
26.9
27.4
27.4
26.9
26.9
27.4
27.4
27.4
27.4
29.9
29.9
29.9
29.9
29.9
100%
87%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
66
62
36
36
36
36
36
26
26
35
35
26
26
26
26
3.9
3.9
3.9
3.9
3.9
Appendix 2d
Results of the homology search for bacterial proteins with similar amino acid sequences to that used for designing the TaqMan probe (entry query: HTVIDQRP)
Max.
Total
Query
Accession
Description
E value
score
score
coverage
88%
100%
88%
88%
88%
88%
88%
88%
88%
88%
88%
88%
88%
88%
88%
100%
100%
100%
100%
100%
Max.
identity
117
ZP_08185090.1
YP_003064019.1
EGU20313.1
EKG36301.1
EIW13008.1
CCC17611.1
CCB81656.1
YP_004210612.1
YP_006434875.1
Isoleucyl-tRNA ligase [Rhodanobacter spathiphylli B39] >gb|EIL94872.1| isoleucyl-tRNA
ligase [Rhodanobacter spathiphylli B39]
Iron-regulated ABC transporter permease protein SufD [Flexibacter litoralis DSM 6794]
>gb|AFM05082.1| Iron-regulated ABC transporter permease protein SufD [Flexibacter litoralis
DSM 6794]
ParA family chromosome partitioning protein [Granulicella tundricola MP5ACTX9]
>gb|ADW71485.1| ParA family chromosome partitioning protein [Granulicella tundricola
MP5ACTX9]
Putative deaminase [Vibrio mimicus SX-4]
RTX toxin [P. syringae pv. avellanae str. ISPaVe013]
Aryl-alcohol dehydrogenase [Lactobacillus pentosus KCA1]
Aryl-alcohol dehydrogenase [Lactobacillus pentosus IG1]
Aryl-alcohol dehydrogenase [Lactobacillus pentosus MP-10]
Aryl-alcohol dehydrogenase [Lactobacillus plantarum JDM1] >ref|YP_003925820.1|
Aryl-alcohol dehydrogenase [Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ST-III]
>ref|YP_004890618.1| Aryl-alcohol dehydrogenase [Lactobacillus plantarum WCFS1]
>gb|ACT63322.1| Aryl-alcohol dehydrogenase [Lactobacillus plantarum JDM1]
>gb|EFK27994.1| Aryl-alcohol dehydrogenase [Lactobacillus plantarum subsp. plantarum
ATCC 14917] >gb|ADN99726.1| Aryl-alcohol dehydrogenase [Lactobacillus plantarum subsp.
plantarum ST-III] >emb|CCC80104.1| Aryl-alcohol dehydrogenase [Lactobacillus plantarum
WCFS1]
Cytochrome P450 [Xanthomonas gardneri ATCC 19865] >gb|EGD17269.1| Cytochrome P450
[Xanthomonas gardneri ATCC 19865]
Hypothetical protein Dali7_04991 [Dietzia alimentaria 72]
ZP_11235564.1
ZP_10192637.1
26.1
ABC-type multidrug transporter [Enterococcus gallinarum EG2] >gb|EEV31992.1| ABC-type
multidrug transporter [Enterococcus gallinarum EG2] >gb|EHG29468.1| hypothetical protein
HMPREF9478_01084 [Enterococcus saccharolyticus 30_1]
ZP_05648659.1
24
24
24.4
24.4
24
24
24
25.2
25.7
26.1
26.1
26.1
Trk system potassium uptake protein [Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1]
CAM76063.1
26.1
Trk system potassium uptake protein trkA [Phaeospirillum molischianum DSM 120]
>emb|CCG43130.1| Trk system potassium uptake protein trkA [Phaeospirillum molischianum
DSM 120]
ZP_09878308.1
24
24
24.4
24.4
24
24
24
25.2
25.7
26.1
26.1
26.1
26.1
26.1
87%
87%
87%
100%
87%
87%
87%
100%
100%
87%
87%
87%
87%
87%
312
312
216
233
312
312
312
119
91
68
67
67
67
67
Appendix 2d (continued)
Results of the homology search for bacterial proteins with similar amino acid sequences to that used for designing the TaqMan probe (entry query: HTVIDQRP)
Max.
Total
Query
Accession
Description
E value
score
score
coverage
86%
86%
86%
75%
86%
86%
86%
80%
89%
100%
100%
100%
100%
100%
Max.
identity
118
24
24
Putative methyl-accepting chemotaxis protein [Aurantimonas manganoxydans SI85-9A1]
>gb|EAS49117.1| Putative methyl-accepting chemotaxis protein [Aurantimonas manganoxydans
SI85-9A1]
Outer membrane adhesin-like protein [Runella slithyformis DSM 19594] >gb|AEI51420.1| Outer
membrane adhesin like proteiin [Runella slithyformis DSM 19594]
ZP_01228543.1
YP_004658552.1
D-alanyl-D-alanine endopeptidase [Erwinia pyrifoliae Ep1/96] >emb|CAX56156.1|
Penicillin-binding protein 7 (D-alanyl-D-alanine-endopeptidase) [Erwinia pyrifoliae Ep1/96]
D-alanyl-D-alanine endopeptidase [Klebsiella oxytoca 10-5246]
D-alanyl-D-alanine endopeptidase [Klebsiella oxytoca M5al]
YP_002649376.1
EHT06761.1
EKP25050.1
EGR88891.1
YP_006905682.1
YP_006860495.1
ZP_08569009.1
YP_002997742.1
EGL49334.1
YP_006014062.1
23.5
23.5
23.5
23.5
23.5
23.5
23.5
23.5
23.5
23.5
23.5
24
Potassium uptake protein [Rhodospirillum photometricum DSM 122] >emb|CCG07843.1|
Potassium uptake protein [Rhodospirillum photometricum DSM 122]
YP_005416813.1
Penicillin-binding protein 7 [Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae DSM 30104]
Amidohydrolase 2 [Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis ATCC 12394]
>gb|ADX25482.1| Amidohydrolase 2 [Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis ATCC
12394]
Amidohydrolase family protein [Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis SK1249]
Amidohydrolase 2 [Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis GGS_124] >dbj|BAH82528.1|
Amidohydrolase 2 [Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis GGS_124]
Uncharacterized lipoprotein [Rheinheimera sp. A13L] >gb|EGM79479.1| Uncharacterized
lipoprotein [Rheinheimera sp. A13L]
Amidohydrolase 2 [Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis RE378] >dbj|BAM61998.1|
Amidohydrolase 2 [Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis RE378]
Amidohydrolase 2 [Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis AC-2713] >emb|CCI63624.1|
Amidohydrolase 2 [Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis AC-2713]
Amidohydrolase family protein [Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis SK1250]
24
COG0569: K+ transport systems, NAD-binding component [Magnetospirillum magnetotacticum
MS-1]
ZP_00053079.1
EJK89749.1
24
Potassium transporter peripheral membrane component [Magnetospirillum magneticum AMB-1]
>dbj|BAE51174.1| K+ transport systems, NAD-binding component [Magnetospirillum
magneticum AMB-1]
YP_421733.1
23.5
23.5
23.5
23.5
23.5
23.5
23.5
23.5
23.5
23.5
23.5
24
24
24
24
24
87%
87%
87%
100%
100%
100%
87%
100%
100%
100%
87%
100%
87%
87%
87%
87%
421
421
420
418
418
416
408
408
408
408
404
322
317
314
314
314
Appendix 2d (continued)
Results of the homology search for bacterial proteins with similar amino acid sequences to that used for designing the TaqMan probe (entry query: HTVIDQRP)
Max.
Total
Query
Accession
Description
E value
score
score
coverage
86%
86%
86%
75%
75%
75%
86%
75%
75%
75%
86%
75%
86%
86%
86%
86%
Max.
identity
第４章
４．１
今後の展望
301C 汚泥の改良における研究成果の活用方法
第２章（研究Ⅰ）において易生分解性試験の性能比較を行い、301C とその他の易
生分解性試験の性能の違いは植種源である 301C 汚泥と下水処理場汚泥の違いに強
く依存し、301C は生分解されにくい傾向にあることを明らかにした。また、第３章（研究
Ⅱ）では qPCR によるアニリン分解菌迅速検出法を新たに開発し、生分解性試験にお
ける活性汚泥の評価に適用可能であることを実証した。
最終目標である 301C 汚泥の改良においては、次の 2 つのポイントが重要である。
・易生分解性試験データの国際的な相互受け入れを実現するためには、301C 汚泥
と下水処理場汚泥との分解活性の差をなるべく少なくする必要がある。
・環境浄化に伴う 301C 汚泥の活性低下に対処するため、使用期間を通して有効性
基準を満たす分解活性を維持できる培養条件を確立する必要がある。
上記のポイントを踏まえた研究成果の活用イメージを示す（Fig. 15）。開発した qPCR
High
α-Ad gene
Level of WWTP sludge
Condition C
Pass level of activity
Condition B
Condition A
301C sludge
(current condition)
Start of use
End of use
Cultivation time
Fig. 15. Image of a manner to utilize the findings of this study.
119
法は、アニリン分解活性を α-Ad 遺伝子の相対コピー数として数値化できるだけでなく、
任意の短い間隔でデータを取得することができるため、従来の BOD 測定では困難で
あった分解活性のリアルタイムモニタリングを実現できる。そこで、従来の 301C の培養
条件における α-Ad 遺伝子の変動パターンと、異なる培養条件（例えば、種汚泥につ
いて数、種類および混合割合を変更した条件、合成下水について組成、添加濃度お
よび添加頻度を変更した条件など）における α-Ad 遺伝子の変動パターンを比較する
ことで、301C 汚泥の分解活性に影響を与える因子の絞込みが可能になると考えられ
る。そして、下水処理場汚泥における α-Ad 遺伝子レベルと、試験の有効性基準で求
められる分解活性のパスレベルに相当する α-Ad 遺伝子の閾値に留意しながら最適化
を図ることで、前述のポイントを押さえた最適な培養条件を確立できると考えられる。
４．２
検討課題
４．１において研究成果の活用方法を述べたが、301C 汚泥の改良においては以下
の検討課題がある。
４．２．１過去の試験結果との整合性
１．２で述べたとおり、化審法制定（1973 年）以来、301C 汚泥の調製方法について
大幅な変更はなされていない。その理由の一つとして、培養条件の見直しによって過
去に取得された試験データとの整合性が確保できなくなる可能性が指摘されてきた。
研究Ⅰの成果から、301C 汚泥は下水処理場汚泥に比べて分解活性が低いことが明
白であるため、301C 汚泥を下水処理場汚泥に近づけた場合、おそらく多くの物質で
その整合性を確保することが困難になるであろう。特に、301C 汚泥で生分解されにく
いリン、窒素および分岐状炭素を有する化合物について注視すべきである。
上記の課題については、日本と海外の化学物質管理規制における易生分解性試
験データの取り扱いの相違も考慮に入れる必要がある。日本の化審法では、難分解
性の性状を有する化学物質を管理するティア方式の評価体系がとられている。具体的
120
には、化審法では最初に生分解性評価（301C）を実施し、その結果から難分解性と評
価された場合にのみ後続試験（生物濃縮性、生態毒性およびヒト毒性を評価する試
験）を実施する。逆に、301C で完全に生分解された場合（良分解性と評価された場
合）は後続試験が不要となる。一方、海外では、易生分解性試験データは化学物質の
安全性データセットの一つとして他の安全性試験と同列に取り扱われ、総合的に化学
物質のリスクが評価される。例えば、易生分解性試験において完全に生分解されても、
毒性試験の結果において強い毒性を示した化学物質は規制の対象となり得る。した
がって、海外では、易生分解性試験データは日本ほど重要視されていない。このよう
に、日本と海外では生分解性試験データの取り扱いに大きな違いがあり、化審法で要
求される 301C は体系的に誤った評価ができない位置づけであるため、試験データの
再現性とともに安全サイドでの生分解性評価が求められる。
以上を踏まえ、化審法の生分解性評価において 301C 汚泥がどの程度の分解活性
を有しているのが妥当であるか、過去の試験結果との整合性をどの程度確保すべきか
など、規制当局である経済産業省や専門家に意見を求めながら 301C 汚泥の改良を
慎重に進める必要がある。
４．２．２アニリン以外の物質に対する影響評価
301C を含む易生分解性試験において、アニリンが植種源の分解活性を評価す
る指標物質となっているため、便宜上、アニリン分解活性を評価することで様々
な化学物質に対する分解活性を代表させている。しかし、アニリンを分解する
細菌がすべての化学物質を同様に分解できる訳ではないため、アニリン分解活
性の高さに比例して他の化学物質に対する分解活性が高いとは限らない。301C
汚泥の改良においては、BOD 測定等によりアニリン以外の構造的な特徴を有す
る物質への影響を評価しながら、培養条件の最適化を図る必要がある。
121
４．２．３菌叢解析
301C 汚泥を含む活性汚泥は、様々な細菌や原生動物が含まれる生態系であり、
いわゆる複合微生物系の一つである。このような複合微生物系に対して、アニ
リン分解活性という一つの機能だけでキャラクタリゼーションを行うことは一
般的ではない。複雑な生物の総体として理解するためには、機能だけでなく菌
叢も評価することが必要不可欠であろう。
近年、環境試料から核酸を抽出して、多量な遺伝子情報を網羅的に解析でき
る次世代シーケンサー（NGS）によるメタゲノム解析が注目されている。NGS
を用いれば、16S rRNA 遺伝子配列等を基に、未培養・難培養の微生物を含めて、
301C 汚泥の詳細な菌叢を定量的に評価することが可能である。301C 汚泥の改良
において、従来法で得られた 301C 汚泥の菌叢、下水処理場汚泥の菌叢との比較
に活用できる可能性がある。
４．３
ロードマップ
301C 汚泥の改良に向けたロードマップを下表に示す。表に示す項目について
順次検討を進め、最終的に 2017 年頃には 301C 汚泥の調製方法の見直しに関す
る試験法改正の提案を行う予定である。
項目
2013 年
2014 年
2015 年
2016 年
2017 年
qPCR による変動因子の絞込み
qPCR による培養条件の最適化
アニリン以外の物質に対する影響評価
NGS による菌叢解析の検討
NGS による菌叢解析および評価
経済産業省および専門家との意見調整
試験法改正の提案（最終目標）
○
122
第５章
総
括
化学物質による環境汚染を未然に防止するためには、化学物質の生分解性を
適切に評価することが非常に重要であり、一連の易生分解性試験法はその簡便
さから日本だけでなく世界で最もポピュラーな試験法となっている。近年、日
本の化審法で要求される易生分解性試験（301C）とその他の試験法との試験結
果の不整合、301C で使用する活性汚泥（301C 汚泥）の環境浄化に伴う活性低下
の問題などが指摘されている。
以上の背景から、本研究では 301C 汚泥の改良を行うことを目的とし、本博士
論文研究では、基礎研究として二つの研究（研究ⅠおよびⅡ）に取り組んだ。
各章の要約を以下に示す。
第１章では、生分解性試験の概説および化審法における生分解性試験（301C）
の課題について論述するとともに、本研究の目的ならびに研究ⅠおよびⅡの内容に
ついて記述した。
第２章（研究Ⅰ）では、国際協調の観点から 301C の特性や他の易生分解性試
験との性能の違いを理解することを目的として、301C とその他の試験法との性
能比較を行った。研究Ⅰで得られた主な研究成果を以下に示す。
・301C ではその他の易生分解性試験と比較して生分解されにくい傾向にあり、
その違いは植種源である 301C 汚泥と下水処理場汚泥の違いに強く依存するこ
とを明らかにした。
・301C ではリン、窒素及び分岐状炭素を有する化合物が生分解されにくい傾向
にあることを明らかにした。
第３章（研究Ⅱ）では、301C 汚泥の改良に役立つ新規ツールとして、活性汚
123
泥の分解活性を迅速かつ簡便に評価するアニリン分解菌迅速検出法の開発を行った。
研究Ⅱで得られた主な研究成果を以下に示す。
・α-アニリンジオキシゲナーゼ（α-Ad）遺伝子を標的とし、様々なアニリン分
解菌を網羅的かつ特異的に検出できる定量的 Real-Time PCR 法（qPCR 法）用の
プライマー及びプローブを新規に設計した。
・開発した qPCR 法により得られた α-Ad 遺伝子の相対コピー数（16S rRNA 遺
伝子のコピー数に対する比）は、最確数法（MPN 法）で得られたアニリン分
解菌数ならびに BOD 測定で得られたアニリン分解の誘導期（アニリン分解活
性）と良好な相関を示した。
・以上より、生分解性試験に用いる活性汚泥の評価に本手法が適用可能である
ことが示された。
第４章では、第２章の易生分解性試験の性能比較（研究Ⅰ）および第３章のアニリ
ン分解菌迅速検出法の開発（研究Ⅱ）で得られた研究成果を踏まえ、今後の展望とし
て、301C 汚泥の改良に向けた研究成果の活用方法、今後の検討課題およびロードマ
ップを示した。
第５章では、以上を総括した。
最後に、第 4 章で記述したとおり、最終目標である 301C 汚泥の改良に向けて
は様々な検討課題が残されており、特に、現在の化学物質管理規制の中で 301C
汚泥に必要とされる分解活性をどう考えるかが重要なポイントである。この課
題の解決には、規制当局である経済産業省との密接な連携、専門家への意見収
集が必要不可欠であるが、活性汚泥のような複合微生物系の機能を人為的にコ
ントロールする限界を十分に理解した上で検討を進める必要があると考える。
124
引用文献
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Testing of Chemicals, Section 3. Organisation for Economic Co-operation and
Development, Paris.
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(Headspace Test). OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 3.
Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.
3) 厚生労働省, 経済産業省, 環境省, 2005, 新規化学物質等に係る試験の方法に
ついて（平成 15 年 11 月 21 日, 薬食発 1121002 号, 平成 15･11･13 製局発 2
号, 環保企発第 031121002 号）.
4) 平成 23 年度経済産業省委託研究
化学物質安全確保・国際規制対策推進等
「化学物質の試験方法開発等」成果報告書
（http://www.meti.go.jp/meti_lib/report/2012fy/E002115.pdf）
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in the biodegradation test: changes of bacterial population and isolation of aniline
degradable bacteria from activated sludge. Environ. sci. 9, 35–43 (in Japanese).
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in Tokyo. FEMS Microbiol. Ecol. 54, 205–217.
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10) Zhang, T., Fang, H.H.P., 2006. Applications of real-time polymerase chain reaction
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11) Harms, G., Layton, A.C., Dionisi, H.M., Gregory, I.R., Garrett, V.M., Hawkins, S.A.,
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129
公表論文
1.
Takakazu Kayashima, Masanori Taruki, Kazuomi Katagiri, Ryosuke Nabeoka,
Tomohiko Yoshida, Toshiaki Tsuji, Comparison of biodegradation performance of
OECD test guideline 301C with those of other ready biodegradation test. Environ.
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2.
Takakazu Kayashima, Hisako Suzuki, Toshinari Maeda, Hiroaki I. Ogawa, 2013.
Real-time PCR for rapidly detecting aniline-degrading bacteria in activated sludge.
Chemosphere 91, 1338–1343.
130
謝
辞
本研究を遂行し博士論文をまとめるにあたり、終始懇切丁寧なご指導とご鞭
撻を賜りました、九州工業大学生命体工学研究科の尾川博昭名誉教授ならびに
前田憲成准教授に厚く御礼申し上げますとともに、心より感謝の意を表します。
あわせて、本博士論文の査読・ご閲覧を賜りました、九州工業大学生命体工
学研究科の白井義人教授および西田治男教授ならびに北九州市立大学国際環境
工学部の門上希和夫教授に感謝致します。
また、本研究の実験の一部（研究Ⅱの一部）に協力していただいた、九州工
業大学生命体工学研究科の所属であった Viviana Sanches-Torres 博士に感謝致し
ます。
最後に、本研究の一部（研究Ⅰ）については、平成 23 年度経済産業省委託研
究
化学物質安全確保・国際規制対策推進等「化学物質の試験方法開発等」の
成果の一部であり、本研究を遂行するにあたり様々なご助言をいただいた、淑
徳大学総合福祉学部の北野大教授をはじめ検討委員会の委員の先生方に深く御
礼申し上げます。
2013 年 9 月
茅島
131
孝和