3 α ‒HYDROXYSTEROID DEHYDROGENASE

（Diagnostic Reagent Grade）
ASAHI KASEI ENZYMES
T−58
3 α ‒HYDROXYSTEROID DEHYDROGENASE
[3α‒HSDⅡ]
from Pseudomonas sp.
（3 α ‒Hydroxysteroid: NAD + oxidoreductase, EC 1.1.1.50）
O
O
+ NAD
+
+ NADH + H
+
O
HO
3‒Oxoandrosterone
Androsterone
Preparation and Specification
Appearance
: White amorphous powder, lyophilized
Specific activity : More than 30 U/mg solid
Properties
Substrate specificity
Molecular weight
Isoelectric point
Michaelis constant
Optimum pH
pH stability
Optimum temperature
Thermal stability
Effect of metal ions
Effect of detergents
Inhibitor
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
:
See Table 1
41 kDa（gel filtration）
pH 4.8±0.2
Androsterone 2.1 × l0-4M
8.0‒10.0
6.0‒10.0（37℃, 10 min）
50℃（Phosphate buffer）
Stable at 50℃ and below（pH 8.0, 10 min）
See Table 2
See Table 3
MnCl2
Figure
Figure
Figure
Figure
1
2
3
4
Applications for Diagnostic Test
This enzyme is useful for enzymatic cycling determination of bile acid when
coupled with thio‒NAD and NADH.
＋
＋
Thio‒NAD
Thio‒NADH + H
3α‒HSD Ⅱ
3α‒Hydroxybile acid
3‒Oxobile acid
＋
＋
NAD
NADH + H
90
Table 1. Substrate specificity
Table 3. Effect of detergents on 3 α‒HSD Ⅱ activity
Substrate（1mM）
Relative activity（%）
Detergent（0.1%）
Cholic acid
100
None
Androsterone
131
Deoxycholic acid
115
Triton X‒100
Triton X‒305
Triton X‒114
89.0
Chenodeoxycholic acid
99.0
Taurocholic acid
Relative activity（%）
None
NaCl
KCl
100
105
102
LiCl
MgCl2
101
106
MnCl2
16.0
105
CaCl2
76.0
84.0
50.0
Emulgen 810
Emulgen 109P
Rheodol 460
Rheodol TWL‒103
Fig.2 pH Stability
112
71.0
72.0
Fig.3 Optimum Temperature
Fig.4 Thermal Stability
120
120
100
100
100
100
80
60
40
20
0
80
60
40
20
2
4
8
6
10
12
0
80
60
40
20
2
4
8
6
pH
10
12
0
:
:
:
:
80
60
40
20
0
20
40
60
80
100
0
0
Temperature (℃)
pH
: 3,3-Dimethylglutarate-NaOH
buffer
: Phosphate buffer
: Tris-HCI buffer
: Glycine-NaOH buffer
Acetate buffer
Phosphate buffer
Tris-HCI buffer
Glycine-NaOH buffer
pH 8.0
20 mM Phosphate buffer
20
40
60
80
Temperature (℃)
pH 8.0, 10 min.
20 mM Phosphate buffer
■ Reagents
Assay
1. Reaction mixture
10 mM NAD solution
0.25%（W/V）NTB solution
100 U/ml DI solution
■ Principle
The assay is based on the increase in absorbance
at 550 nm as formazan dye is formed in the following
reactions:
3α‒HSD Ⅱ
Cholic acid + NAD+
3‒Oxocholic acid + NADH + H+
2%（W/V）Triton X‒100 solution
0.05 ml
0.05 ml
0.025 ml
0.10 ml
0.2 M Tris‒HCl buffer pH 8.0
0.10 ml
Distilled water
0.175 ml
1）
: 100 U/ml DI solution
Dissolve 100 U of DI with 1 ml of 10 mM Tris‒HCl
DI
NADH + H+ + NTB
Residual activity (%)
120
Relative activity (%)
120
Residual activity (%)
Relative activity (%)
Fig.1 pH Optimum
75.0
78.0
75.0
Emulgen 911
Emulgen 709
Table 2. Effect of metal ions on 3 α‒HSD Ⅱ activity
Metal ion（10mM）
71.0
104
Adekanol B‒795
Emulgen B‒66
128
Taurodeoxycholic acid
100
71.0
71.0
Adekanol SO‒120
Adekanol NP‒720
103
Glycocholic acid
Relative activity（%）
NAD+ + NTBH2
buffer pH 8.0.
NAD: Nicotineamido adenine dinucleotide,
NTB: Nitrotetrazolium blue
DI: Diaphorase
2. Substrate solution（20 mM Androsterone）
Dissolve 23 mg of androsterone with 2 ml of methanol.
3. Reaction stopper
0.5%（W/V）Sodiumdodecyl sulfate（SDS）solution
■ Unit definition
4. Enzyme dilution buffer
One unit is defined as the amount of enzyme which
oxidizes 1 μmole of cholic acid to 3‒oxocholic acid per
minute at 37℃ under the conditions specified in the assay
procedure.
10 mM Tris‒HCl buffer pH 8.0
5. Reagents
NAD: NACALAI TESQUE, INC. #24334‒84
91
100
NTB: Dojindo Laboratories #344‒02033
DI: Asahi Kasei Pharma Corporation #T‒06
Triton X‒100: The Dow Chemical Company
Androsterone: Sigma Chemical Co. #A‒9755
SDS: NACALAI TESQUE, INC.
Special grade #316‒06
■ Enzyme solution
16.7 : millimolar extinction coefficient of NTBH2 at 550 nm
（cm2/ μmole）
5 : reaction time（min）
3.045 : final volume（ml）
0.02 : volume of enzyme solution（ml）
X : concentration of the sample in enzyme solution
（mg/ml）
Accurately weigh about 20 mg of the sample and add
enzyme dilution buffer to make a total of 20 ml. Dilute it
with enzyme dilution buffer to adjust the concentration
as required.
Storage
Storage at −20℃ in the presence of a desiccant is
recommended.
■ Procedure
References
1. Pipette accurately 0.5 ml of reaction mixture into a
small test tube, then add 20 μl of enzyme solution into
the same test tube and preincubate at 37℃.
※ In the case of a test blank, add 20 μl of enzyme
dilution buffer in place of enzyme solution.
2. After 5 min, add exactly 25 μl of substrate solution and
mix to start the reaction at 37℃.
3. At 5 min after starting the reaction, add 2.5 ml of the
reaction stopper to stop the reaction.
4. Measure the absorbance at 550 nm.
Absorbance
sample : As
blank
: Ab
△A =（As−Ab）≦ 0.20 Abs
1. Suzuki, K. and Tamaoki, B.（1974）J. Steroid Biochem., 5,
249‒256.
2. Inano, H., Hayashi, S. and Tamaoki, B.（1977）J. Steroid
Biochem., 8, 41‒46.
3. Shikita, M. and Talalay, P.（1979）Anal. Biochem., 92,
286‒292.
4. Uwajima, T., Takayama, K. and Terada, O.（1978）Agric.
Biol. Chem., 42, 1577‒1583.
5. Talalay, P.（1962）Methods Enzymol., 5, 512.
6. Mowszowicz, I. and Bardin, C. W.（1974）Steroids, 23,
793‒807.
7. Nimrod, A., Lamprecht, S. A. and Lindner, R. H.（1975）J.
Steroid Biochem., 6, 1205‒1209.
8. Nozu, K., Inano, H. and Tamaoki, B.（1974）Proteins
Nucleic Acids and Enzymes（Japan）
, 19, 397‒410.
■ Calculation
△A/5
3.045
1
Activity（U/mg of powder）= ―――― × ―― × ――
0.02
X
16.7
Ⅱ．酵素試料液
検品約 20mg を精密に量り、酵素溶解希釈用液で溶
解して全容 20ml とする。
その液を酵素溶解希釈用液で適宜希釈する。
3α‒HSD Ⅱ活性測定法（Japanese）
Ⅰ．試薬液
1. 反応試薬混合液
10mM NAD 溶液
0.25%（W/V）NTB 溶液
100U/ml DI 溶液 1）
2.
3.
4.
5.
0.05 ml
0.05 ml
0.025 ml
0.10 ml
0.10 ml
0.175 ml
Ⅲ．測定操作法
1. 小試験管に反応試薬混合液 0.50ml を正確に分注し、
後に酵素試料液 20 μl を正確に分注して 37℃で予備
加温する。
※盲検は酵素試料液の代わりに酵素溶解希釈用液
20 μl を加える。
2. 5 分経過後、基質溶液 25 μl を正確に加えて混和し、
37℃で反応を開始する。
3. 5 分経過後、反応停止液 2.50ml を正確に加えて混和
し、反応を停止する。
4. 550nm における吸光度を測定する。
求められた吸光度を試料液は As、盲検液は Ab とする。
ΔA =（As−Ab）≦ 0.20 Abs
2%（W/V）トリトン X‒100 溶液
0.2M トリス−HCl 緩衝液 pH8.0
精製水
1）
：100U/ml DI 溶液
DI 100 単位（U）を 10mM トリス−HCl 緩衝液
pH8.0 1ml で溶解する。
基質溶液（20mM アンドロステロン溶液）
アンドロステロン 23mg を MeOH4ml で溶解する。
反応停止液
0.5%（W/V）SDS 溶液
酵素溶解希釈用液
10mM トリス−HCl 緩衝液 pH8.0
試薬
NAD（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）
：
ナカライテスク社製 #24334‒84
NTB（ニトロテトラゾリウムブルー）
：
同仁化学製 #344‒02033
DI（ジアフォラーゼ）
：旭化成ファーマ製 #T‒06
トリトン X‒100：Dow Chemical 社製
アンドロステロン：シグマ社製 #A‒9755
SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）
：
ナカライテスク社製 特級 #316‒06
Ⅳ．計算
ΔA/5
3.045
1
活性（U/mg）= ――――― × ―― × ――
16.7
0.02
X
16.7 : NTBH2 の 550nm におけるミリモル分子吸光係数
（cm2/ μmole）
5 : 反応時間（min）
3.045 : 反応総液量（ml）
0.02 : 反応に供した酵素試料液量（m1）
X : 酵素試料液中の検品濃度（mg/ml）
92