THUNDERBIRD

性能に自信あり。BMB2007 でのアンケートに基づいて製品設計致しました。
高効率リアルタイム PCR Master Mix （サンダーバード）
R
THUNDERBIRD
qPCR Mix
で
R
C
P
？
ム
か
イ
ん
タ
● リアルりではありませ
困
プ
お
1 プライマーダイマーの比較
その他
コスト
30 %
効率
24 %
バッファーに改良を加えることにより、SYBR® Green I、
および TaqMan® アッセイにおいて、低コピー数のターゲット
の検出感度、 定量性が向上しました。
19
19%
%
特異性
特異性
（プライマーダイマー）
（プライマーダイマー）
THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix A 社試薬
増幅曲線
10-1
融解曲線
BMB2007( 日本分子生物学会 ・
生化学会 合同大会 ) にて約 100 名
の先生方に、リアルタイムPCR 解析
でお困りの点について伺いました。
プライマー
ダイマー
10-5
コピー数が少なく
なるとプライマー
ダイマーが混入
10-5 希釈
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0
5
Cycles
プライマー
ダイマー
15
THUNDERBIRD®
qPCR Mix
希釈
30
35
40
45
25
30
35
40
45
Cycles
広いレンジで高い PCR 効率
（等間隔）
をキープ
10 0
20
25
プライマーダイマーの発生が顕著なプライマー
セットを用いて、各リアルタイム PCR 試薬によ
る反応特異性の比較を行いました。 HeLa 細胞
Total RNA から合成したｃＤＮＡを用いてヒト　β-Actin 遺伝子 (188 bp) を増幅しました。
コピー数が少なく
なるとプライマー
ダイマーが混入
10
20
(Applied Biosystems 7900HT 使用 )
10-5
5
15
SYBR® Green I 検出系による
反応特異性の比較
10-1
新規エンハンサー * を採用し、ターゲットごとの PCR 効率の
ばらつきを最小限に抑えることにより、広いダイナミックレンジ
を実現しています。
* 特許出願中
0
10
Cycles
B 社試薬
PCR効率の比較
2 P
10 0 希釈
10-1
測定精度の検証
3 測
微妙なコピー数の差を、 精度よく検出することができます。
A 社試薬
1.000 E+1
24.5
B 社試薬
slope: 3.2587
相 関係数: 0.9956
24.0
23.5
Ct 値
10 -4
⊿Rn
10 -4
ＴａｑＭａｎ® 検出系による GAPDH cDNA の定量
SYBR® Green I 検出系による
ノロウイルス G1 cDNA の検出
（Roche Diagnostics LightCycler 1.1 使用）
（Roche Diagnostics LightCycler 1.1 使用）
23.0
22.5
22.0
21.5
1.000
21.0
20.5
-1.00
-0.90
-0.80
-0.70
-0.60
-0.50
-0.40
-0.30
-0.20
-0.10
0.00
Log 鋳型量 (20.5 倍 [1.414 倍 ] 希釈）
1.000 E-1
0
5
10
15
20
Cycles
25
30
35
お試し用サンプルとして、
SYBR® Green I 検出による cDNA 2 0.5 倍希釈系列の検出
40 回用の商品 (￥8,500 円相当 )
・ サンプル ： HeLa 細胞 Total RNA 由来ｃDNA の 2 0.5（=1.414）倍希釈系列（7 水準 , N=4 ）
・ ターゲット遺伝子 ： GAPDH
・ 反応液量 ： 20 µl
・ 測定装置 ： Applied Biosystems 7900HT
価格
をご進呈いたします！
品名
包装
*
1ml×1 本 [40 回用 ]
1.67ml×3 本 [200 回用*]
・ THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix
・ 50×ROX reference dye
(1.67ml×3 本 )×5 [1,000 回用*]
1ml×1 本 [40 回用*]
THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix
1.67ml×3 本 [200 回用*]
・ THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix
・ 50×ROX reference dye
(1.67ml×3 本 )×5 [1,000 回用*]
THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix
( 保存温度 ： -20℃)
Code No.
価格
QPS-101T
QPS-101
QPS-101X5
QPS-201T
QPS-201
QPS-201X5
￥8,500
￥29,000
￥133,000
￥8,500
￥29,000
￥133,000
リアルタイム PCR 用 cDNA 合成キット
ReverTra Ace® qPCR RT Kit
(Code No. FSQ-101; 200 回用）
￥38,000
とのセットで更にお得です。
*50μl 反応時の使用回数で表示しています。
毎日使う試薬だからこそ、コストパフォーマンス重視で！ ●THUNDERBIRD® Probe qPCR RT Set*
(Code No. QPS101/FSQ101 ￥63,000)
●THUNDERBIRD® SYBR® qPCR RT Set*
(Code No. QPS201/FSQ101 ￥63,000)
* それぞれ QPS-101、QPS-201 とのセットです。
裏面に詳細がございます。
THUNDERBIRD® ってどんな試薬？
対応機器一覧
THUNDERBIRD® qPCR Mix は、Taq DNA polymerase をベース
として開発された、高効率リアルタイム PCR 用マスターミックス
（2× 濃度） です。本製品は、新規エンハンサーの採用を始め、
組成を根本的に見直すことによって、反応特異性と PCR 効
率が飛躍的に向上しています。 これらの改良によって、　幅広
い定量可能域 （ダイナミックレンジ） を実現しました。
また、抗体を用いるホットスタートの機能や、ガラス壁への
吸着防止に加え、ROX の濃度を調整できることから、さらに幅
広い機器で同様に用いることができます。
さらに、 製造方法の見直しなどにより、製造コストを大幅に抑
えることに成功しました。
ラボ Tips
TaKaRa
BioFlux
※お試し用サンプル
(40 回用 ) をご用意
しております。
リアルタイム PCR 用 cDNA 合成キット
ReverTra Ace® qPCR RT Kit
200 回用
（10 µl 反応）
リアルタイム PCR でのトラブルのかなりの部分は cDNA合成に
起因しているようです。本キットは、
リアルタイム PCR 用鋳型
cDNA 作製に最適な、簡便かつ効率的な cDNA 合成キットです。
M 1 2 3 4 5
配列によるプライマー
ダイマー 形成傾向の検討
rTaq DNA polymerase を用い、 様々
なプライマー配列で PCR を実施しま
した。 メインバンドの下のバンドが　プライマーダイマーです。
1
1
幅広いダイナミックレンジを実現
1
2
レア発現遺伝子の検出に最適
3
わずか 15 分で逆転写反応完了
部分的に相補的＋3’末端GC含量高
< キット構成 >
5×RT Buffer
Enzyme Mix
Primer Mix
Nuclease-free
Water
最適化された Primer Mix(Oligo dT と Random primer)、および Buffer 組成の
改良により、 RNA を偏りなく安定に逆転写することができます。低コピー域
の検出率が向上しており、広いレンジで高い直線性を得ることができます。
リアルタイムPCR 反応液に最大 20% まで逆転写反応液を持ち込むことが
可能であり、さらにレア発現遺伝子の検出率を高めることができます。
5’-GATTCCTGGTTCGGGTGTTA
5’
- GATAGGAAGTAACTCAACCC
5’-GATTCCTGGTTCGGGTGTTA
Stratagene
●定番商品紹介●
プライマーの配列によっては、 顕著にプライマーダイマーが生じてしまう場
合があります。 特に、① 3’末端が相補的なプライマーペア （下図 ： 3, 4) 、 ②
3’末端側の GC 含量が高いプライマー ( 下図 : 5 ) の場合、 注意が必要なよう
です。 以下の実験では、 3’末端の重なりが 1 塩基の場合 ( 下図 : 2) は大丈
夫でしたが、 理想的には 1 塩基も重ならない方がベストのようです。
3’末端が相補的
Bio-Rad/MJ
TOYOBO の研究員が日々使用している実験テクニックをご紹介いたします。
プライマーダイマーが生じやすい配列
100 bp Ladder Markers
相補性なし
3’ 末端 1 塩基の重なり
3’ 末端 2 塩基の重なり
3’ 末端 4 塩基の重なり
部分的に相補的＋3 末端 GC 含量高
Roche
Diagnositics
第 2 回　リアルタイム PCR の精度をアップ
● プライマーダイマーについて
M:
1:
2:
3:
4:
5:
ABI PRISM 7000
ABI PRISM 7700
Applied Biosystems 7300
Applied Biosystems 7500
Applied Biosystems 7500 FAST
Applied Biosystems 7900HT
Applied Biosystems Step One™
LightCycler 1.x
LightCycler 2.0
LightCycler 480
iCycler iQ
Mx3000P
Mx3005P
Mx4000
Thermal Cycler Dice
Line Gene
Applied
Biosystems
30.0
5’-TTAGCACGTACTGGCTTGAT
5’-TAGCACGTACTGGCTTGATA
5’-GGAAGTAACTCAACCCTAAC
● リアルタイム PCR における誤差の低減
Ct値
31.0
無視できないピペット誤差
リアルタイム PCR の際、20 µl 以下の少ないボリュームで反応を行うことも多
31.56
31.90
32.40
32.76
33.03
Ct値平均
100%
40%
100%
60%
40%
PCR成功率
X: 検出できず
32.0
33.0
いと思いますが、50 µl 反応のプロトコールをそのまま比例計算し、サンプルの
添加量を 1 µl とかに設定されている方もいらっしゃるのではないでしょうか？
おそらく、コントロール実験を行なわれているとは思いますが、注意が必要です。
ピペットのカタログを見ると、1 µl 吸引
時の誤差スペックは 3 % 前後。
その他の要因で最大で 10 % 前後
2.5 µl
1 µl サンプル
( ひどい時はもっと） ずれてしまう可能
比例的に
性はあると考えられます。
減らして
サンプルを希釈するなどして、添加量
大丈夫？
が多くなるよう液量を調整すべきです。
50 µl 反応 20 µl 反応
( 切り取って、 ノートに貼ってご参照ください）
逆転写反応はわずか 15 分で完了。 RNase H 処理などは必要ありません。
34.0
×× ×
××
×× ×
ReverTra Ace® A社キット B社キット C社キット D社キット
qPCR RT Kit
TNF-α遺伝子 （レア発現） の検出における検出率の比較
HeLa 細胞の Total RNA 100ng を各社キットを用いて逆転写した後、 反応液の 2%
を用いて、 SYBR® Green I アッセイ法によるリアルタイム PCR 解析を行いました。
品名
包装
THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix 200 回用
THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix 200 回用
ReverTra Ace® qPCR RT Kit
200 回用
Code No.
価格
QPS-101
QPS-201
FSQ-101
\29,000
\29,000
\38,000
( 詳細は弊社ウェブサイト [http://www.toyobo.co.jp/bio] をご覧ください）
取扱店
ライフサイエンス事業部（大阪）
〒530-8230 大阪市北区堂島浜二丁目 2 番 8 号
TEL 06-6348-3786
FAX 06-6348-3833
(E-mail) [email protected]
ライフサイエンス事業部（東京）
〒141-8633 東京都品川区東五反田二丁目 10 番 2 号
東五反田スクエア
TEL 03-6422-4819
FAX 03-6422-4951
(E-mail) [email protected]
Toyobo テクニカルライン
TEL 06-6348-3888
( 9:00 ∼ 12:00 13:00 ∼ 17:00 [ 土、日、祝を除く ] ）
FAX 06-6348-3833
( E - m a il ) t ech_o s aka@ to y o b o .jp
Toyobo Web Site
[http://www.toyobo.co.jp/bio]
2010.6.16