Title 化学物質の発達期曝露による脳白質発達障害の短期評価手 法

Title
化学物質の発達期曝露による脳白質発達障害の短期評価手
法開発に関する研究( 本文(Fulltext) )
Author(s)
冨士本, 仁
Report No.(Doctoral
Degree)
博士(獣医学) 乙第123号
Issue Date
2013-09-24
Type
博士論文
Version
ETD
URL
http://repository.lib.gifu-u.ac.jp/handle/123456789/47369
※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。
化学物質の発達期曝露による脳白質発達障害の
短期評価手法開発に関する研究
2013 年
岐阜大学大学院連合獣医学研究科
冨士本 仁
1
目次
4
序論
第1章
デカブロモジフェニルエーテル (DBDE) 発達期曝露によるオリゴデンドロサイ
トの発達への影響
8
緒言
材料および方法
10
結果
15
考察
19
小括
24
第2章
発達期甲状腺機能低下に起因する脳白質低形成に関連する分子マーカーの探索
緒言
26
材料および方法
28
結果
33
考察
35
小括
40
第3章
臭素化難燃剤の発達期曝露動物における発達期甲状腺機能低下に起因するグリ
ア細胞発達障害分子の動態
42
緒言
2
材料および方法
44
結果
49
考察
52
小括
58
総合考察
59
結論
62
謝辞
65
引用文献
66
要旨
81
Abstract
84
図表
88
3
序
論
甲状腺ホルモンは, 胎児期や新生児期の正常な脳発達に不可欠であり, ニューロン, グリ
ア細胞の増殖, 移動および分化を制御している。妊娠初期の甲状腺機能低下は胎児の脳発達
に悪影響を与え, 発達遅延や神経障害, 行動障害および学習障害を引き起こすことが知られ
ている。近年, 環境中の難分解・高蓄積性化学物質の母親に対する曝露により, 母親の胎盤を
経由した胎児への曝露, 出生後の母乳を介した乳児への曝露から, 脳発達障害が生じる可能
性が指摘されている。これらの化学物質による, 甲状腺ホルモン産生抑制作用, 甲状腺ホルモ
ン輸送タンパク質および甲状腺ホルモン受容体に結合する直接作用を介した, 甲状腺ホルモ
ンかく乱作用に関する懸念が増加している。このような特徴を持つ化学物質のうち, ポリブ
ロモジフェニルエーテル類 (PBDEs), ポリ塩化ビフェニル, ペルフルオロオクタンスルホン
酸等の化学物質が, 2001 年に採択された「残留性有機汚染物質に関するストックホルム条約
(POPs 条約)」および 2006 年に EU で施行された「RoHS (Restriction of Hazardous Substances) 指
令」において規制対象物質に指定され, 現在も指定対象化学物質に関する議論が継続してい
る。
化学物質の発達神経毒性に関する評価については, 現在, 経済協力開発機構 (OECD) およ
び米国環境保護庁 (EPA) から試験ガイドラインが提示されている。これらガイドラインに則
った発達神経毒性試験は, 試験の信頼性および再現性については優れているものの, 高次試
4
験であるため, 必要とされる動物数, 検査項目および試験方法の複雑さから, 試験実施機関
には多大な労力が要求されている。また, 病理組織学的検索においては, 脳の組織構築の形態
計測が主体であり, 神経行動学的検査との整合性は乏しいため, 発達神経毒性の病理発生を
基盤とした解析手法の開発が望まれている。ことに, 実施する動物試験のサテライト指標と
しての導入はもとより, 簡便で高感度なスクリーニング試験指標としての確立が望まれてい
る。
本研究では, 神経毒性物質を短期試験でスクリーニングすることを目的として, 発達期甲
状腺機能低下に起因する白質の形成異常に関連する分子マーカーに着目した評価系の開発を
行った。第 1 章では, POPs 条約の規制対象外とはなっているものの, PBDEs の一種であるデカ
ブロモジフェニルエーテル (DBDE) の発達期曝露の影響について, 脳発達障害指標の形態計
測手法を導入して評価した。第 2 章では, 発達期甲状腺機能低下に起因する白質発達異常に
関連する分子マーカーを見出すために, 抗甲状腺剤を発達期において曝露したラットの脳を
用いて, マイクロアレイによる白質組織特異的な網羅的遺伝子発現解析を行い, 抽出した分
子について, 免疫組織学的手法による細胞局在解析を実施した。第 3 章では, 軽度の発達期甲
状腺機能低下が認められた DBDE について, 発達期曝露ラットを用いた白質組織特異的な網
羅的遺伝子発現解析を行い, 抗甲状腺剤を発達期曝露したラットにおけるプロファイルと共
通して発現変動を示した分子を抽出した。抽出した分子については, DBDE と同様に臭素化難
燃剤であるヘキサブロモシクロドデカン (HBCD) およびテトラブロモビスフェノール A
5
(TBBPA) を発達期曝露した動物についても DBDE 発達期曝露ラットと同様に免疫組織学的
解析を行い, 見出したマーカーの有用性について検討した。
6
第1章
デカブロモジフェニルエーテル (DBDE) 発達期曝露によるオリゴデンドロサイトの発達へ
の影響
7
緒
言
甲状腺ホルモンは, 胎児期, 新生児期の正常な脳発達に不可欠であり, この時期の甲状腺
機能低下は, 発達遅延, 行動障害および学習障害等の神経障害を引き起こす [1, 57, 60, 66]。動
物実験においても, 母動物の血清中甲状腺ホルモン濃度は胎児の甲状腺ホルモンレベルに直
接の影響を及ぼし, 母動物がプロピルチオウラシル (PTU) 等の抗甲状腺剤に曝露された子
動物では, ニューロンの移動異常や, 軸索の髄鞘形成不全, オリゴデンドロサイトの減少お
よび白質の低形成が生じる [28, 44, 56, 66, 71]。妊娠初期においては, 軽度の甲状腺ホルモン
レベルの変化でも子供に有害影響が生じる可能性が示唆されていることから, 環境中の甲状
腺ホルモンかく乱化学物質への懸念が近年高まっている。
臭素化難燃剤は, コンピューターやテレビ, 携帯電話, 家具, カーペット, 断熱板, マット
レス等, 様々な製品に使用されている効果的な難燃剤である [5]。臭素化難燃剤の多くは, 脂
溶性が高く, 難分解性であり, 生物濃縮性が高いことから, 環境影響およびヒトの健康への
影響が懸念されている [15]。近年の研究により, 臭素化難燃剤の一種である PBDEs は発がん
性, 甲状腺への毒性, エストロゲン作用あるいは神経毒性をヒトおよび実験動物で示すこと
が明らかになり, PBDEs 曝露による発達期甲状腺機能低下等の子供への影響について強く懸
念されている [43, 59, 72]。DBDE は PBDEs の中で最も使用量が多く, PBDEs の中では比較的
生物蓄積性が低いと考えられているものの, ヒトの血中でも検出されており, 職業曝露の影
8
響も報告されている [73, 77, 82]。また, マウスおよびラットの新生子への DBDE 曝露により,
行動異常を起こすとの報告もある [82, 83]。
本章では, DBDE 発達期曝露の影響を評価するため, 妊娠ラットに DBDE を 10, 100 および
1,000 ppm で妊娠 10 日目から離乳時まで混餌投与し, 子動物に経胎盤・経乳的に曝露した際
の毒性影響を検討・評価した。特に, 発達期甲状腺機能低下に関連する脳発達異常について
検索するため, 著者らが過去に確立した, ニューロンの移動異常やオリゴデンドロサイトの
発達異常を検出する形態計測手法を導入して評価した [71]。
9
材料および方法
化学物質
DBDE は和光純薬工業 (Osaka, Japan) より購入した。
供試動物
妊娠 3 日目の雌性 CD (SD) IGS ラットを日本チャールス・リバー (Yokohama, Japan) より購
入し, 温度 24 ± 1℃, 湿度 55 ±5 %, 照明サイクル 12 時間明/12 時間暗条件の環境下でポリカー
ボネートケージ内において飼育した。飼料は, 甲状腺ホルモン産生への影響を除くため, 大豆
由来の植物性エストロゲンを除いた SF (NIH-07 変型) 飼料 (オリエンタル酵母工業, Tokyo,
Japan) を用い [47], 飲用水は上水道水を用いて, それぞれ自由摂取とした。一週間の馴化期
間の後, 異常が認められなかった動物を実験に供した。
実験デザイン
32 匹の母動物を 4 群に分け, 0, 10, 100 および 1,000 ppm DBDE を妊娠 10 日目から離乳時 (出
産後 20 日) まで混餌投与した (無処置群, 10 ppm DBDE 群, 100 ppm DBDE 群および 1,000 ppm
DBDE 群)。事前に 0, 10, 100 および 10,000 ppm DBDE を妊娠 10 日目から離乳時まで混餌投与
する用量設定試験を各群 3 匹の妊娠ラットを用いて実施した。明確な用量反応性は認められ
10
なかったものの, 全用量において, 甲状腺の絶対・相対重量が増加傾向を示し, 甲状腺の濾胞
上皮細胞の肥大が認められた。用量設定試験では, 妊娠, 出産に関連するパラメーターに影響
は認められなかった。10 ppm においても母動物の甲状腺重量に影響が認められたことから,
投与濃度の最低濃度を 10 ppm とした。
本試験では, 全ての母動物について, 妊娠・授乳期の体重と摂餌量を測定した。子動物につ
いては，生後翌日に出生子数，体重および肛門・生殖突起間距離 (AGD) を測定し，生後 2
日目に 1 匹の母動物あたり雌雄各 4 匹となるようにリッター・サイズを調整した。体重は離
乳までの間, 毎週測定した。離乳時には，母動物に対する DBDE 投与を終了し，全ての母動
物を剖検に供した。子動物についても, 離乳時（生後 20 日目）に各群雌雄 10 匹ずつについ
て春期発動前の剖検を実施し, 病理組織学的評価を行った。さらに, 各群の雌雄 10 匹ずつの
子動物を剖検し, 免疫系への影響評価に供した [26]。残りの子動物は, 通常の基礎飼料である
CRF-1 (オリエンタル酵母工業) に切り替えて飼育し, 生後 11 週目に剖検を行った。これらの
動物について, 雌動物は生後 26 日目, 雄動物は生後 34 日目より春期発動 (包皮分離および膣
開口) の日と体重を記録した。雌動物については，生後 8 週目より膣スメアの観察による性
周期回帰の検討を行い，発情休止期を示す日に解剖を行った。いずれの剖検時も, エーテル
麻酔下で腹大動脈から採血後に放血し, 安楽殺した。
子動物の離乳時の剖検では，脳，甲状腺, 肝，腎，副腎，精巣，精巣上体，卵巣および子
宮を採材し，甲状腺以外は臓器重量を測定した。精巣と脳はブアン固定を，他の臓器はホル
11
マリン固定を行った後にパラフィン包埋した。生後 11 週目の剖検時には更に，前立腺，精嚢,
凝固腺および下垂体を採材し, ホルマリン固定後に重量測定, パラフィン包埋を実施した。母
動物については, 離乳時の剖検時に甲状腺を採取して病理組織学的検索を実施し，子宮の着
床痕数を確認した。
動物実験計画は, 実施施設 (国立医薬品食品衛生研究所) の動物実験倫理委員会に提出し
て承認を受け, 動物の取り扱いは施設の実験動物指針を遵守した。
甲状腺関連ホルモンの測定
離乳時および 11 週目の剖検時に, 各群 10 匹の雄子動物から採取した血液を用いて, 甲状腺
刺激ホルモン (TSH), トリヨードサイロニン (T3) およびサイロキシン (T4) の血清中濃度を,
エスアールエル (Tokyo, Japan) にて, 化学発光免疫測定法により測定した。
病理組織学的解析
離乳時および 11 週目の剖検時に採取した各臓器について, パラフィン包埋後に, 3 µm の厚
さに薄切した後にヘマトキシリン・エオジン (HE) 染色を施し, 病理組織学的検索を行った。
大脳については, Bregma の後方約–3.4 mm の 1 カ所で冠状割面を作製し, その対称面が薄切面
となるようにして Bregma の後方–4.5, –2.3 mm で病理標本を作製した。
12
免疫組織化学的解析
生後 11 週目の剖検時に得られた雄子動物の脳を用いて, オリゴデンドロサイトを特異的に
標識する 2’,3’-cyclic nucleotide 3’-phosphodiesterase (CNPase; mouse monoclonal antibody, 1: 300,
CHEMICON International, Inc., Temecula, CA) および有糸分裂後ニューロンの核を特異的に標
識する neuron-specific nuclear protein (NeuN; mouse monoclonal antibody, 1: 1,000, CHEMICON
International, Inc.) について免疫組織化学的解析を実施した。CNPase 抗体使用時には, 標本を
10 mM クエン酸緩衝液内でマイクロウェーブにより 10 分間加熱することにより抗原賦活化
を行った。シグナル検出は, VECTASTAIN Elite ABC Mouse IgG kit (Vector Laboratories, Inc.,
Burlingame, CA, USA) のプロトコールに従い, 免疫反応は 3,3’-diaminobenzidine/H2O2 を用い
て可視化した後, ヘマトキシリンにより対比染色した。
海馬 CA1 領域でのニューロン分布を検討するために, NeuN 染色切片を用いて，Bregma の
後方–4.5 mm の冠状割面における左右 1 箇所の CA1 領域(海馬台の頭側)を 200 倍の顕微鏡視
野で観察した (Fig. 1-1)。また, 白質領域の測定に関しては, CNPase 染色切片を用いて, 1 個体
につき大脳の 2 つの冠状割面での脳梁面積を測定した。即ち, 左右の大脳半球をまたぎ, 帯状
束と背側海馬交連に挟まれた脳梁領域のうち上縁 (外側縁) が頭頂部に最も近いところで区
切った部位の面積を求め, 2 割面の平均値を求めた (Fig. 1-2)。次に, 大脳皮質に分布する
CNPase 陽性オリゴデンドロサイトの単位面積 (mm2) 当りの数を, 100 倍の顕微鏡視野におけ
る内側下端が帯状束の上端に重なるように視野を固定した状態で, 拡大を 200 倍にした際の
13
頭頂部大脳皮質中間層において計測し, 2 割面の左右の平均値を求めた (Fig. 1-2)。定量解析の
ために, DP70 Digital Camera System (オリンパス, Tokyo, Japan) を搭載した BX51 microscope
(オリンパス) にて染色標本の写真を取り込み, WinROOF image analysis software 5.7 (三谷商事,
Fukui, Japan) を用いて細胞数や面積を計測した。
統計解析
定量データについては無処置群と各 DBDE 投与群間で比較した。Bartlett 法により分散性の
同等性を評価した後に, 分散が等しい場合は Dunnett 法, 分散が等しくない場合は Dunnett 型
の多重比較検定を実施した。病理組織学的検査における病変発生頻度および性周期について
は Fisher の正確確率検定を実施し, 病理組織学的検査における病変の程度については
Mann-Whitney の U 検定を実施した。
14
結
果
母動物に対する影響
妊娠期間 (妊娠 10～20 日目) を通して, 母動物の体重増加および摂餌量に DBDE 投与によ
る変化は認められなかった (Table 1-1)。授乳期間中 (出産後 1～20 日目) においても, いずれ
のパラメーターにも DBDE 投与による変化はなかった。よって, 母動物の DBDE の一日摂取
量は混餌濃度に比例すると考えられた。出産関連のパラメーターである子宮の着床痕数, 出
産子動物数, 子動物雌雄比についても DBDE 投与による変化は認められなかった (Table 1-1)。
離乳時の剖検において, 体重に DBDE 投与による変動は認められなかったが, 甲状腺の絶
対・相対重量が 10 ppm および 1,000 ppm DBDE 群で有意に増加し, 100 ppm 群においても, 統
計学的に有意な差は認められなかったものの, 増加傾向を示した (Table 1-1)。甲状腺濾胞上皮
のび漫性肥大については, 発生頻度, 程度ともに無処置群と DBDE 投与群で統計学的に有意
な差は認められなかった。
離乳時剖検までの子動物に対する影響
出産翌日の子動物において, 外表奇形はいずれの投与群でも認められず, 子動物体重およ
び AGD についても, 雌雄ともに DBDE 曝露による影響は認められなかった (Table 1-1)。
離乳時における春期発動前の剖検では, 肝臓の臓器重量にのみ DBDE 曝露の影響が認めら
15
れ, その他の臓器重量および体重は, 無処置群と比較して各 DBDE 曝露群に差異は認められ
なかった (Table 1-1)。雄子動物では, 明確な用量反応性は認められなかったが, 10 ppm DBDE
群の肝臓の絶対・相対重量, 1,000 ppm DBDE 群の肝臓絶対重量が有意に増加した。雌子動物
では, 1,000 ppm DBDE 群の肝臓の絶対・相対重量が有意に増加した。
子動物の春期発動および性周期に対する影響
雄子動物の包皮分離, 雌子動物の膣開口の時期およびその際の体重について, DBDE 曝露に
よる変化は認められなかった (Table 1-2)。性周期についても, DBDE 曝露による異常所見の統
計学的に有意な変動は認められなかった (Table 1-2)。
離乳時から成熟時剖検までの子動物に対する影響
100 ppm DBDE 群の雄子動物では, 生後 4 週から生後 11 週目まで, 試験期間を通して有意な
体重増加を示した (Fig. 1-3)。10 ppm DBDE 群の雄子動物においても, 生後 4, 5, 8 週目を除い
て有意な体重増加を示した。雌子動物については, 試験期間を通して, DBDE 曝露による体重
の変化は認められなかった (Fig. 1-3)。
生後 11 週目の剖検では, 10 および 100 ppm DBDE 群の雄子動物に体重の有意な増加が認め
られた (Table 1-3)。100 ppm DBDE 群の雌子動物においても, 統計学的に有意ではなかったも
のの体重の増加傾向が認められた。臓器重量については, 脳の相対重量の有意な減少が 10,
16
100 ppm DBDE 群の雄子動物および 100 ppm DBDE 群の雌子動物で認められた (Table 1-3)。ま
た, 100 ppm DBDE 群の雄子動物では, 腎臓および甲状腺の絶対重量が有意に増加した (Table
1-3)。
血清中甲状腺関連ホルモン
各剖検時に雄子動物について血清中甲状腺関連ホルモンを測定したところ, 1,000 ppm
DBDE 群において, 離乳時に T3 の有意な減少が認められ, 生後 11 週目に T4 の有意な減少が認
められた (Table 1-4)。
子動物の各剖検時における病理組織学的解析
離乳時の剖検では, 全ての DBDE 曝露群の雄子動物において, 甲状腺濾胞上皮のび漫性肥
大が認められ, 1,000 ppm DBDE 群では, 発生頻度, 程度共に有意に増加した (Table 1-5, Fig.
1-4)。雌子動物でも同様の変化が 10, 1,000 ppm DBDE 群で認められたが, 発生頻度および程度
に統計学的に有意な差はなかった。肝臓では, 全ての DBDE 曝露群の雄子動物で, 細胞質が好
酸性を示す肝細胞のび漫性肥大が, 発生頻度および程度に有意な増加を示した (Table 1-5, Fig.
1-4)。雌子動物でも同様の変化が認められ, 100 ppm DBDE 群では発生頻度が有意に増加し,
1,000 ppm DBDE 群では発生頻度および程度が有意に増加した。腎臓では, 皮質近位尿細管上
皮の細胞質好酸性の増加が雌雄共に全ての DBDE 曝露群で認められ, 雄子動物では 100 ppm
17
以上, 雌子動物では 10 ppm 以上で発生頻度および程度が有意に増加した (Table 1-5, Fig. 1-4)。
さらに, 雌子動物では, 卵巣の間質腺細胞の増加が 1,000 ppm DBDE 群に認められたが, 統計
学的に有意な差はなかった。
生後 11 週目の剖検時には, 全ての DBDE 曝露群の雄子動物で, 甲状腺濾胞上皮のび漫性肥
大が認められたが, 発生頻度および程度に統計学的に有意な差はいずれの群においてもなか
った (Table 1-5, Fig. 1-4)。雌子動物では, 同様の変化は 100, 1,000 ppm DBDE 群にそれぞれ 1
例ずつ認められたのみであった。その他の病理所見に関しても, 雌雄ともに, 統計学的に有意
な差は認められなかった。
成熟時の子動物における脳形態計測
海馬 CA1 領域でのニューロン分布に関しては, NeuN 陽性ニューロンの錐体細胞層からの平
均距離, 錐体細胞層内の NeuN 陽性ニューロン数および異常分布を示した NeuN 陽性ニューロ
ン比のいずれにおいても, DBDE 曝露による変化は認められなかった (Table 1-6)。白質発達に
関しては, CNPase 陽性の脳梁面積, 大脳皮質の CNPase 陽性オリゴデンドロサイト数共に, 100,
1,000 ppm DBDE 群で有意に減少したが, 明確な用量反応性は認められなかった (Table 1-6,
Fig. 1-5)。これらの白質発達に関連する指標は, 10 ppm DBDE 群においても, 統計学的に有意
な差はなかったものの減少傾向を示した。
18
考
察
本章では, 代表的な臭素化難燃剤である DBDE の発達期曝露による影響を, 特に甲状腺機
能低下に関わる脳発達障害に注目して評価した。本研究では, 1,000 ppm DBDE 曝露群の雄子
動物で, 離乳時に血清中 T3 のわずかな低下が認められた。同時に甲状腺濾胞上皮細胞の肥大
が用量依存的に生じており, 1,000 ppm DBDE 群で統計学的に有意であった。これらの結果か
ら, DBDE は少なくとも高用量群で軽度の発達期甲状腺機能低下を誘発することが示唆され
た。成熟後の子動物に関して, DBDE のマウスへの出生前曝露により, 血清中 T3 濃度の減少が
報告されているが [79], 本研究では, 過去に報告されている SD ラットを用いた発達期曝露試
験の結果と同様, 1,000 ppm DBDE 曝露群において T4 がわずかに減少した [40]。PBDEs の低臭
素化体は, 甲状腺ホルモンのホメオスタシスに影響を及ぼし, ラットおよびマウスの血清中
T4 濃度に影響を及ぼすことが知られている [31, 37, 89]。その原因としては, 肝臓のウリジン
二リン酸グルクルノシルトランスフェラーゼ (UDPGT) の誘導とその活性化により, 甲状腺
ホルモン, 特に T4 の肝臓でのクリアランスが亢進し, それによって血清中の全 T4 および遊離
型 T4 の濃度が減少するというメカニズムが報告されている [89]。また, 多くのハロゲン化ジ
フェニルエーテルは構造的に甲状腺ホルモンと類似しているため, 甲状腺ホルモンの受容体
や, トレンスサイレチン等の輸送タンパク質との結合に拮抗作用を有するという直接作用の
可能性も示唆されている [9, 46]。マウスを用いた DBDE のがん原性試験において, 甲状腺濾
19
胞上皮細胞の増殖性病変の発生頻度が増加していることから [52], DBDE も低臭素化 PBDEs
と同様に,甲状腺機能に影響をおよぼす可能性が示唆されるが, DBDE による発達期甲状腺機
能低下の発生メカニズムが, 低臭素化 PBDEs と同様であるかは明らかではない。
低臭素化 PBDE (テトラブロモジフェニルエーテル, ペンタブロモジフェニルエーテル, ヘ
キサブロモジフェニルエーテル, ヘプタブロモジフェニルエーテル, オクタブロモジフェニ
ルエーテルおよびノナブロモジフェニルエーテル) のマウスへの発達期曝露により, ポリ塩
化ビフェニルと同様な自発運動の異常を引き起こすことが報告されている [19-22]。DBDE の
発達期曝露に関しても, シナプス形成異常を含む, 神経毒性に関する in vivo での証拠が増え
てきている [84, 86]。著者らは以前, 発達期甲状腺機能低下モデルラットを用いて, 神経発達
障害に起因する神経組織における構造的な影響について, 本研究と同様の形態計測手法を用
いて検討した。その結果, 甲状腺機能低下に関連して, オリゴデンドロサイトの発達に関連す
る指標と同様に, 海馬 CA1 領域のニューロン分布にも変化が生じることを確認している [71]。
他の報告においても, 発達期甲状腺機能低下により, 成熟アストロサイトが減少し, 脳梁の
ような交連線維の面積が減少することが示されている [66]。本研究では, 生後 11 週目におい
て, 脳梁面積およびオリゴデンドロサイト密度の減少が 100 ppm 以上の DBDE 曝露により認
められているが, ニューロン分布に関する指標に変化は認められなかった。これらの結果か
ら, DBDE は甲状腺機能低下に関連するメカニズムにより, オリゴデンドロサイト発達に対し
てのみ軽度の影響を与えることが示唆された。著者らは, HBCD の発達期曝露 (10,000 ppm)
20
により, 軽度の甲状腺機能低下およびオリゴデンドロサイト密度の減少が生じることを見出
している [62]。しかし, 本研究の DBDE 曝露と同様に, HBCD 曝露においても, ニューロン分
布に関する指標に変化は認められなかった。
放射性同位体である 14C で標識した DBDE をマウス新生子に投与した実験において, DBDE
は新生子の脳に分布することが示されており, 脳における放射活性は, 投与後 1 週間まで増
加した [82]。この結果は, DBDE の発達期曝露が直接的な神経毒性を引き起こす可能性を示唆
している。投与方法が本研究とは異なるが, 生後 3 日目のマウスおよびラットの新生子への
DBDE の単回投与 (20.1 mg/kg body weight, 強制経口投与) により, 成熟後における自発運動
障害が生じ, 経時的に悪化することも報告されている [82, 83]。
一方, 市販 DBDE (純度 77%, ノナブロモジフェニルエーテル 21.8%, オクタブロモジフェ
ニルエーテル 0.8%) の強制経口投与による発達期曝露試験において, 胎子吸収の増加が 10
mg/kg/day および 100 mg/kg/day 群で妊娠 6～15 日目に認められたが, 1,000 mg/kg/day 群では認
められず, 用量反応性はなかった [53]。本変化について著者らは, 被験物質投与とは関連のな
い偶発的変化であろうと結論している。本研究では, DBDE を 1,000 ppm まで (66.3～224.3
mg/kg/day) 母動物に混餌投与したが, 生殖パラメーターに変化は認められなかった。同様に,
新生子の体重, 雌雄比, AGD にも投与の影響は認められなかった。DBDE を 1,000 mg/kg/day
で妊娠初日から 19 日目までラットに投与した過去の報告においても, 母動物および新生子に
毒性影響, 発達影響は認められていない [33]。
21
本研究では, 子動物において, 離乳時の肝臓の相対重量が増加し, 肝臓および腎臓に病理
組織学的変化が認められたが, これらの変化は成熟後には完全に回復した。経口投与された
DBDE は主に肝臓に分布することが知られており [13, 50, 82], ラットおよびマウスを用いた
経口投与による DBDE のがん原性試験では, 雌雄ラットで肝臓に腫瘍発生頻度が増加し, 雄
マウスで肝細胞腺腫/腺癌の発生頻度が増加した [52]。最近の報告では, DBDE の経口投与に
より, 肝臓におけるシトクロム P450 1A, 2B の発現が誘導され, DBDE 発達期曝露によって S9
7-エトキシレゾルフィン-デエチラーゼ活性を増加することが示されている [79, 81]。肝臓の
第Ⅰ相および第Ⅱ相酵素の誘導については, UDPGT も含めて, 過去の試験では一貫しない結
果も得られているが [10], 本研究における子動物の肝細胞肥大は, 母動物を介した DBDE 曝
露による酵素誘導が原因であると推測される。本研究で認められた離乳時の子動物における
近位尿細管上皮の細胞質好酸性増加については, DBDE 曝露による同様の変化の報告がない
ものの, ラットへの DBDE 反復投与により尿細管の硝子変性が生じることが報告されている
[53]。尿細管上皮の細胞質好酸性増加が生じる病理学的メカニズムは明らかではないが, 肝細
胞においても同様の可逆的な細胞質の好酸性化が認められたことを考慮すると, 両臓器で共
通のメカニズムに起因している可能性が示唆された。投与された DBDE は腎臓にも分布する
ことが報告されており [50], DBDE ないしその代謝物と細胞の相互作用により, 反応性に細
胞質好酸性化が生じた可能性が示唆された。
ラット子動物は生後 14 日前後から徐々に摂餌を開始するため, 生後 3 週目の被験物質摂取
22
量は, 授乳による摂取のみではない可能性が考えられるが, 本研究において DBDE のラット
発達期曝露による最小毒性量 (LOAEL) は, 離乳時の肝臓および腎臓の病理組織学的変化,
肝臓重量変化から, 10 ppm (0.7～2.4 mg/kg/day) と判断された。
23
小
括
第１章では, 代表的な臭素化難燃剤のひとつである DBDE の母動物を介した発達期曝露に
よって子動物に現れる発達神経影響を, 甲状腺機能低下に起因する神経発達障害指標を導入
して雄子動物で検討した。その結果, DBDE 曝露により成熟後まで継続する軽度の甲状腺機能
低下が生じ, 100 ppm 以上の曝露群ではオリゴデンドロサイトを標的とした不可逆的な白質の
低形成を誘発した。高用量群におけるこの不可逆的な変化は, 発達期甲状腺機能低下に起因
して生じるものと考えられた。
本研究における DBDE 発達期曝露の LOAEL は, 可逆的な変化ではあるものの, 離乳時の肝
臓および腎臓の病理組織学的変化, 肝臓重量変化から, 10 ppm (0.7～2.4 mg/kg/day) と判断し
た。
24
第2章
発達期甲状腺機能低下に起因する脳白質低形成に関連する分子マーカーの探索
25
緒
言
第 1 章の結果から, 臭素化難燃剤のひとつである DBDE のラットを用いた発達期曝露によ
り, 軽度の甲状腺機能低下および不可逆的な白質の低形成を生じることが示された。
発達期甲状腺機能低下は発達遅延や神経障害の他, 様々な行動障害を引き起こし [1, 12],
母動物に抗甲状腺剤である PTU およびメチマゾール (MMI) を曝露した子動物は, 白質形成
不全, 髄鞘形成不全, オリゴデンドロサイトの減少, 増殖異常, ニューロンの移動異常あるい
はシナプス形成の異常等, 様々な脳発達障害を起こすことが知られている [28, 30, 44, 66]。こ
れらの脳発達異常は構造および機能的な異常を伴う不可逆的な変化であるが, その発生メカ
ニズムについてはいまだ不明な点が多い。
病変発生時のメカニズムについて解析する際には, マイクロダイセクション法により標的
とする組織部位を採取し, 部位特異的な分子解析を行うことにより有用な情報を得ることが
できる [63, 70, 85]。その際には, 分解度合いの低い高品質の RNA を組織標本から採取するこ
とが重要である。有機溶媒, 酸およびアルコールを組み合わせたメタカーン液による組織固
定後にパラフィン包埋して得られた組織標本を用いた DNA, RNA およびタンパク質の分子解
析は, 未固定凍結組織から得られた生体高分子に準ずる抽出効率と品質を保証し, バラツキ
の少ない正確なデータ取得が可能であることが知られている [69, 76, 80]。
第 2 章では, 発達期甲状腺機能低下に起因する白質発達異常に関連する分子マーカーを見
26
出すために, 抗甲状腺剤を発達期曝露したラットの脳を用いて, マイクロアレイによる白質
部位特異的な網羅的遺伝子発現解析を行った。白質組織特異的な遺伝子発現プロファイルを
得るため, メタカーン固定後にパラフィン包埋した組織標本の脳梁およびそれにつながる両
側の大脳白質 (外包) をマイクロダイセクション法により採取し, マイクロアレイに供した。
得られた遺伝子発現プロファイルを基に, 免疫組織化学的解析が可能な候補分子の細胞局在
についても併せて解析した。
27
材料および方法
化学物質
PTU および MMI は Sigma (St. Louis, MO, USA) より購入した。
供試動物
妊娠 3 日目の雌性 CD (SD) IGS ラットを日本チャールス・リバーより購入し, 温度 24 ± 1℃,
湿度 55 ± 5%, 照明サイクル 12 時間明/12 時間暗条件の環境下でポリカーボネートケージ内に
おいて飼育した。飼料は, 甲状腺ホルモン産生への影響を除くため, 大豆由来の植物性エスト
ロゲンを除いた SF (NIH-07 変型) 飼料 (オリエンタル酵母工業) を用い [47], 飲用水は上水
道水を用いて, それぞれ自由摂取とした。一週間の馴化期間の後, 異常が認められなかった動
物を実験に供した。
実験デザイン
32 匹の妊娠 SD ラットを無処置群, 3 ppm PTU 群, 12 ppm PTU 群および 200 ppm MMI 群の 4
群に分けた。抗甲状腺を投与した 3 群については, 上述の濃度で妊娠 10 日目から離乳時まで
飲水投与した。無処置群については, 上水道水を与えて飼育した。生後 2 日目に, 1 匹の母動
物あたり雌雄各 4 匹となるようにリッター・サイズを調整し, 離乳時 (生後 20 日目) まで子
28
動物を飼育した [16]。投与終了後, 各群雌雄各 20 匹の子動物について, エーテル麻酔下で腹
大動脈から放血することにより安楽殺した。摘出した臓器のうち, 本研究では雄子動物の脳
を以後の検索に用いた。
動物実験計画は, 実施施設 (国立医薬品食品衛生研究所) の動物実験倫理委員会に提出し
て承認を受け, 動物の取り扱いは施設の実験動物指針を尊守した。
組織標本作製およびマイクロダイセクション
採取した各群 4 匹の雄子動物の脳をメタカーン液にて 4°C で 2 時間固定した後, Bregma の
後方約−3.5 mm の 1 カ所で冠状割面を作製し，その対称面が薄切面となるように前後の脳を
パラフィン包埋した。20 µm 厚の切片 40 枚を作製し, PEN-foil film 付きスライドガラス (Leica
Microsystems GmbH, Welzlar, Germany) に貼付してマイクロダイセクション用サンプルとした。
各サンプルは LCM staining kit (Ambion, Inc., Austin, TX, USA) を用いて染色し, 脳梁および両
側大脳白質（外包）組織をレーザーマイクロダイセクション (Leica Microsystems GmbH) を用
いて採取した (Fig. 2-1)。
RNA 抽出およびマイクロアレイ解析
レーザーマイクロダイセクションにより採取したサンプルから, RNAqueous-Micro (Ambion,
Inc.) のプロトコールに従い total RNA を抽出し, RiboGreen RNA Quantitation kit (Molecular
29
Probe Inc., Eugene, OR, USA) を用いて濃度を測定した。Total RNA 200 ng を MessageAmp II
aRNA Kit (Ambion, Inc.) のプロトコールに従い 2 回増幅を行った。2 回目の増幅の際に,
biotin-UTP, biotin-CTP (Enzo Biochem, Inc., Farmingdale, NY, USA) を用いて aRNA をラベルし
た。断片化したビオチンラベル cRNA 15 µg について, GeneChip Rat Genome 230 2.0 Array
(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) および GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix) を用いて遺伝子
発現データを取得した。遺伝子の選抜には GeneSpring software 7.2 (Silicon Genetics, Redwood
City, CA, USA) を用いた。各マイクロアレイチップにおいて, 全遺伝子の発現量の中央値にて
各遺伝子の発現量を除することによりチップ間のバラツキを除いた後に, 無処置群および抗
甲状腺剤曝露群のそれぞれについて平均値を求めた。無処置群の発現量から 2 倍以上の増減
を示す遺伝子を各抗甲状腺剤曝露群にて選抜した後, 抗甲状腺剤曝露群で共通して変動した
遺伝子を選抜した。
Real-time RT-PCR
マイクロアレイ解析で得られた発現変動遺伝子プロファイルを確認するため, ABI Prism
7900 HT (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA) を用いて real-time RT-PCR により
mRNA 発現の定量解析を実施した。検討した遺伝子は, いずれかの抗甲状腺曝露群で無処置
群の発現量から 2 倍以上の増減を示したものとし, 発現量が増加した遺伝子として vimentin,
ret proto-oncogene (Ret), v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene (v-Maf), tektin 4 を, 発
30
現量が減少した遺伝子として claudin 11 (Cld11), zinc finger homeobox 1b (Zfhx1b)を選択した。
cDNA 合成には, マイクロアレイ解析時に調整した aRNA (1 回増幅) を用い, 各遺伝子のプラ
イマーは TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems Inc.) を用いた。内因性コントロ
ールとして glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) の発現量を TaqMan Rodent
GAPDH Control Reagents (Applied Biosystems Inc.) を用いて測定した。発現量の定量は検量線
法により実施し, 各遺伝子の発現量は GAPDH の発現量で補正した。
免疫組織化学的解析
各群 10 匹 (無処置群は 6 匹) の雄子動物の脳をブアン固定後にパラフィン包埋し, 4-5 µm
の厚さに薄切した標本を用いて, マイクロアレイ解析で抽出した以下の分子について免疫組
織化学的解析を実施した；vimentin (mouse monoclonal antibody, 1:200; Millipore Corporation,
Billerica, MA, USA), glial fibrillary acidic protein (GFAP, rabbit polyclonal antibody, 1: 500; Dako,
Glostrup, Denmark), Ret (rabbit polyclonal antibody, 1: 50; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa
Cruz, CA, USA), deleted in colorectal carcinoma (DCC, mouse monoclonal antibody, 1:40; Leica
Microsystems GmbH), oligodendrocyte specific protein (OSP, Cld11 と同一分子, rabbit polyclonal
antibody, 1: 200; Novus Biologicals, Inc., Littleton, CO, USA)。Vimentin 抗体および DCC 抗体使用
時には, 標本を 10 mM クエン酸緩衝液内でマイクロウェーブにより 10 分間加熱することによ
り抗原賦活化を行った。シグナル検出は, VECTASTAIN Elite ABC Mouse IgG kit および
31
VECTASTAIN Elite ABC Rabbit IgG kit (Vector Laboratories, Iic.) のプロトコールに従い, 免疫
反応は 3,3’-diaminobenzidine/H2O2 を用いて可視化した後, ヘマトキシリンにより対比染色し
た。
Vimentin, Ret および GFAP 陽性細胞については, 2 つの切片 (約 100 µm 間隔) を用いて, 各
切片の両側の帯状束における単位面積 (mm2) 当の陽性細胞数を測定した。定量解析のために,
DP70 Digital Camera System (オリンパス) を搭載した BX51 microscope (オリンパス) にて 100
倍の倍率で染色標本の写真を取り込み, WinROOF image analysis software 5.7 (三谷商事) を用
いて定量した。DCC および Cld11 の大脳白質における染色強度は, 次に示す様な基準でスコ
ア化した；0 発現なし, 1 軽微な発現, 2 軽度の発現, 3 中等度の発現, 4 強度の発現。
統計解析
定量データについては, 無処置群と各抗甲状腺剤曝露群間で比較し, Bartlett 法により分散
性の同等性を評価した後に, 分散が等しい場合は Dunnett 法，分散が等しくない場合は Dunnett
型の多重比較検定を実施した。DCC および Cld11 の免疫染色強度のスコアは, Mann-Whitney
の U 検定を用いて無処置群を基準とした検定を実施した。なお, 有意水準 5%以下を有意差あ
りとした。
32
結
果
マイクロアレイ解析による遺伝子発現変動
マイクロアレイ解析の結果, 抗甲状腺剤曝露の 3 群に共通して, 無処置群と比較して 2 倍以
上の発現増加が見られた遺伝子は 428 遺伝子, 0.5 倍以下の発現低下が見られたは遺伝子は 58
遺伝子であった (Table 2-1, -2, Fig. 2-2)。200 ppm MMI 群は, 3 ppm, 12 ppm PTU 群に共通して
変動した遺伝子数と比較し, 変動遺伝子数が少なかった。抗甲状腺剤曝露の 3 群に共通して
変動した遺伝子のうち, 24 遺伝子 (発現増加：20 遺伝子, 発現減少：4 遺伝子) がグリア細胞
分化, 軸索誘導, 髄鞘形成および細胞移動等の中枢神経系発達に関連する遺伝子であった
(Table 2-3)。
マイクロアレイ解析による発現変動プロファイルを検証するため, 発現増加した 4 遺伝子
および発現低下した 2 遺伝子について real-time RT-PCR による遺伝子発現解析を実施したとこ
ろ, いずれの遺伝子についても, マイクロアレイデータと同様の変動を示した (Fig. 2-3)。
マイクロアレイ解析により変動が認められた分子の大脳白質における発現局在
Vimentin, Ret, DCC および Cld11 について, 大脳白質における発現局在を免疫組織学的手法
により解析した。Vimentin 陽性細胞は, 無処置群では白質に散在性に認められた。抗甲状腺剤
曝露群では, 帯状束を中心に発現細胞が認められ, 200 ppm MMI 群および 12 ppm PTU 群で発
33
現細胞の有意な増加が認められた (Fig. 2-4)。
Ret 陽性細胞は, 無処置群では白質において発現が認められ, 200 ppm MMI 群および 12 ppm
PTU 群では帯状束を中心とした発現細胞の有意な増加が認められた (Fig. 2-4)。
DCC は髄鞘と考えられる白質でび漫性に染色性を示し, 200 ppm MMI 群および 12 ppm PTU
群で無処置群と比較して有意な発現強度の増加が認められた (Fig. 2-5)。
Cld11 は髄鞘と考えられる白質でび漫性に染色性を示し, 200 ppm MMI 群で無処置群と比較
して有意な発現強度の増加が認められた (Fig. 2-5)。
GFAP の大脳白質における発現局在
Vimentin 陽性細胞の詳細について検討するため, アストロサイトのマーカーである GFAP
の発現局在を免疫組織学的手法により解析した。GFAP 陽性細胞は, 無処置群では大脳白質に
散在性に認められ, vimentin 陽性細胞より多い陽性細胞数を示した。抗甲状腺剤曝露群では,
200 ppm MMI 群および 12 ppm PTU 群で発現細胞の有意な増加が認められ, vimentin 陽性細胞
と同様に, 帯状束を中心とした分布を示した (Fig. 2-6)。
34
考
察
第 2 章では, オリゴデンドロサイトの発達障害による白質構造の形成不全を示した MMI お
よび PTU 発達期曝露ラットの脳を用いて, グリア細胞を標的としてマイクロダイセクション
法にて採取した大脳白質における発現変動遺伝子をマイクロアレイ法にて探索し, 発現変動
分子の局在を免疫組織学的手法により検討した。本研究に用いたラットは, 甲状腺ホルモン
濃度の変化, ニューロンの移動異常による海馬 CA1 領域の錐体ニューロンの分布のばらつき
等, 甲状腺機能低下に起因する典型的な変化を示すことを確認している [71]。甲状腺ホルモ
ンのグリア細胞の機能・構造に対する作用に関しては, ホルモンレベルの変動に伴うオリゴ
デンドロサイトの髄鞘関連分子およびアストロサイトの酵素や細胞骨格分子の遺伝子発現の
変化が報告されている [4, 14, 23, 24, 35]。したがって, オリゴデンドロサイトとアストロサイ
トの両方が発達期甲状腺機能低下の標的と考えられるため, 本研究では, 過去に報告されて
いる大脳皮質および海馬に関する解析と同様のアプローチを用いて, 白質特異的な遺伝子発
現変化をマイクロアレイにより解析した [41, 61, 63]。本研究では, 抗甲状腺剤曝露がグリア
細胞分化, 軸索誘導, 髄鞘形成および細胞移動等の中枢神経系発達に関連する数々の遺伝子
の発現変動を引き起こすことを示し, それらの遺伝子のうち, vimentin, Ret, DCC および Cld11
は, 大脳白質において免疫組織学的な分布の変化も示した。
Cld11 は 4 回膜貫通型タンパク質であり, 中枢神経系のオリゴデンドロサイトに主に発現し,
35
髄鞘の密着結合の形成に関与している [7, 8, 29, 51]。また, in vitro 試験においては, Cld11 の過
剰発現により, オリゴデンドロサイトの増殖が誘導されることが示されている [78]。発達期
甲状腺機能低下は生後 10 日より脳梁領域のオリゴデンドロサイトの減少を引き起こすこと
が知られているため [66], 本研究で認められた抗甲状腺剤曝露終了時 (生後 20 日) における
Cld11 の過剰発現は, オリゴデンドロサイトの減少に対する代償性反応であることが示唆さ
れた。mRNA レベルでは発現減少を示した点については, mRNA の安定性やタンパク質のタ
ーンオーバー等, 転写後の制御が関係していると推察される。
DCC は 4 つの fibronectin type III ドメインを介して結合する netrin-1 の膜貫通型受容体であ
る [42]。Netrin-1 は, オリゴデンドロサイト移動, 軸索誘導, 髄鞘形成, 神経突起の成長円錐
伸長およびニューロン移動を調整する分泌タンパク質であり, 制御は DCC と Unc5 の受容体
二量体の組み合わせによって行われる [2, 25, 58, 67, 74]。すなわち, DCC がホモ二量体を形成
している受容体は誘導方向に, DCC と UNC-5 のヘテロ二量体を形成している受容体では抑制
方向にシグナルを伝達する。本研究において, 発達期甲状腺機能低下により生後 20 日に認め
られた DCC の髄鞘における発現増加は, 髄鞘形成の抑制 [66] に対する代償的反応である可
能性が考えられた。
一方, 他の報告において, DCC は netrin-1 が存在しない状況下において, ミ
トコンドリアおよび細胞外からのシグナルと関連のない経路によりアポトーシスを誘導する
機能を有することが示されている [26, 27, 48]。本研究のマイクロアレイ解析において,
netrin-1 は mRNA の発現増加が認められなかったため, DCC の発現増加によりリガンドが結合
36
していない DCC が増加し, オリゴデンドロサイトのアポトーシスを誘導した可能性が考えら
れる。発達期甲状腺機能低下ラットは, 成長期においても脳梁面積および脳梁領域のオリゴ
デンドロサイトの減少が進行することが知られているが [66, 71], その原因の一つとして, リ
ガンドに結合していない DCC の増加によるアポトーシスが関連している可能性が示唆され
た。
Ret は transforming growth factor- (TGF-) ファミリーである glial cell line-derived
neurotrophic factor (GDNF) のチロシンキナーゼ型受容体である [65]。GDNF シグナルは神経
系, 腎臓および精子の形成に主要な役割を果たすことが知られている。Ret のオリゴデンドロ
サイトにおける機能的な役割は報告されていないが, オリゴデンドロサイト前駆細胞株およ
びオリゴデンドロサイト細胞株に発現しており, GDNF 処理によって, Ret を介したシグナル
が細胞増殖を誘導することが in vitro 試験にて確認されている [75]。このことから, 発達期甲
状腺機能低下により生後 20 日に認められた Ret の発現増加は, オリゴデンドロサイトの減少
[66] に対する代償性増加である可能性が考えられた。もう一つの可能性として, Ret は DCC
と同様に, リガンドが結合していない状態においてアポトーシスを誘導する機能を有してお
り [6], 本研究のマイクロアレイ解析において GDNF の mRNA は増加していなかったため,
リガンドが結合していない Ret の増加によるオリゴデンドロサイトのアポトーシス誘導によ
り, 成長過程における脳梁面積およびオリゴデンドロサイト密度の減少が引き起こされた可
能性が示唆された。
37
Vimentin は中間径フィラメントの一種であり, 脳においては, 発達期の未成熟なアストロ
サイトに発現していることが知られている [3, 11, 55]。また, vimentin は中枢神経系の実質傷
害に反応して生じるグリオーシスの過程で活性化した未成熟アストロサイト (反応性アスト
ロサイト) においても発現している [16, 68]。反応性アストロサイトは成熟アストロサイトと
同様に GFAP を発現しているため [16, 68], 未成熟アストロサイトは vimentin と GFAP の両分
子を発現していると考えられる。一方, 発達期甲状腺機能低下は胎子ラットの脳における
vimentin の発現増加を誘導し, GFAP も発達期甲状腺機能低下を受けたラットの生後 15 日の脳
梁において発現増加することが報告されている [23, 54]。これらのことから, 発達期甲状腺機
能低下は未成熟なアストロサイトの増加を誘導することが示唆される。本研究において,
vimentin 陽性細胞は GFAP 陽性細胞と同様の局在を示したことから, 発達期甲状腺機能低下に
誘導された帯状束の vimentin 陽性細胞群は, 反応性アストロサイトに類似した未成熟アスト
ロサイトによって構成されていると考えられる。興味深いことに, 筆者らはすでに, 本研究で
使用した発達期甲状腺機能低下ラットにおいて, 脳梁領域に皮質下帯状異所性灰白質が頻繁
に発生していることを確認している [71]。異所性組織の解剖学的な局在は, 発達期甲状腺機
能低下によって未成熟アストロサイトが集積している帯状束に近接していることから, 病因
的関係があると考えられる。未成熟アストロサイトの増加は, 発達期甲状腺機能低下による
オリゴデンドロサイトの減少 [54, 66, 71] に対する反応性変化であると推察されるが, 発達
期甲状腺機能低下によってグリア前駆細胞の分化に障害が生じ, オリゴデンドロサイトへの
38
分化が抑制され, アストロサイトへの分化が促進された可能性も示唆された。
39
小
括
第 2 章では, 発達期甲状腺機能低下に起因する白質発達の異常に焦点をあて, 抗甲状腺剤
を発達期曝露した動物の脳を用いて白質組織特異的マイクロアレイ解析を行い, 脳発達に関
連する分子の発現変動を見出した。得られた遺伝子発現プロファイルの中から, Cld11, DCC,
Ret および vimentin について免疫組織学的解析を行い, 白質におけるこれらの分子の陽性細胞
数ないし染色強度の増加を認めた。帯状束に主に分布する vimentin 陽性未成熟アストロサイ
トおよび Ret 陽性オリゴデンドロサイトは定量的に評価可能であることから, vimentin および
Ret は甲状腺ホルモンかく乱化学物質の発達期曝露に反応するグリア細胞発達障害に関する
有用なマーカーとなる可能性を示した。
40
第3章
臭素化難燃剤の発達期曝露動物における発達期甲状腺機能低下に起因する
グリア細胞発達障害分子の動態
41
緒
言
第 2 章の結果から, 帯状束に主に分布する vimentin 陽性未成熟アストロサイトおよび Ret
陽性オリゴデンドロサイトが, 発達期甲状腺機能低下に起因する白質発達の異常を早期検出
する有用なマーカーとなる可能性が示された。
防火を目的として広く用いられている臭素化難燃剤のうち, DBDE, HBCD および TBBPA
は世界中で最も多く用いられている。これらの物質は, ヒトの血中および母乳中でも検出さ
れていることから, 甲状腺機能低下および神経毒性の影響に関して調査が進められている
[5]。第 1 章にて示した通り, DBDE の発達期曝露は, 高用量群において発達期甲状腺機能低下
に起因すると考えられる不可逆的な白質の低形成を誘発し, 中間用量群においては, 血清中
甲状腺ホルモン濃度の変化を伴わない白質低形成を示した。著者らは, HBCD の発達期曝露に
より弱い甲状腺機能低下および不可逆的なオリゴデンドロサイト密度の減少が生じる一方,
TBBPA 発達期曝露では, 血清中甲状腺ホルモン濃度および白質発達のいずれにおいても顕著
な影響を示さないことを報告している [62]。
第 3 章では, 甲状腺かく乱化学物質の発達期曝露により白質発達に影響を及ぼす分子を明
らかにするため, 軽度の発達期甲状腺機能低下が認められた DBDE 発達期曝露ラットを用い
て, マイクロダイセクション法による白質組織特異的な網羅的遺伝子発現解析を行った。発
現変動を示した分子のうち, 発達期甲状腺機能低下に関連する分子および DBDE の直接影響
により変動した分子を分離するため, 第 2 章にて検討した, 抗甲状腺剤を用いた発達期甲状
42
腺機能低下モデルのプロファイルとの比較を行った。共通して発現変動を示した分子につい
ては, DBDE 発達期曝露ラットと併せて, HBCD および TBBPA を発達期曝露したラットを用い
て免疫組織学的手法による細胞局在の解析を行い, 見出した分子のマーカーとしての有用性
について検討した。
43
材料および方法
化学物質
DBDE は和光純薬工業より購入した。TBBPA および HBCD は東京化成工業 (Tokyo, Japan)
より購入した。
供試動物
妊娠 3 日目の雌性 CD (SD) IGS ラットを日本チャールス・リバーより購入し, 温度 24 ± 1℃,
湿度 55 ± 5%, 照明サイクル 12 時間明/12 時間暗条件の環境下でポリカーボネートケージ内に
おいて飼育した。飼料は, 甲状腺ホルモン産生への影響を除くため, 大豆由来の植物性エスト
ロゲンを除いた SF (NIH-07 変型) 飼料 (オリエンタル酵母工業) を用い [47], 飲用水は上水
道水を用いて, それぞれ自由摂取とした。一週間の馴化期間の後, 異常が認められなかった動
物を実験に供した。
実験デザイン
DBDE, TBBPA および HBCD の曝露実験はそれぞれ個別に実施した。DBDE については第 1
章に記載した試験動物を用いた (DBDE 無処置群, 10 ppm DBDE 群, 100 ppm DBDE 群および
1,000 ppm DBDE 群)。TBBPA については, 32 匹の母動物を 4 群に分け, 0, 100, 1,000 および
44
10,000 ppm TBBPA を妊娠 10 日目から離乳時まで混餌投与した (TBBPA 無処置群, 100 ppm
TBBPA 群, 1,000 ppm TBBPA 群および 10,000 ppm TBBPA 群)。HBCD については, 40 匹の母動
物を 4 群に分け, 0, 100, 1,000 および 10,000 ppm HBCD を妊娠 10 日目から離乳時まで混餌投
与した (HBCD 無処置群, 100 ppm HBCD 群, 1,000 ppm HBCD 群および 10,000 ppm HBCD 群)。
いずれの試験系も, 生後 2 日目に, 1 匹の母動物あたり雌雄各 4 匹となるようにリッター・サ
イズを調整し, 離乳時まで子動物を飼育した。投与終了後, 各群雌雄 20 匹の子動物について,
エーテル麻酔下で腹大動脈から放血することにより安楽殺した。摘出した臓器のうち, 本研
究では雄子動物の脳を以後の検索に用いた。
動物実験計画は, 実施施設 (国立医薬品食品衛生研究所) の動物実験倫理委員会に提出し
て承認を受け, 動物の取り扱いは施設の実験動物指針を尊守した。
組織標本作製およびマイクロダイセクション
DBDE 曝露試験にて採取した各群 4 匹の雄子動物の脳をメタカーン液にて 4°C で 2 時間固
定した後, Bregma の後方約−3.5 mm の 1 カ所で冠状割面を作製し，その対称面が薄切面となる
ように前後の脳をパラフィン包埋した。20 µm 厚の切片 40 枚を作製し, PEN-foil film 付きスラ
イドガラス (Leica Microsystems GmbH) に貼付してマイクロダイセクション用サンプルとし
た。各サンプルは LCM staining kit (Ambion, Inc.) を用いて染色し, 脳梁および外包をレーザー
マイクロダイセクション (Leica Microsystems GmbH) を用いて採取した (Fig. 2-1)。
45
RNA 抽出およびマイクロアレイ解析
レーザーマイクロダイセクションにより採取したサンプルから, RNAqueous-Micro (Ambion,
Inc.) のプロトコールに従い total RNA を抽出し, RiboGreen RNA Quantitation kit (Molecular
Probe Inc.) を用いて濃度を測定した。Total RNA 200 ng を MessageAmp II aRNA Kit (Ambion,
Inc.) のプロトコールに従い 2 回増幅を行った。2 回目の増幅の際に, biotin-UTP, biotin-CTP
(Enzo Biochem, Inc.) を用いて aRNA をラベルした。断片化したビオチンラベル cRNA 15 µg
について, GeneChip Rat Genome 230 2.0 Array (Affymetrix) および GeneChip Scanner 3000
(Affymetrix) を用いて遺伝子発現データを取得した。遺伝子の選抜には GeneSpring software
7.2 (Silicon Genetics) を用いた。各マイクロアレイチップにおいて, 全遺伝子の発現量の中央
値にて各遺伝子の発現量を除することによりチップ間のばらつきを除いた後に, DBDE 無処
置群および各 DBDE 曝露群について平均値を求めた。DBDE 無処置群の発現量から 2 倍以上
の増減を示す遺伝子を各 DBDE 群にて選抜した後, 第 2 章で記載した, 抗甲状腺剤曝露群によ
り変動した遺伝子と共通した遺伝子を選抜した。
免疫組織化学的解析
DBDE 曝露試験, TBBPA 曝露試験, HBCD 曝露試験における各群 5 匹の雄子動物の脳をブア
ン固定後にパラフィン包埋し, 4-5 µm の厚さに薄切した標本を用いて, マイクロアレイ解析
46
にて, DBDE 曝露と抗甲状腺剤曝露で共通して変動した vimentin (mouse monoclonal antibody,
1:200; Millipore Corporation) および Ret (rabbit polyclonal antibody, 1: 50; Santa Cruz
Biotechnology, Inc.) について免疫組織化学的解析を実施した。さらに, DBDE 曝露試験の動物
については, マイクロアレイ解析で変動が認められた neuregulin 1 (Nrg1, heregulin と同一分子;
mouse monoclonal antibody, 1: 40, Exalpha Biologicals, Inc., Watertown, MA), Crk (mouse
monoclonal antibody, 1:2000, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) および Cld11 (rabbit polyclonal
antibody, 1: 200, Novus Biologicals, Inc.) についても免疫組織化学的解析を実施した。
Vimentin 抗体および Nrg1 抗体使用時には, 標本を 10 mM クエン酸緩衝液内でマイクロウェ
ーブにより 10 分間加熱することにより抗原賦活化を行った。シグナル検出は, VECTASTAIN
Elite ABC Mouse IgG kit および VECTASTAIN Elite ABC Rabbit IgG kit (Vector Laboratories, Iic.)
のプロトコールに従い, 免疫反応は 3,3’-diaminobenzidine/H2O2 を用いて可視化した後, ヘマト
キシリンにより対比染色した。
Vimentin および Ret 陽性細胞については, 2 つの切片 (約 100 µm 間隔) を用いて, 各切片の
両側の帯状束における単位面積 (mm2) 当の陽性細胞数を測定した。定量解析のために, DP70
Digital Camera System (オリンパス) を搭載した BX51 microscope (オリンパス) にて 100 倍の
倍率で染色標本の写真を取り込み, WinROOF image analysis software 5.7 (三谷商事) を用いて
定量した。Nrg1, Crk および Cld11 の大脳白質における染色強度は, 次に示す様な基準でスコ
ア化した；0 発現なし, 1 軽微な発現, 2 軽度の発現, 3 中等度の発現, 4 強度の発現。
47
統計解析
定量データについては, 各試験について, 無処置群と各臭素化難燃剤曝露群間で比較した。
Bartlett 法により分散性の同等性を評価した後に, 分散が等しい場合は Dunnett 法，分散が等し
くない場合は Dunnett 型の多重比較検定を実施した。Nrg1, Crk および Cld11 の免疫染色強度
のスコアは, Mann-Whitney の U 検定を用いて無処置群を基準とした検定を実施した。
なお, 有
意水準 5%以下を有意差ありとした。
48
結
果
DBDE 発達期曝露ラットのマイクロアレイ解析における遺伝子発現変動
マイクロアレイ解析の結果, 3 用量の DBDE 群に共通して, DBDE 無処置群と比較して 2 倍
以上の発現増加が見られた遺伝子は 129 遺伝子, 0.5 倍以下の発現低下が見られたは遺伝子は
16 遺伝子であり, 100 ppm および 1,000 ppm DBDE 群に共通して, DBDE 無処置群と比較して 2
倍以上の発現増加が見られた遺伝子は 669 遺伝子, 0.5 倍以下の発現低下が見られたは遺伝子
は 224 遺伝子であった (Table 3-1, -2, -3, -4, Fig. 3-1)。3 用量の DBDE 群に共通して変動した遺
伝子のうちの 12 遺伝子 (発現増加：11 遺伝子, 発現減少：1 遺伝子) および 100 ppm, 1,000 ppm
DBDE 群に共通して変動した遺伝子のうちの 70 遺伝子 (発現増加：52 遺伝子, 発現減少：18
遺伝子) が中枢神経系発達に関連する遺伝子であった (Table 3-5)。
抗甲状腺剤ないし DBDE 発達期曝露における遺伝子発現プロファイルの比較
DBDE 発達期曝露ラットの白質組織における網羅的遺伝子発現プロファイルを第 2 章で示
した抗甲状腺剤発達期曝露ラットの遺伝子発現プロファイルと比較したところ, 発現増加遺
伝子については, 4 遺伝子が 3 用量の DBDE 群および抗甲状腺剤投与 3 群の全てに共通して変
動を認め, 42 遺伝子が 100 ppm, 1,000 ppm DBDE 群および抗甲状腺剤投与 3 群間に共通, 33 遺
伝子が 1,000 ppm DBDE 群および抗甲状腺剤投与 3 群間に共通であった (Table 3-6, Fig. 3-2)。
49
発現低下遺伝子については, 3 用量の DBDE 群および抗甲状腺剤投与 3 群に共通して変動した
遺伝子は認められず, 100 ppm, 1,000 ppm DBDE 群および抗甲状腺剤投与 3 群間, 1,000 ppm
DBDE 群および抗甲状腺剤投与 3 群間において, それぞれ 2 遺伝子が共通して変動した。
Vimentin および Ret の臭素化難燃剤曝露動物の大脳白質における発現局在
マイクロアレイ解析において, vimentin および Ret は抗甲状腺剤曝露動物および DBDE 曝露
動物に共通して発現増加を示した (Table 3-6)。第 2 章で示した通り, vimentin 陽性細胞および
Ret 陽性細胞は, 発達期甲状腺機能低下モデルにて, 帯状束における変動が定量可能であった
ため, これらの分子について, 免疫組織学的手法により, 臭素化難燃剤曝露動物の白質にお
ける発現局在を検討した。
Vimentin 陽性細胞は, 各無処置群では散在性に認められた。DBDE 曝露動物では, 帯状束を
中心に用量依存的な発現細胞の増加が認められ, 100 ppm および 1,000 ppm 群で発現細胞の有
意な増加が認められた (Fig. 3-3)。HBCD 曝露動物では, vimentin 陽性細胞は DBDE 曝露動物
と同様の局在を示し, 1,000 ppm および 10,000 ppm 群で発現細胞の有意な増加が認められた
(Fig. 3-3)。TBBPA 曝露動物では, いずれの用量においても, TBBPA 無処置群と比較して発現
細胞の有意な変動は認められなかった (Fig. 3-3)。
Ret 陽性細胞は, 各無処置群では白質のオリゴデンドロサイトに散在性に発現が認められ
た。DBDE 曝露動物では, 帯状束を中心に用量依存的な発現細胞の増加が認められ, 全ての用
50
量で有意な発現増加が認められた (Fig. 3-4)。
HBCD 曝露動物においても, Ret 陽性細胞は 1,000
ppm および 10,000 ppm 群で有意な発現増加が認められた (Fig. 3-4)。
TBBPA 曝露動物では, い
ずれの用量においても, TBBPA 無処置群と比較して発現細胞の有意な変動は認められなかっ
た (Fig. 3-4)。
マイクロアレイ解析により変動が認められた分子の DBDE 曝露動物の大脳白質における発現
強度
DBDE 発達期曝露動物を用いたマイクロアレイ解析で発現変動を示した分子について,
DBDE 曝露動物での免疫組織学的解析を実施した。対象とした分子は, 100 ppm, 1,000 ppm
DBDE 群および抗甲状腺剤投与 3 群間で共通して発現低下を示した Cld11 および, 100 ppm,
1,000 ppm DBDE 群で共通して発現増加を示した Nrg1, Crk とした (Table 3-3, -6)。100 ppm
DBDE 群および 1,000 ppm DBDE 群は, オリゴデンドロサイトを対象とした形態計測的解析に
より白質の低形成を示したため, これらの分子を選択した。
Nrg1, Crk および Cld11 のいずれも, 髄鞘に相当する白質でび漫性に染色され, Nrg1 および
Crk は 1,000 ppm DBDE 群で DBDE 無処置群と比較して有意な発現強度の増加が認められた
(Fig. 3-5)。Cld11 は 10 ppm DBDE 群で DBDE 無処置群と比較して有意な発現強度の低下が認
められ, 100 ppm DBDE 群および 1,000 ppm DBDE 群においても, 統計学的有意差はないもの
の, 発現強度の低下傾向が認められた (Fig. 3-5)。
51
考
察
第 1 章にて, 母動物への DBDE 曝露はラット子動物にオリゴデンドロサイトを標的とした
白質の低形成を 100 ppm 以上の濃度で誘発し, 少なくとも 1,000 ppm では軽度の甲状腺機能低
下を伴うことを示した。同じ実験サンプルを用いて, 第 3 章においては, マイクロダイセクシ
ョン法にて脳梁と外包からなる白質組織を採取し, DBDE 発達期曝露に関する網羅的遺伝子
発現プロファイルを取得した。さらに, その発現プロファイルを第 2 章で示した抗甲状腺剤
を用いた発達期甲状腺機能低下ラットモデルにおけるプロファイルと比較した。比較した結
果, 発達期甲状腺機能低下と DBDE 発達期曝露間で共通して変動した遺伝子群が見出された
ことから, DBDE 曝露により, 大脳白質に発達期甲状腺機能低下と同様のメカニズムが生じて
いることが示唆された。一方, DBDE 曝露でのみ発現変動が認められた遺伝子も存在したこと
から, DBDE が脳に直接作用する可能性も示唆された。甲状腺機能低下と DBDE 曝露で共通し
て変動を示した遺伝子の中には, 発達期甲状腺機能低下により陽性細胞の分布が増加した
vimentin および Ret も含まれていた。
本研究では, DBDE および HBCD を中, 高用量で母動物に曝露した離乳時の子動物の帯状束
において, vimentin 陽性細胞数の増加が認められた。変化を示した動物のうち, DBDE 発達期
曝露動物は第 1 章で示した通り, 生後 11 週目に定量的形態計測解析により白質の低形成およ
びオリゴデンドロサイト密度の減少を示した。また, HBCD 発達期曝露動物についても高用量
52
群ではオリゴデンドロサイト密度の減少を示した [62]。一方, TBBPA 発達期曝露動物は本研
究において vimentin 陽性細胞数の変化は示さず, 生後 11 週目に白質の低形成およびオリゴデ
ンドロサイト密度の減少が認められなかったことと同様の結果を示した [62]。第 2 章で示し
た通り, 発達期甲状腺機能低下により, 帯状束で発現細胞数が増加した vimentin は GFAP 陽性
細胞と同様の局在を示すことを見出している。Vimentin は発達中の未成熟アストロサイトで
発現しており, GFAP は未成熟アストロサイト, 成熟アストロサイトの両方で発現している [3,
16]。DBDE および HBCD 曝露により増加を示した vimentin 陽性細胞は, 発達期甲状腺機能低
下で認められた vimentin 陽性細胞と同様の局在を示していることから, 未成熟アストロサイ
トであると考えられた。本研究で, DBDE および HBCD の発達期曝露により, 帯状束で
vimentin 陽性細胞が増加した理由は明らかではないが, 著者らは以前に, 発達期甲状腺機能低
下動物において, 解剖学的に異常な皮質組織が認められる皮質下帯状異所性灰白質が脳梁領
域に頻繁に生じていることを報告している [71]。この異所性組織の解剖学的な局在は発達期
甲状腺機能低下によって未成熟アストロサイトが集積する帯状束に近接していることから,
病因的関係があることが示唆されるが, DBDE および HBCD 曝露では異所性組織は認められ
なかった。もうひとつの可能性として, 未成熟アストロサイトの増加は, DBDE および HBCD
曝露によるオリゴデンドロサイトの減少に関連する単純な反応性変化である可能性も考えら
れる。
本研究では, DBDE の全用量および HBCD の中, 高用量で離乳時の子動物の帯状束において,
53
Ret 陽性オリゴデンドロサイトの増加が認められたが, TBBPA 曝露動物では, Ret 陽性オリゴ
デンドロサイトの局在の変化は認められなかった。Ret は TGF-ファミリーである GDNF の
チロシンキナーゼ型受容体であり, リガンドが結合していない状態においてアポトーシスを
誘導する [6, 65]。DBDE 曝露動物を用いたマイクロアレイ解析において GDNF mRNA の発現
増加は認められなかったため, 第 2 章で示した発達期甲状腺機能低下モデルと同様に, リガ
ンドが結合していない Ret の増加によるアポトーシスの促進により, DBDE および HBCD では,
白質の低形成が誘導された可能性が示唆された。
本研究では, Cld11 は発達期甲状腺機能低下と DBDE 発達期曝露の白質組織特異的なマイク
ロアレイ解析で共通して mRNA の発現低下を示した。よって, DBDE 発達期曝露動物につい
て免疫組織学的解析を実施したところ, Cld11 は発現強度の低下傾向が認められた。Cld11 は
オリゴデンドロサイトに発現する 4 回膜貫通型タンパク質であり, in vitro 試験においては, 過
剰発現によってオリゴデンドロサイトの増殖が誘導されることが示されている [8, 78]。この
結果は, DBDE 発達期曝露による白質の Cld11 の発現強度の減少が, 第 1 章で示した不可逆的
な白質の低形成と関連している可能性を示唆している。
DBDE 試験において, マイクロアレイ解析により発現変動を示した遺伝子のうち, Crk およ
び Nrg1 は 1,000 ppm DBDE 曝露動物の白質において発現強度の増加を示した。Crk は, 新生
子の海馬歯状回の顆粒細胞の移動や成熟を制御する reelin 経路において, Dab1 のチロシンリ
ン酸化に関連するアダプター分子である [34]。また, Nrg1 は中枢神経系において, ニューロン
54
移動, 軸索経路探索, 神経伝達およびシナプス可塑性を制御する神経栄養因子であることが
知られている [49]。Crk および Nrg1 は, 1,000 ppm DBDE 群のみで発現強度の増加を示したこ
とから, これらの分子は, DBDE 発達期曝露による影響を検出するマーカーとして, vimentin
および Ret よりも感度が低いと考えられた。また, これら分子は, 免疫組織学的手法により染
色強度のみ評価可能であり, 定量的に測定することが不可能であることから, マーカーとし
ての有用性は低いと判断した。
DBDE 曝露による甲状腺への影響および発達期の神経行動学的影響については, マウスお
よびラットに関する報告がなされており [40, 59, 83], 第 1 章で示した通り, 本研究で用いて
いるサンプルにおいても, 1,000 ppm DBDE 群で発達期甲状腺機能低下が生じることが示唆さ
れている。Zhang 氏 [88] は, 出産前および出産後に DBDE を曝露されたラット子動物の乳子
期において, DBDE およびその脱臭素化された代謝物が脳を含む臓器・組織に分布しているこ
とを報告しているが, この結果は, グリア細胞の変化に DBDE が直接影響をおよぼす可能性
を示唆している。本研究では, 離乳時の子動物において, 100 ppm (7.0–22.8 mg/kg body
weight/day) 以上の DBDE 曝露で vimentin 陽性未成熟アストロサイトの増加が認められ, 10
ppm (0.7–2.4 mg/kg body weight/day) 以上の DBDE 曝露で Ret 陽性オリゴデンドロサイトの増
加が認められた。また, DBDE 発達期曝露により発現変動を示した遺伝子のうち抗甲状腺剤投
与による発達期甲状腺機能低下モデルの発現変動と共通している遺伝子数はわずか 6%であ
る。これらの結果は, 1,000 ppm DBDE 群においては軽微な甲状腺機能低下に関連した影響も
55
付随しているものの, DBDE はグリア細胞に直接的な影響を生じることを示唆している。欧州
食品安全機関 (EFSA) は, 一般的な成人は食事により 0.35～2.82 ng/kg body weight/day, ハウ
スダストにより 0.045–7 ng/kg body weight/day の DBDE に曝露されており, 乳児は母乳により
1.44–19.95 ng/kg body weight/day の DBDE に曝露されていることを報告している [17]。この報
告から考えると, 本研究で影響の認められた DBDE 曝露量はヒトの推定一日摂取量の約 104
程度のレベルであると考えられる。著者らは過去に, 本研究と同じサンプルを用いて, 100
ppm 以上の DBDE 曝露により, 離乳時の子動物に神経発達に影響が生じることを報告してい
る [64]。また, DBDE は甲状腺ホルモン受容体の DNA 結合部位と干渉することにより, 甲状
腺ホルモンを介する転写を阻害することを示唆する報告もある [36]。これらの結果は, 現状
のヒトへの曝露レベルよりはるかに高い用量ではあるものの, DBDE が脳における甲状腺ホ
ルモンの作用に影響を及ぼす可能性を示唆している。
著者らは以前, 本研究で用いているサンプルにおいて, 10,000 ppm HBCD 曝露により, 離乳
時の子動物において, 軽度な血清中 T3 濃度の減少および血清中 TSH 濃度の増加を報告してい
る [62]。また, 甲状腺機能低下に関連する影響として, 10,000 ppm (803.2–2231.3 mg/kg body
weight/day) HBCD 曝露によりオリゴデンドロサイトの分布が減少し, ニューロンの発達にも
影響が生じることを示している [62, 64]。本研究では, 離乳時において, 1,000 ppm (80.7–212.9
mg/kg body weight/day) 以上の HBCD 曝露により, vimentin 陽性未成熟アストロサイトおよび
Ret 陽性オリゴデンドロサイトの増加が検出されており, HBCD の脳発達への直接的な作用の
56
可能性が示唆された。EFSA は, 一般的な成人は食事により 0.09～0.99 ng/kg body weight/day,
ハウスダストにより 2.4–6 ng/kg body weight/day の HBCD に曝露されており, 乳児は母乳によ
り 0.90–213 ng/kg body weight/day の HBCD に曝露されていることを報告している [18]。この
報告から考えると,
本研究で影響の認められた HBCD 曝露量は, ヒトの推定一日摂取量の約
105 程度のレベルであると考えられる。HBCD は, 甲状腺ホルモン受容体への直接影響や, T4
とその血漿中輸送蛋白質であるトランスサイレチンとの結合に対する拮抗作用に関する報告
がなされている [32, 87]。これらの報告と併せて考えると, 現状のヒトへの曝露レベルよりは
るかに高い用量ではあるものの, HBCD が脳発達に直接作用する可能性を示唆している。
TBBPA に関しては, 本研究で用いているサンプルにおいて, 100 および 1,000 ppm TBBPA 曝
露により離乳時に認められた, 用量反応性のない血清中 T3 濃度の減少を除き, 甲状腺に関連
する変化は認められていない [62]。著者らの過去の研究では, TBBPA によるニューロン発達
への直接影響が示唆されているが [64], 本研究では, TBBPA 発達期曝露によって vimentin 陽
性未成熟アストロサイト数および Ret 陽性オリゴデンドロサイト数に変化は認められなかっ
たことから, 白質発達に関しては TBBPA は影響を及ぼさないことが示唆された。
57
小
括
第 3 章では, DBDE 曝露子動物を用いたマイクロアレイ解析により, 大脳白質において, 第 2
章で示した発達期甲状腺機能低下モデルと同様に, vimentin および Ret の mRNA 発現が増加を
示すことを見出した。臭素化難燃剤を発達期曝露した子動物において, これらの分子に関し
て免疫組織学的解析を実施したところ, vimentin 陽性未成熟アストロサイトは 100 ppm 以上の
DBDE 曝露および 1,000 ppm 以上の HBCD 曝露で増加し, Ret 陽性オリゴデンドロサイトは 10
ppm 以上の DBDE 曝露および 1,000 ppm 以上の HBCD 曝露で増加した。一方, TBBPA につい
ては, vimentin 陽性細胞, Ret 陽性細胞のいずれについても影響を示さなかった。DBDE および
HBCD の高用量群では, 抗甲状腺作用もグリア細胞発達に影響するメカニズムの一部を構成
するものと考えられたが, その寄与は軽度であり, DBDE および HBCD はグリア細胞発達に関
する直接作用を有することが示唆された。本研究で認められた大脳白質の vimentin 陽性未成
熟アストロサイトおよび Ret 陽性オリゴデンドロサイトの変化は, 成熟後に認められた不可
逆的な白質低形成およびオリゴデンドロサイト密度の減少と同様の用量で認められているこ
とから, 甲状腺ホルモンかく乱物質様の発達期神経毒性を生じる化学物質の影響を評価する
上で, 有用なマーカーとなることが示唆された。
58
総合考察
本研究では, 臭素化難燃剤の一種である DBDE の発達期曝露により, 発達期甲状腺機能低
下に関連する不可逆的な白質の低形成が生じることを示した。また, 発達期甲状腺機能低下
により生じる白質低形成に関連する分子マーカーとして, 帯状束に分布する vimentin 陽性未
成熟アストロサイトおよび Ret 陽性オリゴデンドロサイトを見出し, これらの細胞が, DBDE
発達期曝露動物および HBCD 発達期曝露動物における不可逆的な白質低形成およびオリゴデ
ンドロサイト密度の減少と関連して増加することを示した。
DBDE は食糧農業機関/世界保健機関 合同食品添加物専門家会議 (JECFA) および EFSA に
おけるリスク評価にて, 曝露マージンが十分に大きく, ヒトの健康リスクへの影響の懸念は
ないと結論されており, HBCD も EFSA にて同様の評価がなされている [17, 18, 39]。本研究で
適用したこれらの物質の曝露量は, 現状のヒトへの曝露量と比較してかなり高い用量ではあ
ったが, これらの物質が大脳白質に器質的な変化を生じる可能性を示し, その影響は離乳時
の vimentin 陽性未成熟アストロサイトおよび Ret 陽性オリゴデンドロサイトの数の測定によ
り検出可能であった。EPA では DBDE を段階的に代替していく旨を 2009 年に発表しており,
HBCD についても 2013 年にリスク評価を実施する予定としている。本邦においても, DBDE
は化管法の第１種指定化学物質, HBCD は化審法の監視化学物質に指定されており, 将来的に
は他の難燃剤への代替が進んでいくことが想定されるが, 代替が進まず, ヒトへの曝露量が
59
増加していった場合は, 高蓄積・難分解性という物質特性からも, 発達期曝露された子供の脳
発達に障害が生じる可能性が懸念される。
本研究は, 臭素化難燃剤による発達期甲状腺機能低下に焦点をあて, 白質低形成に関連す
る分子マーカーの探索・有用性検討を進めたが, DBDE および HBCD については, 発達期甲状
腺機能低下を介さない脳への直接影響についても vimentin 陽性細胞および Ret 陽性細胞で検
出することができた。著者らは, 過去に本研究と同様のアプローチにて, 発達期甲状腺機能低
下に起因する海馬でのニューロン発達障害に関連する分子として, 甲状腺ホルモンにより発
現制御を受け, ニューロンの移動や位置情報を決定する分子である Reelin を見出している
[63]。
歯状回門に分布する Reelin 陽性未熟 GABA ニューロンについて, 本研究と同様に DBDE,
HBCD および TBBPA の 3 種類の臭素化難燃剤について評価を行ったところ, DBDE について
は vimentin 陽性細胞と同様に中間用量から, TBBPA についても中間用量から, Reelin 陽性細胞
の増加が認められ, 発達期甲状腺機能低下を介さない脳への直接影響を検出している [64]。
本研究では, Ret 陽性オリゴデンドロサイトの増加がオリゴデンドロサイトのアポトーシスを
誘導し, vimentin 陽性未成熟アストロサイトの増加は, オリゴデンドロサイトの減少に対する
反応性変化であることが示唆されており, これらの細胞は各群 5 匹の子動物の測定により影
響を定量的に評価可能であるほどの感度を有していたことから, OECD および EPA から示さ
れたガイドラインに則った高次の発達期神経毒性試験を実施する前の簡便なスクリーニング
試験のマーカーとして有用であると考えられる。今後, これら分子に関するメカニズムの詳
60
細な解析を進めると共に, WHO から例示されている発達神経毒性を引き起こす化学物質
[38] , OECD および EPA のガイドラインに則った発達期神経毒性試験で影響が確認されてい
る化学物質 [45] に関して, 本研究で見出した白質発達に関するマーカーおよび先に示した
reelin 等のニューロン発達に関するマーカーを用いた評価を実施し, これらマーカーが検出可
能な化学物質およびそのカテゴリー, 機序を把握することにより, 環境中にある神経毒性物
質を検出する有用なスクリーニング系の構築が可能になると考えられる。
61
結
論
本研究は, 発達期甲状腺機能低下に起因する白質の形成異常に関連する発達期神経毒性物
質の評価系の確立を目的とし, 陽性対照である抗甲状腺剤を用いたマーカー探索を行った。
次いで, 弱い抗甲状腺作用を有する臭素化難燃剤を曝露した際の影響について, 見出したマ
ーカーを用いて評価し, マーカーの有用性検討を行った。
第１章では, DBDE 発達期曝露の影響を評価するため, 妊娠ラットに DBDE を 10, 100 およ
び 1,000 ppm で妊娠 10 日目から離乳時まで混餌投与し, 子動物に経胎盤・経乳的に曝露した
際の毒性影響を脳発達障害の形態計測手法を導入して解析した。その結果, 雄子動物に成熟
後まで継続する軽度の甲状腺機能低下が生じ, 100 ppm 以上の DBDE 曝露群では, オリゴデン
ドロサイトを標的とした, 不可逆的な白質の低形成が生じることを見出した。
第 2 章では, 発達期甲状腺機能低下に起因する白質発達異常に関連する分子マーカーを見
出すために, 抗甲状腺剤を発達期曝露したラットの脳を用いて, マイクロダイセクション法
を適用した白質組織特異的な網羅的遺伝子発現解析を行い, 脳発達に関連する分子の発現変
動プロファイルを取得した。Vimentin および Ret については, 免疫組織学的手法による細胞局
在についても併せて解析したところ, 帯状束に主に分布する vimentin 陽性未成熟アストロサ
イトおよび Ret 陽性オリゴデンドロサイトは, 発達期甲状腺機能低下の影響を離乳時にて定
62
量的に評価可能であることから, 甲状腺ホルモンかく乱化学物質の発達期曝露に反応するグ
リア細胞発達障害に関する有用なマーカーとなる可能性を示した。
第 3 章では, 第 1 章にて軽度の発達期甲状腺機能低下が認められた DBDE 発達期曝露ラッ
トを用いて, マイクロダイセクション法を適用した白質組織に特異的な網羅的遺伝子発現解
析を行い, 第 2 章で実施した抗甲状腺剤を用いた発達期甲状腺機能低下モデルのプロファイ
ルとの比較を行った。
その結果, vimentin および Ret が共通して発現変動していたことから, 両
分子について, DBDE に加えて, 2 つの臭素化難燃剤発達期曝露ラットを用いて免疫組織学的
解析を行った。対象とした臭素化難燃剤は, 発達期曝露により軽度の甲状腺機能低下および
オリゴデンドロサイト密度の減少を示した HBCD と, 顕著な変化を示さなかった TBBPA とし
た。Vimentin 陽性未成熟アストロサイトは 100 ppm 以上の DBDE 曝露および 1,000 ppm 以上
の HBCD 曝露でその数が増加し, Ret 陽性オリゴデンドロサイトは 10 ppm 以上の DBDE 曝露
および 1,000 ppm 以上の HBCD 曝露で数が増加した。この結果から, DBDE および HBCD は, 発
達期甲状腺機能低下を介さない直接的な影響をグリア細胞発達に及ぼすことが示唆された。
一方, TBBPA については, vimentin 陽性細胞および Ret 陽性細胞のいずれについても影響を示
さなかった。
以上の結果から, 離乳時における大脳白質の vimentin 陽性未成熟アストロサイトおよび Ret
陽性オリゴデンドロサイトの分布変化は, 成熟後に認められた不可逆的な白質低形成および
オリゴデンドロサイト密度の減少と同様の挙動を示すことを抗甲状腺剤および臭素化難燃剤
63
を発達期曝露した動物において確認できた。これらの分子は, 甲状腺ホルモンかく乱物質様
の発達期神経毒性を生じる化学物質の有用なスクリーニング系のマーカーとして期待される。
64
謝
辞
本稿を終えるにあたり, 本研究の逐行に際して終始御指導, 御鞭撻を賜りました東京農工
大学大学院農学研究院動物生命科学部門 渋谷 淳 教授に深謝いたします。
本稿作成に際し, 懇篤な御指導, 御助言を賜りました, 帯広畜産大学基礎獣医学研究部門病態
予防学分野 古林 与志安 教授, 岩手大学農学部共同獣医学科 御領 政信 教授, 東京農工大学大
学院農学研究院動物生命科学部門 下田 実 教授, 岐阜大学応用生物科学部応用生物科学科 柳井
徳磨 教授に謹んで深謝の意を表します。
研究に際し, 御指導・御協力賜りました, 広瀬 雅雄 先生, 国立医薬品食品衛生研究所安全
性生物試験研究センター長 西川 秋佳 先生, 国立医薬品食品衛生研究所病理部の皆様に心
から感謝いたします。
65
引用文献
1)
Akaike, M., Kato, N., Ohno, H. and Kobayashi, T. (1991). Hyperactivity and spatial maze
learning impairment of adult rats with temporary neonatal hypothyroidism. Neurotoxicol. Teratol.
13, 317~22.
2)
Alcántara, S., Ruiz, M., De Castro, F., Soriano, E. and Sotelo, C. (2000). Netrin 1 acts as an
attractive or as a repulsive cue for distinct migrating neurons during the development of the
cerebellar system. Development. 127, 1359~1372.
3)
Alonso, G. (2001) Proliferation of progenitor cells in the adult rat brain correlates with the
presence of vimentin-expressing astrocytes. Glia. 34, 253~266.
4)
Barradas, P.C., Vieira, R.S.and De, Freitas, M.S. (2001). Selective effect of hypothyroidism on
expression of myelin markers during development. J. Neurosci. Res. 66, 254~261.
5)
Birnbaum, L.S. and Staskal, D.F. (2004). Brominated flame retardants: cause for concern?
Environ. Health. Perspect. 112, 9~17.
6)
Bordeaux, M.C., Forcet, C., Granger, L., Corset, V., Bidaud, C., Billaud, M., Bredesen, D.E.,
Edery, P. and Mehlen, P. (2000). The RET proto-oncogene induces apoptosis: a novel mechanism
for Hirschsprung disease. EMBO J. 19, 4056~4063.
7)
Bronstein, J.M., Popper, P., Micevych, P.E. and Farber, D.B. (1996). Isolation and
66
characterization of a novel oligodendrocyte-specific protein. Neurology. 47, 772~778.
8)
Bronstein, J.M., Micevych, P.E. and Chen, K. (1997). Oligodendrocyte-specific protein (OSP) is a
major component of CNS myelin. J. Neurosci. Res. 50, 713~720.
9)
Brouwer, A., Morse, D.C., Lans, M.C., Schuur, A.G., Murk, A.J., Klasson-Wehler, E., Bergman,
A. and Visser, T.J. (1998). Interactions of persistent environmental organohalogens with the
thyroid hormone system: mechanisms and possible consequences for animal and human health.
Toxicol. Ind. Health. 14, 59~84.
10) Carlson, G.P. (1980). Induction of xenobiotic metabolism in rats by short-term administration of
brominated diphenyl ethers. Toxicol. Lett. 5, 19~25.
11) Ciesielski-Treska, J., Goetschy, J.F., Ulrich, G. and Aunis, D. (1988). Acquisition of vimentin in
astrocytes cultured from postnatal rat brain. J. Neurocytol. 17, 79~86.
12) Comer, C.P. and Norton, S. (1982) Effects of perinatal methimazole exposure on a developmental
test battery for neurobehavioral toxicity in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol. 63, 133~141.
13) Darnerud, P.O., Eriksen, G.S., Jóhannesson, T., Larsen, P.B. and Viluksela, M. (2001).
Polybrominated diphenyl ethers: occurrence, dietary exposure, and toxicology. Environ. Health.
Perspect. 109, 49~68.
14) Dasgupta, A., Das, S. and Sarkar, P.K. (2007). Thyroid hormone promotes glutathione synthesis
in astrocytes by up regulation of glutamate cysteine ligase through differential stimulation of its
67
catalytic and modulator subunit mRNAs. Free Radic. Biol. Med. 42, 617~626.
15) de Wit, C.A. (2002). An overview of brominated flame retardants in the environment.
Chemosphere 46, 583~624.
16) Eddleston, M. and Mucke, L. (1993). Molecular profile of reactive astrocytes—implications for
their role in neurologic disease. Neuroscience 54, 15~36.
17) EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain. (2011). Scientific Opinion on Polybrominated
Diphenyl Ethers (PBDEs) in Food. EFSA Journal. 9: 2156 [274 pp].
18) EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain. (2011). Scientific Opinion on
Hexabromocyclododecanes (HBCDDs) in Food. EFSA Journal. 9, 2296 [118 pp].
19) Eriksson, P., Ankarberg, E., Viberg, H. and Fredriksson, A. (2001). The developing cholinergic
system as target for environmental toxicants, nicotine and polychlorinated biphenyls (PCBs):
implications for neurotoxicological processes in mice. Neurotox. Res. 3, 37~51.
20) Eriksson, P., Jakobsson, E. and Fredriksson, A. (2001). Brominated flame retardants: a novel class
of developmental neurotoxicants in our environment? Environ. Health. Perspect. 109, 903~908.
21) Eriksson, P., Viberg, H., Jakobsson, E., Orn, U. and Fredriksson, A. (2002). A brominated flame
retardant, 2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether: uptake, retention, and induction of
neurobehavioral alterations in mice during a critical phase of neonatal brain development.
Toxicol. Sci. 67, 98~103.
68
22) Eriksson, P., Fischer, C. and Fredriksson, A. (2006). Polybrominated diphenyl ethers, a group of
brominated flame retardants, can interact with polychlorinated biphenyls in enhancing
developmental neurobehavioral defects. Toxicol. Sci. 94, 302~309.
23) Evans, I.M., Pickard, M.R., Sinha, A.K., Leonard, A.J., Sampson, D.C. and Ekins, R.P. (2002).
Influence of maternal hyperthyroidism in the rat on the expression of neuronal and astrocytic
cytoskeletal proteins in fetal brain. J. Endocrinol. 175, 597~604.
24) Farwell, A.P. and Dubord-Tomasetti, S.A. (1999). Thyroid hormone regulates the expression of
laminin in the developing rat cerebellum. Endocrinology 140, 4221~4227.
25) Fazeli, A., Dickinson, S.L., Hermiston, M.L., Tighe, R.V., Steen, R.G., Small, C.G., Stoeckli, E.T.,
Keino-Masu, K., Masu, M., Rayburn, H., Simons, J., Bronson, R.T., Gordon, J.I.,
Tessier-Lavigne, M. and Weinberg, R.A. (1997). Phenotype of mice lacking functional Deleted in
colorectal cancer (Dcc) gene. Nature 386, 796~804.
26) Forcet, C., Ye, X., Granger, L., Corset, V., Shin, H., Bredesen, D.E. and Mehlen, P. (2001). The
dependence receptor DCC (deleted in colorectal cancer) defines an alternative mechanism for
caspase activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3416~3421.
27) Furne, C., Corset, V., Hérincs, Z., Cahuzac, N., Hueber, A.O. and Mehlen, P. (2006). The
dependence receptor DCC requires lipid raft localization for cell death signaling. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 103, 4128~4133.
69
28) Goodman, J.H. and Gilbert, M.E. (2007). Modest thyroid hormone insufficiency during
development induces a cellular malformation in the corpus callosum: a model of cortical
dysplasia. Endocrinology 148, 2593~2597.
29) Gow, A., Southwood, C.M., Li, J.S., Pariali, M., Riordan, G.P., Brodie, S.E., Danias, J., Bronstein,
J.M., Kachar, B. and Lazzarini, R.A. (1999). CNS myelin and sertoli cell tight junction strands
are absent in Osp/claudin-11 null mice. Cell 99, 649~659.
30) Guadaño, Ferraz. A., Escobar, del. Rey. F., Morreale, de. Escobar. G., Innocenti, G.M. and Berbel,
P. (1994). The development of the anterior commissure in normal and hypothyroid rats. Brain.
Res. Dev. Brain. Res. 81, 293~308.
31) Hallgren, S., Sinjari, T., Håkansson, H. and Darnerud, P.O. (2001). Effects of polybrominated
diphenyl ethers (PBDEs) and polychlorinated biphenyls (PCBs) on thyroid hormone and vitamin
A levels in rats and mice. Arch. Toxicol. 75, 200~208.
32) Hamers, T., Kamstra, J.H., Sonneveld, E., Murk, A.J., Kester, M.H., Andersson, P.L., Legler, J.
and Brouwer, A. (2006). In vitro profiling of the endocrine-disrupting potency of brominated
flame retardants. Toxicol. Sci. 92, 157~173.
33) Hardy, M.L., Schroeder, R., Biesemeier, J. and Manor, O. (2002). Prenatal oral (gavage)
developmental toxicity study of decabromodiphenyl oxide in rats. Int. J. Toxicol. 21, 83~91.
34) Huang, Y., Magdaleno, S., Hopkins, R., Slaughter, C., Curran, T. and Keshvara, L. (2004).
70
Tyrosine phosphorylated Disabled 1 recruits Crk family adapter proteins. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 318, 204~212.
35) Ibarrola, N. and Rodríguez-Peña, A. (1997). Hypothyroidism coordinately and transiently affects
myelin protein gene expression in most rat brain regions during postnatal development. Brain
Res. 752, 285~293.
36) Ibhazehiebo, K., Iwasaki, T., Kimura-Kuroda, J., Miyazaki, W., Shimokawa, N. and Koibuchi, N.
(2011). Disruption of thyroid hormone receptor-mediated transcription and thyroid
hormone-induced Purkinje cell dendrite arborization by polybrominated diphenyl ethers. Environ.
Health. Perspect. 119, 168~175.
37) IPCS (International Program on Chemical Safety). (1994). Environmental Health Criteria no. 162.
Brominated diphenyl ethers. WHO, Geneva.
38) IPCS (International Program on Chemical Safety). (2001). Environmental Health Criteria no. 223.
Neurotoxicity risk assessment for human health, principles and approaches. WHO, Geneva.
39) JECFA, (2006). Polybrominated Dipheny Ethers. In: Safety evaluation of certain contaminants in
food, WHO Food Additives Series 55, (FAO Food and Nutrition Paper 82). Prepared by the
Sixty-fourth meeting of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA),
WHO, Geneva, 351~561.
40) Kim, T.H., Lee, Y.J., Lee, E., Kim, M.S., Kwack, S.J., Kim, K.B., Chung, K.K., Kang, T.S., Han,
71
S.Y., Lee, J., Lee, B.M. and Kim, H.S. (2009). Effects of gestational exposure to
decabromodiphenyl ether on reproductive parameters, thyroid hormone levels, and neuronal
development in Sprague-Dawley rats offspring. J. Toxicol. Environ. Health A 72, 1296~1303.
41) Kobayashi, K., Akune, H., Sumida, K., Saito, K., Yoshioka, T. and Tsuji, R. (2009). Perinatal
exposure to PTU decreases expression of Arc, Homer 1, Egr 1 and Kcna 1 in the rat cerebral
cortex and hippocampus. Brain Res. 1264, 24~32.
42) Kruger, R.P., Lee, J., Li, W. and Guan, K.L. (2004). Mapping netrin receptor binding reveals
domains of Unc5 regulating its tyrosine phosphorylation. J. Neurosci. 24, 10826~10834.
43) Kuriyama, S.N., Wanner, A., Fidalgo-Neto, A.A., Chris, E., Talsness, C.E., Koerner, W. and
Chahoud, I. (2007). Developmental exposure to low-dose PBDE-99: Tissue distribution and
thyroid hormone levels. Toxicology 242, 80~90.
44) Lavado-Autric, R., Ausó, E., García-Velasco, J.V., Arufe, Mdel. C., Escobar, del. Rey. F., Berbel,
P. and Morreale, de. Escobar. G. (2003). Early maternal hypothyroxinemia alters histogenesis and
cerebral cortex cytoarchitecture of the progeny. J. Clin. Invest. 111, 1073~1082.
45) Makris, S.L., Raffaele, K., Allen, S., Bowers, W.J., Hass, U., Alleva, E., Calamandrei, G., Sheets,
L., Amcoff, P., Delrue, N., and Crofton, K.M. (2009). A retrospective performance assessment of
the developmental neurotoxicity study in support of OECD Test Guideline 426. Environ. Health
Perspect. 117, 17~25.
72
46) Marsh, G., Bergman, Å., Bladh, L-G., Gillner, M. and Jakobsson, E. (1998). Synthesis of
p-hydroxybromodiphenyl ethers and binding to the thyroid hormone receptor. Organohalogen
Comp. 37, 305~309.
47) Masutomi, N., Shibutani, M., Takagi, H., Uneyama, C. and Hirose, M. (2004). Dietary influence
on the impact of ethinylestradiol-induced alterations in the endocrine/reproductive system with
perinatal maternal exposure. Reprod. Toxicol. 18, 23~33.
48) Mehlen, P., Rabizadeh, S., Snipas, S.J., Assa-Munt, N., Salvesen, G.S. and Bredesen, D.E. (1998).
The DCC gene product induces apoptosis by a mechanism requiring receptor proteolysis. Nature
395, 801~804.
49) Mei, L. and Xiong, W.C. (2008). Neuregulin 1 in neural development, synaptic plasticity and
schizophrenia. Nat. Rev. Neurosci. 9, 437~452.
50) Morck, A., Hakk, H., Orn, U. and Klasson, W.E. (2003). Decabromodiphenyl ether in the rat:
absorption, distribution, metabolism, and excretion. Drug Metab. Dispos. 31, 900~907.
51) Morita, K., Sasaki, H., Fujimoto, K., Furuse, M. and Tsukita, S. (1999). Claudin-11/OSP-based
tight junctions of myelin sheaths in brain and Sertoli cells in testis. J. Cell Biol. 145, 579~588.
52) National Toxicology Program. (1986). NTP Toxicology and Carcinogenesis Studies of
Decabromodiphenyl Oxide (CAS No. 1163-19-5) In F344/N Rats and B6C3F1 Mice (Feed
Studies). Natl. Toxicol. Program Tech. Rep. Ser. 309, 1~242.
73
53) Norris, J.M., Kociba, R.J., Schwetz, B.A., Rose, J.Q., Humiston, C.G., Jewett, G.L., Gehring, P.J.
and Mailhes, J.B. (1975). Toxicology of octabromobiphenyl and decabromodiphenyl oxide.
Environ. Health Perspect. 11, 153~161.
54) Pekny, M., Wilhelmsson, U., Bogestål, Y.R. and Pekna, M. (2007). The role of astrocytes and
complement system in neural plasticity. Int. Rev. Neurobiol. 82, 95~111.
55) Pixley, S.K. and de, Vellis. J. (1984). Transition between immature radial glia and mature
astrocytes studied with a monoclonal antibody to vimentin. Brain Res. 317, 201~209.
56) Porterfield, S.P. and Hendrich, C.E. (1992). Tissue iodothyronine levels in fetuses of control and
hypothyroid rats at 13 and 16 days gestation. Endocrinology 131, 195~200.
57) Porterfield, S.P. (2000). Thyroidal dysfunction and environmental chemicals－Potential impact
on brain development. Environ. Health Perspect. 108, 433~438.
58) Rajasekharan, S., Baker, K.A., Horn, K.E., Jarjour, A.A., Antel, J.P. and Kennedy, T.E. (2009).
Netrin 1 and Dcc regulate oligodendrocyte process branching and membrane extension via Fyn
and RhoA. Development 136, 415~426.
59) Rice, D.C., Reeve, E.A., Herlihy, A., Zoeller, R.T., Thompson, W.D. and Markowski, V.P. (2007).
Developmental delays and locomotor activity in the C57BL6/J mouse following neonatal
exposure to the fully-brominated PBDE, decabromodiphenyl ether. Neurotoxicol. Teratol. 29,
511~520.
74
60) Rivas, M. and Naranjo, J.R. (2007). Thyroid hormones, learning and memory. Genes Brain
Behav. 6, 40~44.
61) Royland, J.E., Parker, J.S. and Gilbert, M.E. (2008). A genomic analysis of subclinical
hypothyroidism in hippocampus and neocortex of the developing rat brain. J. Neuroendocrinol.
20, 1319~1338.
62) Saegusa, Y., Fujimoto, H., Woo, G.H., Inoue, K., Takahashi, M., Mitsumori, K., Hirose, M.,
Nishikawa, A. and Shibutani, M. (2009). Developmental toxicity of brominated flame retardants,
tetrabromobisphenol A and 1,2,5,6,9,10-hexabromocyclododecane, in rat offspring after maternal
exposure from mid-gestation through lactation. Reprod. Toxicol. 28, 456~467.
63) Saegusa, Y., Woo, G.H., Fujimoto, H., Inoue, K., Takahashi, M., Hirose, M., Igarashi, K., Kanno,
J., Mitsumori, K., Nishikawa, A. and Shibutani, M. (2010). Gene expression profiling and cellular
distribution of molecules with altered expression in the hippocampal CA1 region after
developmental exposure to anti-thyroid agents in rats. J. Vet. Med. Sci. 72, 187~195.
64) Saegusa, Y., Fujimoto, H., Woo, G.H., Ohishi, T., Wang, L., Mitsumori, K., Nishikawa, A. and
Shibutani, M. (2012). Transient aberration of neuronal development in the hippocampal dentate
gyrus after developmental exposure to brominated flame retardants in rats. Arch. Toxicol. 86,
1431~1442.
65) Sariola, H. and Saarma, M. (2003). Novel functions and signalling pathways for GDNF. J. Cell
75
Sci. 116, 3855~3862.
66) Schoonover, C.M., Seibel, M.M., Jolson, D.M., Stack, M.J., Rahman, R.J., Jones, S.A., Mariash,
C.N. and Anderson, G.W. (2004). Thyroid hormone regulates oligodendrocyte accumulation in
developing rat brain white matter tracts. Endocrinology 145, 5013~5020.
67) Serafini, T., Colamarino, S.A., Leonardo, E.D., Wang, H., Beddington, R., Skarnes, W.C. and
Tessier-Lavigne, M. (1996). Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the
developing vertebrate nervous system. Cell 87, 1001~1014.
68) Sharlin, D.S., Bansal, R. and Zoeller, R.T. (2006). Polychlorinated biphenyls exert selective
effects on cellular composition of white matter in a manner inconsistent with thyroid hormone
insufficiency. Endocrinology 147, 846~858.
69) Shibutani, M., Uneyama, C., Miyazaki, K., Toyoda, K. and Hirose, M. (2000). Methacarn
fixation: a novel tool for analysis of gene expressions in paraffin-embedded tissue specimens.
Lab. Invest. 80, 199~208.
70) Shibutani, M., Lee, K.Y., Igarashi, K., Woo, G.H., Inoue, K., Nishimura, T. and Hirose, M. (2007).
Hypothalamus region-specific global gene expression profiling in early stages of central
endocrine disruption in rat neonates injected with estradiol benzoate or flutamide. Dev.
Neurobiol. 67, 253~269.
71) Shibutani, M., Woo, G.H., Fujimoto, H., Saegusa, Y., Takahashi, M., Inoue, K., Hirose, M. and
76
Nishikawa, A. (2009). Assessment of developmental effects of hypothyroidism in rats from in
utero and lactation exposure to anti-thyroid agents. Reprod. Toxicol. 28, 297~307.
72) Siddiqi, M.A., Laessig, R.H. and Reed, K.D. (2003). Polybrominated Diphenyl Ethers (PBDEs):
New Pollutants-Old Diseases. Clin. Med. Res. 1, 281~290.
73) Sjödin, A., Patterson, D.G.Jr. and Bergman, A. (2001). Brominated flame retardants in serum from
U.S. blood donors. Environ. Sci. Technol. 35, 3830~3833.
74) Spassky, N., de Castro, F., Le Bras, B., Heydon, K., Quéraud-LeSaux, F., Bloch-Gallego, E.,
Chédotal, A., Zalc, B. and Thomas, J.L. (2002). Directional guidance of oligodendroglial
migration by class 3 semaphorins and netrin-1. J. Neurosci. 22, 5992~6004.
75) Strelau, J. and Unsicker, K. (1999). GDNF family members and their receptors: expression and
functions in two oligodendroglial cell lines representing distinct stages of oligodendroglial
development. Glia 26, 291~301.
76) Takagi, H., Shibutani, M., Kato, N., Fujita, H., Lee, K.Y., Takigami, S., Mitsumori, K. and Hirose,
M. (2004). Microdissected region-specific gene expression analysis with methacarn-fixed,
paraffin-embedded tissues by real-time RT-PCR. J. Histochem. Cytochem. 52, 903~913.
77) Thuresson, K., Bergman, A. and Jakobsson, K. (2005). Occupational exposure to commercial
decabromodiphenyl ether in workers manufacturing or handling flame-retarded rubber. Environ.
Sci. Technol. 39, 1980~1986.
77
78) Tiwari-Woodruff, S.K., Buznikov, A.G., Vu, T.Q., Micevych, P.E., Chen, K., Kornblum, H.I. and
Bronstein, J.M. (2001). OSP/claudin-11 forms a complex with a novel member of the tetraspanin
super family and beta1 integrin and regulates proliferation and migration of oligodendrocytes. J.
Cell. Biol. 153, 295~305.
79) Tseng, L.H., Li, M.H., Tsai, S.S., Lee, C.W., Pan, M.H., Yao, W.J. and Hsu, P.C. (2008).
Developmental exposure to decabromodiphenyl ether (PBDE 209): effects on thyroid hormone
and hepatic enzyme activity in male mouse offspring. Chemosphere 70, 640~647.
80) Uneyama, C., Shibutani, M., Masutomi, N., Takagi, H. and Hirose, M. (2002). Methacarn fixation
for genomic DNA analysis in microdissected, paraffin-embedded tissue specimens. J. Histochem.
Cytochem. 50, 1237~1245.
81) Van der Ven, L.T., van de Kuil, T., Leonards, P.E., Slob, W., Cantón, R.F., Germer, S., Visser, T.J.,
Litens, S., Håkansson, H., Schrenk, D., van den Berg, M., Piersma, A.H., Vos, J.G. and
Opperhuizen, A. (2008). A 28-day oral dose toxicity study in Wistar rats enhanced to detect
endocrine effects of decabromodiphenyl ether (decaBDE). Toxicol. Lett. 179, 6–14.
82) Viberg, H., Fredriksson, A., Jakobsson, E., Orn, U. and Eriksson, P. (2003). Neurobehavioral
derangements in adult mice receiving decabromodiphenyl ether (PBDE 209) during a defined
period of neonatal brain development. Toxicol. Sci. 76, 112~120.
83) Viberg, H., Fredriksson, A. and Eriksson, P. (2007). Changes in spontaneous behaviour and
78
altered response to nicotine in the adult rat, after neonatal exposure to the brominated flame
retardant, decabromodiphenyl ether (PBDE 209). Neurotoxicology 28, 136~142.
84) Viberg, H. (2009). Neonatal ontogeny and neurotoxic effect of decabrominated diphenyl ether
(PBDE 209) on levels of synaptophysin and tau. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 423~429.
85) Woo, G.H., Takahashi, M., Inoue, K., Fujimoto, H., Igarashi, K., Kanno, J., Hirose, M.,
Nishikawa, A. and Shibutani, M. (2009). Cellular distributions of molecules with altered
expression specific to thyroid proliferative lesions developing in a rat thyroid carcinogenesis
model. Cancer Sci. 100, 617~625.
86) Xing, T., Chen, L., Tao, Y., Wang, M., Chen, J. and Ruan, D.Y. (2009). Effects of decabrominated
diphenyl ether (PBDE 209) exposure at different developmental periods on synaptic plasticity in
the dentate gyrus of adult rats in vivo. Toxicol. Sci. 110, 401~410.
87) Yamada-Okabe, T., Sakai, H., Kashima, Y. and Yamada-Okabe, H. (2005). Modulation at a
cellular level of the thyroid hormone receptor-mediated gene expression by
1,2,5,6,9,10-hexabromocyclododecane (HBCD), 4,4'-diiodobiphenyl (DIB), and nitrofen (NIP).
Toxicol. Lett. 155, 127~133.
88) Zhang, W., Cai, Y., Sheng, G., Chen, D. and Fu, J. (2011). Tissue distribution of decabrominated
diphenyl ether (BDE-209) and its metabolites in sucking rat pups after prenatal and/or postnatal
exposure. Toxicology 283, 49~54.
79
89) Zhou, T., Ross, D.G., DeVito, M.J. and Crofton, K.M. (2001). Effects of short-term in vivo
exposure to polybrominated diphenyl ethers on thyroid hormones and hepatic enzyme activities in
weanling rats. Toxicol. Sci. 61, 76~82.
80
要
旨
甲状腺ホルモンは, 胎児期や新生児期の正常な脳発達に不可欠であり, 妊娠初期の甲状腺
機能低下は胎児の脳発達に悪影響を与えることが知られている。近年, 環境中の難分解・高
蓄積性化学物質の母親に対する曝露により, 子供の脳発達障害を引き起こす可能性が指摘さ
れており, これらの化学物質による甲状腺ホルモンかく乱作用に関する懸念が増加している。
化学物質の発達神経毒性に関する評価については, 現在, 経済協力開発機構および米国環境
保護庁から試験ガイドラインが提示されているが, 高次試験であるため, 必要とされる動物
数, 検査項目および試験方法の複雑さから, 試験実施機関には多大な労力が要求されている。
また, 病理組織学的検索においては, 脳の組織構築の形態計測が主体であり, 発達神経毒性
の病理発生を基盤とした効果的な病理指標は定められていない。したがって, 細胞レベルの
機能異常を基盤とした, 小規模かつ短期間・高感度な発達神経毒性検出法の開発が望まれて
いる。そこで本研究では, 発達期甲状腺機能低下に関連する指標を用いて, 甲状腺ホルモンか
く乱化学物質がグリア細胞の発達に及ぼす影響について解析した。
第 1 章では, 環境影響およびヒトの健康への影響が懸念されている臭素化難燃剤の一つで
あるデカブロモジフェニルエーテル (DBDE) の母動物を介した発達期曝露によって子動物
に現れる発達神経影響を, 甲状腺機能低下に起因する神経発達障害指標を導入して検討した。
妊娠 SD ラットに妊娠 10 日目から離乳時 (生後 20 日) まで DBDE を 10, 100 および 1,000 ppm
の用量で混餌投与した｡その結果, 高用量で成熟後まで継続する軽度の甲状腺機能低下が生
81
じ, 中間用量以上の曝露群ではオリゴデンドロサイトを標的とした不可逆的な白質の低形成
を誘発した。高用量群におけるこの不可逆的な変化は, 発達期甲状腺機能低下に起因して生
じたと考えられた。
第 2 章では, 発達期甲状腺機能低下に起因する白質発達異常に関連する分子マーカーを見
出すために, 抗甲状腺剤であるプロピルチオウラシルおよびメチマゾールを発達期曝露した
生後 20 日の雄ラットの脳を用いて, マイクロアレイによる白質組織特異的な網羅的遺伝子発
現解析を行った。得られた発現変動プロファイルをもとに, claudin 11, deleted in colorectal
carcinoma, ret proto-oncogene (Ret) および vimentin について免疫組織学的解析を行ったところ,
白質におけるこれらの分子の陽性細胞数ないし染色強度の増加を認めた。帯状束に主に分布
する vimentin 陽性未成熟アストロサイトおよび Ret 陽性オリゴデンドロサイトは定量的に評
価可能であることから, vimentin および Ret は甲状腺ホルモンかく乱化学物質の発達期曝露に
反応するグリア細胞発達障害に関する有用なマーカーとなる可能性が示唆された。
第 3 章では,甲状腺かく乱化学物質の発達期曝露により白質発達に影響を及ぼす分子を明ら
かにするため, 第 1 章にて, 軽度の発達期甲状腺機能低下が認められた DBDE 発達期曝露ラッ
トを用いて, 白質組織特異的な網羅的遺伝子発現解析を行った。発現変動を示した分子のう
ち, 発達期甲状腺機能低下に関連する分子を抽出するため, 第 2 章にて検討した, 抗甲状腺剤
を用いた発達期甲状腺機能低下モデルのプロファイルとの比較を行ったところ, vimentin およ
び Ret の mRNA 発現が増加を示すことを見出した。これらの分子について, DBDE 発達期曝
82
露ラットおよび他の代表的な臭素化難燃剤であるテトラブロモビスフェノール A (TBBPA),
ヘキサブロモシクロドデカン (HBCD) を発達期曝露したラットを用いて免疫組織学的手法
による細胞局在の解析を行った。TBBPA および HBCD は, 各々100, 1,000 および 10,000 ppm
で発達期曝露し, HBCD 10,000 ppm 群では軽度の甲状腺機能低下およびオリゴデンドロサイ
ト密度の減少を示すが, TBBPA では顕著な変化を示さないことを確認している。その結果,
vimentin 陽性未成熟アストロサイトは 100 ppm 以上の DBDE 曝露および 1,000 ppm 以上の
HBCD 曝露で増加し, Ret 陽性オリゴデンドロサイトは 10 ppm 以上の DBDE 曝露および 1,000
ppm 以上の HBCD 曝露で増加した。DBDE および HBCD 曝露動物では, 軽度の甲状腺機能低
下が認められた用量よりも低い用量域から影響が認められたことから, DBDE および HBCD
はグリア細胞発達に関する直接作用を有することが示唆された。一方, TBBPA については,
vimentin 陽性細胞および Ret 陽性細胞のいずれについても影響を示さなかった。
以上の結果から, 離乳時における大脳白質の vimentin 陽性未成熟アストロサイトおよび Ret
陽性オリゴデンドロサイトの分布変化は, 成熟後に認められた不可逆的な白質低形成および
オリゴデンドロサイト密度の減少と同様の挙動を示すことを抗甲状腺剤および臭素化難燃剤
を発達期曝露した動物において確認できた。これらの分子は, 甲状腺ホルモンかく乱物質様
の発達期神経毒性を生じる化学物質の有用なスクリーニング系のマーカーとして期待される。
83
Abstract
Thyroid hormones (TH) are required for normal brain development during the fetal and
neonatal periods. Developmental hypothyroidism in early pregnancy causes adverse effects on fetal
brain development targeting both neuronal and glial populations. Recently, there has been increased
concern for TH-disrupting chemicals that have persistent characteristics and the highest potential for
bioaccumulation in the environment, because there is a possibility that maternal exposure to such
chemicals induce impaired brain development in children. Testing guidelines for developmental
neurotoxicity (DNT) study have been developed by OECD and U.S. EPA; however, because DNT
study is classified as a high-order testing among toxicity studies, these guidelines require large
numbers of animals, many parameters and complex procedures. Furthermore, these testing guidelines
include morphometric analysis on the brain tissues as well as conventional neuropathological analysis;
however, any efficient histopathological parameters based on the mechanism of DNT have remained
optional. Thus, it is now necessary to establish a rapid and sensitive screening system of DNT based
on the detection of functional abnormalities of the brain cellular components in a small-scale animal
study. Therefore, in the present study, I focused on glial development as a target of TH-disrupting
chemicals through analysis in hypothyroidism-related parameters.
In Chapter 1, to assess the effects of developmental neurotoxicity of decabromodiphenyl ether
84
(DBDE), one of the major classes of brominated flame retardants (BFRs) that have evoked concern for
both environmental and human health, I applied brain development parameters that are affected by
hypothyroidism. Pregnant Sprague-Dawley rats were given diet containing DBDE either at 0, 10, 100,
or 1,000 ppm from gestation day 10 until day 20 after delivery (PND 20). As a result, developmental
exposure of DBDE at high dose caused mild hypothyroidism, which lasts into adulthood. Furthermore,
I found irreversible white matter hypoplasia targeting oligodendrocytes at the middle dose and higher,
which is likely to be related to developmental hypothyroidism at high dose.
In Chapter 2, to elucidate target molecules for white matter hypoplasia responding to
hypothyroidism, I applied a global gene expression profiling of the cerebral white matter in male rat
offspring after maternal exposure to anti-thyroid agent, 6-propyl-2-thiouracil or methimazole, on PND
20. According to the gene expression profile obtained, immunohistochemical distributions of
Claudin11, deleted in colorectal cancer protein, ret proto-oncogene (Ret), and vimentin were examined.
As a result, immunoreactive cells or immunoreactive intensity of these molecules were increased in
white matter by treatment with anti-thyroid agents. Immunoreactive cells for vimentin and Ret were
immature astrocytes and oligodendrocytes, respectively. These immunoreactive cell populations were
mainly distributed in the cingulum. Because vimentin- and Ret-positive cells can be quantitatively
evaluated, these cellular populations may be useful markers of the glial cells responding to
developmental exposure to TH-disrupting chemicals.
85
In Chapter 3, to elucidate the target molecules in the white matter of developmental exposure to
TH-disrupting chemicals, I performed cerebral white matter-specific global gene expression analysis
in developmentally DBDE-exposed rat offspring, which showed a mild hypothyroidism as revealed in
Chapter 1. Next, I extracted the common gene expression profile between the DBDE-exposed rat
offspring and anti-thyroid agent-exposed ones as shown in Chapter 2 and found that both vimentin and
Ret were commonly increased in the transcript levels between the both cases. These molecules were
then immunohistochemically analyzed in the cerebral white matter in rat offspring developmentally
exposed to representative BFRs, i.e., DBDE, tetrabromobisphenol A (TBBPA; 100, 1,000 or 10,000
ppm) and 1,2,5,6,9,10-hexabromocyclododecane (HBCD; 100, 1,000 or 10,000 ppm). HBCD-exposed
rat offspring showed mild hypothyroidism and decrease of ologodendrocyte density at the highest dose,
while TBBPA-exposed rat offspring did not show any effect on TH homeostasis.
Immunohistochemical analysis revealed that vimentin-positive immature astrocytes increased at ≥ 100
ppm for DBDE and ≥ 1,000 ppm for HBCD. Also, the Ret-positive oligodendrocytes increased at ≥ 10
ppm for DBDE and ≥ 1,000 ppm for HBCD. Considering the magnitude of the TH responses, a direct
effect of DBDE and HBCD on glial cell development may be considered under the present
experimental conditions. At the highest dose of DBDE as well as that of HBCD, hypothyroidism may
additionally be the inducing mechanism, while its contribution was rather minor. On the other hand,
TBBPA did not show the effect on both vimentin-positive and Ret-positive cells.
86
Based on the results obtained in these studies, vimentin-positive immature astrocytes and
Ret-positive oligodendrocytes in the cerebral white matter of rat offspring at the end of developmental
exposure to anti-thyroid agents or BFRs on weaning correlated with irreversible white matter
hypoplasia or decrease of ologodendrocyte density at the adulthood. These molecules can be used as
markers for screening of the effects of developmental neurotoxicants mimicking TH disrupting
chemicals.
87
Table 1-1. Effects on dams and offspring until prepubertal necropsy by exposure to DBDE from
mid-gestation to the end of lactation
No. of dams examined
Maternal parameter
Body weight gain (g/day)
GD 10-GD 20
Day 1–Day 9 after delivery
Day 9–Day 20 after delivery
Food consumption (g/day)
GD 10-GD 20
Day 1–Day 9 after delivery
Day 9–Day 20 after delivery
DBDE intake (mg/kg BW/day)
GD 10-GD 20
Day 1–Day 9 after delivery
Day 9–Day 20 after delivery
Duration of pregnancy (days)
Necropsy at weaning (Day 20 after delivery)
BW (g)
Thyroid
Absolute weight (mg)
Relative weight (mg/100g BW)
Histopathology: diffuse follicular cell
hypertrophy (±/+) a
Offspring parameter
No. of implantation sites
No. of live offspring
Male ratio (%)
BW, PND 1 (g)
Males
Females
AGD, PND 1 (mm)
Males
Females
Prepubertal necropsy on PND 20
Males
No. of animals examined
BW (g)
Liver (g)
Liver (g/100g BW)
Females
No. of animals examined
BW (g)
Liver (g)
Liver (g/100g BW)
0
8
DBDE in diet (ppm)
10
100
8
8
1000
8
10.4 ± 1.6
4.7 ± 1.2
-0.2 ± 0.9
10.5 ± 1.5
5.6 ± 1.9
-0.4 ± 1.4
11.1 ± 1.7
5.1 ± 1.5
-0.7 ± 1.7
11.0 ± 1.1
5.5 ± 2.2
0.2 ± 1.5
27.8 ± 3.6
46.5 ± 6.0
75.6 ± 17.3
26.2 ± 3.1
46.6 ± 4.8
76.1 ± 12.3
26.8 ± 3.4
46.1 ± 6.3
74.0 ± 16.3
25.3 ± 2.7
44.6 ± 3.2
71.4 ± 6.3
0
0
0
21.6 ± 0.5
0.7
1.5
2.4
21.8
7.0
13.9
22.8
21.5
±
±
±
±
0.1
0.2
0.4
0.5
±
±
±
±
0.4
1.0
4.2
0.5
66.3 ± 4.8
140.4 ± 5.7
224.3 ± 20.1
21.6 ± 0.5
302.0 ± 25.3
302.3 ± 21.8
311.4 ± 24.0
302.2 ± 23.5
17.9 ± 1.8
21.8 ± 3.1*
20.1 ± 2.5
21.6 ± 3.2*
5.95 ± 0.56
2 b (2/0) c
7.20 ± 0.93*
4 (3/1)
6.48 ± 0.93
6 (5/1)
7.17 ± 1.08*
5 (3/2)
13.0 ± 2.4
12.4 ± 2.6
47.5 ± 16.2
13.1 ± 1.5
12.1 ± 1.7
53.7 ± 14.6
12.4 ± 1.9
11.5 ± 2.4
46.7 ± 17.3
13.4 ± 1.3
12.5 ± 2.0
38.5 ± 7.0
7.46 ± 0.58
7.05 ± 0.58
7.16 ± 1.00
6.99 ± 0.87
7.50 ± 1.06
6.92 ± 1.10
7.08 ± 0.73
6.69 ± 0.82
3.93 ± 0.15
1.70 ± 0.57
3.90 ± 0.23
1.89 ± 0.08
3.98 ± 0.31
1.88 ± 0.07
3.93 ± 0.17
1.86 ± 0.07
10
51.6 ± 6.2
1.88 ± 0.34
3.62 ± 0.26
10
55.8 ± 4.0
2.22 ± 0.24*
3.98 ± 0.20*
10
52.7 ± 6.0
2.07 ± 0.35
3.90 ± 0.29*
10
54.0 ± 3.0
2.37 ± 0.24**
4.39 ± 0.27**
10
10
10
10
49.8 ± 4.2
48.4 ± 7.3
48.0 ± 4.5
51.3 ± 2.7
1.85 ± 0.25
1.84 ± 0.36
1.83 ± 0.27
2.21 ± 0.20*
3.71 ± 0.23
3.77 ± 0.26
3.80 ± 0.26
4.31 ± 0.20**
a
Grade of change: (±), minimal; (+), slight, b Total number of animals with each finding, c No. of animals with each grade.
Abbreviations: AGD, anogenital distance; BW, body weight; DBDE, decabromodiphenyl ether; GD, gestational day; PND,
postnatal day.
*, ** P < 0.05, 0.01 vs. 0 ppm group (Dunnett’s test or Dunnett-type rank-sum test).
88
Table 1-2. Onset of puberty and estrous cycles in the offspring exposed to DBDE from
mid-gestation to the end of lactation
DBDE in diet (ppm)
10
100
0
1000
Onset of puberty
Preputial separation in males
No. of animals examined
11
Age by day
41.1 ± 1.5
BW (g)
189.6 ± 14.4
Vaginal separation in females
No. of animals examined
Age by day
11
41.5 ± 1.6
208.8 ± 28.6
12
41.3 ± 2.1
193.2 ± 19.2
11
34.4 ± 2.0
12
34.7 ± 2.4
10
34.8 ± 2.4
126.0 ± 19.8
126.6 ± 15.2
121.9 ± 11.8
10
10
10
1
2
1
11
35.1 ± 2.4
BW (g)
121.5 ± 9.0
Estrous cycles during PNW 8–11
No. of animals examined
10
Irregularity (Extended diestrus)
12
40.1 ± 1.5
192.1 ± 18.8
1
Abbreviations: DBDE, decabromodiphenyl ether; BW, body weight; PNW, postnatal week.
89
Table 1-3. Body and organ weights of the offspring exposed to DBDE from mid-gestation to the
end of lactation and examined at PNW 11
DBDE in diet (ppm)
10
100
0
1000
Males
BW
Brain
Liver
Kidneys
Thyroid
No. of animals examined
10
(g)
414.4 ± 22.3
(g)
2.08 ± 0.07
(g/100g BW)
0.50 ± 0.02
(g)
15.2 ± 1.0
(g/100g BW)
3.66 ± 0.18
(g)
2.87 ± 0.23
(g/100g BW)
0.69 ± 0.03
(mg)
22.3 ± 2.3
(mg/100g BW)
5.40 ± 0.63
10
447.8 ± 24.1*
2.10 ± 0.12
0.47 ± 0.02*
16.3 ± 1.4
3.65 ± 0.20
2.99 ± 0.27
0.67 ± 0.05
23.8 ± 3.9
5.32 ± 0.87
10
455.1 ± 22.9**
2.11 ± 0.09
0.46 ± 0.02*
16.5 ± 1.0
3.62 ± 0.10
3.17 ± 0.19*
0.70 ± 0.03
26.5 ± 3.9*
5.84 ± 0.90
10
423.2 ± 34.5
2.11 ± 0.04
0.50 ± 0.04
14.5 ± 1.7
3.42 ± 0.29
2.80 ± 0.22
0.66 ± 0.06
22.3 ± 3.5
5.32 ± 1.13
Females
No. of animals examined
10
11
10
(g)
254.0 ± 20.8 a
262.3 ± 18.1
278.2 ± 26.7
(g)
1.96 ± 0.07
1.95 ± 0.08
1.92 ± 0.09
(g/100g BW)
0.78 ± 0.07
0.75 ± 0.06
0.70 ± 0.05*
Liver
(g)
8.50 ± 0.98
8.79 ± 0.98
9.60 ± 1.32
(g/100g BW)
3.34 ± 0.24
3.35 ± 0.27
3.44 ± 0.22
Kidneys
(g)
1.72 ± 0.14
1.71 ± 0.14
1.86 ± 0.15
(g/100g BW)
0.68 ± 0.04
0.65 ± 0.04
0.67 ± 0.04
Thyroid
(mg)
17.5 ± 2.3
18.9 ± 3.5
19.1 ± 2.5
(mg/100g BW)
6.88 ± 0.78
7.21 ± 1.14
6.88 ± 0.76
Abbreviations: BW, body weight; DBDE, decabromodiphenyl ether, PNW, postnatal week.
*, ** P < 0.05, 0.01 vs. 0 ppm group (Dunnett’s test or Dunnett-type rank-sum test).
BW
Brain
90
11
266.0 ± 29.3
1.94 ± 0.08
0.74 ± 0.06
9.09 ± 1.41
3.42 ± 0.36
1.68 ± 0.20
0.63 ± 0.06
19.4 ± 2.9
7.42 ± 1.41
Table 1-4. Serum levels of thyroid-related hormones of the male offspring exposed to DBDE
from mid-gestation to the end of lactation
0
PND 20
No. of animals examined
T3
(ng/ml)
T4
(µg/dl)
TSH (ng/ml)
PNW 11
No. of animals examined
DBDE in diet (ppm)
10
100
1000
10
1.39 ± 0.11
5.19 ± 0.74
10
1.35 ± 0.15
4.89 ± 0.84
10
1.33 ± 0.18
5.66 ± 0.71
10
1.17 ± 0.10**
4.89 ± 0.54
5.38 ± 0.89
5.12 ± 0.71
5.85 ± 1.22
4.74 ± 0.69
10
10
10
10
T3
(ng/ml)
0.99 ± 0.09
1.01 ± 0.08
1.01 ± 0.11
1.02 ± 0.11
T4
(µg/dl)
6.02 ± 0.70
6.00 ± 0.66
5.98 ± 0.94
5.17 ± 0.57*
TSH (ng/ml)
8.30 ± 3.40
8.81 ± 1.63
9.71 ± 3.45
10.47 ± 2.35
Abbreviations: DBDE, decabromodiphenyl ether; PND, postnatal day; PNW, postnatal week; T3, triiodothyronine; T4,
thyroxine; TSH, thyroid-stimulating hormone.
*, ** P < 0.05, 0.01 vs. 0 ppm group (Dunnett’s test or Dunnett-type rank-sum test).
91
Table 1-5. Histopathological changes for male and female offspring exposed to DBDE from
mid-gestation to the end of lactation
DBDE in diet (ppm)
100
0
10
1000
10
10
10
10
0
1 (1/0)
3 (2/1)
9 (3/6)**, ##
PND 20
Males
No. of animals examined
Thyroid
Diffuse follicular cell hypertrophy (±/+)
Liver
Diffuse liver cell hypertrophy with increased
cytoplasmic eosinophilia (±/+/++) a
0
Kidney
Increased cytoplasmic eosinophilia, cortical
proximal tubules (±/+)
1 (1/0)
4 (4/0)
7 (5/2)**, #
10 (1/9)**, ##
10
10
10
10
0
2 (2/0)
0
3 (3/0)
0
0
3 (2/1)
7 (1/6)**, ##
0
7 (5/2)**, ##
6 (5/1)*, #
7 (4/3)**, ##
0
0
0
2
10
10
10
10
0
3 (1/2/0)
2 (2/0/0)
4 (2/1/1)
2 (0/1/1)
3 (1/2/0)
6 (2/2/2)
3 (2/0/1)
10
11
10
11
0
0
1 (1/0)
1 (0/1)
1
0
3
10 b (8/2/0) c, **, ## 10 (4/6/0)**, ##
10 (0/2/8)**, ##
Females
No. of animals examined
Thyroid
Diffuse follicular cell hypertrophy (±/+)
Liver
Diffuse liver cell hypertrophy with increased
cytoplasmic eosinophilia (±/+)
Kidney
Increased cytoplasmic eosinophilia, cortical
proximal tubules (±/+)
Ovary
Increase of interstitial glands (+)
PNW 11
Males
No. of animals examined
Thyroid
Diffuse follicular cell hypertrophy (±/+/++)
Mammary gland
Diffuse lobular atrophy (±/+/++)
Females
No. of animals examined
Thyroid
Diffuse follicular cell hypertrophy (±/+)
Uterus
Hydrometra (+)
0
a
Grade of change: (±), minimal; (+), slight; (++), moderate.
b
Total no. of animals with each finding.
c
No. of animals with each grade.
*, ** P < 0.05, 0.01 vs. 0 ppm group (Fisher’s exact probability test).
# ##
, P < 0.05, 0.01 vs. 0 ppm group (Mann-Whitney’s U-test).
92
Table 1-6. Brain morphometry of the male offspring exposed to DBDE from mid-gestation to the
end of lactation and examined at PNW 11
DBDE in diet (ppm)
No. of offspring examined
Hippocampal CA1 neurons
0
10
100
1000
10
10
10
10
a
Mean distance of the location of neurons from the
innermost margin of the pyramidal cell layer (µm)
No. of neurons located lateral to the pyramidal cell
layer (/mm)
Ratio of abnormally distributed neurons/ CA1
neurons (%)
33.8 ± 4.4
32.5 ± 3.4
32.3 ± 3.5
32.2 ± 5.3
59.5 ± 26.9
80.8 ± 35.9
65.1 ± 29.2
58.4 ± 27.0
2.7 ± 0.9
3.2 ± 1.3
2.9 ± 1.1
2.6 ± 1.0
0.18 ± 0.03
0.15 ± 0.02
0.12 ± 0.02**
0.13 ± 0.03**
150.9 ± 23.0
137.7 ± 10.8
122.4 ± 13.9**
124.9 ± 13.0**
CC
Area of CC (mm2)
Cingulate deep cortex
CNPase (+) cell count (count/mm2)
a
NeuN (+) neurons were subjected to analysis.
Abbreviations: CC, corpus callosum; CNPase, 2’,3’-cyclic nucleotide 3’-phosphodiesterase; DBDE,
decabromodiphenyl ether; PNW, postnatal week.
** P < 0.01 vs. 0 ppm group (Dunnett’s test or Dunnett-type rank-sum test).
93
Fig. 1-1
Quantitative measurement of the variability in the distribution of neurons located within and lateral to
the pyramidal cell layer of the hippocampal CA1 region at PNW 11. (A) Hippocampal CA1 region
stained with NeuN-immunohistochemistry at 0.9 mm lateral to the boundary with the subiculum. 40x
magnification. (B) Measurement of the distance of the location of neurons positive for NeuN from the
innermost margin of the pyramidal cell layer adjacent to the lucid layer. 200x magnification. (C)
Number of NeuN-positive nuclei within the pyramidal cell layer and outside of this layer
(polymorphic layer: arrowheads) in the same view area. 200x magnification.
94
Fig. 1-2
Quantitative measurement of the effect on the oligodendroglial development at PNW 11. (A) Size
measurement of the white matter area immunoreactive for CNPase. The area of the corpus callosum
medial to the cerebral white matter at the uppermost position of the cingulum was measured. 40x
magnification. (B) Number of CNPase-positive oligodendrocytes surrounding myelinated axons
distributed at the layer V of the parietal isocortex dorsolateral to the cingulum under 200x
magnification. At first, the lower and innermost ends of the view area with a 10x objective lens were
fixed at the uppermost position of the cingulum, then magnification of the view area was increased for
cellular counting by changing the lens to 20x. 40x magnification.
95
(A) Male
500
#
#
#
Body weight (g)
400
##
**
**
**
**
**
300
#
**
200
100
**
*
Control
10ppm DBDE
100ppm DBDE
1000ppm DBDE
0
Week Week Week Week Week Week Week Week
4
5
6
7
8
9
10
11
Age (week)
(B) Female
300
250
Body weight (g)
200
150
100
50
Control
10ppm DBDE
100ppm DBDE
1000ppm DBDE
0
Week Week Week Week Week Week Week Week
4
5
6
7
8
9
10
11
Age (week)
Fig. 1-3
Body weight curves of offspring exposed to DBDE from mid-gestation to the end of lactation.
Circle dots represent the control group, square dots represent 10 ppm DBDE group, triangular dots
represent 100 ppm DBDE group, and diamond-shaped dots represent 1,000 ppm DBDE group in both
male and female offspring. # and ## P < 0.05, 0.01 vs. control group at 10 ppm DBDE group, * and **
P < 0.05, 0.01 vs. control group at 100 ppm DBDE group (Dunnett’s test or Dunnett-type rank-sum
test).
96
97
Fig. 1-4
Histopathological changes observed in offspring exposed to DBDE from mid-gestation to the end of
lactation. (A, B) Thyroid gland of a male offspring on PND 20 given DBDE at 0 (control) (A) or 1,000
ppm (B). Compared with the control, diffuse follicular cell hypertrophy (slight degree) is evident with
1,000 ppm DBDE. Hematoxylin and eosin. 400x magnification. (C, D) Thyroid gland of a male
offspring on PNW 11 after developmental exposure to DBDE at 0 (control) (C) or 1,000 ppm (D).
Compared with the control, diffuse follicular cell hypertrophy (moderate degree) is evident with 1,000
ppm DBDE. Hematoxylin and eosin. 200x magnification. (E, F) Liver of a male offspring on PND 20
given DBDE at 0 (control) (E) or 1,000 ppm (F). Note that liver cells show diffuse hypertrophy
associated with increase of cytoplasmic eosinophilia in the 1,000 ppm DBDE-exposed rat.
Hematoxylin and eosin. 200x magnification. (G, H) Kidney of a female offspring on PND 20 given
DBDE at 0 (control) (G) or 1,000 ppm (H). Note increased eosinophilia in the cytoplasm of cortical
proximal tubules in the 1,000 ppm DBDE-exposed case. Hematoxylin and eosin. 400x magnification.
98
Fig. 1-5
Distribution of CNPase-positive oligodendrocytes in the cingulate deep cortex of the cerebrum in
offspring exposed to DBDE from mid-gestation to the end of lactation. (A, B) A male offspring on
PNW 11 given DBDE at 0 (control) (A) or 1,000 ppm (B). Compared with the control, decrease of
CNPase-positive oligodendrocytes is evident with 1,000 ppm DBDE. CNPase-immunohistochemistry.
200x magnification.
99
Table 2-1. List of genes commonly up-regulated in the microdissected cerebral white matter
region after treatment with anti-thyroid agents (≥ 2-fold)
Accession number
Up-regulated (428 genes)
NM_031502
AW918413
BF545930
NM_001013965
BF548234
NM_001106848
NM_001010970
XM_001060951
NM_001106595
NM_144750
AW529115
BE095613
NM_001107747
NM_001107049
NM_001039035
BE107816
BF542399
NM_031664
AW251647
BF398031
BE113460
NM_001015032
XM_213312
AA893195
BF399373
BF400248
NM_033021
BF405546
BM385105
AI407705
NM_052803
NM_001015027
NM_001108564
NM_012929
NM_001024345
AI175691
BF406167
BF523837
BE120246
NM_001107067
XM_001063498
NM_001031647
NM_001107702
Gene title
Symbol
amylase 2, pancreatic
Amy2
EST
EST
tektin 4
Tekt4
EST
Ring finger protein 7
Rnf7
amylase 1, salivary
Amy1
coiled-coil domain containing 113
Ccdc113
SET and MYND domain containing 1
Smyd1
lysophospholipase
LOC246266
EST
EST
Rho GTPase activating protein 1
Arhgap1
tetratricopeptide repeat domain 25
Ttc25
Splicing factor, arginine/serine-rich 7
Sfrs7
EST
EST
solute carrier family 28 (sodium-coupled
Slc28a2
nucleoside transporter), member 2
EST
EST
EST
UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polyp
Galnt3
eptide N-acetylgalactosaminyltransferase 3
family with sequence similarity 183,
Fam183b
member B
EST
EST
EST
SEC31 homolog A
Sec31a
EST
EST
EST
ATPase, Cu++ transporting, alpha
Atp7a
polypeptide
cAMP responsive element binding
Crebl2
protein-like 2
amylo-1,6-glucosidase,
Agl
4-alpha-glucanotransferase
collagen, type II, alpha 1
Col2a1
tropomyosin 2
Tpm2
EST
EST
EST
EST
rhomboid 5 homolog 2
Rhbdf2
hypothetical protein LOC682874
LOC682874
dynein, axonemal, light intermediate
Dnali1
polypeptide 1
Fc receptor-like S, scavenger receptor
Fcrls
100
MMI PTU, 3 ppm PTU, 12 ppm
46.70
14.19
13.86
12.56
8.82
8.50
8.37
8.32
8.21
7.67
7.60
6.95
6.28
6.27
6.22
6.10
5.65
64.86
26.48
21.20
40.08
14.30
8.17
11.41
20.95
9.71
6.39
17.74
8.56
3.98
15.96
5.86
7.71
5.50
102.80
8.57
30.60
30.84
19.40
4.59
17.62
18.68
13.66
14.72
16.75
14.54
9.55
18.34
6.11
7.62
9.98
5.49
12.30
14.35
5.47
5.44
5.42
10.34
3.97
3.48
10.54
6.55
9.31
5.35
3.62
4.74
5.34
10.84
11.19
5.33
5.29
5.15
5.09
5.09
5.07
5.05
22.57
3.54
6.50
7.55
7.05
5.20
7.26
13.10
4.57
7.96
8.53
7.92
8.42
10.77
5.02
11.39
11.09
5.02
10.61
11.53
5.01
2.69
4.57
4.90
4.74
4.73
4.69
4.64
4.62
4.57
4.47
7.40
7.20
2.30
4.51
10.89
5.85
4.48
10.75
7.29
9.42
4.23
7.33
7.44
3.70
7.59
11.26
4.46
7.82
8.09
4.44
12.50
10.53
BI300548
NM_012849
NM_031686
XM_001080773
NM_001134555
XR_007575
AW527250
NM_001108322
BF413171
AI178343
BE113293
AI169061
BF410720
NM_001044289
XM_001060527
BF402613
NM_001034950
NM_053293
BF286450
NM_001106620
XM_001074223
NM_001134933
XM_001055507
NM_001014008
NM_173094
NM_001002813
XM_001064742
BI296694
AI407549
NM_001108463
AA955889
NM_012715
BE108778
NM_001109024
BF386266
NM_138842
NM_198746
AI412344
XM_001063079
NM_080768
BI291326
NM_001106934
NM_001024902
NM_031550
BF418099
NM_022303
AFFX-r2-Bs-dap-3
NM_145674
AI137437
EST
gastrin
Gast
sodium channel, voltage-gated, type VII,
Scn7a
alpha
Similar to hypothetical protein BC018697 RGD1565197
complement component 1, r subcomponent C1r
similar to hypothetical protein FLJ23074
RGD1566400
EST
T-box 1
Tbx1
EST
EST
EST
EST
EST
similar to Protein EAN57
LOC686841
laminin, alpha 5
Lama5
EST
urinary protein 3
Rup3
glutathione S-transferase theta 1
Gstt1
EST
leprecan-like 2
Leprel2
Similar to PR domain containing 11
LOC690358
cysteine-rich intestinal protein
Crip
similar to shippo 1
RGD1564322
asporin
Aspn
3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A
Hmgcs2
synthase 2
cathepsin Q-like 2
Ctsql2
hypothetical LOC289530
RGD1310384
EST
EST
radial spokehead-like 2
Rshl2
EST
adrenomedullin
Adm
EST
DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C,
Dnajc30
member 30
EST
surfactant associated protein B
Sftpb
killer cell lectin-like receptor, subfamily A,
Klra5
member 5
EST
similar to Na+ dependent glucose
RGD1561777
transporter 1
tachykinin receptor 2
Tacr2
EST
premature ovarian failure 1B
Pof1b
leucine rich repeat containing 56
Lrrc56
cyclin-dependent kinase inhibitor 2A
Cdkn2a
EST
caspase recruitment domain family, member
Card9
9
EST
Glycoprotein, alpha-galactosyltransferase 1 Ggta1
EST
-
101
4.43
4.40
4.82
5.81
3.91
4.33
4.31
42.69
17.08
4.30
4.24
4.23
4.22
4.20
4.18
4.18
4.17
4.16
4.15
4.13
4.11
4.10
4.10
4.06
4.05
4.03
3.99
3.91
3.91
3.89
3.39
4.26
18.89
15.80
4.34
4.09
7.35
2.93
4.20
3.56
4.36
11.57
3.96
4.21
5.33
10.88
3.00
2.27
10.16
8.63
8.18
5.24
8.08
10.14
12.38
2.31
5.38
7.44
6.19
5.78
6.17
5.09
9.35
5.59
4.27
6.31
7.27
7.70
6.74
8.74
7.91
5.50
3.88
11.91
9.03
3.87
3.86
3.85
3.82
3.81
3.79
3.79
3.75
4.09
3.10
3.20
5.95
5.27
3.03
4.10
6.34
5.11
2.81
5.92
7.98
6.01
4.05
4.17
5.68
3.74
5.49
6.54
3.72
3.70
6.39
2.54
6.90
4.14
3.67
2.02
10.11
3.64
12.53
8.89
3.63
5.73
5.83
3.60
3.59
3.59
3.59
3.59
3.59
2.91
12.88
4.43
6.92
2.70
5.41
7.34
8.26
3.21
6.30
3.37
6.52
3.58
3.50
2.29
3.57
3.56
3.55
6.45
5.21
10.29
3.42
5.70
6.23
NM_001007009
NM_012588
BE112417
NM_001014087
NM_080893
NM_001109074
AI103063
NM_001114330
NM_019292
AW531659
NM_022614
XM_001057060
AA858815
NM_001013178
BI280974
NM_001024750
BM383972
XM_001059059
NM_053332
AI058852
NM_001011947
AA859828
XM_001080515
XM_001076288
BG381643
AI639305
BG373926
XM_001073195
NM_001033655
NM_001107559
BE120224
BE121176
NM_001100658
NM_031235
BF396578
NM_001008724
NM_023091
NM_031826
AW532932
BE106592
NM_001109289
BF412370
AI237240
XM_001056519
AI013206
NM_001012176
AI764498
NM_012620
BI281668
NM_001107692
XM_001058594
similar to hypothetical protein
MGC94915
insulin-like growth factor binding protein 3 Igfbp3
EST
coiled-coil domain containing 67
Ccdc67
phosphodiesterase 11A
Pde11a
similar to novel protein
RGD1565283
EST
glutamate receptor, metabotropic 1
Grm1
carbonic anhydrase 3
Car3
EST
inhibin beta C
Inhbc
ADP-ribosylation factor-like 4C
Arl4c
EST
mediator complex subunit 20
Med20
EST
polymerase (DNA-directed), delta 3,
Pold3
accessory subunit
EST
stromal antigen 2
Stag2
cubilin
Cubn
EST
retinoic acid induced 14
Rai14
EST
atonal homolog 7
Atoh7
coiled-coil domain containing 37
Ccdc37
EST
EST
EST
hypothetical protein LOC686269
LOC686269
dynein, axonemal, heavy chain 1
Dnahc1
G protein-coupled receptor 123
Gpr123
EST
EST
heat shock protein 9
Hspa9
Par-3 (partitioning defective 3) homolog
Pard3
EST
fibrinogen, alpha polypeptide
Fga
gamma-aminobutyric acid (GABA-A)
Gabre
receptor, subunit epsilon
fibrillin 2
Fbn2
EST
EST
similar to RIKEN cDNA 1700012B09
RGD1561795
EST
EST
similar to talin 2
RGD1565416
EST
radial spoke head 1 homolog
Rsph1
EST
serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade
Serpine1
E, member 1
EST
ephrin A4
Efna4
similar to Prefoldin subunit 3 (Von
LOC681825
Hippel-Lindau-binding protein 1)
102
3.54
3.51
3.51
3.50
3.49
3.48
3.48
3.45
3.44
3.44
3.43
3.41
3.40
3.39
3.38
10.75
9.64
2.43
15.54
3.54
9.39
2.33
2.92
3.26
5.64
3.23
4.04
2.39
2.23
7.54
9.08
6.52
6.88
8.25
3.60
7.58
6.09
5.89
6.28
3.51
6.29
5.05
3.21
3.47
9.33
3.38
6.83
5.50
3.37
3.37
3.34
3.31
3.30
3.29
3.29
3.27
3.27
3.26
3.26
3.25
3.25
3.23
3.23
3.23
3.22
3.22
3.22
3.20
3.78
5.37
5.73
3.27
2.34
4.81
3.90
5.68
3.59
5.09
5.79
5.00
5.73
10.38
5.16
2.09
2.88
5.43
4.08
3.47
5.44
5.09
6.36
3.42
3.44
5.24
6.01
6.89
4.60
4.73
5.83
5.71
5.99
8.61
2.99
5.16
2.60
3.11
6.05
4.14
3.20
3.91
7.46
3.20
3.19
3.17
3.16
3.16
3.15
3.15
3.14
3.14
3.14
7.58
7.89
5.00
4.22
3.99
3.50
4.24
4.09
8.37
4.82
6.46
6.81
5.16
7.64
3.46
3.18
3.11
5.20
6.89
5.83
3.13
2.11
7.58
3.13
3.13
10.36
5.07
7.38
6.72
3.13
6.28
8.25
AI412578
BF406860
NM_001108559
NM_001108585
AA997980
XM_001061499
NM_031115
AI176102
AW252092
NM_012760
NM_053762
NM_001002805
BF419834
BF399526
BF388150
BF412962
NM_001107680
NM_001114330
NM_001108037
NM_019328
NM_031502
AI144863
NM_001105991
BE119364
NM_001106976
XM_001077978
NM_001108238
AA997660
NM_001106335
NM_001108074
BF398637
AI602005
NM_001110099
XR_008690
BM386570
XR_005460
NM_001108055
NM_030848
NM_001106511
NM_001109613
BM385125
NM_013112
AA923898
XM_001056805
NM_013059
AI171550
(VHL-binding protein 1) (VBP-1)
EST
EST
PRP3 pre-mRNA processing factor 3
homolog
similar to RIKEN cDNA A930018P22
EST
similar to Myb proto-oncogene protein
(C-myb) (predicted)
secretin receptor
EST
EST
pleiomorphic adenoma gene-like 1
zona pellucida glycoprotein 3
complement component 4a
EST
EST
EST
EST
myeloid leukemia factor 1
glutamate receptor, metabotropic 1
retinol dehydrogenase 12
(all-trans/9-cis/11-cis)
nuclear receptor subfamily 4, group A,
member 2
amylase 2, pancreatic
EST
ATPase, H+ transporting, lysosomal V1
subunit G3
EST
periplakin
similar to hypothetical protein A730098P15
ankyrin repeat domain 12
EST
inner centromere protein
fizzy/cell division cycle 20 related 1
EST
EST
ret proto-oncogene
Similar to GTL2, imprinted maternally
expressed untranslated
EST
similar to 2410024A21Rik protein
adenylate kinase 7
bone marrow stromal cell antigen 1
carboxypeptidase X (M14 family), member
1
hypothetical protein LOC690918
EST
apolipoprotein A-II
EST
similar to growth and
transformation-dependent protein
alkaline phosphatase
EST
103
-
3.10
3.10
4.75
2.02
2.69
3.26
Prpf3
3.09
2.69
2.98
RGD1563222
-
3.09
3.08
6.40
4.85
6.07
3.62
RGD1560020
3.07
8.60
6.71
Sctr
Plagl1
Zp3
C4a
Mlf1
Grm1
3.07
3.07
3.06
3.05
3.04
3.04
3.04
3.04
3.03
3.02
3.02
3.01
4.93
6.19
2.49
9.17
5.08
7.15
2.56
6.75
3.09
3.91
13.05
2.85
4.52
5.91
5.59
5.35
3.40
6.43
3.33
4.52
3.71
3.52
7.73
2.88
Rdh12
3.00
5.94
5.98
Nr4a2
2.97
2.87
4.92
Amy2
-
2.96
2.95
3.94
6.52
2.25
3.40
Atp6v1g3
2.94
5.01
4.82
Ppl
RGD1565726
Ankrd12
Incenp
Fzr1
Ret
2.94
2.93
2.93
2.93
2.93
2.92
2.91
2.91
2.90
2.89
5.40
4.63
12.21
5.71
2.93
3.20
2.09
3.95
4.45
5.01
6.04
5.08
7.20
5.91
2.85
4.87
3.25
4.98
5.55
4.39
RGD1566401
2.89
2.19
4.67
RGD1304878
Ak7
Bst1
2.89
2.89
2.88
2.88
7.77
4.24
7.39
3.69
5.26
4.31
6.24
4.77
Cpxm1
2.88
6.28
5.59
LOC690918
Apoa2
-
2.87
2.87
2.86
2.86
6.36
2.56
2.85
5.82
5.97
3.67
2.10
6.48
LOC680351
2.86
3.69
3.14
Alpl
-
2.86
2.85
3.09
4.80
5.70
5.65
NM_031703
NM_053629
AI007657
NM_017266
AI535351
XM_001066354
NM_001106825
NM_001025770
NM_001106100
NM_080581
XM_001069649
XM_001066267
BG374111
NM_183331
XR_007778
NM_001009362
NM_019236
NM_019264
AI112040
NM_031577
NM_001108535
AI111707
AW142608
NM_133288
NM_001109223
XM_001063752
NM_033231
NM_012692
NM_022213
BI287343
NM_001130508
NM_001108688
NM_001108508
XM_001074750
NM_023021
NM_001108612
XM_001065965
NM_017329
AI231422
NM_001014171
XM_001077447
NM_001126294
AI058581
NM_001107727
aquaporin 3
Aqp3
follistatin-like 3
Fstl3
EST
lactate dehydrogenase C
Ldhc
EST
gastrulation brain homeobox 2
Gbx2
hypothetical LOC300751
RGD1311874
testis specific gene A14
Tsga14
ATP/GTP binding protein 1
Agtpbp1
ATP-binding cassette, sub-family C
Abcc3
(CFTR/MRP), member 3
hypothetical protein LOC691223
LOC691223
hypothetical protein LOC686032
LOC686032
EST
coagulation factor VIII
F8
similar to BC040823 protein
RGD1563798
PAS domain containing serine/threonine
Pask
kinase
hairy and enhancer of split 2
Hes2
protein kinase, cAMP-dependent,
Prkar2a
regulatory, type 2, alpha
EST
growth hormone releasing hormone
Ghrh
cell division cycle and apoptosis regulator 1 Ccar1
EST
EST
ATPase, Ca++ transporting, plasma
Atp2b3
membrane 3
wingless-type MMTV integration site
Wnt16
family, member 16
RGD1563109
RGD1563109
acyl-CoA synthetase medium-chain family
Acsm3
member 3
cytochrome P450 IIA1 (hepatic steroid
Cyp2a1
hydroxylase IIA1) gene
phosphatidylinositol 3 kinase, regulatory
Pik3r3
subunit, polypeptide 3
EST
scleraxis
Scx
cytidine deaminase
Cda
EPS8-like 2
Eps8l2
similar to RIKEN cDNA D330022A01 gene RGD1306603
potassium intermediate/small conductance
calcium-activated channel, subfamily N,
Kcnn4
member 4
death inducer-obliterator 1
Dido1
dynein, axonemal, heavy polypeptide 7
Dnah7
surfactant, pulmonary-associated protein A1 Sftpa1
EST
ventricular zone expressed PH domain
Veph1
homolog 1
Nuclear receptor co-repressor 1
Ncor1
similar to hypothetical protein FLJ25416
RGD1559690
EST
microsomal triglyceride transfer protein
Mttp
104
2.85
2.85
2.84
2.84
2.83
2.82
2.81
2.80
2.79
3.68
4.28
5.77
4.04
4.55
4.73
2.33
3.28
2.82
4.64
6.08
6.02
4.43
2.74
4.09
3.99
2.23
3.16
2.79
2.34
4.04
2.79
2.79
2.77
2.77
2.77
6.64
7.24
2.68
4.27
2.61
5.67
8.67
3.75
3.68
2.51
2.77
4.07
3.76
2.76
2.93
3.11
2.76
6.66
3.29
2.74
2.74
2.74
2.73
2.73
3.02
2.64
3.40
3.97
6.42
3.78
2.81
5.10
4.11
4.92
2.73
5.42
8.04
2.71
2.42
3.82
2.71
6.04
5.37
2.71
7.78
5.27
2.71
2.04
2.66
2.70
4.10
2.74
2.70
2.70
2.70
2.70
2.70
3.43
4.27
3.57
2.18
5.28
4.22
4.59
4.00
2.53
5.28
2.69
5.73
3.06
2.69
2.69
2.67
2.67
4.50
5.88
2.72
8.39
3.83
5.21
2.02
6.24
2.67
9.78
5.95
2.67
2.66
2.66
2.65
2.01
3.38
3.37
3.25
2.97
3.72
4.17
3.39
NM_001013165
BE104952
NM_001108066 NCBI
XM_001062557
NM_001110155
NM_001037643
NM_212459
XM_001066855
AA859744
NM_177482
NM_001012741
BI296619
NM_022246
BF409110
AI137489
NM_001135119
AI178692
NM_001002803
NM_001105864
NM_001134801
XM_001061006
NM_001085403
NM_001025032
BF388014
XM_001062555
NM_001012220
BE119630
XM_001078035
NM_001109478
BF413876
NM_133603
AI105271
XM_001057601
BE109256
NM_012524
AW528430
BI274778
BE108785
AA964532
BI300437
NM_012676
NM_001106402
BF418003
NM_012734
NM_001002822
NM_133614
AI575421
BF563384
BF387010
leucine rich repeat containing 23
Lrrc23
EST
AT rich interactive domain 3A
Arid3a
Muscleblind-like 1
Mbnl1
RGD1565611
RGD1565611
Ubiquitin-conjugating enzyme E2Z
Ube2z
ADP-ribosylation factor-like 9
Arl9
ankyrin repeat domain 55
Ankrd55
EST
prostatic steroid binding protein C1
Psbpc1
lipase, endothelial
Lipg
EST
RAD50
Rad50
EST
EST
angel homolog 2
Angel2
EST
transporter 1, ATP-binding cassette,
Tap1
sub-family B (MDR/TAP)
Scavenger receptor class F, member 2
Scarf2
similar to apolipoprotein L2
RGD1309808
glycyl-tRNA synthetase
Gars
similar to Nkrp1f protein
LOC683758
CD96 antigen
Cd96
EST
similar to Probable
phospholipid-transporting ATPase ID
LOC685152
(ATPase class I type 8B member 2)
cation channel, sperm associated 2
Catsper2
EST
similar to zinc finger protein 59
LOC687333
non-metastatic cells 4, protein expressed in Nme4
EST
Potassium voltage-gated channel, Isk-related
Kcne2
subfamily, gene 2
EST
dynein, axonemal, heavy polypeptide 12
Dnah12
EST
CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP),
Cebpa
alpha
EST
EST
EST
EST
EST
troponin T2, cardiac
Tnnt2
lipoma HMGIC fusion partner-like 2
Lhfpl2
EST
hexokinase 1
Hk1
RT1 class Ib, locus Aw2
RT1-Aw2
solute carrier family 25 (mitochondrial
Slc25a21
oxodicarboxylate carrier), member 21
EST
EST
EST
-
105
2.65
2.65
2.65
2.65
2.64
2.64
2.63
2.63
2.62
2.61
2.60
2.60
2.60
2.59
2.59
2.58
2.58
6.67
2.43
2.13
2.55
5.17
4.33
2.27
3.41
3.28
3.27
2.64
6.65
2.81
5.90
3.50
2.71
2.42
5.81
3.66
3.69
2.72
4.74
3.05
3.59
4.27
3.60
2.58
3.32
5.52
2.74
5.61
3.39
3.66
6.37
2.58
3.38
4.65
2.58
2.57
2.57
2.56
2.55
2.55
4.83
2.11
3.43
3.11
3.12
5.54
2.48
3.99
4.46
2.65
2.19
2.09
2.54
2.09
3.13
2.54
2.53
2.52
2.52
2.51
6.69
4.63
6.31
7.20
2.31
4.56
4.34
3.54
5.71
3.81
2.51
3.63
3.94
2.50
2.50
2.50
5.15
7.46
4.16
5.22
5.19
3.05
2.49
2.52
2.01
2.49
2.48
2.47
2.47
2.47
2.47
2.47
2.46
2.46
2.45
4.65
12.15
2.70
5.82
6.76
2.80
3.62
3.75
6.77
4.60
3.92
4.85
2.69
4.63
5.17
3.82
4.23
3.25
5.78
4.64
2.43
2.88
2.88
2.43
2.43
2.41
5.19
2.45
2.15
4.38
4.32
3.43
BI292177
BF397224
NM_199093
NM_001014188
AI169347
AW251736
BE096865
NM_001024316
NM_021696
NM_001107712
BF402577
NM_133573
AI137817
NM_012920
XM_001068622
NM_181694
AW530423
NM_001106319
NM_001107393
NM_001025681
NM_017318
XM_001069194
XM_001064653
NM_053808
NM_001108588
BF402073
AI548601
NM_001024275
XM_001058430
NM_053734
NM_001008871
NM_031538
NM_001024330
NM_001034139
BF396077
NM_057149
AI716819
NM_013123
BF552068
XM_228760
AW529671
BE096970
NM_212538
AW527234
NM_053810
XM_213732
EST
EST
serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade
Serping1
G, member 1
ISY1 splicing factor homolog
Isy1
EST
EST
EST
GATA binding protein 5
Gata5
serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade
Serpinb2
B, member 2
CTTNBP2 N-terminal like
Cttnbp2nl
EST
G protein-coupled estrogen receptor 1
Gper
EST
calcium/calmodulin-dependent protein
Camk2a
kinase II, alpha
similar to testes development-related
RGD1561916
NYD-SP22 isoform 1
Rsb-66 protein
Rsb66
EST
Cysteinyl-tRNA synthetase
Cars
diaphanous homolog 1
Diap1
tetratricopeptide repeat domain 23
Ttc23
protein tyrosine kinase 2 beta
Ptk2b
hypothetical LOC315072
RGD1311993
ropporin 1-like
Ropn1l
coagulation factor II (thrombin)
F2rl3
receptor-like 3
solute carrier family 5 (sodium/glucose
Slc5a12
cotransporter), member 12
EST
EST
Ras association (RalGDS/AF-6) domain
Rassf4
family 4
ribosomal protein L3-like
Rpl3l
neutrophil cytosolic factor 1
Ncf1
serine peptidase inhibitor, Kazal type 4
Spink4
CD8 antigen, alpha chain
Cd8a
hypothetical gene supported by BC079424 LOC500227
leucine rich repeat containing 8 family,
Lrrc8e
member E
EST
tumor necrosis factor (ligand) superfamily,
Tnfsf11
member 11
EST
interleukin 1 receptor, type I
Il1r1
EST
Transcription factor E3
Tcfe3
EST
EST
PHD finger protein 1
Phf1
EST
synaptosomal-associated protein 29
Snap29
paired immunoglobin-like type 2 receptor Pilra
106
2.41
2.41
3.03
4.13
4.12
4.12
2.41
7.37
5.21
2.40
2.39
2.39
2.38
2.38
3.69
2.93
4.78
2.14
2.34
2.92
2.53
2.42
3.68
2.09
2.38
2.18
2.65
2.37
2.37
2.37
2.37
4.67
3.03
4.96
2.57
5.18
4.52
2.24
2.64
2.36
2.10
2.32
2.36
5.59
4.69
2.36
2.36
2.35
2.35
2.35
2.34
2.34
2.34
3.74
3.10
4.23
2.40
4.30
2.61
2.92
5.74
4.32
3.67
4.16
3.77
5.07
3.17
5.32
4.66
2.34
4.63
3.52
2.34
2.11
3.54
2.34
2.33
3.41
3.61
4.75
4.10
2.31
4.67
5.43
2.31
2.31
2.31
2.30
2.30
2.05
2.56
4.24
3.40
3.44
3.52
2.69
3.95
3.95
3.98
2.30
2.97
2.61
2.29
2.00
3.08
2.29
5.24
2.11
2.29
2.28
2.28
2.27
2.27
2.27
2.26
2.26
2.26
2.26
4.84
2.96
9.63
2.56
2.47
4.08
2.46
2.80
2.26
2.56
2.31
3.83
5.84
2.82
2.95
4.46
3.29
2.77
3.00
2.46
AA817993
NM_001107780
NM_020471
NM_017239
NM_001004263
NM_001014003
XM_001063710
XR_007761
NM_199502
NM_001109403
NM_001108050
BF386208
NM_001077669
AI548139
NM_001077677
AI043711
NM_001107778
AI639222
BG378431
NM_017016
BI288982
NM_138871
NM_001109530
XM_001053786
NM_001012353
AA858604
NM_031017
NM_001109075
AW529600
BI289090
NM_001135757
NM_053491
BE097232
XM_001080939
AW915885
BF416488
NM_001024739
NM_138518
AI454925
NM_001108285
NM_012716
NM_019375
NM_133596
NM_138502
NM_001025688
NM_001011974
BM387975
alpha
EST
hydroxyacid oxidase 1
ISL LIM homeobox 2
myosin, heavy polypeptide 6, cardiac
muscle, alpha
integrin, beta 6
glutamic-oxaloacetic transaminase 1-like 1
Hypothetical LOC300074
similar to DKFZP434I092 protein
kohjirin
Complement component 1, q
subcomponent-like 3
SMEK homolog 1, suppressor of mek1
EST
solute carrier family 39 (zinc transporter),
member 4
EST
Park2 co-regulated
EST
heat shock protein 12B
EST
EST
histidine decarboxylase
EST
tudor domain containing 7
SAM pointed domain containing ets
transcription factor
histone deacetylase 10
similar to interferon-inducible GTPase
EST
cAMP responsive element binding protein 1
similar to RIKEN cDNA 1700009P17
EST
EST
FUN14 domain containing 2
plasminogen
EST
WD repeat domain 22
EST
EST
tektin 3
cysteine-rich secretory protein LCCL
domain containing 2
EST
Nucleoredoxin
solute carrier family 16 (monocarboxylic
acid transporters), member 1
septin 3
UDP-glucose ceramide
glucosyltransferase-like 1
Monoglyceride lipase
palmdelphin
A kinase (PRKA) anchor protein 2
EST
107
Hao1
Isl2
2.26
2.26
2.26
2.58
2.02
2.62
3.92
2.90
3.57
Myh6
2.26
2.71
3.06
Itgb6
Got1l1
RGD1305939
RGD1565493
Chrdl1
2.26
2.25
2.24
2.24
2.24
3.84
2.80
4.64
6.61
4.09
3.82
2.78
4.25
5.07
3.94
C1ql3
2.24
3.75
3.77
Smek1
-
2.23
2.23
2.40
2.22
2.82
2.67
Slc39a4
2.23
2.37
3.46
Pacrg
Hspa12b
Hdc
Tdrd7
2.23
2.22
2.22
2.22
2.22
2.21
2.21
2.21
2.21
2.77
4.72
2.78
3.11
3.03
3.57
3.69
2.65
2.28
2.70
4.03
2.60
2.16
2.36
5.50
3.59
2.27
4.26
Spdef
2.20
2.99
3.43
Hdac10
MGC108823
Creb1
RGD1562658
Fundc2
Plg
Wdr22
Tekt3
2.19
2.19
2.19
2.19
2.18
2.18
2.17
2.17
2.17
2.17
2.17
2.17
2.17
2.16
5.63
6.48
5.77
2.81
4.45
3.11
3.42
3.94
3.47
2.77
5.66
2.33
3.77
3.52
3.81
4.57
2.88
2.86
4.03
2.60
3.49
2.98
2.80
2.22
3.77
2.47
2.47
4.00
Crispld2
2.15
3.40
2.71
Nxn
2.15
2.15
2.93
2.43
2.37
2.38
Slc16a1
2.15
2.02
2.20
Sep3
2.15
2.82
2.99
Ugcgl1
2.14
2.10
3.67
Mgll
Palmd
Akap2
-
2.14
2.14
2.14
2.13
4.22
3.33
2.91
6.33
3.45
4.16
2.91
3.96
NM_001106460
NM_001109201
AI547999
NM_138900
NM_001108616
NM_031970
NM_017252
NM_031140
NM_001013134
AI013990
AI234028
BE096287
BF288845
XM_001068874
XM_001076512
NM_001126286
NM_001024311
AW527144
AW531942
BF404369
BM389613
NM_001109175
BI284316
NM_001014062
NM_001047912
XM_001068018
NM_001108451
NM_021776
XM_001068302
NM_139259
NM_001107159
BF387484
NM_012897
XM_001066515
AI454929
NM_053555
AI111975
NM_001109477
BF417784
BF567578
NM_001005900
NM_130741
NM_001107128
NM_001034130
AI136674
BE106241
NM_001025026
NM_001106703
AI012250
XM_001058176
protein tyrosine phosphatase, non-receptor
type 22 (lymphoid)
similar to RIKEN cDNA 1700029I15
EST
complement component 1, s subcomponent
ArfGAP with GTPase domain, ankyrin
repeat and PH domain 3
heat shock protein 1
POU domain, class 3, transcription factor 4
vimentin
NIMA (never in mitosis gene a)-related
kinase 4
EST
EST
EST
EST
sushi, nidogen and EGF-like domains 1
similar to Serine/threonine-protein kinase
SNK (Serum inducible kinase)
similar to RIKEN cDNA 1810030O07
Similar to RIKEN cDNA 4933404M02
EST
EST
EST
EST
cyclin O
EST
similar to RAN protein
MORN repeat containing 5
hypothetical protein LOC683910
dynein light chain roadblock-type 2
endothelin converting enzyme-like 1
SRY (sex determining region Y)-box 4
neurotrophin receptor associated death
domain
matrix metallopeptidase 19
EST
adrenergic, beta, receptor kinase 2
similar to hypothetical protein FLJ22527
EST
Vesicle-associated membrane protein 5
EST
dynein, axonemal, light chain 1
EST
EST
hematopoietic cell signal transducer
lipocalin 2
zinc finger protein 68
IQ motif and ubiquitin domain containing
EST
EST
signal transducing adaptor family member 2
GLIS family zinc finger 1
EST
OTU domain containing 7A
108
Ptpn22
2.13
4.81
4.01
RGD1563263
C1s
2.13
2.13
2.12
4.63
2.27
3.31
2.92
2.68
3.88
Agap3
2.12
2.38
3.06
Hspb1
Pou3f4
Vim
2.12
2.11
2.11
3.00
3.83
6.01
3.18
3.92
4.27
Nek4
2.11
2.94
3.67
Sned1
2.11
2.11
2.11
2.11
2.10
16.68
3.04
3.55
4.43
4.58
7.64
3.41
4.26
4.53
4.01
RGD1305038
2.10
3.59
5.63
RGD1565685
LOC499806
Ccno
RGD1306195
Morn5
LOC683910
Dynlrb2
Ecel1
Sox4
2.10
2.10
2.09
2.09
2.08
2.08
2.08
2.07
2.07
2.06
2.06
2.05
2.05
2.05
3.94
4.50
2.78
4.06
2.12
9.35
96.36
2.96
3.32
4.59
4.24
4.97
2.09
2.40
2.01
4.06
3.13
4.19
3.31
11.36
26.66
3.21
3.83
4.74
4.05
4.00
2.53
3.19
Nradd
2.05
2.55
2.35
Mmp19
Adrbk2
RGD1305311
Vamp5
Dnal1
Hcst
Lcn2
Zfp68
Iqub
Stap2
Glis1
Otud7a
2.04
2.04
2.04
2.04
2.04
2.04
2.03
2.03
2.03
2.03
2.02
2.02
2.02
2.01
2.01
2.01
2.00
2.00
2.00
2.00
3.57
2.82
7.96
4.46
14.28
2.62
2.26
2.33
3.56
3.24
2.12
2.01
5.67
6.53
4.22
4.30
3.55
2.61
2.24
2.51
4.86
3.03
7.57
4.00
6.09
3.41
3.20
2.11
3.61
6.60
3.72
2.30
2.17
4.56
3.83
3.88
2.87
3.26
2.99
3.12
NM_001107990
AI555620
NM_001108514
ciliary rootlet coiled-coil, rootletin
Crocc
EST
ankyrin repeat domain 13 family, member D Ankrd13d
2.00
2.00
2.00
5.01
4.18
3.14
Abbreviations: MMI, 2-mercapto-1-methylimidazole; PTU, 6-propyl-2-thiouracil; EST, expressed sequence tag.
109
4.00
2.77
3.57
Table 2-2. List of genes commonly down-regulated in the microdissected cerebral white matter
region after treatment with anti-thyroid agents (≤ 0.5-fold)
Accession number
Down-regulated (58 genes)
NM_013107
BF289133
AW251983
AI137678
NM_053312
NM_019154
NM_001135010
BF408794
NM_001025275
BF389501
XM_001077520
AI639222
BF405058
AI639183
BG664708
XM_001063702
XM_001061691
XM_001054773
AI045148
AI535089
NM_133404
NM_019125
BF392912
BG374305
NM_001106161
BF413176
NM_001025774
BF405308
NM_001108617
BF420118
NM_001007801
AT003256
NM_001107597
NM_212495
BF410662
NM_207165
NM_001106725
NM_001106264
NM_001002022
AI412008
BF387478
BF288380
NM_053759
BI294274
AA998453
NM_019280
BF405021
Gene title
Symbol
Bone morphogenetic protein 6
EST
EST
EST
dihydrolipoamide branched chain
transacylase E2
amelogenin X chromosome
mast cell protease 10
EST
RAD23 homolog B
EST
Exosome component 6
EST
EST
EST
EST
similar to homeotic protein Hox 4.6
zinc finger, CCHC domain containing 3
ankyrin repeat domain 60
EST
EST
Lon peptidase 1, mitochondrial
probasin
EST
EST
desmocollin 1
EST
coiled-coil domain containing 105
EST
PFTAIRE protein kinase 1
EST
Yip1 domain family, member 3
EST
doublesex and mab-3 related
transcription factor 2
bromodomain containing 2
EST
ADP-ribosylation factor-like 10
anterior gradient homolog 2
RALBP1 associated Eps domain
containing 1
Enthoprotin
EST
EST
EST
SIX homeobox 1
EST
EST
gap junction protein, alpha 5
EST
Bmp6
-
0.23
0.24
0.26
0.28
0.38
0.39
0.35
0.26
0.25
0.40
0.33
0.36
Dbt
0.28
0.48
0.35
Amelx
Mcpt10
Rad23b
Exosc6
RGD1563800
Zcchc3
Ankrd60
Lonp1
Pbsn
Dsc1
Ccdc105
Pftk1
Yipf3
-
0.31
0.32
0.32
0.33
0.35
0.35
0.36
0.36
0.38
0.39
0.39
0.40
0.40
0.41
0.41
0.42
0.42
0.42
0.42
0.43
0.43
0.43
0.44
0.44
0.44
0.44
0.44
0.07
0.18
0.39
0.49
0.18
0.34
0.23
0.26
0.05
0.45
0.22
0.27
0.17
0.21
0.29
0.36
0.34
0.16
0.17
0.32
0.25
0.22
0.34
0.24
0.19
0.36
0.11
0.09
0.23
0.23
0.14
0.23
0.14
0.30
0.19
0.17
0.17
0.36
0.30
0.12
0.19
0.29
0.25
0.34
0.14
0.17
0.42
0.35
0.29
0.40
0.23
0.45
0.06
0.15
Dmrt2
0.44
0.26
0.35
Brd2
Arl10
Agr2
0.44
0.44
0.44
0.45
0.26
0.24
0.12
0.39
0.18
0.29
0.16
0.50
Reps1
0.45
0.20
0.21
Enth
Six1
Gja5
-
0.45
0.45
0.45
0.45
0.45
0.45
0.46
0.46
0.46
0.41
0.28
0.28
0.30
0.35
0.34
0.35
0.16
0.27
0.26
0.13
0.08
0.20
0.46
0.31
0.26
0.28
0.16
110
MMI PTU, 3 ppm
PTU, 12 ppm
NM_133293
XM_001068655
BF399365
XM_001055117
NM_183334
AA875080
BF399584
AI639252
BF394727
NM_053794
AW921479
GATA binding protein 3
fms-related tyrosine kinase 3
EST
similar to spatial-delta
lactate dehydrogenase A-like 6B
EST
EST
EST
EST
WNK lysine deficient protein kinase 1
EST
Gata3
Flt3
RGD1561665
Ldhal6b
Wnk1
-
0.47
0.47
0.47
0.47
0.49
0.49
0.49
0.50
0.50
0.50
0.50
0.47
0.42
0.19
0.23
0.30
0.43
0.50
0.27
0.28
0.26
0.29
Abbreviations: MMI, 2-mercapto-1-methylimidazole; PTU, 6-propyl-2-thiouracil; EST, expressed sequence tag.
111
0.24
0.43
0.29
0.26
0.46
0.50
0.42
0.25
0.35
0.24
0.49
Table 2-3. List of representative genes associated with brain development showing up- or
down-regulation common to treatments with MMI and PTU at both 3 and 12 ppm (≥ 2-fold, ≤
0.5-fold)
Accession No.
Gene title
Symbol
MMI
PTU, 3 ppm PTU, 12 ppm
Up-regulated (20 genes)
NM_052803
ATPase, Cu++ transporting, alpha polypeptide
Atp7a
5.02
11.39
11.09
NM_001108322
T-box 1
Tbx1
4.20
4.34
2.31
NM_001191609
Laminin, alpha 5
Lama5
4.11
11.57
9.35
NM_031550
Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A
Cdkn2a
3.59
2.70
3.37
NM_001114330
Glutamate receptor, metabotropic 1
Grm1
3.45
2.92
5.89
NM_023091
gamma-Aminobutyric acid A receptor, epsilon
Gabre
3.20
3.91
7.46
NM_001107692
Ephrin A4
Efna4
3.13
5.07
6.72
NM_001002805
Complement component 4a
C4a
3.04
7.15
6.43
NM_019328
Nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2
Nr4a2
2.97
2.87
4.92
NM_001110099
Ret proto-oncogene
Ret
2.89
5.01
4.39
NM_053629
Follistatin-like 3
Fstl3
2.85
4.28
6.08
NM_053708
Gastrulation brain homeobox 2
Gbx2
2.82
4.73
4.09
NM_019236
Hairy and enhancer of split 2
Hes2
2.76
2.93
3.11
NM_001109223
Wingless-related MMTV integration site 16
Wnt16
2.71
2.42
3.82
XM_001077495
Nuclear receptor co-repressor 1
Ncor1
2.67
2.01
2.97
NM_001012220
Cation channel, sperm associated 2
Catsper2
2.54
6.69
4.56
NM_001024275
Ras association (RalGDS/AF-6) domain family 4
Rassf4
2.31
4.67
5.43
NM_138900
Complement component 1, s subcomponent
C1s
2.12
3.31
3.88
NM_031140
Vimentin
Vim
2.11
6.01
4.27
NM_053555
Vesicle-associated membrane protein 5
Vamp5
2.04
2.62
3.41
Down-regulated (4 genes)
NM_013107
Bone morphogenetic protein 6
Bmp6
0.23
0.38
0.25
NM_053759
Sine oculis homeobox homolog 1
Six1
0.45
0.35
0.46
NM_019280
Gap junction membrane channel protein alpha 5
Gja5
0.46
0.16
0.28
NM_133293
GATA binding protein 3
Gata3
0.47
0.47
0.24
Abbreviations: MMI, 2-mercapto-1-methylimidazole; PTU, 6-propyl-2-thiouracil.
112
Fig. 2-1
Overview of the cerebral hemisphere of a male rat at PND 20 atained with hematoxylin and eosin.
12.5x magnification.
113
Fig. 2-2
Venn diagram of genes with altered expression in microarray analysis in response to maternal
exposure to anti-thyroid agents. (Left) Up-regulated genes (≥ 2-fold). (Right) Down-regulated genes
(≤ 0.5-fold).
114
Fig. 2-3
Validation of mRNA expression of genes selected from microarray data (n = 4 in each group). * and
** P < 0.05, 0.01 vs. untreated controls (Dunnett’s test or Dunnett-type rank-sum test).
115
Fig. 2-4
Immunohistochemical distributions of vimentin- and Ret-positive cells in the while matter tissue. (A)
vimentin-immunoreactive cells in the cingulum. Untreated control animal (left) and MMI-treated
animal (right). 200× magnification (inset: 400× magnification). Graph shows the mean number of
positive cells within the cingulum at 100× magnification (untreated controls: n = 6, MMI and PTU
groups: n = 10). ** P < 0.01 vs. untreated controls (Dunnett’s test or Dunnett-type rank-sum test). (B)
Ret-immunoreactive cells in the cingulum. Untreated control animal (left), MMI-treated animal (right).
200× magnification (inset: 400× magnification). Graph shows the mean number of positive cells
within the cingulum at 100× magnification (untreated controls: n = 6, MMI and PTU groups: n = 10).
* and ** P < 0.05, 0.01 vs. untreated controls (Dunnett’s test or Dunnett-type rank-sum test).
116
Fig. 2-5
Immunohistochemical distributions of DCC- and Cld11-immunoreactivity in the while matter tissue.
(A) DCC-immunoreactivity in the myelin sheaths of the lateral cerebral white matter, internal capsule
and fimbria of the hippocampus. Untreated control animal (left), MMI-treated animal (right). 40×
magnification (untreated controls: n = 6, MMI and PTU groups: n = 10). Graph shows the mean
intensity score of immunoreactivity at 40× magnification. ** P < 0.01 vs. untreated controls
(Mann-Whitney’s U-test). (B) Cld11-immunoreactivity in the myelin sheaths of the lateral cerebral
white matter, internal capsule and fimbria of the hippocampus. Untreated control animal (left),
MMI-treated animal (right). 40× magnification. Graph shows the mean intensity score of
immunoreactivity at 40× magnification (untreated controls: n = 6, MMI and PTU groups: n = 10). **
P < 0.01 vs. untreated controls (Mann-Whitney’s U-test).
117
Fig. 2-6
Immunohistochemical distributions of GFAP in the cingulum. Untreated control animal (left),
MMI-treated animal (right). 200× magnification. Graph shows the mean number of positive cells
within the cingulum at 100× magnification (untreated controls: n = 6, MMI and PTU groups: n = 10).
* and ** P < 0.05, 0.01 vs. untreated controls (Dunnett’s test or Dunnett-type rank-sum test).
118
Table 3-1. List of genes commonly up-regulated in the microdissected cerebral white matter
region after exposure to DBDE at 10, 100, and 1,000 ppm (≥ 2-fold)
Accession no.
Gene title
Symbol
DBDE
10 ppm
Up-regulated (129genes)
XM_002725261
100 ppm 1000 ppm
Similar to KB07 protein
RGD1561940
5.42
15.74
14.96
AI176450
AI237569
EST
EST
–
–
3.60
6.60
11.22
7.79
12.26
12.06
NM_012718
NM_145879
androgen regulated 20 kDa protein
suppressor of cytokine signaling 1
Andpro
Socs1
4.36
3.19
5.97
4.90
11.48
11.25
NM_001108693
AI712659
retinol binding protein 7, cellular
EST
Rbp7
–
3.41
2.48
13.75
3.66
10.17
9.02
NM_001108617
NM_031502
PFTAIRE protein kinase 1
amylase 2
Pftk1
Amy2
2.57
6.73
2.32
3.92
6.57
6.36
XM_002725036
BM385169
Leucine rich repeat containing 3B
EST
Lrrc3b
–
2.67
4.47
2.61
2.33
6.36
6.25
AI502924
NM_173309
–
Elavl2
2.22
3.97
5.65
2.11
6.20
6.02
NM_001101680
AW523012
EST
ELAV (embryonic lethal, abnormal vision,
Drosophila)-like 2
forkhead box C2
EST
Foxc2
–
3.11
2.05
2.55
2.14
5.83
5.75
NM_001025051
BF394267
family with sequence similarity 110, member C Fam110c
EST
–
6.00
2.44
8.02
6.25
5.64
5.55
BI295646
AA893529
EST
EST
–
–
2.06
2.59
4.09
3.54
5.52
5.41
NM_001025740
AF053092
ribonucleotide reductase M2
EST
Rrm2
–
2.20
2.80
2.10
5.63
5.39
5.34
NM_001106908
NM_138879
similar to RIKEN cDNA 4832428D23 gene
selectin E
RGD1561425
Sele
2.19
4.85
4.04
3.72
5.21
5.13
NM_030985
NM_181440
angiotensin II receptor, type 1a
glutamine/glutamic acid-rich protein A
Agtr1a
Grpca
2.57
3.05
9.55
4.04
5.10
5.02
BF288392
NM_001107058
–
Map3k3
2.29
2.86
7.03
2.36
4.99
4.96
NM_001109226
NM_001013079
EST
mitogen activated protein kinase kinase kinase
3
Proline-rich transmembrane protein 4
oxysterol binding protein-like 2
Prrt4
Osbpl2
3.01
2.78
5.52
6.87
4.94
4.88
NM_001136151
AI072042
neuregulin 2
EST
Nrg2
–
2.61
3.55
3.91
2.73
4.84
4.81
AI385307
AI535212
EST
EST
–
–
2.46
2.15
2.06
5.15
4.72
4.69
AI113065
AW528250
EST
EST
–
–
2.84
2.32
7.40
2.49
4.63
4.59
NM_001173426
NM_053986
RNA binding protein with multiple splicing 2
myosin Ib
Rbpms2
Myo1b
3.24
2.10
5.76
3.56
4.53
4.53
BE104268
NM_001037357
EST
leukocyte immunoglobulin-like receptor,
subfamily B (with TM and ITIM domains),
member 3-like
EST
zinc finger, CCHC domain containing 24
–
Lilrb3l
2.07
2.72
2.86
2.69
4.52
4.41
–
Zcchc24
4.04
3.01
4.29
3.96
4.37
4.36
AI639063
NM_001108394
119
NM_012620
2.75
4.72
4.34
AI102874
serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade E, Serpine1
member 1
EST
–
2.18
6.65
4.30
BF396605
NM_012596
EST
leptin receptor
–
Lepr
2.23
2.26
3.66
3.54
4.25
4.23
NM_001135877
TAF7-like RNA polymerase II, TATA box
binding protein (TBP)-associated factor
Taf7l
2.59
4.56
4.20
NM_198735
NM_001109304
ADP-ribosyltransferase 2b
cripto, FRL-1, cryptic family 1
Art2b
Cfc1
2.20
3.24
2.06
3.19
4.20
4.10
BF396608
NM_001009691
EST
Doublecortin-like kinase 2
–
Dclk2
2.00
2.42
3.32
4.02
4.07
4.05
NM_019236
NM_017001
hairy and enhancer of split 2
erythropoietin
Hes2
Epo
3.63
3.58
2.35
3.25
4.03
4.02
NM_001025013
NM_017144
melanoma antigen family B, 16
troponin I type 3
Mageb16
Tnni3
2.40
4.51
2.46
3.15
4.01
4.01
AI059493
AI706203
EST
EST
–
–
2.27
2.66
2.18
3.73
4.00
3.98
BF288661
NM_001107025
EST
abhydrolase domain containing 15
–
Abhd15
4.32
2.49
3.76
8.15
3.97
3.91
AA955915
BE096287
EST
EST
–
–
2.71
2.44
2.71
2.01
3.87
3.87
AI030285
NM_001107097
EST
zinc finger and BTB domain containing 11
–
Zbtb11
2.65
2.59
2.23
2.89
3.87
3.85
NM_001107413
AW527665
iroquois homeobox 3
EST
Irx3
–
2.42
2.70
4.11
2.31
3.79
3.78
BF391952
BF392832
EST
EST
–
–
2.14
6.00
5.61
2.82
3.70
3.63
AA859474
NM_173110
EST
prolactin family 8, subfamily a, member 5
–
Prl8a5
4.11
5.16
6.71
3.64
3.61
3.60
XM_001055799
NM_183331
–
F8
2.03
2.87
4.01
2.71
3.57
3.53
XM_001069604
NM_024353
EST
coagulation factor VIII, procoagulant
component
smoothelin-like 1
phospholipase C, beta 4
Smtnl1
Plcb4
2.30
2.54
2.40
2.14
3.52
3.50
NM_134384
NM_001024786
spermatogenesis associated 19
WD repeat domain 78
Spata19
Wdr78
2.67
2.19
2.59
4.40
3.50
3.49
BF415997
NM_001108251
EST
Ubiquilin 2
–
Ubqln2
2.26
2.77
3.46
7.77
3.44
3.35
BF416277
NM_053704
EST
BCL2-interacting killer
–
Bik
2.00
2.84
3.93
3.94
3.30
3.23
NM_012841
NM_021837
deleted in colorectal carcinoma
myc-like oncogene, s-myc protein
Dcc
Mycs
3.30
3.39
2.75
2.96
3.17
3.10
XM_001056035
AI113090
forkhead box I2
EST
Foxi2
–
3.99
3.87
3.48
2.45
3.08
3.05
NM_138978
AW534043
prokineticin receptor 2
EST
Prokr2
–
2.76
2.24
2.06
3.45
3.04
2.97
NM_001106490
XM_002726010
myosin binding protein C
EST
Mybpc3
–
2.05
2.39
3.28
2.05
2.96
2.96
NM_053708
BF403955
gastrulation brain homeobox 2
EST
Gbx2
–
2.43
2.93
2.59
3.11
2.93
2.92
120
NM_012770
NM_152936
guanylate cyclase 1, soluble, beta 2
serine peptidase inhibitor, Kazal type 1
Gucy1b2
Spink1
2.15
2.53
6.00
3.56
2.90
2.89
NM_019374
NM_012684
prodynorphin
variable coding sequence A1
Pdyn
Vcsa1
2.80
4.80
3.59
8.64
2.88
2.79
NM_001129878
BI290864
Homeo box A10
EST
Hoxa10
–
2.32
2.04
2.58
3.41
2.79
2.78
NM_001109257
NM_173322
kelch domain containing 5
proline-rich nuclear receptor coactivator 1
Klhdc5
Pnrc1
2.13
2.77
2.70
5.68
2.77
2.75
AI011647
NM_001106024
EST
–
phosphodiesterase 6B, cGMP-specific, rod, beta Pde6b
2.42
2.90
4.75
3.69
2.74
2.71
XM_001069645
BF401369
EST
EST
5.01
2.23
4.69
2.76
2.71
2.66
NM_001110490
NM_001177682
LIM domain binding 3
Ldb3
purinergic receptor P2Y, G-protein coupled, 10 P2ry10
2.24
2.58
2.77
4.27
2.63
2.61
AI502559
NM_053818
EST
solute carrier family 6 (neurotransmitter
transporter, glycine), member 9
–
Slc6a9
2.33
2.21
2.06
3.11
2.60
2.60
BF410362
EST
–
2.82
3.72
2.54
XM_002729411
NM_138836
EST
protease, serine, 8
–
Prss8
2.33
2.12
3.38
2.12
2.48
2.48
NM_001107804
BE120031
Molybdenum cofactor synthesis 3
EST
Mocs3
–
4.36
2.22
2.98
2.80
2.48
2.43
NM_139113
3.32
2.84
2.43
BF399574
nuclear receptor subfamily 2, group F, member Nr2f6
6
EST
–
2.49
6.21
2.42
NM_001134598
AW920335
EST
EST
2.40
2.19
2.22
2.17
2.41
2.41
NM_001127683
AW921534
heat shock transcription factor 2 binding protein Hsf2bp
EST
–
2.67
2.13
3.11
2.27
2.41
2.40
XM_001066131
NM_017023
2.84
3.35
2.88
2.27
2.36
2.27
NM_022379
XR_085738
EST
–
potassium inwardly-rectifying channel,
Kcnj1
subfamily J, member 1
transcription factor EC
Tfec
family with sequence similarity 184, member A Fam184a
2.27
2.23
2.67
2.23
2.27
2.23
BF414624
NM_053629
EST
follistatin-like 3
–
Fstl3
2.54
2.56
2.00
2.51
2.23
2.19
BF400760
NM_001108497
EST
EST
–
–
2.08
2.35
6.58
2.27
2.15
2.15
BF400813
BF400843
EST
EST
–
–
2.21
2.38
2.57
4.12
2.05
2.04
AI237240
NM_001033955
EST
calcitonin-related polypeptide alpha
–
Calca
2.22
2.10
2.42
2.78
2.03
2.03
BF403851
BF396335
EST
EST
–
–
2.26
2.50
2.85
2.61
2.03
2.01
–
–
–
–
Abbreviations: DBDE, decabromodiphenyl ether; EST, expressed sequence tag.
121
Table 3-2. List of genes commonly down-regulated in the microdissected cerebral white matter
region after exposure to DBDE at 10, 100, and 1,000 ppm (≤ 0.5-fold)
Accession no.
Gene title
Symbol
DBDE
10 ppm 100 ppm
Down-regulated (16 genes)
NM_001025420
1000 ppm
lymphocyte-specific protein 1
Lsp1
0.18
0.11
0.16
NM_172222
AW142962
complement component 2
EST
C2
–
0.46
0.19
0.27
0.45
0.17
0.22
BF403278
BI291223
EST
EST
–
–
0.45
0.46
0.33
0.35
0.23
0.24
NM_145672
AA892204
chemokine (C-X-C motif) ligand 9
EST
Cxcl9
–
0.48
0.29
0.31
0.34
0.27
0.28
BI290841
BF416112
EST
EST
–
–
0.47
0.39
0.35
0.37
0.30
0.31
NM_130424
AI058852
transmembrane protease, serine 2
EST
Tmprss2
–
0.43
0.36
0.23
0.30
0.32
0.35
NM_147135
NM_001007684
SH3-binding domain kinase 1
Kruppel-like factor 2
Sbk1
Klf2
0.22
0.41
0.30
0.36
0.36
0.38
NM_022707
BE100194
phospholamban
EST
Pln
–
0.25
0.44
0.24
0.37
0.38
0.40
BF567236
EST
–
0.45
0.43
0.45
Abbreviations: DBDE, decabromodiphenyl ether; EST, expressed sequence tag.
122
Table 3-3. List of genes commonly up-regulated in the microdissected cerebral white matter
region after exposure to DBDE at 100 and 1,000 ppm (≥ 2-fold)
Accession no.
Gene title
Symbol
DBDE
10 ppm 100 ppm 1000 ppm
Up-regulated (669genes)
NM_001191992
outer dense fiber of sperm tails 3B
Odf3b
1.55
5.87
29.88
BI288579
NM_001106602
EST
deoxyguanosine kinase
–
Dguok
1.18
0.82
84.91
28.19
27.81
24.35
XR_085573
BM390363
similar to mKIAA1783 protein
EST
RGD1560214
–
0.63
0.82
9.81
2.20
15.39
12.46
NM_031686
NM_001191598
sodium channel, voltage-gated, type VII, alpha
coiled-coil domain containing 113
Scn7a
Ccdc113
0.89
1.33
7.34
2.08
11.60
11.31
BE113493
NM_021666
EST
triadin
–
Trdn
0.64
1.38
12.08
5.40
11.20
10.88
XM_002725158
BM386877
Hypothetical LOC290577
EST
LOC290577
–
1.43
1.65
3.86
5.38
10.76
10.34
NM_138884
aldo-keto reductase family 1, member D1 (delta
4-3-ketosteroid-5-beta-reductase)
G protein-coupled receptor kinase 4
Akr1d1
1.64
10.18
10.25
Grk4
0.61
4.57
9.86
Fut2
LOC685020
1.14
1.72
5.31
10.32
9.83
9.74
AW433528
AI010736
fucosyltransferase 2 (secretor status included)
Similar to paired immunoglobin-like type 2 receptor
alpha
EST
EST
–
–
1.02
1.13
5.75
6.35
9.32
9.10
NM_024365
NM_001033073
5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 6
defensin alpha-related sequence 1
Htr6
Defa-rs1
1.15
1.05
14.58
6.78
8.69
8.61
AI233574
NM_001135807
EST
H2A histone family, member Y2
–
H2afy2
1.74
1.45
4.29
3.10
8.20
8.06
NM_139184
NM_001141935
proline-rich glycoprotein (sgp158)
ATPase, class V, type 10A
Sgp158
Atp10a
1.77
1.50
6.77
7.61
7.93
7.67
XM_001061900
NM_001106689
histone cluster 1, H4m
Zinc finger protein 593
Hist1h4m
Znf593
1.87
1.01
5.14
5.07
7.57
7.45
NM_001009920
NM_001191758
glutathione S-transferase Yc2 subunit
cache domain containing 1
Gsta5
Cachd1
1.03
1.19
2.42
6.53
7.39
7.22
AA893390
XM_001058380
EST
Hypothetical protein LOC680687
–
LOC680687
0.54
1.44
2.68
5.41
7.19
7.16
BE119818
XR_085609
EST
hypothetical LOC100363796
–
LOC100363796
1.35
0.92
7.87
2.13
7.12
7.07
AI598332
NM_147213
EST
alpha-2u globulin PGCL5
–
LOC259245
1.02
1.98
2.19
3.02
6.96
6.93
NM_001033964
1.92
6.05
6.89
BF410174
6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase Pfkfb2
2
EST
–
1.09
2.76
6.86
XR_085950
BI282568
similar to Gene model 784
keratinocyte differentiation associated protein
RGD1561693
Krtdap
1.51
1.18
5.62
5.46
6.85
6.83
BF420118
AI008553
EST
EST
–
–
1.07
1.88
4.91
3.64
6.74
6.71
NM_001025417
AA850953
actin-like 7b
EST
Actl7b
–
1.66
0.78
6.41
10.18
6.71
6.61
XM_001059437
Methyl-CpG binding domain protein 4
Mbd4
1.97
5.69
6.58
NM_022928
NM_031635
XM_001061953
123
NM_022213
Pik3r3
0.86
2.82
6.50
BF545930
phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 3
(gamma)
EST
–
0.89
3.20
6.27
NM_001025661
XM_001081628
crumbs homolog 3
SRY-box containing gene 9
Crb3
Sox9
1.70
1.39
4.61
3.18
6.19
6.17
NM_181378
AA800583
cathepsin M
EST
Ctsm
–
1.12
1.21
7.07
4.46
6.14
6.05
NM_031688
NM_012873
synuclein, gamma (breast cancer-specific protein 1) Sncg
protamine 2
Prm2
0.97
1.71
4.50
2.15
6.05
5.92
BF409344
NM_053851
EST
–
calcium channel, voltage-dependent, beta 2 subunit Cacnb2
1.15
1.42
2.94
3.55
5.84
5.70
NM_133536
AI763952
RAB3C, member RAS oncogene family
EST
Rab3c
–
1.00
1.08
2.31
6.14
5.68
5.66
NM_001109289
BM389765
similar to RIKEN cDNA 1700012B09
EST
RGD1561795
–
1.05
1.19
2.20
2.72
5.59
5.56
AW536017
XM_001066684
EST
similar to ovostatin-2
–
RGD1565709
1.49
1.19
3.52
6.73
5.55
5.55
NM_001013994
XR_085857
REST corepressor 2
similar to Kiaa0575
Rcor2
RGD1564091
1.92
1.60
2.91
2.16
5.53
5.49
NM_001025713
NM_012566
similar to melanoma antigen family A, 10
MGC114529
growth factor independent 1 transcription repressor Gfi1
0.92
1.50
2.04
2.54
5.39
5.38
AI639396
XM_578186
EST
Similar to C20orf118
–
RGD1561343
1.07
1.95
4.82
4.37
5.37
5.35
NM_001108069
NM_022628
serine/threonine kinase 11
nephrosis 1 homolog
Stk11
Nphs1
1.23
0.86
10.93
2.22
5.32
5.27
BF399795
BF416438
EST
EST
–
–
1.38
1.20
4.48
2.29
5.26
5.24
BE113044
NM_023968
EST
neuropeptide Y receptor Y2
–
Npy2r
1.09
1.65
2.57
3.58
5.22
5.22
NM_001106544
1.09
3.04
5.22
NM_183334
dolichyl-phosphate mannosyltransferase polypeptide Dpm1
1, catalytic subunit
lactate dehydrogenase A-like 6B
Ldhal6b
1.25
2.28
5.21
NM_053753
AW528716
C-type lectin domain family 4, member f
EST
Clec4f
–
1.04
0.88
2.24
3.32
5.21
5.19
NM_022599
BE114170
synaptojanin 2 binding protein
EST
Synj2bp
–
0.88
1.18
7.00
4.22
5.14
5.09
BE115208
NM_017265
–
Hsd3b6
1.15
0.68
3.73
3.84
5.04
5.03
BE102060
XM_002727806
EST
hydroxy-delta-5-steroid dehydrogenase, 3 beta- and
steroid delta-isomerase 6
EST
homeobox B2
–
LOC100361765
1.56
1.50
4.90
2.36
5.02
5.01
BF391102
AI556639
EST
EST
–
–
1.02
1.76
3.92
2.47
5.00
4.98
BG374590
NM_001108398
EST
Hyaluronan and proteoglycan link protein 4
–
Hapln4
0.86
1.80
2.10
2.66
4.97
4.96
BG375582
BE100632
EST
EST
–
–
1.12
1.72
2.30
4.77
4.96
4.95
XM_001059736
NM_012540
similar to chromosome 9 open reading frame 5
RGD1308958
cytochrome P450, family 1, subfamily a, polypeptide Cyp1a1
1
EST
–
0.66
0.92
3.28
3.18
4.90
4.89
0.94
5.21
4.88
BF414994
124
NM_001109363
NM_031813
RAB17, member RAS oncogene family
myosin binding protein H
Rab17
Mybph
0.93
0.86
4.36
2.49
4.84
4.82
NM_001109607
XM_001067323
histidine triad nucleotide binding protein 1
Hypothetical protein LOC688535
Hint1
LOC688535
0.97
1.58
4.29
2.26
4.80
4.77
AI044342
NM_001109124
EST
Coiled-coil domain containing 112
–
Ccdc112
1.01
0.70
3.95
3.67
4.77
4.77
NM_001109024
BF403436
DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C, member 30
EST
Dnajc30
–
1.49
1.18
2.12
7.28
4.77
4.75
NM_001033860
Ceacam1
0.72
4.52
4.74
Tomm40b
0.83
5.21
4.74
–
Phlda1
1.27
1.32
2.67
2.91
4.72
4.72
BF409856
NM_031538
carcinoembryonic antigen-related cell adhesion
molecule 1
translocase of outer mitochondrial membrane 40
homolog B
EST
pleckstrin homology-like domain, family A, member
1
EST
CD8a molecule
–
Cd8a
1.54
0.98
4.94
2.40
4.70
4.70
XM_001080252
BM385451
similar to Complement C5 precursor
EST
RGD1308742
–
1.15
1.19
11.97
3.31
4.66
4.63
AI059958
NM_001108066
EST
AT rich interactive domain 3A (Bright like)
–
Arid3a
1.27
1.05
3.34
3.93
4.62
4.62
NM_001025274
NM_001108550
splicing factor, arginine/serine-rich 18
periostin, osteoblast specific factor
Sfrs18
Postn
0.43
0.51
2.90
5.03
4.61
4.60
NM_019345
Slc12a3
0.53
4.51
4.59
AI113313
solute carrier family 12 (sodium/chloride
transporters), member 3
EST
–
1.43
7.47
4.55
BE099423
NM_181364
EST
thyrotropin releasing hormone receptor 2
–
Trhr2
1.40
1.10
3.54
3.08
4.52
4.47
AI412543
BF284535
EST
EST
–
–
0.95
1.41
4.54
4.57
4.45
4.44
BE099881
NM_022696
EST
Heart and neural crest derivatives expressed 2
–
Hand2
0.88
0.88
2.34
4.27
4.44
4.42
NM_001105920
AI555247
alkB, alkylation repair homolog 4
EST
Alkbh4
–
1.16
1.02
2.44
4.64
4.42
4.42
BE113549
X76129
EST
EST
–
–
1.28
1.66
4.81
3.50
4.38
4.38
BF408794
BE097095
EST
EST
–
–
1.36
0.97
5.24
2.71
4.37
4.37
NM_001100659
BF415420
CDC23 (cell division cycle 23)
EST
Cdc23
–
1.97
0.85
4.07
2.37
4.36
4.35
NM_173321
NM_001037357
LOC286987
Lilrb3l
1.03
1.50
3.34
5.33
4.35
4.32
NM_001109892
NM_021659
hemiferrin, transferrin-like protein
leukocyte immunoglobulin-like receptor, subfamily
B (with TM and ITIM domains), member 3-like
fibroblast growth factor receptor 2
synaptotagmin VII
Fgfr2
Syt7
1.26
0.69
2.70
4.49
4.30
4.30
NM_001166020
NM_001025115
E030032D13Rik gene
signal transducing adaptor family member 1
E030032D13Rik
Stap1
1.67
1.18
4.31
2.43
4.29
4.27
NM_001164396
BF405078
similar to 20-alpha-hydroxysteroid dehydrogenase
EST
RGD1564865
–
0.69
0.77
2.83
2.52
4.27
4.27
NM_001079712
AA997287
lysine (K)-specific demethylase 4D
EST
Kdm4d
–
1.54
1.62
2.38
3.41
4.27
4.26
XM_001075943
ER degradation enhancer, mannosidase alpha-like 1 Edem1
1.49
4.15
4.21
NM_001083338
BF393107
NM_017180
125
BF404359
NM_021583
EST
prostaglandin E synthase
–
Ptges
1.98
0.67
3.42
3.48
4.21
4.21
NM_001101008
AI598405
Similar to Fgfr1 oncogene partner
EST
LOC683722
–
1.54
0.41
2.58
4.45
4.19
4.19
BF391867
BE106653
EST
EST
–
–
1.41
1.25
2.73
3.88
4.18
4.18
NM_031584
1.68
3.52
4.15
BE097012
solute carrier family 22 (organic cation transporter), Slc22a2
member 2
EST
–
1.46
5.57
4.14
AI716045
XM_002729840
EST
hypothetical protein LOC100362109
–
LOC100362109
1.36
1.26
5.80
3.02
4.14
4.14
AI639330
XM_001061311
EST
Hypothetical protein LOC681335
–
LOC681335
1.11
1.47
2.43
3.25
4.10
4.09
NM_001017497
BF410178
submaxillary gland androgen regulated protein 3A
EST
Smr3a
–
1.03
1.15
2.63
3.81
4.08
4.06
NM_134336
AI072279
neuroligin 3
EST
Nlgn3
–
1.62
1.10
3.28
2.85
4.04
4.03
AI113047
NM_001127659
EST
methionine-tRNA synthetase
–
Mars
1.17
1.33
3.08
3.33
4.03
4.01
NM_053914
St8sia4
1.35
4.05
4.01
NM_001108930
ST8 alpha-N-acetyl-neuraminide
alpha-2,8-sialyltransferase 4
pre-B lymphocyte 3
Vpreb3
1.26
3.88
4.01
BI850153
BI298075
EST
EST
–
–
1.26
0.72
8.13
3.51
4.00
3.98
XM_001076876
obscurin, cytoskeletal calmodulin and
titin-interacting RhoGEF
myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia
(trithorax homolog, Drosophila); translocated to, 4
EST
EST
Obscn
1.13
3.66
3.98
Mllt4
0.64
2.04
3.97
–
–
0.77
1.30
9.47
2.79
3.97
3.97
–
Agap2
1.61
0.95
2.59
4.54
3.96
3.96
BF390840
AI044004
EST
ArfGAP with GTPase domain, ankyrin repeat and
PH domain 2
EST
EST
–
–
1.33
1.39
3.07
2.00
3.94
3.94
AI555848
NM_173127
EST
protease, serine, 3
–
Prss3
1.31
0.84
2.08
3.81
3.94
3.93
BF405026
BM389444
EST
EST
–
–
1.23
1.90
3.13
5.68
3.90
3.89
XM_001054773
BF288845
ankyrin repeat domain 60
EST
Ankrd60
–
1.93
1.86
3.14
4.18
3.89
3.88
NM_019166
NM_001191916
synaptogyrin 1
Bromodomain adjacent to zinc finger domain, 1B
Syngr1
Baz1b
1.57
1.00
2.83
4.98
3.88
3.86
NM_012996
NM_001107194
oxytocin, prepropeptide
pogo transposable element with KRAB domain
Oxt
Pogk
0.91
1.72
4.78
3.27
3.86
3.83
AI548379
AI235868
EST
EST
–
–
1.07
0.89
2.55
2.70
3.83
3.81
NM_001100514
NM_019183
centrosomal protein 76kDa
actin, alpha, cardiac muscle 1
Cep76
Actc1
0.67
1.20
3.85
2.40
3.80
3.79
NM_001042579
NM_001107153
unc-13 homolog B
ubiquitin specific peptidase 30
Unc13b
Usp30
1.21
0.93
3.24
3.11
3.79
3.78
BE098450
EST
–
1.00
2.85
3.78
NM_013217
BF564328
BG380223
AI030975
NM_023026
126
NM_001082572
NM_001107867
Tripartite motif-containing 21
ATPase, H transporting, lysosomal V1 subunit B1
Trim21
Atp6v1b1
1.89
0.94
3.20
3.05
3.77
3.77
NM_138975
NM_001039338
WW domain binding protein 2
Zinc finger, DHHC-type containing 5
Wbp2
Zdhhc5
1.65
0.79
3.66
3.64
3.77
3.76
BI302053
NM_031713
–
Lilrb3
1.35
0.97
2.80
10.23
3.76
3.76
XM_002725948
BF284722
EST
leukocyte immunoglobulin-like receptor, subfamily
B (with TM and ITIM domains), member 3
hypothetical protein LOC100360513
EST
LOC100360513
–
1.17
1.70
2.59
6.20
3.76
3.75
AW915304
NM_001100852
EST
zinc finger protein 746
–
Znf746
1.39
0.72
3.76
3.93
3.74
3.74
BF397286
BF410377
EST
EST
–
–
1.00
1.83
2.61
2.24
3.73
3.73
NM_001005877
BI282060
free fatty acid receptor 2
EST
Ffar2
–
1.09
1.21
5.88
2.19
3.73
3.73
NM_031804
BE105421
cytokine inducible SH2-containing protein
EST
Cish
–
1.84
0.61
2.64
2.84
3.72
3.72
AA956474
NM_053789
EST
interleukin 17B
–
Il17b
0.68
1.69
3.47
3.07
3.72
3.70
AI043832
NM_001191725
EST
Myotubularin related protein 1
–
Mtmr1
0.97
1.64
2.44
2.10
3.69
3.69
NM_017102
Slc2a3
1.98
4.42
3.68
AI044912
solute carrier family 2 (facilitated glucose
transporter), member 3
EST
–
1.24
2.96
3.68
BF396101
NM_001110099
EST
ret proto-oncogene
–
Ret
1.00
1.67
3.86
4.48
3.68
3.67
NM_147144
AA963295
cancer susceptibility candidate 3
EST
Casc3
–
1.26
1.13
2.82
4.60
3.67
3.65
NM_031739
Kcnd3
0.96
3.75
3.64
NM_001191692
potassium voltage-gated channel, Shal-related
subfamily, member 3
leucine rich repeat containing 16A
Lrrc16a
1.18
2.30
3.63
AA946053
NM_172157
EST
AT rich interactive domain 1B (Swi1 like)
–
Arid1b
0.95
1.56
3.32
5.29
3.63
3.61
XM_001075996
AI555088
ring finger protein 207
EST
Rnf207
–
0.93
1.00
3.31
2.37
3.60
3.60
NM_001107087
BF399291
organic solute transporter alpha
EST
Ostalpha
–
1.44
1.50
2.76
3.38
3.59
3.59
NM_170667
NM_023103
Relaxin 3
murinoglobulin 1
Rln3
Mug1
1.06
1.80
3.19
3.00
3.58
3.57
AW527295
BF401303
EST
EST
–
–
1.04
1.90
2.01
4.34
3.56
3.56
AI030318
NM_001102403
EST
seminal vesicle secretory protein 6
–
Svs6
1.29
1.75
2.60
3.15
3.55
3.52
NM_001011947
BE114399
retinoic acid induced 14
EST
Rai14
–
1.35
0.88
2.11
2.94
3.51
3.51
NM_012531
XM_002726882
catechol-O-methyltransferase
rCG49027-like
Comt
LOC100362836
0.97
1.71
3.86
3.52
3.50
3.50
BF396390
NM_022684
EST
BH3 interacting domain death agonist
–
Bid
0.99
1.02
3.47
2.80
3.50
3.48
BF415758
NM_001191100
EST
Similar to RNA binding motif protein 24
–
LOC690139
0.86
1.45
3.96
3.04
3.47
3.46
127
BE098827
NM_031533
EST
UDP glycosyltransferase 2 family, polypeptide B
–
Ugt2b
0.87
1.26
3.25
3.18
3.46
3.46
XM_001055673
LOC685179
1.53
2.29
3.44
BI296600
Similar to SWI/SNF-related matrix-associated
actin-dependent regulator of chromatin c2
EST
–
1.63
2.20
3.43
NM_001108382
AFFX-TrpnX-3
coiled-coil domain containing 25
EST
Ccdc25
–
0.90
1.43
2.40
5.29
3.43
3.42
BF405278
U39571
EST
EST
–
–
0.88
0.80
2.57
2.47
3.42
3.42
BF401158
NM_001106207
EST
Myc target 1
–
Myct1
0.71
1.09
2.19
2.77
3.41
3.41
BF405941
NM_053953
EST
interleukin 1 receptor, type II
–
Il1r2
1.06
0.85
4.26
2.57
3.41
3.40
XM_001069222
NM_012524
Similar to KIAA1549 protein
CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), alpha
RGD1306271
Cebpa
1.30
0.95
3.23
2.63
3.38
3.36
BF386426
NM_017254
EST
5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 2A
–
Htr2a
0.99
1.13
2.50
3.26
3.35
3.34
BF410005
NM_001106319
EST
Cysteinyl-tRNA synthetase
–
Cars
0.52
1.15
4.13
4.23
3.33
3.31
NM_017093
AI072237
v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 2
EST
Akt2
–
1.07
1.16
2.91
2.27
3.30
3.29
NM_001107804
NM_153621
Molybdenum cofactor synthesis 3
disabled homolog 1
Mocs3
Dab1
1.12
0.45
3.19
2.85
3.28
3.28
NM_001008831
NM_031538
RT1 class II, locus Ba
CD8a molecule
RT1-Ba
Cd8a
1.25
0.99
2.26
4.37
3.27
3.27
AI144892
NM_012849
EST
gastrin
–
Gast
1.32
1.10
4.44
3.30
3.26
3.26
NR_026689
NM_001008297
LOC686120
RGD1305689
1.55
1.01
2.75
3.20
3.26
3.25
Timm44
1.26
5.17
3.25
BG373668
hypothetical protein LOC686120
similar to DNA segment, Chr 14, ERATO Doi 449,
expressed
Translocase of inner mitochondrial membrane 44
homolog
EST
–
1.86
4.09
3.25
XR_005459
NM_139085
similar to inter-alpha-inhibitor H2 chain
cystatin 11
LOC498793
Cst11
1.58
1.26
2.06
3.27
3.25
3.24
NM_012715
AI555339
adrenomedullin
EST
Adm
–
1.22
1.48
2.01
2.29
3.24
3.23
NM_001108463
AI638966
radial spokehead-like 2
EST
Rshl2
–
1.75
0.78
2.87
2.71
3.22
3.22
NM_173135
NM_001010970
amiloride-sensitive cation channel 3
amylase, alpha 1A
Accn3
Amy1a
0.91
0.39
2.06
23.87
3.21
3.21
NM_001008758
NM_001106506
keratin 34
nephronophthisis 1 (juvenile) homolog
Krt34
Nphp1
1.30
1.50
2.57
2.07
3.21
3.20
BF404936
NM_001013159
EST
formin binding protein 4
–
Fnbp4
1.03
1.77
2.73
2.27
3.20
3.20
NM_001127652
BF288361
creatine kinase, mitochondrial 2, sarcomeric
EST
Ckmt2
–
1.30
0.93
2.36
2.41
3.19
3.19
NM_021659
AI555284
synaptotagmin VII
EST
Syt7
–
1.04
1.36
2.92
4.89
3.19
3.18
NM_001012355
NM_021584
Sumo1/sentrin/SMT3 specific peptidase 8
doublecortin-like kinase 1
Senp8
Dclk1
0.95
1.11
2.42
3.98
3.18
3.18
NM_017267
128
BF410736
NM_207605
EST
SH2 domain protein 2A
–
Sh2d2a
0.67
1.19
3.05
2.84
3.18
3.17
BE110921
BM385125
EST
EST
–
–
1.32
0.73
2.04
3.06
3.17
3.17
BG378715
NM_134327
EST
Cd69 molecule
–
Cd69
0.94
1.23
2.36
2.16
3.17
3.16
AW532385
BI273836
EST
EST
–
–
0.82
1.75
2.97
2.03
3.16
3.16
NM_053291
NM_001012181
phosphoglycerate kinase 1
E74-like factor 2
Pgk1
Elf2
0.56
1.29
4.09
2.19
3.15
3.15
BF291108
NM_012568
EST
glycine receptor, alpha 2
–
Glra2
1.82
1.84
2.74
2.42
3.14
3.14
NM_022393
AA955985
C-type lectin domain family 10, member A
EST
Clec10a
–
1.39
1.12
3.45
2.45
3.13
3.13
NM_001108238
BI292034
ankyrin repeat domain 12
EST
Ankrd12
–
0.86
1.43
3.47
2.46
3.12
3.12
NR_002151
XM_001069306
RT1 class I, locus T24, gene 2
zinc finger CCCH-type, antiviral 1-like
RT1-T24-2
Zc3hav1l
1.43
1.52
5.16
2.83
3.11
3.11
NM_001105727
1.00
3.33
3.11
BF401649
proteasome (prosome, macropain) subunit, beta type Psmb5
5
EST
–
1.38
2.94
3.10
BF419542
NM_001108880
EST
BARX homeobox 1
1.57
1.17
3.79
3.72
3.09
3.09
NM_001009497
0.51
3.19
3.09
BF400860
killer cell lectin-like receptor, subfamily A, member Klra17
17
EST
–
1.14
2.48
3.09
AI013206
NM_173300
EST
olfactory receptor 1271
–
Olr1271
1.69
1.68
2.81
4.11
3.08
3.08
NM_001010970
NM_013193
amylase, alpha 1A
neurofibromin 2
Amy1a
Nf2
1.20
1.61
8.40
3.08
3.08
3.08
AI072079
XM_001078877
EST
genetic suppressor element 1
–
Gse1
1.67
0.95
2.34
2.79
3.07
3.07
BM389874
NM_001134341
EST
ischemia related factor NYW-1
–
Nyw1
1.38
0.77
3.03
2.76
3.06
3.06
NM_024401
NM_001009494
Avil
Klra5
1.76
1.61
2.74
2.31
3.06
3.05
NM_022933
AI169247
advillin
killer cell lectin-like receptor, subfamily A, member
5
chromodomain helicase DNA binding protein 8
EST
Chd8
–
1.16
0.95
5.84
2.45
3.04
3.04
AW433964
NM_153621
EST
Disabled homolog 1
–
Dab1
0.90
0.91
2.16
2.61
3.03
3.02
BF394624
NM_001173434
EST
hemochromatosis
–
Hfe
0.70
1.16
2.04
2.15
3.02
3.01
AW534610
NM_031545
EST
natriuretic peptide precursor B
–
Nppb
0.77
0.51
3.07
2.36
3.01
3.01
BM391972
NM_173130
EST
vomeronasal 2 receptor, 27
–
Vom2r27
1.76
1.25
3.92
3.70
3.00
3.00
BF396142
NM_031140
EST
vimentin
–
Vim
1.33
1.65
2.53
2.82
2.99
2.99
NM_001033958
NM_022253
alpha-2u globulin PGCL4
Csk binding protein
Obp3
Cbp
1.68
0.78
2.79
3.54
2.99
2.98
–
Barx1
129
NM_024160
XM_002725069
cytochrome b-245, alpha polypeptide
hypothetical protein LOC100364843
Cyba
LOC100364843
0.93
1.11
3.21
3.10
2.98
2.97
NM_053871
NM_001109530
Srp54a
Spdef
1.48
1.22
2.79
2.09
2.96
2.96
AI231651
XM_001078167
signal recognition particle 54a
SAM pointed domain containing ets transcription
factor
EST
Similar to CG9646-PA
–
RGD1304694
0.97
1.12
2.31
4.83
2.96
2.95
AA963477
NM_001107291
EST
inter-alpha trypsin inhibitor, heavy chain 1
–
Itih1
0.97
0.88
2.33
3.37
2.94
2.94
BF419668
XM_001061208
EST
similar to ribosomal protein S12
–
LOC680988
1.17
1.58
2.18
2.03
2.94
2.94
BF290383
NM_031141
EST
paired box 8
–
Pax8
1.15
1.27
3.06
2.30
2.94
2.94
NM_199107
NM_001109070
Glycosyltransferase-like 1B
golgi transport 1 homolog A
Gyltl1b
Golt1a
1.19
1.60
2.22
2.23
2.93
2.93
NM_139041
BF393928
mucin 13, cell surface associated
EST
Muc13
–
1.03
0.99
2.36
2.42
2.92
2.92
NM_181365
NM_207593
Kv channel interacting protein 4
prostatic steroid-binding protein C2
Kcnip4
Psbpc2
1.78
0.75
3.43
2.80
2.92
2.91
NM_053312
NM_001009624
Dbt
Ska2
0.86
1.15
2.14
4.34
2.91
2.90
BE101809
XR_007893
dihydrolipoamide branched chain transacylase E2
Spindle and kinetochore associated complex subunit
2
EST
similar to TICAM-1
–
LOC363328
0.94
1.07
2.30
2.31
2.89
2.88
NM_019321
AI072437
mast cell protease 4
EST
Mcpt4
–
1.06
0.65
6.31
2.84
2.88
2.88
NM_013097
BF394493
deoxyribonuclease I
EST
Dnase1
–
1.40
1.13
3.95
2.37
2.87
2.87
NM_001034931
NM_022235
Pkhd1l1
Kcne3
0.84
0.92
2.20
2.91
2.87
2.87
AA859889
AI071526
polycystic kidney and hepatic disease 1-like 1
potassium voltage-gated channel, Isk-related
subfamily, gene 3
EST
EST
–
–
1.93
1.76
3.38
2.37
2.86
2.86
NM_138504
NM_001025411
oxidative stress induced growth inhibitor 1
DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily A, member 4
Osgin1
Dnaja4
1.13
1.18
3.08
3.96
2.85
2.85
AI229471
XR_009042
EST
similar to RGD, leucine-rich repeat, tropomodulin
and proline-rich containing protein
EST
leukotriene B4 receptor 2
–
RGD1562390
1.76
1.85
2.08
2.37
2.85
2.84
–
Ltb4r2
1.00
1.35
2.13
2.89
2.84
2.84
Lrig3
1.13
2.15
2.83
BE108754
leucine-rich repeats and immunoglobulin-like
domains 3
EST
–
1.10
3.07
2.83
NM_001108559
AI045029
PRP3 pre-mRNA processing factor 3 homolog
EST
Prpf3
–
1.36
1.39
5.13
3.17
2.82
2.82
NM_020097
NM_001109541
exostoses (multiple)-like 3
DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 2
Extl3
Dnajb2
0.97
1.03
2.02
5.85
2.82
2.81
NM_053644
NM_017047
cadherin 23 (otocadherin)
solute carrier family 10 (sodium/bile acid
cotransporter family), member 1
Similar to Myeloid/lymphoid or mixed-lineage
leukemia protein 3 homolog (Histone-lysine
N-methyltransferase, H3 lysine-4 specific MLL3)
Cdh23
Slc10a1
0.80
0.72
2.47
2.42
2.80
2.80
LOC502710
0.93
2.38
2.79
AI763894
NM_053640
XM_001055013
XR_006158
130
NM_031588
AI578317
neuregulin 1
EST
Nrg1
–
0.82
1.49
2.44
2.10
2.79
2.79
BF400683
AI072041
EST
EST
–
–
0.84
0.95
5.55
4.60
2.79
2.78
AW921479
BM390376
EST
EST
–
–
1.73
0.98
2.45
3.45
2.77
2.76
BF403678
AW142608
EST
EST
–
–
1.12
1.01
3.00
2.76
2.76
2.75
AA957926
NM_001126303
EST
ubiquitin specific protease 43
–
Usp43_predicted
1.02
0.84
3.08
2.70
2.74
2.74
NM_212459
AI045025
ADP-ribosylation factor-like 9
EST
Arl9
–
0.36
0.68
2.13
2.28
2.74
2.74
AI071595
BF394024
EST
EST
–
–
0.88
1.24
2.49
2.80
2.73
2.72
NM_001130551
NM_017078
similar to secreted Ly6/uPAR related protein 2
cholinergic receptor, nicotinic, alpha 5
RGD1308195
Chrna5
0.85
1.18
2.33
2.19
2.72
2.72
NM_053613
NM_053724
reticulon 4 receptor
glycine receptor, alpha 3
Rtn4r
Glra3
0.99
1.15
2.88
2.05
2.72
2.71
AI600230
BE113971
EST
EST
–
–
1.17
0.96
3.77
2.44
2.71
2.71
BF410456
AW530928
EST
EST
–
–
1.17
1.02
2.49
4.05
2.70
2.70
NM_001002827
NM_001108652
Notch homolog 4
similar to hypothetical protein DKFZp761D0211
Notch4
RGD1306151
1.10
1.18
4.25
2.73
2.70
2.70
AT005664
AW251681
EST
EST
–
–
1.03
1.16
2.20
3.92
2.69
2.69
NM_012511
NM_001011892
Atp7b
Serpinf2
1.34
1.10
2.84
2.20
2.69
2.69
AI103351
NM_001107823
ATPase, Cu++ transporting, beta polypeptide
serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade F,
member 2
EST
growth factor independent 1B transcription repressor
–
Gfi1b
0.43
0.95
2.22
2.44
2.68
2.68
BF412962
BF400135
EST
EST
–
–
1.60
0.70
4.74
2.68
2.67
2.67
BE097058
XM_002725301
–
LOC100360100
0.74
1.52
3.03
3.62
2.67
2.67
NM_019359
AI232217
EST
TAF3 RNA polymerase II, TATA box binding
protein (TBP)-associated factor
Calponin 3, acidic
EST
Cnn3
–
1.11
1.04
3.64
2.65
2.67
2.67
NM_012553
NM_001004022
chymotrypsin-like elastase family, member 2A
keratin 15
Cela2a
Krt15
0.67
1.17
2.63
2.17
2.67
2.67
NM_001025641
AI385279
pregnancy-specific glycoprotein 29
EST
Psg29
–
1.67
1.32
4.16
2.67
2.67
2.66
BF387484
BF404369
EST
EST
–
–
0.93
0.99
2.48
2.13
2.66
2.66
NM_001013065
NM_138861
gametogenetin
Prolactin family 2, subfamily b, member 1
Ggn
Prl2b1
1.09
0.89
2.70
2.80
2.65
2.65
NM_012944
AW917217
dopamine receptor D4
EST
Drd4
–
0.46
0.95
4.21
4.17
2.64
2.64
XM_001070946
NM_012813
similar to class-alpha glutathione S-transferase
ST8 alpha-N-acetyl-neuraminide
alpha-2,8-sialyltransferase 1
RGD1562107
St8sia1
1.36
1.02
2.26
3.22
2.64
2.64
131
XM_002727399
NM_001013098
paired immunoglobin-like type 2 receptor alpha
dehydrogenase/reductase (SDR family) member 7
Pilra
Dhrs7
1.23
0.57
2.06
2.42
2.63
2.63
BE120674
NM_001017480
EST
homeo box B7
–
Hoxb7
0.96
1.18
2.31
2.74
2.63
2.62
NM_001030029
NM_019292
COMM domain containing 7
carbonic anhydrase 3
Commd7
Car3
1.00
1.15
2.21
2.01
2.62
2.61
NM_001106972
NM_001108271
Similar to CG4768-PA
LOC360508
RGD1309748
RGD1306625
1.49
1.72
2.70
2.24
2.61
2.61
BF404505
BE106136
EST
EST
–
–
1.00
0.99
2.79
2.19
2.60
2.60
NM_080768
NM_022631
tachykinin receptor 2
wingless-type MMTV integration site family,
member 5A
THAP domain containing 11
EST
Tacr2
Wnt5a
1.42
1.72
2.37
2.38
2.60
2.60
Thap11
–
1.30
1.38
2.19
2.89
2.60
2.59
Klk1c10
Cacng1
0.75
1.90
2.43
4.50
2.59
2.59
AI235078
BF413876
T-kininogenase
calcium channel, voltage-dependent, gamma subunit
1
EST
EST
–
–
1.17
0.77
2.16
2.35
2.59
2.58
NM_001135157
XM_002727932
myosin, heavy chain 2, skeletal muscle
F-box and WD repeat domain containing 7-like
Myh2
LOC100361588
1.49
0.93
3.72
3.01
2.57
2.56
BF403846
BI300244
EST
EST
–
–
0.95
0.87
2.98
2.97
2.56
2.56
AI069951
NM_053822
EST
S100 calcium binding protein A8
–
S100a8
1.08
1.74
2.06
2.01
2.55
2.55
NM_001004131
NM_022239
Keratin 24
neuromedin U
Krt24
Nmu
1.67
0.60
2.61
2.89
2.55
2.55
NM_053706
NM_021586
Dmrt1
Ltbp2
0.77
0.88
2.88
2.30
2.55
2.54
LOC100364813
1.00
2.49
2.54
NM_001106257
doublesex and mab-3 related transcription factor 1
latent transforming growth factor beta binding
protein 2
solute carrier family 25 (mitochondrial carrier;
adenine nucleotide translocator), member 31-like
myosin binding protein C, fast-type
Mybpc2
1.00
2.53
2.54
AA859673
NM_001109556
EST
ovary-specific acidic protein
–
Osap
0.89
1.22
3.20
2.11
2.54
2.53
BF418099
BF405181
EST
EST
–
–
1.20
1.19
2.52
2.09
2.53
2.53
NM_001106196
UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polypeptide
N-acetylgalactosaminyltransferase 2 (GalNAc-T2)
Galnt2
0.93
3.57
2.53
NM_020081
NM_022582
CD86 molecule
lectin, galactoside-binding, soluble, 7
Cd86
Lgals7
1.23
1.99
2.34
3.22
2.53
2.53
H33294
NM_001034943
–
Slc22a12
1.11
1.54
2.78
2.78
2.53
2.53
NM_001106067
AA893234
EST
solute carrier family 22 (organic anion/urate
transporter), member 12
glycosyltransferase 25 domain containing 1
EST
Glt25d1
–
0.74
1.10
2.77
2.45
2.53
2.52
BF561222
AI071607
EST
EST
–
–
1.05
1.72
3.86
2.12
2.52
2.52
NM_001012047
NM_001024764
biotinidase
solute carrier family 36 (proton/amino acid
symporter), member 3
Btd
Slc36a3
1.68
1.48
2.83
3.57
2.52
2.52
NM_001107422
BI296703
NM_001135173
NM_019255
XM_002725935
132
NM_053419
NM_001107033
synergin, gamma
T-box 2
Synrg
Tbx2
1.49
1.64
2.38
2.83
2.52
2.52
NM_001111115
NM_012530
brain-enriched guanylate kinase-associated
creatine kinase, muscle
Begain
Ckm
1.31
1.31
2.24
2.17
2.51
2.51
AI071958
AI599545
EST
EST
–
–
0.98
1.14
2.48
2.34
2.50
2.50
XM_001076431
NM_145088
sin3A-binding protein, SAP25
mammary cancer associated protein RMT-1
Sap25
Rmt1
1.33
1.68
2.28
2.23
2.50
2.50
NM_031632
NM_001109912
caspase 9, apoptosis-related cysteine peptidase
TSC22 domain family, member 1
Casp9
Tsc22d1
1.60
0.86
2.24
3.22
2.50
2.49
NM_012596
NM_138874
leptin receptor
casein alpha s1
Lepr
Csn1s1
1.46
1.33
2.10
2.15
2.49
2.49
BF393838
NM_001006990
EST
cell adhesion molecule JCAM
–
LOC304000
1.34
1.21
2.48
2.89
2.49
2.49
NM_012718
NM_001106841
androgen regulated 20 kDa protein
Mitochondrial translation optimization 1 homolog
Andpro
Mto1
1.12
1.90
3.15
2.15
2.48
2.48
NM_138977
NM_012879
Prokr1
Slc2a2
1.02
1.16
2.51
2.06
2.48
2.48
BM391896
AA893682
prokineticin receptor 1
solute carrier family 2 (facilitated glucose
transporter), member 2
EST
EST
–
–
0.72
1.09
2.13
2.46
2.47
2.47
BF401574
NM_001107133
EST
GRB10 interacting GYF protein 1
–
Gigyf1
0.82
1.16
3.30
2.24
2.47
2.46
NM_001014008
AI058733
asporin
EST
Aspn
–
1.08
1.38
3.61
2.87
2.46
2.46
NM_080581
ATP-binding cassette, sub-family C (CFTR/MRP),
member 3
EST
Abcc3
0.95
2.37
2.45
–
AA943800
1.14
2.95
2.44
1.30
2.09
2.43
NM_001191567
cytochrome P450, family 2, subfamily c, polypeptide Cyp2c22
22
Golgi integral membrane protein 4
Golim4
0.81
2.53
2.42
XM_001070024
NM_001108396
similar to Cystatin S precursor (LM protein)
ARP8 actin-related protein 8 homolog
LOC100365949
Actr8
1.57
0.85
3.95
2.68
2.42
2.42
NM_001191609
NM_017288
laminin, alpha 5
sodium channel, voltage-gated, type I, beta
Lama5
Scn1b
0.94
0.89
2.09
2.08
2.42
2.42
BF404398
BF390565
EST
EST
–
–
1.59
1.15
2.05
2.30
2.42
2.42
AA894070
AA955079
EST
EST
–
–
0.69
1.60
2.40
2.42
2.42
2.41
BE106256
AA875586
EST
EST
–
–
0.92
1.02
2.71
2.28
2.41
2.41
NM_001108137
NM_001025065
membrane frizzled-related protein
angiopoietin-like 3
Mfrp
Angptl3
1.15
0.98
2.60
3.08
2.41
2.41
NM_001013904
1.67
3.07
2.40
BF401148
cytochrome P450, family 2, subfamily c, polypeptide Cyp2c6
6
EST
–
1.38
3.28
2.40
AA964652
AI008432
EST
EST
–
–
0.95
0.87
5.15
2.21
2.40
2.40
BF401468
AA892778
EST
EST
–
–
0.94
0.48
2.13
2.50
2.40
2.40
NM_053394
Kruppel-like factor 5
Klf5
1.60
2.46
2.39
NM_138512
133
BF283420
BE119143
EST
EST
–
–
0.90
1.02
2.21
4.14
2.39
2.39
BI296715
NM_176074
EST
complement component 6
–
C6
1.68
1.46
2.08
2.24
2.39
2.39
NM_001137645
AI113302
FYVE, RhoGEF and PH domain containing 6
EST
Fgd6
–
1.19
1.17
2.30
2.31
2.38
2.38
AI103536
BF393042
EST
EST
–
–
0.37
1.37
2.09
2.72
2.37
2.37
NM_023969
NM_001105776
lysophosphatidic acid receptor 3
forkhead box I1
Lpar3
Foxi1
1.45
1.09
4.37
2.05
2.37
2.37
NM_030873
NM_022592
profilin 2
transketolase
Pfn2
Tkt
1.02
1.25
2.79
2.85
2.37
2.36
NM_024395
NM_001024273
Htr5b
Cmah
1.75
1.17
2.13
2.40
2.36
2.36
NM_017254
BF416353
5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 5B
cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid
hydroxylase
5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 2A
EST
Htr2a
–
1.14
1.02
2.13
3.27
2.36
2.35
NM_144751
XM_001069443
resection-induced TPI (rs11)
forkhead box E3
LOC246267
Foxe3
1.12
0.84
2.27
2.38
2.35
2.35
NM_031982
1.22
2.56
2.35
BE111113
transient receptor potential cation channel, subfamily Trpv1
V, member 1
EST
–
1.03
2.09
2.34
NM_019241
NM_012790
gap junction protein, beta 5
dentin sialophosphoprotein
Gjb5
Dspp
1.29
1.42
3.71
2.03
2.34
2.33
AI008973
NM_001109474
EST
EST
–
–
1.39
1.26
2.31
3.86
2.33
2.32
BG376806
XM_001077495
EST
Nuclear receptor co-repressor 1
–
Ncor1
1.15
0.69
2.76
2.28
2.32
2.32
NM_023971
BI291303
dystrophin related protein 2
EST
Drp2
–
1.04
1.36
2.80
3.24
2.32
2.31
XM_001079649
NM_022384
Similar to KIAA2026 protein
Achaete-scute complex homolog 1
RGD1311595
Ascl1
1.05
1.51
2.38
2.53
2.31
2.31
NM_031705
NM_080580
dihydropyrimidinase
RAB3D, member RAS oncogene family
Dpys
Rab3d
0.89
0.95
2.03
3.17
2.31
2.31
NM_053502
ATP-binding cassette, sub-family G (WHITE),
member 1
EST
Abcg1
1.27
2.58
2.31
–
1.13
3.67
2.31
Dci
1.01
2.92
2.30
NM_001013064
dodecenoyl-Coenzyme A delta isomerase (3,2
trans-enoyl-Coenzyme A isomerase)
F-box protein 17
Fbxo17
0.52
2.47
2.30
BF400669
NM_031028
EST
gamma-aminobutyric acid (GABA) B receptor 1
–
Gabbr1
1.11
1.02
2.02
2.08
2.30
2.30
NM_031538
BF388435
CD8a molecule
EST
Cd8a
–
1.48
1.84
2.04
3.28
2.29
2.29
NM_001106670
NM_001106711
complement component 8, alpha polypeptide
Centromere protein A
C8a
Cenpa
1.14
1.80
2.07
3.41
2.28
2.28
BF398910
NM_138918
–
Ss18l1
0.98
1.30
2.36
3.80
2.28
2.27
NM_012877
NM_001130510
EST
synovial sarcoma translocation gene on chromosome
18-like 1
sodium channel, voltage-gated, type II, beta
DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 7
Scn2b
Dnajb7
1.02
1.40
3.32
4.09
2.27
2.27
NM_022859
cysteine-rich secretory protein 1
Crisp1
1.19
2.36
2.26
AW531919
NM_017306
134
BF561222
AA964735
EST
EST
–
–
1.06
1.52
3.56
2.05
2.25
2.25
NM_001012209
AI172180
ribonuclease, RNase A family, 12 (non-active)
EST
Rnase12
–
1.02
0.70
2.40
2.02
2.25
2.25
AW530665
BF418127
EST
EST
–
–
1.85
0.87
3.41
3.95
2.24
2.24
NM_032070
NM_001134595
high mobility group AT-hook 2
solute carrier family 26, member 10
Hmga2
Slc26a10
0.89
0.88
2.42
2.10
2.24
2.24
NM_001110345
NM_001107480
ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 1
striatin, calmodulin binding protein 4
Ube2v1
Strn4
0.93
1.74
3.16
4.79
2.24
2.23
NM_001015025
NM_001191665
serine/threonine kinase 38
Rab interacting lysosomal protein-like 1
Stk38
Rilpl1
0.86
1.21
2.45
2.52
2.23
2.23
NM_001106103
XM_001060972
osteoglycin
similar to RIKEN cDNA 1500015O10
Ogn
RGD1305645
0.97
1.22
3.88
2.01
2.23
2.23
BF412617
NM_031558
EST
steroidogenic acute regulatory protein
–
Star
0.85
1.70
2.23
2.07
2.22
2.22
BF288144
BF553125
EST
EST
–
–
1.09
0.74
2.42
2.57
2.22
2.22
NM_001134792
NM_001159493
similar to complement factor H-related protein
RGD1564614
glutamyl-tRNA synthetase 2 mitochondrial (putative) Ears2
1.42
0.87
2.33
2.03
2.22
2.22
NM_001014178
AW920931
family with sequence similarity 69, member B
EST
Fam69b
–
1.45
1.78
3.70
2.57
2.22
2.22
NM_019302
AI103612
v-crk sarcoma virus CT10 oncogene homolog
EST
Crk
–
1.13
1.68
2.71
2.32
2.21
2.21
XM_002730008
BF411180
translocating chain-associating membrane protein 2 LOC100361830
EST
–
1.56
1.18
2.36
2.22
2.20
2.20
AA943548
AI548331
EST
EST
–
–
1.01
1.26
2.10
2.87
2.20
2.20
NM_024349
AI548652
adenylate kinase 1
EST
Ak1
–
0.79
0.93
2.01
2.06
2.19
2.19
NM_013028
NM_001106286
Short stature homeobox 2
lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1
Shox2
Lyve1
1.99
0.98
3.78
2.15
2.19
2.19
NM_001107250
NM_001008759
Zinc finger protein 503
keratin complex 1, acidic, gene 5
Znf503
Krt1-5
0.87
1.16
2.02
3.78
2.18
2.18
NM_001170466
NM_031828
Mcpt3
Kcnma1
1.01
1.03
2.23
2.29
2.18
2.18
NM_021670
NM_001106595
mast cell peptidase 3
potassium large conductance calcium-activated
channel, subfamily M, alpha member 1
bone morphogenetic protein 15
SET and MYND domain containing 1
Bmp15
Smyd1
0.98
1.00
4.16
2.16
2.17
2.17
AI556345
NM_031017
EST
cAMP responsive element binding protein 1
–
Creb1
1.09
1.21
2.18
2.01
2.17
2.17
AW251649
NM_001107780
EST
hydroxyacid oxidase (glycolate oxidase) 1
–
Hao1
0.73
1.93
2.26
2.54
2.16
2.16
NM_001034108
BF417885
membrane-associated ring finger (C3HC4) 2
EST
March2
–
0.89
1.15
2.37
3.35
2.16
2.16
AI137962
AA860039
EST
EST
–
–
1.63
1.51
2.87
2.34
2.16
2.15
NM_001107037
NM_001108251
eosinophil peroxidase
ubiquilin 2
Epx
Ubqln2
0.85
0.89
2.01
2.32
2.15
2.15
NM_001107665
Ubiquitin specific protease 13 (isopeptidase T-3)
Usp13
1.36
2.14
2.15
135
XM_001062926
BG374972
aldehyde dehydrogenase 5 family, member A1
EST
Aldh5a1
–
1.28
1.07
2.38
3.54
2.14
2.14
NM_001191609
NM_001013998
laminin, alpha 5
phosphodiesterase 12
Lama5
Pde12
1.69
1.41
2.65
2.05
2.14
2.14
BF416590
NM_001011896
–
Abcf3
1.11
1.22
2.15
2.42
2.14
2.14
AI145781
BI299857
EST
ATP-binding cassette, sub-family F (GCN20),
member 3
EST
EST
–
–
1.03
1.55
2.28
2.62
2.13
2.13
XM_001053529
NM_022643
similar to CG18437-PA
histone cluster 1, H2ba
LOC316460
Hist1h2ba
0.76
1.52
3.95
3.41
2.13
2.12
BF390528
AI011063
EST
EST
–
–
1.14
0.82
2.27
2.33
2.12
2.12
NM_139262
BF394144
cathepsin Q
EST
Ctsq
–
1.46
1.08
6.03
2.86
2.12
2.12
NM_001106883
Apobec2
1.19
2.07
2.12
BF387379
apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic
polypeptide-like 2
EST
–
0.73
2.99
2.11
NM_001195599
NM_001107611
RGD1559980
RNA binding motif protein 20
RGD1559980
Rbm20
1.03
1.95
6.53
2.17
2.11
2.10
NM_053810
BF407971
synaptosomal-associated protein 29
EST
Snap29
–
1.50
1.66
2.94
2.90
2.10
2.09
NM_030988
BM385963
thyroglobulin
EST
Tg
–
1.47
1.65
2.57
2.20
2.08
2.08
AW530922
NM_138529
EST
neuron navigator 2
–
Nav2
0.90
1.32
3.67
3.12
2.08
2.08
XM_001060344
AI639197
consortin, connexin sorting protein
EST
Cnst
–
1.15
1.39
2.36
3.27
2.08
2.08
NM_001106899
Plekhb2
1.73
2.46
2.07
NM_017269
pleckstrin homology domain containing, family B
(evectins) member 2
protein tyrosine phosphatase, receptor type, J
Ptprj
1.01
2.34
2.07
BF394459
AW252555
EST
EST
–
–
1.84
0.98
3.07
2.60
2.07
2.07
AI412432
NM_001145840
EST
glucosidase, alpha; neutral C
–
Ganc
1.05
0.89
2.14
2.23
2.07
2.06
XM_001056520
AI600226
Similar to cullin 7
EST
LOC680835
–
1.09
0.87
2.09
2.49
2.06
2.06
BG376813
AW920132
EST
EST
–
–
1.28
0.92
2.34
2.22
2.05
2.05
NM_021598
BF394645
mast cell protease 8
EST
Mcpt8
–
0.99
0.96
5.41
2.74
2.05
2.05
XM_238267
NM_001122658
RGD1560210
family with sequence similarity 178, member B
RGD1560210
Fam178b
0.96
1.04
2.31
2.50
2.05
2.04
NM_001077645
BE112342
protein kinase, cAMP dependent, catalytic, beta
EST
Prkacb
–
1.08
0.74
2.94
2.67
2.04
2.04
NM_001024263
NM_001008854
protein kinase D3
RT1 class Ib, locus N1
Prkd3
RT1-N1
1.20
0.93
2.02
2.33
2.04
2.03
NM_001109006
Slc23a3
1.14
2.73
2.03
XM_002726189
solute carrier family 23 (nucleobase transporters),
member 3
Sp3 transcription factor
Sp3
1.38
2.34
2.03
NM_134378
sulfatase 1
Sulf1
1.15
2.69
2.03
136
NM_001106664
BE112754
tyrosinase-related protein 1
EST
NM_031343
1.14
1.09
2.02
2.86
2.03
2.03
1.84
2.39
2.03
NM_022218
solute carrier family 6 (neurotransmitter transporter, Slc6a2
noradrenalin), member 2
chemokine-like receptor 1
Cmklr1
0.90
2.46
2.03
BE119364
NM_001107711
EST
Moloney leukemia virus 10
–
Mov10
1.08
1.42
2.17
2.47
2.02
2.02
AI176826
NM_001107965
–
B4galt2
0.90
1.05
2.18
3.05
2.02
2.02
NM_001109591
XM_001066061
EST
UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1,4galactosyltransferase, polypeptide 2
junctional sarcoplasmic reticulum protein 1
late cornified envelope 1D
Jsrp1
Lce1d
0.94
1.36
2.88
3.96
2.02
2.02
NM_001109422
BF411772
B-cell CLL/lymphoma 3
EST
Bcl3
–
1.01
0.79
2.30
2.23
2.01
2.00
NM_173098
solute carrier family 9 (sodium/hydrogen exchanger), Slc9a4
member 4
myocyte enhancer factor 2D
Mef2d
1.37
2.17
2.00
0.98
3.16
2.00
NM_030860
Tyrp1
–
Abbreviations: DBDE, decabromodiphenyl ether; EST, expressed sequence tag.
137
Table 3-4. List of genes commonly down-regulated in the microdissected cerebral white matter
region after exposure to DBDE at 100 and 1,000 ppm (≤ 0.5-fold)
Accession no.
Gene title
Symbol
DBDE
10 ppm
Down-regulated (224 genes)
NM_001108395 placenta-specific 9
100 ppm
1000 ppm
Plac9
0.97
0.10
0.08
BF411568
NM_021580
EST
prolactin family 8, subfamily a, member 4
–
Prl8a4
1.01
0.57
0.08
0.12
0.10
0.11
NM_019154
BF393053
amelogenin X chromosome
EST
Amelx
–
1.22
0.94
0.28
0.38
0.13
0.13
NM_001024305
0.72
0.22
0.13
BF544537
PRP38 pre-mRNA processing factor 38 (yeast) Prpf38b
domain containing B
EST
–
0.51
0.32
0.14
AI454929
NM_052803
EST
ATPase, Cu++ transporting, alpha polypeptide
–
Atp7a
0.94
0.94
0.15
0.33
0.14
0.16
NM_019161
AI111659
EST
EST
–
–
1.02
0.96
0.17
0.47
0.17
0.17
NM_001173507
AW532329
stromal antigen 2
EST
Stag2
–
0.85
0.91
0.46
0.46
0.17
0.18
NM_001030035
Rpgrip1
0.75
0.35
0.18
Eif3s6ip
0.97
0.38
0.19
BI291927
NM_001106055
Retinitis pigmentosa GTPase regulator
interacting protein 1
eukaryotic translation initiation factor 3, subunit
6 interacting protein
EST
MYC binding protein 2
–
Mycbp2
0.84
1.00
0.38
0.30
0.19
0.19
NM_057203
AI638976
chemokine (C-C motif) ligand 22
EST
Ccl22
–
0.74
0.63
0.23
0.25
0.19
0.20
NM_031664
Slc28a2
1.08
0.12
0.20
BF418003
solute carrier family 28 (sodium-coupled
nucleoside transporter), member 2
EST
–
0.90
0.46
0.20
NM_053671
NM_001134706
TATA element modulatory factor 1
nucleosomal binding protein 1
Tmf1
Nsbp1
0.92
1.03
0.42
0.31
0.20
0.20
AW919728
NM_022671
EST
one cut homeobox 1
–
Onecut1
1.00
1.21
0.38
0.34
0.20
0.20
BF418026
BI296453
EST
EST
–
–
0.74
0.95
0.24
0.27
0.20
0.21
AI712467
BF413347
EST
EST
–
–
1.24
0.59
0.32
0.44
0.21
0.22
AI071599
NM_001107868
EST
zinc finger, matrin-like
–
Zfml
1.07
0.92
0.28
0.36
0.22
0.23
AW527234
AW921461
EST
EST
–
–
0.65
1.06
0.50
0.04
0.23
0.23
XR_086345
NM_030584
rCG23949-like
sclerosteosis
LOC100362458
Sost
0.75
0.57
0.26
0.46
0.23
0.23
BG371725
NM_181084
EST
tumor protein p53 inducible nuclear protein 1
–
Tp53inp1
1.02
0.88
0.24
0.46
0.23
0.24
AI577552
NM_001024275
EST
Ras association (RalGDS/AF-6) domain family
member 4
mCG147639-like
EST
–
Rassf4
0.93
1.03
0.28
0.43
0.24
0.25
LOC100363606
–
1.25
0.94
0.17
0.41
0.25
0.25
NM_001034134
XM_002726772
AW532375
138
NM_001109260
AI029275
similar to RIKEN cDNA 3110035E14
EST
RGD1561849
–
1.04
1.02
0.26
0.17
0.26
0.26
XR_005460
BE110143
Similar to 2410024A21Rik protein
EST
RGD1304878
–
1.58
0.84
0.40
0.41
0.26
0.26
NM_001025649
NM_001106572
transmembrane 9 superfamily protein member 4 Tm9sf4
olfactomedin-like 2A
Olfml2a
0.96
1.01
0.44
0.42
0.26
0.26
AW253361
NM_023962
EST
platelet-derived growth factor, D polypeptide
–
Pdgfd
0.96
0.91
0.41
0.42
0.26
0.27
AI013758
AA944650
EST
EST
–
–
0.94
1.16
0.39
0.31
0.27
0.27
BM385973
BI289090
EST
EST
–
–
0.97
0.87
0.31
0.24
0.28
0.29
NM_001035000
BE095613
histone deacetylase 10
EST
Hdac10
–
1.15
0.90
0.33
0.38
0.29
0.29
BF400824
BF387018
EST
EST
–
–
0.55
0.84
0.28
0.35
0.29
0.29
NM_022692
XR_005469
RAB5A, member RAS oncogene family
similar to KIAA0339 protein
Rab5a
RGD1311624
1.04
0.89
0.46
0.45
0.29
0.29
NM_001034923
NM_001108485
dihydrouridine synthase 3-like
general transcription factor IIH, polypeptide 1
Dus3l
Gtf2h1
0.85
0.81
0.14
0.37
0.29
0.30
BF568017
BI299977
EST
EST
–
–
0.78
0.98
0.37
0.29
0.30
0.30
NM_001009637
NM_030985
leucyl-tRNA synthetase
angiotensin II receptor, type 1a
Lars
Agtr1a
0.98
0.91
0.37
0.44
0.30
0.30
NM_031610
NM_001108564
–
Agl
0.84
1.14
0.33
0.40
0.30
0.30
BI300412
NM_001034068
EST
amylo-1,6-glucosidase,
4-alpha-glucanotransferase
EST
tropomyosin 1, alpha
–
Tpm1
0.67
0.87
0.33
0.49
0.30
0.30
BE105927
NM_053524
EST
NADPH oxidase 4
–
Nox4
0.92
0.67
0.41
0.28
0.31
0.31
BE119146
BF416814
EST
EST
–
–
0.90
0.85
0.35
0.50
0.31
0.31
BE109223
NM_017264
–
Psme1
1.10
1.04
0.32
0.28
0.31
0.32
NM_199094
AI071789
EST
Proteasome (prosome, macropain) activator
subunit 1
tubulin, beta 2c
EST
Tubb2c
–
0.95
0.95
0.48
0.50
0.32
0.32
NM_133295
NM_001008880
carboxylesterase 3
sodium channel, voltage-gated, type IV, beta
Ces3
Scn4b
1.08
0.98
0.35
0.24
0.32
0.32
NM_019188
BG373926
microseminoprotein, beta
EST
Msmb
–
0.97
0.63
0.31
0.28
0.32
0.32
AI169620
NM_001006967
EST
lysyl-tRNA synthetase
–
Kars
1.05
0.99
0.23
0.45
0.32
0.33
AI411637
XM_001060853
EST
ATPase, H+ transporting, lysosomal accessory
protein 2
EST
FXYD domain-containing ion transport
regulator 2
EST
–
Atp6ap2
0.51
1.04
0.48
0.32
0.33
0.33
–
Fxyd2
1.01
1.41
0.28
0.26
0.33
0.34
–
0.93
0.42
0.34
AA963228
NM_017349
BM389786
139
BE117531
AI010054
EST
EST
–
–
0.80
0.92
0.29
0.46
0.34
0.34
AA956454
XM_001060944
EST
annexin V-binding protein ABP-10
–
Abp10
1.02
0.95
0.31
0.25
0.34
0.34
NM_019328
0.93
0.47
0.34
BE119312
nuclear receptor subfamily 4, group A, member Nr4a2
2
EST
–
0.88
0.13
0.34
NM_053426
NM_021693
Splicing factor 3b, subunit 1
salt-inducible kinase 1
Sf3b1
Sik1
0.68
0.91
0.42
0.13
0.34
0.35
AI072025
BF413539
EST
EST
–
–
0.77
0.91
0.25
0.32
0.35
0.35
BI299522
XM_002725785
EST
damage-specific DNA binding protein 1
–
Ddb1
1.11
0.86
0.23
0.35
0.35
0.35
NM_001112742
NM_001109023
glutamate receptor, ionotrophic, AMPA 3
pinin, desmosome associated protein
Gria3
Pnn
1.03
1.07
0.33
0.48
0.35
0.35
XM_001070053
AI639055
kinesin family member 1A
EST
Kif1a
–
0.94
1.02
0.18
0.20
0.35
0.36
NM_145721
BF400127
CDK5 regulatory subunit associated protein 1
EST
Cdk5rap1
–
0.78
0.96
0.40
0.41
0.36
0.36
XM_001073918
AI136271
ferric-chelate reductase 1
EST
Frrs1
–
0.79
1.02
0.45
0.39
0.36
0.36
NM_019315
Kcnn3
0.94
0.40
0.36
AI029721
potassium intermediate/small conductance
calcium-activated channel, subfamily N,
member 3
EST
–
0.88
0.42
0.37
AI072270
BF403095
EST
EST
–
–
0.99
0.94
0.40
0.24
0.37
0.37
NM_001124768
NM_001195606
tachykinin 1
hypothetical protein LOC686032
Tac1
LOC686032
1.25
0.74
0.38
0.28
0.37
0.37
BF404462
BF290198
EST
EST
–
–
1.00
0.63
0.43
0.38
0.37
0.37
BE121123
NM_001105929
EST
zinc finger, CCHC domain containing 8
–
Zcchc8
0.61
1.10
0.42
0.43
0.37
0.38
BF398283
NM_001106548
EST
hypothetical LOC296411
–
RGD1307805
1.14
1.00
0.50
0.28
0.38
0.38
BI296717
NM_053903
EST
ephrin A5
–
Efna5
0.96
0.84
0.49
0.39
0.38
0.38
NM_031665
BE120096
syntaxin 6
EST
Stx6
–
1.04
1.00
0.36
0.49
0.38
0.38
XM_001055673
LOC685179
1.73
0.45
0.39
Ubr4
0.97
0.50
0.39
BF284365
AI511079
similar to SWI/SNF-related matrix-associated
actin-dependent regulator of chromatin c2
ubiquitin protein ligase E3 component
n-recognin 4
EST
EST
–
–
1.03
0.78
0.37
0.40
0.39
0.39
AI548586
AW251280
EST
EST
–
–
0.73
0.77
0.31
0.23
0.39
0.39
NM_001007623
BE117956
methyltransferase like 6
EST
Mettl6
–
1.21
1.09
0.29
0.22
0.39
0.39
NM_001108378
short chain dehydrogenase/reductase family
39U, member 1
RT1 class Ib, locus EC2
Sdr39u1
0.83
0.38
0.40
RT1-EC2
1.02
0.36
0.40
NM_001039026
NM_012645
140
BG666316
NM_001106592
EST
zinc finger protein 282
–
Znf282
1.00
0.51
0.50
0.34
0.40
0.40
BF283568
AW534476
EST
EST
–
–
1.01
0.88
0.27
0.44
0.40
0.41
NM_133413
BE111740
cysteinyl leukotriene receptor 2
EST
Cysltr2
–
0.83
0.67
0.47
0.29
0.41
0.41
NM_053927
AI601993
erythrocyte protein band 4.1-like 3
EST
Epb4.1l3
–
0.68
0.90
0.41
0.35
0.41
0.41
NM_138902
Ear11
0.93
0.32
0.41
NM_001008843
eosinophil-associated, ribonuclease A family,
member 11
RT1 class I, locus CE5
RT1-CE5
1.04
0.15
0.41
XM_001065262
XM_001058877
similar to hypothetical protein
DAZ interacting protein 3, zinc finger
RGD1563056
Dzip3
0.91
0.69
0.35
0.37
0.41
0.42
NM_053817
AA998248
neurexin 3
EST
Nrxn3
–
1.09
1.05
0.49
0.46
0.42
0.42
NM_053457
BE099838
claudin 11
EST
Cldn11
–
0.99
1.00
0.49
0.40
0.42
0.42
NM_153821
BI298185
paired related homeobox 1
EST
Prrx1
–
0.77
0.55
0.29
0.42
0.42
0.42
AI554998
NM_001037650
EST
nephronophthisis 4 (juvenile) homolog
–
Nphp4
1.81
0.63
0.49
0.49
0.42
0.43
NM_013107
XM_002725812
Bone morphogenetic protein 6
mCG1051031-like
Bmp6
LOC100364485
1.60
1.21
0.48
0.42
0.43
0.43
NM_031115
XM_001078360
secretin receptor
SRY (sex determining region Y)-box 21
Sctr
Sox21
1.01
1.21
0.48
0.14
0.43
0.43
BF386350
BF400716
EST
EST
–
–
0.97
0.87
0.11
0.48
0.43
0.43
NM_001011943
Obfc1
0.96
0.26
0.43
AI409359
oligonucleotide/oligosaccharide-binding fold
containing 1
EST
–
1.16
0.35
0.43
AI137489
NM_001107477
EST
zinc finger protein 329
–
Zfp329
1.20
0.98
0.50
0.26
0.43
0.44
NM_001109137
BM392272
tubby like protein 4
EST
Tulp4
–
1.02
0.97
0.48
0.36
0.44
0.44
NM_019374
BE120205
prodynorphin
EST
Pdyn
–
0.95
0.98
0.49
0.48
0.44
0.44
XM_002726225
similar to fatty acid desaturase 2; linoleoyl-CoA RGD1311224
desaturase (delta-6-desaturase)-like 2; delta-6
fatty acid desaturase
EST
–
1.04
0.50
0.44
0.97
0.10
0.44
Fut4
0.93
0.36
0.44
BF289978
fucosyltransferase 4 (alpha (1,3)
fucosyltransferase, myeloid-specific)
EST
–
0.80
0.48
0.44
AW526150
NM_001105993
EST
glomulin, FKBP associated protein
–
Glmn
1.00
0.58
0.37
0.30
0.44
0.44
AI556222
NM_173140
EST
crystallin, beta A2
–
Cryba2
0.67
1.28
0.34
0.27
0.45
0.45
NM_001014017
NM_001107809
zinc finger protein 819
Zinc finger protein 512B
Zfp819
Znf512b
1.52
0.86
0.46
0.50
0.45
0.45
AW254395
BG670822
EST
EST
–
–
0.93
0.82
0.42
0.43
0.45
0.45
BI291351
NM_022219
141
NM_001107103
BG378170
receptor-interacting serine-threonine kinase 4
EST
NM_001106779
0.73
0.97
0.47
0.33
0.45
0.46
1.01
0.47
0.46
NM_017054
neural precursor cell expressed, developmentally Nedd1
down-regulated 1
thromboxane A2 receptor
Tbxa2r
0.96
0.41
0.46
BF404834
NM_030871
EST
phosphodiesterase 1A, calmodulin-dependent
–
Pde1a
1.01
1.55
0.49
0.22
0.46
0.46
NM_001012168
NM_001024305
tubby-like protein 2
PRP38 pre-mRNA processing factor 38 (yeast)
domain containing B
Ring finger protein 150
dopamine receptor D2
Tulp2
Prpf38b
1.30
1.06
0.44
0.29
0.46
0.46
Rnf150
Drd2
1.03
1.08
0.49
0.46
0.46
0.46
–
Kctd3
1.04
1.58
0.49
0.28
0.46
0.46
BM386499
BF284363
EST
potassium channel tetramerisation domain
containing 3
EST
EST
–
–
0.67
0.96
0.37
0.36
0.46
0.46
NM_001106964
NM_031150
transducin (beta)-like 1 X-linked
Tbl1x
zona pellucida glycoprotein 2 (sperm receptor) Zp2
0.98
1.33
0.34
0.29
0.47
0.47
BE108111
AA850773
EST
EST
–
–
0.91
1.00
0.43
0.43
0.47
0.47
XM_001071108
BF567806
ribosomal RNA processing 1 homolog B
EST
Rrp1b
–
0.97
1.23
0.25
0.33
0.47
0.48
BF288188
NM_001105723
–
Ubtf
0.93
1.11
0.37
0.43
0.48
0.48
AI501207
BG670822
EST
upstream binding transcription factor, RNA
polymerase I
EST
EST
–
–
1.06
0.78
0.50
0.49
0.48
0.48
NM_172222
BM385905
complement component 2
EST
C2
–
0.97
0.99
0.35
0.44
0.48
0.48
NM_053781
AI554981
aldo-keto reductase family 1, member B7
EST
Akr1b7
–
1.02
0.99
0.17
0.20
0.48
0.48
AA943846
NM_012587
EST
integrin-binding sialoprotein
–
Ibsp
1.11
1.17
0.38
0.17
0.48
0.48
BF390674
NM_001024749
EST
similar to RIKEN cDNA 3110040N11
–
RGD1305713
1.10
1.14
0.40
0.41
0.48
0.48
BF401679
AI547999
EST
EST
–
–
1.06
1.25
0.32
0.42
0.49
0.49
XM_002727559
AI180454
rCG36307-like
EST
LOC100365336
–
1.12
1.02
0.29
0.44
0.49
0.49
NM_001107750
AI548961
tetraspanin 18
EST
Tspan18
–
0.99
0.89
0.44
0.31
0.49
0.49
NM_001014092
NM_001107523
progestin and adipoQ receptor family member V Paqr5
chromodomain helicase DNA binding protein 2 Chd2
1.23
1.25
0.29
0.31
0.49
0.50
NM_012800
NM_001106986
purinergic receptor P2Y, G-protein coupled, 1
NADPH oxidase organizer 1
P2ry1
Noxo1
1.21
0.80
0.45
0.31
0.50
0.50
AA943744
AI556780
EST
EST
–
–
1.01
0.90
0.37
0.42
0.50
0.50
NM_001191093
NM_012547
BF409020
NM_001107199
Ripk4
–
Abbreviations: DBDE, decabromodiphenyl ether; EST, expressed sequence tag.
142
Table 3-5. List of representative genes associated with brain development showing up- or
down-regulation commonly after exposure to DBDE (≥ 2-fold, ≤ 0.5-fold)
Accession no.
Gene title
Symbol
DBDE
10ppm
10, 100, 1000 ppm commonly up-regulated (11 genes)
NM_001136151
Neuregulin 2
100ppm
1000ppm
Nrg2
2.61
3.91
4.84
NM_053986
NM_019236
Myosin Ib
Hairy and enhancer of split 2
Myo1b
Hes2
2.10
3.63
3.56
2.35
4.53
4.03
NM_017001
NM_001107413
Erythropoietin
Iroquois homeobox 3
Epo
Irx3
3.58
2.42
3.25
4.11
4.02
3.79
NM_012841
NM_053708
Deleted in colorectal carcinoma
Gastrulation brain homeobox 2
Dcc
Gbx2
3.30
2.43
2.75
2.59
3.17
2.93
NM_019374
NM_053818
Prodynorphin
Solute carrier family 6 (neurotransmitter transporter,
glycine), member 9
Pdyn
Slc6a9
2.80
2.21
3.59
3.11
2.88
2.60
NM_139113
Nuclear receptor subfamily 2, group F, member 6
Nr2f6
3.32
2.84
2.43
Calca
2.10
2.78
2.03
Sbk1
0.22
0.30
0.36
NM_001033955
Calcitonin-related polypeptide alpha
10, 100, 1000 ppm commonly down-regulated (1 gene)
NM_147135
SH3-binding domain kinase 1
100, 1000ppm commonly up-regulated (52 genes)
NM_022928
NM_024365
G protein-coupled receptor kinase 4
5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 6
Grk4
Htr6
0.61
1.15
4.57
14.58
9.86
8.69
NM_031688
NM_053851
Synuclein, gamma (breast cancer-specific protein 1)
Calcium channel, voltage-dependent, beta 2 subunit
Sncg
Cacnb2
0.97
1.42
4.50
3.55
6.05
5.70
NM_133536
NM_001108069
RAB3C, member RAS oncogene family
Serine/threonine kinase 11
Rab3c
Stk11
1.00
1.23
2.31
10.93
5.68
5.32
NM_023968
NM_022696
Neuropeptide Y receptor Y2
Heart and neural crest derivatives expressed 2
Npy2r
Hand2
1.65
0.88
3.58
4.27
5.22
4.42
NM_001109892
NM_021659
Fibroblast growth factor receptor 2
Synaptotagmin VII
Fgfr2
Syt7
1.26
0.69
2.70
4.49
4.30
4.30
NM_134336
NM_019166
Neuroligin 3
Synaptogyrin 1
Nlgn3
Syngr1
1.62
1.57
3.28
2.83
4.04
3.88
NM_012996
NM_001042579
Oxytocin, prepropeptide
Unc-13 homolog B
Oxt
Unc13b
0.91
1.21
4.78
3.24
3.86
3.79
NM_001110099
NM_031739
1.67
0.96
4.48
3.75
3.67
3.64
NM_012531
NM_022684
Ret proto-oncogene
Ret
Potassium voltage-gated channel, Shal-related subfamily, Kcnd3
member 3
Catechol-O-methyltransferase
Comt
BH3 interacting domain death agonist
Bid
0.97
1.02
3.86
2.80
3.50
3.48
NM_017254
NM_153621
5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 2A
Disabled homolog 1
Htr2a
Dab1
1.13
0.45
3.26
2.85
3.34
3.28
NM_012715
NM_021584
Adrenomedullin
Doublecortin-like kinase 1
Adm
Dclk1
1.22
1.11
2.01
3.98
3.24
3.18
NM_012568
NM_001108880
Glycine receptor, alpha 2
BARX homeobox 1
Glra2
Barx1
1.84
1.17
2.42
3.72
3.14
3.09
NM_013193
NM_024401
Neurofibromin 2
Advillin
Nf2
Avil
1.61
1.76
3.08
2.74
3.08
3.06
NM_031140
NM_024160
Vimentin
Cytochrome b-245, alpha polypeptide
Vim
Cyba
1.65
0.93
2.82
3.21
2.99
2.98
143
NM_031588
NM_053613
Neuregulin 1
Reticulon 4 receptor
Nrg1
Rtn4r
0.82
0.99
2.44
2.88
2.79
2.72
NM_053724
NM_001002827
Glycine receptor, alpha 3
Notch homolog 4
Glra3
Notch4
1.15
1.10
2.05
4.25
2.71
2.70
NM_019359
NM_012944
Calponin 3, acidic
Dopamine receptor D4
Cnn3
Drd4
1.11
0.46
3.64
4.21
2.67
2.64
NM_022631
Wnt5a
1.72
2.38
2.60
NM_022239
Wingless-type MMTV integration site family, member
5A
Neuromedin U
Nmu
0.60
2.89
2.55
NM_031632
NM_138977
Caspase 9, apoptosis-related cysteine peptidase
Prokineticin receptor 1
Casp9
Prokr1
1.60
1.02
2.24
2.51
2.50
2.48
XM_001077495
NM_023971
Nuclear receptor co-repressor 1
Dystrophin related protein 2
Ncor1
Drp2
0.69
1.04
2.28
2.80
2.32
2.32
NM_022384
NM_138918
Achaete-scute complex homolog 1
Synovial sarcoma translocation gene on chromosome
18-like 1
Sodium channel, voltage-gated, type II, beta
Steroidogenic acute regulatory protein
Ascl1
Ss18l1
1.51
1.30
2.53
3.80
2.31
2.27
Scn2b
Star
1.02
1.70
3.32
2.07
2.27
2.22
NM_012877
NM_031558
NM_019302
NM_031828
v-Crk sarcoma virus CT10 oncogene homolog
Crk
Potassium large conductance calcium-activated channel, Kcnma1
subfamily M, alpha member 1
1.13
1.03
2.71
2.29
2.21
2.18
XM_001062926
Aldehyde dehydrogenase 5 family, member A1
Aldh5a1
1.28
2.38
2.14
NM_001191609
NM_053810
Laminin, alpha 5
Synaptosomal-associated protein 29
Lama5
Snap29
1.69
1.50
2.65
2.94
2.14
2.10
NM_138529
NM_031343
Neuron navigator 2
Solute carrier family 6 (neurotransmitter transporter,
noradrenalin), member 2
Nav2
Slc6a2
1.32
1.84
3.12
2.39
2.08
2.03
NM_030860
Myocyte enhancer factor 2D
Mef2d
0.98
3.16
2.00
100, 1000ppm commonly down-regulated (18 genes)
NM_052803
ATPase, Cu++ transporting, alpha polypeptide
Atp7a
0.94
0.33
0.16
NM_001106055
NM_030584
MYC binding protein 2
Sclerosteosis
Mycbp2
Sost
1.00
0.57
0.30
0.46
0.19
0.23
NM_001035000
NM_022692
Histone deacetylase 10
RAB5A, member RAS oncogene family
Hdac10
Rab5a
1.15
1.04
0.33
0.46
0.29
0.29
NM_019328
NM_001112742
Uuclear receptor subfamily 4, group A, member 2
Glutamate receptor, ionotrophic, AMPA 3
Nr4a2
Gria3
0.93
1.03
0.47
0.33
0.34
0.35
NM_001124768
NM_053903
Tachykinin 1
Ephrin A5
Tac1
Efna5
1.25
0.84
0.38
0.39
0.37
0.38
NM_053927
NM_053817
Erythrocyte protein band 4.1-like 3
Neurexin 3
Epb4.1l3
Nrxn3
0.68
1.09
0.41
0.49
0.41
0.42
NM_053457
NM_013107
Claudin 11
Bone morphogenetic protein 6
Cldn11
Bmp6
0.99
1.60
0.49
0.48
0.42
0.43
NM_019374
NM_001106779
Pdyn
Nedd1
0.95
1.01
0.49
0.47
0.44
0.46
NM_030871
NM_012547
Prodynorphin
Neural precursor cell expressed, developmentally
down-regulated 1
Phosphodiesterase 1A, calmodulin-dependent
Dopamine receptor D2
Pde1a
Drd2
1.55
1.08
0.22
0.46
0.46
0.46
NM_012800
Purinergic receptor P2Y, G-protein coupled, 1
P2ry1
1.21
0.45
0.50
Abbreviations: DBDE, decabromodiphenyl ether.
144
Table 3-6. List of genes with commonly altered expression between the studies of DBDE and
anti-thyroid agents (≥ 2-fold, ≤ 0.5-fold)
Accession no.
Gene title
Symbol
DBDE (ppm)
10
100
1000
DBDE 10, 100 and 1000 ppm, MMI 200 ppm and PTU 3 and 6 ppm commonly up-regulated (4 genes)
NM_031502
Amylase 2, pancreatic
Amy2
6.73
3.92
6.36
2.96
3.94
2.25
BE096287
EST
–
2.44
2.01
3.87
2.11
3.55
4.26
XM_002729411 Similar to Nkrp1f protein
LOC689809
2.33
3.38
2.48
2.56
3.11
2.65
AI237240
–
2.22
2.42
2.03
3.15
3.50
3.18
7.91
EST
MMI (ppm)
200
PTU (ppm)
3
12
DBDE 10, 100 and 1000 ppm, MMI 200 ppm and PTU 3 and 6 ppm commonly down-regulated (0 genes)
DBDE 100 and 1000 ppm, MMI 200 ppm and PTU 3 and 6 ppm commonly up-regulated (42 genes)
XM_001055507 Outer dense fiber of sperm tails 3B
Odf3b
1.55
5.87
29.88
3.91
8.63
NM_031686
Scn7a
0.89
7.34
11.60
4.31
42.69 17.08
XM_001060951 Coiled-coil domain containing 113
Ccdc113
1.33
2.08
11.31
8.32
20.95 18.68
NM_001106595 SET and MYND domain containing 1
Smyd1
1.13
6.35
9.10
8.21
9.71 13.66
XR_086009
Similar to CG8138-PA
LOC685158
0.92
2.13
7.07
3.26
5.09
4.73
NM_022213
Phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 3
(gamma)
EST
Pik3r3
0.86
2.82
6.50
2.70
4.10
2.74
–
0.89
3.20
6.27
13.86
21.20 30.60
RGD1561795 1.05
BF545930
Sodium channel, voltage-gated, type VII, alpha
NM_001109289 Similar to RIKEN cDNA 1700012B09
2.20
5.59
3.16
4.22
7.64
NM_001109024 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C, member 30 Dnajc30
1.49
2.12
4.77
3.74
5.49
6.54
NM_031538
Cd8a
0.98
2.40
4.70
2.30
3.40
3.95
NM_001108066 AT rich interactive domain 3A
Arid3a
1.05
3.93
4.62
2.65
2.13
3.69
BF288845
–
1.86
4.18
3.88
2.11
4.43
4.53
NM_001110099 Ret proto-oncogene
Ret
1.67
4.48
3.67
2.89
5.01
4.39
NM_001011947 Retinoic acid induced 14
Rai14
1.35
2.11
3.51
3.30
2.34
3.44
CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), alpha Cebpa
0.95
2.63
3.36
2.49
2.52
2.01
NM_012524
CD8a molecule
EST
NM_001106319 Cysteinyl-tRNA synthetase
Cars
1.15
4.23
3.31
2.35
4.23
4.16
NM_012849
Gastrin
Gast
1.10
3.30
3.26
4.40
5.81
4.33
NM_012715
Adrenomedullin
Adm
1.22
2.01
3.24
3.79
4.10
4.17
NM_001108463 Radial spokehead-like 2
Rshl2
1.75
2.87
3.22
3.81
5.27
6.01
NM_001010970 Amylase, alpha 1A
Amy1a
0.39
23.87
3.21
46.70
64.86 102.80
BM385125
–
0.73
3.06
3.17
2.87
2.56
3.67
NM_001108238 Ankyrin repeat domain 12
Ankrd12
0.86
3.47
3.12
2.93
5.71
5.91
AI013206
–
1.69
2.81
3.08
3.14
4.09
5.20
NM_001010970 Amylase, alpha 1A
Amy1a
1.20
8.40
3.08
8.37
11.41 17.62
NM_031140
Vim
1.65
2.82
2.99
2.11
6.01
4.27
NM_001109530 SAM pointed domain containing ets transcription Spdef
factor
AW142608
EST
–
1.22
2.09
2.96
2.20
2.99
3.43
1.01
2.76
2.75
2.73
6.42
4.92
NM_212459
ADP-ribosylation factor-like 9
Arl9
0.36
2.13
2.74
2.63
2.27
3.59
BF412962
EST
–
1.60
4.74
2.67
3.02
3.91
3.52
BF387484
EST
–
0.93
2.48
2.66
2.04
2.82
3.03
BF404369
EST
EST
EST
Vimentin
–
0.99
2.13
2.66
2.08
2.12
3.31
XM_002727399 Paired immunoglobin-like type 2 receptor alpha
Pilra
1.23
2.06
2.63
2.26
2.56
2.46
NM_080768
Tachykinin receptor 2
Tacr2
1.42
2.37
2.60
3.60
2.91
7.34
BF413876
EST
–
0.77
2.35
2.58
2.51
2.31
3.81
BF418099
EST
–
1.20
2.52
2.53
3.59
5.41
6.52
Aspn
1.08
3.61
2.46
3.89
8.18
5.50
0.95
2.37
2.45
2.79
2.34
4.04
NM_001014008 Asporin
NM_080581
ATP-binding cassette, sub-family C (CFTR/MRP), Abcc3
145
member 3
XM_001077495 Nuclear receptor co-repressor 1
Ncor1
0.69
2.28
2.32
2.67
2.01
2.97
NM_031017
Creb1
1.21
2.01
2.17
2.19
2.81
2.86
NM_001107780 Hydroxyacid oxidase (glycolate oxidase) 1
cAMP responsive element binding protein 1
Hao1
1.93
2.54
2.16
2.26
2.02
2.90
NM_053810
Synaptosomal-associated protein 29
Snap29
1.50
2.94
2.10
2.26
2.26
3.00
BE119364
EST
–
1.08
2.17
2.02
2.94
5.40
6.04
DBDE 100 and 1000 ppm, MMI 200 ppm and PTU 3 and 6 ppm commonly down-regulated (2 genes)
NM_019154
Amelogenin X chromosome
Amelx
1.22
0.28
0.13
0.31
0.07
0.09
NM_013107
Bone morphogenetic protein 6
Bmp6
1.60
0.48
0.43
0.23
0.38
0.25
DBDE 1000 ppm, MMI 200 ppm and PTU 3 and 6 ppm commonly up-regulated (33 genes)
NM_001015027 cAMP responsive element binding protein-like 2
Crebl2
1.02
0.90
14.38
5.02
10.61 11.53
XM_002724862 Similar to hypothetical protein FLJ23074
RGD1566400 1.23
1.70
4.36
4.23
18.89 10.14
NM_001014087 Coiled-coil domain containing 67
Ccdc67
1.28
1.59
4.34
3.50
15.54 8.25
XM_002724609 Family with sequence similarity 183, member B
Fam183b
1.12
1.03
3.60
5.34
10.84 11.19
NM_001134933 Cysteine-rich intestinal protein
Crip
0.90
1.67
3.38
3.91
10.16 8.74
NM_001033655 Dynein, axonemal, heavy chain 1
Dnah1
1.09
0.99
3.22
3.25
5.73
5.99
NM_001105991 ATPase, H+ transporting, lysosomal V1 subunit G3 Atp6v1g3
0.80
1.53
3.11
2.94
5.01
4.82
AI548601
EST
–
1.03
1.94
3.05
2.33
3.61
4.10
AI535351
EST
–
0.90
1.65
2.85
2.83
4.55
2.74
NM_001004263 Integrin, beta 6
Itgb6
1.23
1.09
2.84
2.26
3.84
3.82
NM_001108055 Adenylate kinase 7
Ak7
1.00
1.26
2.83
2.88
7.39
6.24
BF409110
5.61
–
1.39
1.09
2.76
2.59
5.90
NM_001107702 Fc receptor-like S, scavenger receptor
EST
Fcrls
0.92
1.01
2.65
4.44
12.50 10.53
XM_001058430 Ribosomal protein L3-like
Rpl3l
0.76
1.69
2.62
2.31
2.05
3.52
AI231422
–
6.24
EST
0.34
1.16
2.59
2.67
8.39
3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A synthaseHmgcs2
2
XM_001073839 Coiled-coil domain containing 30
Ccdc30
1.10
0.65
2.52
3.88
11.91 9.03
1.16
1.45
2.47
2.10
4.58
4.01
BF419834
NM_173094
0.79
0.89
2.43
3.04
2.56
3.33
NM_001110155 RGD1565611
EST
RGD1565611 1.16
0.71
2.37
2.64
5.17
4.74
AI043711
EST
–
0.64
1.33
2.34
2.22
2.78
2.60
BF406167
EST
–
1.32
1.13
2.33
4.69
4.51
7.33
NM_012840
Cytochrome c, testis
Cyct
0.86
1.95
2.32
3.49
3.54
3.60
AA859744
EST
–
1.20
0.82
2.29
2.62
3.28
3.60
NM_053293
Glutathione S-transferase theta 1
Gstt1
1.42
1.22
2.22
4.06
5.33
6.31
AA899303
EST
–
1.72
1.70
2.19
4.90
7.40
7.29
XM_001058720 Coiled-coil domain containing 74A
Ccdc74a
1.02
1.62
2.19
4.47
10.75 11.26
NM_001109074 Similar to novel protein
RGD1565283 0.79
1.39
2.19
3.48
9.39
7.58
BE096723
–
0.99
0.95
2.18
2.26
2.62
3.57
NM_001106825 Hypothetical LOC300751
RGD1311874 0.77
1.66
2.16
2.81
2.33
3.99
NM_001005900 Hematopoietic cell signal transducer
Hcst
1.52
1.37
2.06
2.02
2.12
3.72
XM_001066515 Similar to hypothetical protein FLJ22527
RGD1305311 1.10
1.24
2.06
2.04
4.46
4.00
BF400248
EST
–
1.74
1.53
2.02
5.15
6.50
7.96
AA964532
EST
–
1.74
1.53
2.02
5.15
6.50
7.96
EST
–
DBDE 1000 ppm, MMI 200 ppm and PTU 3 and 6 ppm commonly down-regulated (2 genes)
BG374305
EST
–
1.12
0.60
0.31
0.42
0.17
0.17
AT003256
EST
–
1.25
0.80
0.44
0.44
0.11
0.15
Abbreviations: DBDE, decabromodiphenyl ether; MMI, methimazole; PTU, propylthiouracil; EST, expressed sequence tag.
146
Fig. 3-1
Venn diagram of genes with altered expression in microarray analysis in response to maternal
exposure to DBDE. (Left) Up-regulated genes (≥ 2-fold). (Right) Down-regulated genes (≤ 0.5-fold).
147
Fig. 3-2
Venn diagram of genes with altered expression in microarray analysis between the studies of DBDE
and anti-thyroid agents, propylthiouracil (PTU) and methimazole (MMI). (Left) Up-regulated genes (≥
2-fold). (Right) Down-regulated genes (≤ 0.5-fold).
148
Fig. 3-3
Immunohistochemical distributions of vimentin+ cells in the white matter tissue of BFR-exposed
offspring. Untreated control animal (left) and 1,000 ppm DBDE-exposed animal (right). 200×
magnification (inset: 400× magnification). Bar = 50 µm. Graph shows the mean number of positive
cells within the cingulum at 100× magnification (n = 5/group). Values are expressed as means + SD. *
and ** P < 0.05, 0.01 vs. untreated controls (Dunnett’s test or Dunnett-type rank-sum test).
149
Fig. 3-4
Immunohistochemical distributions of Ret+ cells in the white matter tissue of BFR-exposed offspring.
Untreated control animal (left), 1,000 ppm DBDE-exposed animal (right). 200× magnification (inset:
400× magnification, Ret+ cells are indicated with arrowheads). Bar = 50 µm. Graph shows the mean
number of positive cells within the cingulum at 100× magnification (n = 5/group). Values are
expressed as means + SD. ** P < 0.01 vs. untreated controls (Dunnett’s test or Dunnett-type rank-sum
test).
150
Fig. 3-5
Immunohistochemical distributions of Crk, Nrg1 and Cld11 in the white matter tissue of
DBDE–exposed offspring. (A) Crk immunoreactivity in the myelin sheath of the external capsule,
internal capsule and fimbria of the hippocampus. Untreated control animal (left), 1,000 ppm
DBDE-exposed animal (right). 40× magnification. Bar = 250 µm. Graph shows the mean intensity
score of immunoreactivity at 40× magnification (n = 5/group). Values are expressed as means + SD. *
P < 0.05 vs. untreated controls (Mann-Whitney’s U-test). (B) Nrg1 immunoreactivity in the myelin
sheath of the external capsule, internal capsule and fimbria of the hippocampus. Untreated control
animal (left), 1,000 ppm DBDE-exposed animal (right). 40× magnification. Bar = 250 µm. Graph
shows the mean intensity score of immunoreactivity at 40× magnification (n = 5/group). Values are
expressed as means + SD. ** P < 0.01 vs. untreated controls (Mann-Whitney’s U-test). (C) Cld11
immunoreactivity in the myelin sheath of the external capsule, internal capsule and fimbria of the
hippocampus. Untreated control animal (left), 10 ppm DBDE-exposed animal (right). 40×
magnification. Bar = 250 µm. Graph shows the mean intensity score of immunoreactivity at 40×
magnification (n = 5/group). Values are expressed as means + SD. * P < 0.05 vs. untreated controls
(Mann-Whitney’s U-test).
151