赤痢菌型別検査方法としての Amplified Fragment Length

513
原
著
赤痢菌型別検査方法としての Amplified Fragment Length
Polymorphism（AFLP）法の有用性の検討
1）
福岡県保健環境研究所，2）国立医薬品食品衛生研究所
野田多美枝１）
石黑 靖尚１）
村上 光一１）
宮原美知子２）
濱
光宏１）
（平成 18 年 2 月 15 日受付）
（平成 18 年 5 月 8 日受理）
Key words : Shigella, bacterial strain typing, amplified fragment length polymorphism（AFLP）
, shigellosis,
molecular epidemiology
要
旨
分子疫学的解析法の一つである amplified fragment length polymorphism（AFLP）法が，赤痢菌に対す
る型別方法として有用であるか否かを検討した．赤痢菌 51 株を，AFLP 法とコリシン型別法およびパルス
フィールドゲル電気泳動法（PFGE 法）の 3 法で型別し，「型別能力」
，「再現性」
，「識別能力」
，「解釈の容
易さ」および「実行の容易さ」の 5 項目について比較を行った．その結果 AFLP 法は，型別能力が 100％，
識別能力が Simpson s Index にて 1.000 と優れている反面，結果の解釈の容易さ，実行の容易さ，さらに再
現性が劣っていることが明らかになった．このうち再現性は，ATCC 株 3 株について 3 回繰り返して全工
程を実施し，結果を比較したところ，AFLP 法は株により Dice 係数を用いた相似値で 81.9％ から 90.5％ で
あり，PFGE 法の 92.3％ から 100％ に比べ劣っていた．しかし，再現性が若干劣っていても系統樹を作成
してクラスター解析を行うには問題はないと考えられた．これらのことから，AFLP 法は再現性が若干低い
ため，赤痢菌に対しては，クラスター解析の手法としては有用であるが，単独で感染源および感染経路特定
のための型別方法として用いるのは困難であると結論付けられた．
〔感染症誌
序
80：513∼521，2006〕
毒が発生した場合には，他の多くの食中毒とは異な
文
細菌性赤痢は，現在でも世界で毎年約 8,000 万人が
１）
り，患者からの二次感染が起こる場合がある．
したがっ
罹患し，うち約 70 万人が死亡している ．我が国でも
て細菌性赤痢は，今なお重要な感染症であり，赤痢菌
細菌性赤痢は，「感染症の予防および感染症の患者に
は食中毒の重要な病因物質でもある．
対する医療に関する法律」で二類感染症に分類され，
一方，感染症，食中毒の感染拡大防止，および再発
その病原菌は「食品衛生法」で食中毒の病因物質とし
予防には，感染源特定，感染経路特定，および過去の
て 1999 年に追加された．我が国における細菌性赤痢
流行の再燃か，新たな流行であるのかの特定などを行
患者（疑似症患者および保菌者を含む）の届け出は
うための情報を得ることが重要であり，これらの情報
2001 年 844 例，2002 年 699 例，2003 年 473 例，2004
を得る手段として型別検査が用いられる．赤痢菌の場
年 578 例である（国立感染症研究所
合は，感染症および食中毒の両面の性質を持つことか
ター
細 菌 性 赤 痢 2004 年
感染症情報セン
http：!
!
idsc.nih.go.jp!
ら，型別検査の重要性がより増大する．
disease!
shigellosis!
2004chumoku.html）
．2001 年には
赤痢菌の型別検査としては，まず血清型別検査が選
韓国産カキを原因とする大規模広域食中毒に発展した
択される４）．赤痢菌は血清型別検査によって，4 菌種
事例２）があり，かつ生カキを摂食した家族からの二次
に大別され，さらに Shigella sonnei 以外の 3 菌種は菌
３）
感染も起こっている ．このように赤痢菌による食中
別刷請求先：（〒818―0135）福岡県太宰府市向佐野 39
福岡県保健環境研究所病理細菌課 野田多美枝
平成18年 9 月20日
種内で細かい血清型に型別される．しかし，国内で一
番多く分離される S. sonneiは，菌種内での細かい血清
型がなく，感染源特定あるいは感染経路特定のために
514
野田多美枝 他
は，さらなる型別検査が要求される．それらには，表
ン反応，二段階の PCR による選択的な DNA 断片の
現型別検査では，コリシン型別（S. sonneiのみ）
，ファー
増幅（preselective PCR および selective PCR）
，PCR
ジ型別および薬剤感受性試験，遺伝子型別検査では，
産物のシークエンサーによる泳動，ソフトウエアによ
プラスミド解析，リボタイピングおよびパルスフィー
る泳動データの解析の各段階からなっている．
４）
ルドゲル電気泳動（PFGE）法などがある ．
赤痢菌の DNA の抽出は，菌株を LB Broth Lennox
一般に遺伝子型別検査の方が，表現型別検査より優
（Difco 社）を用いて 35℃，24 時間振とう培養した
れているとされるが，赤痢菌の遺伝子型別検査として
ものから，DNA 抽出キットの ISOPLANT（Nippon
５）
６）
は，現在 PFGE 法が多用されている ．しかし，PFGE
Gene 社）を用いて行った．DNA 溶液中の RNA を除
法は検査に約 1 週間の日数を要し，操作も煩雑である
くため，キット添付の RNase A で反応させ，終了後
といった問題点もあり，細菌性赤痢の感染拡大防止の
はフェノール!
クロロホルム!
イソプロピルアルコール
ための迅速な対策を行うには，PFGE 法の能力を上回
（25：24：1）（Nippon
る新たな型別検査方法が必要である．
エタノール沈殿を実施したものを，AFLP 法のサンプ
Amplified
fragment
length
polymorphism
７）
Gene 社）処理を行い，再度
ル DNA とした．
（AFLP）法 は，菌 か ら 抽 出 し た DNA を 2 種 類 の
DNA の制限酵素による切断，制限酵素断片へのア
制限酵素で消化し，得られた DNA 断片のうち特定の
ダプターのライゲーション反応，および二段階の PCR
も の の み を 選 択 的 に polymerase
reaction
は，Applied Biosystems 社の AFLP microbial finger-
（PCR）で増幅した後，正確な DNA 断片の長さ を
chain
printing の試薬キットを使用した．AFLP 法を赤痢菌
DNA 自動シークエンサー等により測定して多型を解
に応用するにあたり，初めはこの試薬キット添付のプ
析する方法であり，検査に要する日数が PFGE 法の
ロトコールに準拠した反応条件で行った．しかし，検
およそ半分でかつ，識別能力が高いことなどが報告さ
出される DNA フラグメントの本数が少なく，かつ蛍
８）
れている．また本法は，従来から植物の遺伝子解析
光強度（ピークの高さ）が弱いため，反応条件を変更
に利用されており，細菌の分野では，Campylobacter
した．以下には，
変更後実施した方法を記載している．
に対する疫学的研究９）やメチシリン耐性 Staphylococcus
酵素混合液は 1 サンプル当たり，10×T4 DNA Li-
１０）
aureus の遺伝子型別についての報告 などがあり，優
gase Buffer with ATP（New England Bio Labs 社）
れた型別方法であるとされている．しかし，すべての
を 0.1µL，0.5M NaCl を 0.1µL，5U!
µL MseI（第一化
細菌に有用であるとされる型別検査方法はなく，他の
学）を 0.2µL，50U!
µL EcoR I（タカラバイオ社）を
細菌に応用可能な型別検査が赤痢菌に有用であるかど
0.1µL，100U!
µL T4 DNA Ligase（New England Bio
うかは実際に検討してみないと不明であり，さらに有
Labs 社）を 0.1µL，および滅菌蒸留水 0.4µL を混合し
用性の検討は，一定の基準に基づいて正確および公正
て作成し，スピンダウンの後，氷冷した．制限酵素ラ
１１）
に能力を評価することが大切であると考えられる ．
イゲーション反応用のプレミックス液は，1 サンプル
そこで我々は，一定の基準に基づいてこれらの長所を
当たり 10×T4 DNA Ligase Buffer with ATP を 1
持つとされる AFLP 法の能力を，コリシン型別法お
µL，0.5M
よび PFGE 法の能力と比較することにより，赤痢菌
を 0.5µL，MseI Adaptor pairs を 1µL，EcoR I Adaptor
の型別検査としての有用性を明らかにすることを目的
pairs を 1µL，および酵素混合液を 1µL 混合し作成し
として検討を行った．
材料と方法
1．供試菌株
NaCl を 1µL，1mg!
mL 牛血清アルブミン
た．MseI Adaptor pairs と EcoR I Adaptor pairs は，
あらかじめ 95℃5 分間の熱処理後，室温で 10 分間放
置したものをスピンダウンの後使用した．
患者の渡航先や分離時期など，明らかに由来の異な
このプレミックス液 5.5µL に，サンプル DNA 0.1µg
る患者からの分離株 31 株と，国内同一集団感染事例
を溶解した滅菌蒸留水 5.5µL を加えた．この溶液を
株 10 株および American Type Culture Collection
サーマルサイクラーで 23℃，8 時間，ついで 60℃，20
（ATCC）株 10 株の計 51 株を用い た．菌 種 の 内 訳
分間反応させた．サーマルサイクラーは PCR Thermal
は，S. sonneiは ATCC 株 5 株および同一集団感染事
Cycler SP TP 400（寶酒造株式会社）を用いた．こ
例株 10 株を含む患者分離株 37 株の計 42 株，S. boydii
の反応液に，10 倍希釈した TE buffer を 189µL 加え
は ATCC 株 5 株，S. flexneri は患者分離株 3 株および
て反応希釈液とした．
S. dysenteriae は患者分離株 1 株である（Table 1）
．
反応希釈液を 4µL，EcoR I
preselective
Primer
2．AFLP 法
（Core sequence）を 0.5µL，MseI preselective Primer
AFLP 法は，DNA の抽出，DNA の制限酵素によ
（Core sequence）
を 0.5µL，AFLP Amplification Core
る切断，制限酵素断片へのアダプターのライゲーショ
Mix を 15µL，それぞれ混合し，preselective PCR を
感染症学雑誌 第80巻 第 5 号
赤痢菌に対する AFLP 法の有用性の検討
515
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行った．反応条件は，72℃ 2 分間処理後，熱変性 94℃
次いで，得られた PCR 産物の 5µL を 10 倍希釈し
20 秒間，アニーリング 56℃ 30 秒間，伸長 72℃ 2 分
た TE buffer 45µL で希釈した．この PCR 産物希釈
間，反応サイクルは 20 回で行った．サーマルサイク
液 1.5µL にプライマー AFLP EcoR I-O を 0.5µL，プラ
ラーは，GeneAmp PCR System Model 9600（Perkin-
イマー AFLP MseI-A を 0.5µL，および AFLP Core
Elmer 社）
を用いた．Ramp times は 0.01 に設定した．
Mix 7.5µL を混合し，selective PCR を行った．反応
平成18年 9 月20日
516
野田多美枝 他
条件は，94℃ 2 分間の後，熱変性 94℃ 20 秒間，アニー
変 え て こ れ ら の ATCC 株 3 株 に つ い て 3 回 実 施 し
リング 66℃ 30 秒間，伸長 72℃ 2 分間，アニーリン
た．再現性は，Dice 係数１４）より得られた相似値を用い
グの温度は 1 サイクルで 1℃ ずつ下げていき，10 反
!nX＋nY）で表さ
て比較した．Dice 係数は，F＝2nXY（
応サイクル，熱変性 94℃ 20 秒間，アニーリング 56℃
れ，nX は分離株 X からの DNA フラグメント総数，nY
30 秒間，伸長 72℃ 2 分間の反応サイクルを 20 回行っ
は分離株 Y からの DNA フラグメント総数，nXY は 2
た．その後，60℃ 30 分間反応させた．サーマルサイ
つの分離株で同じ分子量のフラグメントの数を示す．
クラーは，GeneAmp PCR System Model 9600 を用
この F 値が 1.0 であれば，泳動パターンが同一であ
いた．Selective PCR 用のプライマーは，試薬キット
る．
で 64 通りの組み合わせが可能であるので，DNA フ
③識別能力
ラグメントの検出本数や蛍光強度（ピークの高さ）の
明らかに由来の異なる菌株同士を異なる型に型別す
Index１５）で評価した．集団発生
強さをあらかじめ検討した．すなわち selective PCR
る能力を，Simpson s
用のプライマーの，AFLP EcoR I および AFLP MseI
事例株 10 株は，No.11 を代表株とみなして Simpson s
の組み合わせ，O―O，O―A，O―T，O―G，O―C，A―C，
Index を求めた．PFGE 法および AFLP 法は得られた
G―A，および T―C の 8 通りに つ い て，S. sonneiお よ
バンドおよびフラグメントの出現パターンを比較し 1
び S. boydiiの ATCC 株を用いて AFLP 法を行い，そ
本でも異なれば異なる型とした．
の結果，2 菌種ともに検出された DNA フラグメント
④解釈の容易さ
の本数が多く，蛍光強度（ピークの高さ）が強かった
最終的な反応結果を得て，評価するまでの手順の容
プライマー AFLP EcoR I―O，プライマー AFLP MseI
易さを比較した．コリシン型別はペトリ皿上の阻止帯
―A の組み合わせを選択し，その後の実験に使用する
の有無を確認し，阻止パターン表１３）と比較した．PFGE
こととした．
法は泳動像を写真撮影し，これを目視で比較した．
この selective PCR 産物を 2µL，脱イオンホルムア
AFLP 法は，数値 で 表 さ れ る 泳 動 デ ー タ を Finger-
ミド（Amresco 社）とブルーデキストラン溶液 5 対
printing II に取り込んで，相同性の解析を行った．菌
1 の溶液を 2µL，Gene Scan Size Standard を 0.5µL
株間の泳動パターンの比較は Dice 係数を用い，系統
混合し，95℃ 3 分間加熱し，その後，氷で急冷した．
樹作成は unweighted pair-group method using aver-
この溶液 2µL を，Genescan ソフトウエアを搭載した
age linkage（UPGMA）法で行った．
377 DNA Sequencer（ABI 社）を用いて泳動した．
⑤実行の容易さ
泳動ゲルには ABI PRISM Geluxe 377-48（ABI 社）
検査に要する日数および費用で比較した．検査に要
を用いた．菌株間の相同性の解析（系統樹作成）は，
する費用は，必要な機器，ランニングコスト等を考慮
Fingerprinting II ソフトウエア（Bio Rad 社）を用い
して総合的に判断した．
て行った．
成
3．PFGE 法およびコリシン型別法
績
コリシン型別法，PFGE 法および AFLP 法の型別
PFGE 法は，制限酵素 XbaI（タカラバイオ社）を
用い，泳動時間を 5 秒∼55 秒，22 時間として我々の
１２）
既報 に従って行い，コリシン型別法は厚生省監修，
１３）
微生物検査必携，細菌・真菌検査，第 3 版 に従った．
結果は，Table 1に示す．コリシン型別法は，供試菌
株 中 の S. sonnei
42 株 の う ち 27 株 を 7 型 に 型 別 し
た．PFGE 法は供試菌株 51 株を 41 型に，AFLP 法は
供試菌株 51 株を 51 型に型別した．AFLP 法では，35
4．評価方法
から 492 base pairs の長さのフラグメントが，株によ
コリシン型別法と PFGE 法および AFLP 法とを，
り 22 から 56 本，平均すると 37 本のフラグメントが
菌の型別方法を評価する項目として多用される「型別
能力」
，「再現性」
，「識別能力」
，「解釈の容易さ」およ
１１）
び「実行の容易さ」の 5 項目 について比較した．
検出された．
Fingerprinting II ソフトウエア（Bio Rad 社）を用
いて，相同性の解析を行い，作成した系統樹を Fig. 1
①型別能力
に示す．AFLP 法では，PFGE 法で識別できなかった
被検菌株のうち型別可能であった菌株の割合を示し
株（P4，P6，P23）を別の型に識別でき，また今回は
た．
一つのフラグメントでも異なれば異なる型としたの
②再現性
で，同一感染事例株 10 株もすべて別の型となった．
AFLP 法は，菌の培養，DNA 抽出から泳動まです
S. sonneiと他の 3 菌種は明らかに異なるクラスターに
べての工程の検査実施日を変えて，S. sonnei
ATCC
分類され，S. sonneiの集団感染事例株 10 株は相似値
株 No.9290，No.29029，No.29031 の 3 株を 3 回繰り返
80％ でみると，同一のクラスターに分類された．ま
して実験を行った．PFGE 法も，同様に検査実施日を
た今回，S. sonneiとの比較のために他の 3 菌種も用い
感染症学雑誌 第80巻 第 5 号
赤痢菌に対する AFLP 法の有用性の検討
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ているが，用いた菌株数が少ないため菌種内および菌
い血清型とされている S. flexneri 88-893１６）は S. flexneri
種間の詳細な解析は難しいものの，S. flexneriの新し
と近い関係に位置付けられ，S. boydii 5 株中 3 株は同
平成18年 9 月20日
518
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一のクラスターに分類された．
コリシン型別法と PFGE 法および AFLP 法とを，
型に型別でき 81.8％ となった．
2．再現性
「型
菌の型別方法を評価する項目として多用される１１）
PFGE 法の再現性は，株により 92.3％ から 100％，
別能力」
，「再現性」
，「識別能力」
，「解釈の容易さ」お
AFLP 法の再現性は 81.9％ から 90.5％ であった（Ta-
よび「実行の容易さ」の 5 項目について比較した結果
ble 3）
．再現性は AFLP 法よりも PFGE 法が優れて
を，Table 2に示す．
いた．
1．型別能力
3．識別能力
型別能力は，型別不能が少ないほど能力が高いとさ
識別能力は Simpson s Index で 0.900 以上が望まし
れる．PFGE 法および AFLP 法は，すべての株が型
い と さ れ て い る１５）が，AFLP 法 お よ び PFGE 法 の
別でき型別能力は 100％ であり優れていた．コリシン
Simpson s
型別法の型別能力が 64.3％ と低くなっているのは，
AFLP 法および PFGE 法とも優れていた．コリシン
供試菌株の中には同一事例の株が 10 株含まれてお
型別は，Simpson s
り，その株が型別不能であったためと考えられる．そ
は劣っていた．
Index は 0.900 以 上 で あ り，識 別 能 力 は
Index が 0.693 となり，識別能力
のため集団感染事例の 10 株を 1 株として，コリシン
4．解釈の容易さ
型別法の型別能力を計算すると 33 株のうち 27 株を 7
コリシン型別法および PFGE 法は，結果の判定に
感染症学雑誌 第80巻 第 5 号
赤痢菌に対する AFLP 法の有用性の検討
519
は，コンピュータや高価な解析ソフトは必ずしも必要
いるが，その結果は同一菌株内での泳動パターンが
ではないが，AFLP 法は結果の出力時だけではなく，
「indistinguishable」との 表 記 の み で，DNA 抽 出 段
解析時に専用の解析ソフトが必要不可欠である．これ
階以降の検討方法や数値による結果が明記されていな
らのことから，解釈の容易さはコリシン型別法および
い．同じく Valsangiacomo ら２０）の報告では，DNA 抽
PFGE 法が AFLP 法より優れていた．
出段階からの検討でも十分な再現性があったとされて
5．実行の容易さ
いるが，DNA 抽出段階以降の検討方法や用いた菌株
検査に要する日数で比較すると，AFLP 法はコリシ
数および数値による結果が明記されていない．一方，
ン型別法および PFGE 法のおよそ半分の日数で検査
数値による結果を表記している報告をみると，Huys
が終了し優れていた．次に検査に要する費用は，AFLP
ら２１）は「再現性 が 95.5％ か ら 98.5％ で あ っ た」と 報
法および PFGE 法は，多数の高価な機器が必要であ
告しているが，これは 1 株のみでの検討であり，
リファ
るが，コリシン型別法は高価な機器は必要とせず，試
レンス株として電気泳動毎に同時に泳動したもので，
薬等のランニングコストもコリシン型別法が一番廉価
DNA 抽出から電気泳動までの全工程の再現性を検討
であった．これらを総合的に判断すると，実行の容易
したものではない．全工程を検討したものでは，Duim
さはコリシン型別法が一番優れていた．
ら９）は 8 株を用いて 5 回の再現性の検討を行い，平均
考
値や偏差は記載していないものの「90％ から 98％ の
察
今回，赤痢菌に対する型別方法として AFLP 法の
再現性が得られた」と報告しており，AFLP 法の全工
程における再現性が，特段高いものでないことがわか
能力を評価する目的で実験を行った．
１１）
Arbeit は，型別方法の能力を評価する場合，対象
る．また，Bagley ら２２）も DNA 抽出から電気泳動まで
として互いに関連のない株を多く用いて評価するのが
の全工程において，6 株を用いて 2 回の再現性の検討
良く，型別方法の評価基準としては，型別能力，再現
を行い，その結果は「11.3％ のフラグメントが再現性
性，識別能力，解釈の容易さ，および実行の容易さを
のないフラグメントであった」と報告している．我々
１７）
用いることが適当であるとしている．満田 も評価基
は DNA 抽出から電気泳動までの全工程において，3
準としてはこれらの項目を用いており，これらの対象
株を用いて 3 回の繰り返し実験を行った．その結果，
および項目で型別能力を評価することが，最も正確，
AFLP 法の再現 性 は，81.9％ か ら 90.5％ で あ り，平
公正であると考えられ，我々もこの評価基準に準拠
均すると 85.6％ であった．これは再現性のないフラ
し，赤痢菌に対する型別方法としての AFLP 法の能
グメントが 14.4％ であったことと同義で，11.3％ の
力を評価した．その結果，AFLP 法はコリシン型別法
フラグメントに再現性がなかったとする Bagley ら２２）
および PFGE 法に比較し，型別能力および識別能力
の結果と同程度の結果であると考えられる．このよう
が優れている反面，結果の解釈の容易さ，実行の容易
に AFLP 法では，評価項目中最も重要と考えられる
さ，さらに再現性が劣っていることが明らかになっ
再現性が低いことは，型別方法として致命的とも考え
た．
られ，実際の赤痢菌感染症事例に即時的に応用するこ
AFLP 法のこれらの評価結果のうち，最重要と考え
ら れ る 再 現 性 に つ い て は，Desai ら１８），Dijkshoorn
１９）
２０）
とは難しいと考えられる．
AFLP 法の再現性が低い要因は，検査の不安定さに
ら ，および Valsangiacomo ら は「再現性のある結
あると考えられ，この不安定さを招く原因は，泳動毎
果が得られた」と報告している．再現性を検討する場
に変化するフラグメントの蛍光強度２１），次に酵素類の
合，AFLP 法の DNA 抽出，種々の 酵 素 反 応（DNA
製品差あるいはロット差２３），および DNA の抽出方法
の制限酵素による切断，制限酵素断片へのアダプター
による差２３）の 3 点が既に報告されている．フラグメン
のライゲーション反応，二段階の PCR）
，PCR 産物の
トの蛍光強度の変化に関して，我々は，電気泳動のみ
シークエンサーによる電気泳動，ソフトウエアによる
による変動を調べるため，一つの selective PCR 反応
泳動データの解析の段階のうちの，どの段階の再現性
産物を，3 回別々に電気泳動を実施した．その結果，
を検討したかを明らかにするとともに，結果を数値等
泳動毎にフラグメントの強度が若干変化するため，
の検証可能な形で表すことが重要と考えられる．しか
データとして選択されるフラグメントが泳動毎に異な
１８）
し，前述の Desai ら の報告では，種々の酵素反応お
り，再現性は 90.3％ から 91.3％ で平均 90.6％ であっ
よび電気泳動段階の検討と，DNA 抽出段階の検討の
た（データ不掲載）
．Duim ら９）の報告でも，AFLP 法
2 通りで再現性を検討しているが，検討に用いた菌株
の再現性を調べると電気泳動毎に同じ菌株でも 2∼
数 お よ び 数 値 に よ る 結 果 が 明 記 さ れ て い な い．
10％ の異なったフラグメントが現れたとされてい
Dijkshoorn ら１９）の報告では，少なくとも DNA 抽出の
て，我々の結果とほぼ同じ結果が述べられている．同
段階を含め 6 株を用いて 6 回の再現性の検討を行って
様に，Huys ら２１）の報告でも泳動毎にデータの変動が
平成18年 9 月20日
520
野田多美枝 他
起こることが指摘されている．このように AFLP 法
法を開発するか，あるいは赤痢菌に応用可能な PFGE
は，DNA 抽出，種々の酵素反応，および電気泳動の
法より高い能力を持つ型別方法を開発することが必要
それぞれの段階が，おのおの，再現性に影響を及ぼし
と考えられる．
ていると考えられる．今回 AFLP 法は，同一ストレ
謝辞：S. flexneri 88-893 を血清型別して頂きました，東
インを原因菌とすると推測される集団感染事例株 10
京都健康安全研究センター 松下 秀博士，ならびに貴重
株をも，10 型に分類した．このことは，菌株の変異
な菌株をご提供いただきました福岡市保健環境研究所 川
に よ っ て 多 く の 型 に 分 類 さ れ た の か，あ る い は
内良介先生に深謝いたします．また本研究遂行に当たり御
AFLP 法の再現性の低さと同根の，検査の不安定さに
高配をたまわりました，福岡県保健環境研究所 吉村健清
起因するものかの判断が難しい．
所長に深謝するとともに，本論文作成に際し御助言頂きま
１１）
実際の単独の集団感染事例の場合，被検菌株の疫学
的関連を即座に判断せねばならず，一つの型が一つの
した，福岡県保健環境研究所 堀川和美博士，竹中重幸博
士に感謝いたします．
ストレインを表す型別方法が実用的である．しかし，
文
献
AFLP 法の場合，今回検討に用いた集団感染事例株
1）World Health Organization : Guidelines for the
は，フラグメントが一本でも異なれば異なった型とみ
control of shigellosis, including epidemics due to
Shigella dysenteriae type 1, Geneva, 2005.
なした場合は，すべて異なった型と型別してしまっ
た．これらの型がどの程度近縁であれば，同一ストレ
インであるのかを判断するためには，相似値にカット
オフ値を設定せねばならないが，検査の不安定さによ
りカットオフ値を即座に設定することが難しい．この
ため，実際の感染症事例に即時的に応用することには
この面からも難点がある．
一方で AFLP 法は，赤痢菌以外の細菌では，電気
泳動の結果から系統樹を作成しクラスター解析に利用
されているものがある．そのなかでは，菌種の分類学
的検討が行われ，菌種内でのストレイン分類や，他の
菌種との遺伝的な類似性が調べられ成果をあげてい
る９）２１）．電気泳動の結果から系統樹を作成することは，
PFGE 法でも行われるが，フラグメント数は AFLP
法の方がはるかに多く，かつフラグメントの長さが数
値として系統樹作成ソフトに取り込めるため，PFGE
法より正確な系統樹が作成できる．また，Duim ら９）
も報告しているが，クラスター解析の場合には系統樹
の全体像から各菌株の関連を判断するので，AFLP 法
の再現性が若干低いことの影響は少ない．実際に，今
回は S. sonnei以外の 3 菌種に関しては，用いた菌株数
が少ないため，菌種内および 3 菌種間の詳細なクラス
ター解析は難しかったが，S. sonnei は他の 3 菌種とは
明らかに異なるクラスターに分類された．
これらのことから AFLP 法は，遺伝子型の近縁度
を調べ菌株の分類を行うクラスター解析などの手法と
しては有用であるが，PFGE 法に比較し再現性が若干
劣るため，疫学的関連を即座に判断する必要のある感
染症や食中毒発生時に，赤痢菌の遺伝子型別検査方法
として単独で用いることは難しいと考えられる．今回
の検討により，従来明らかでなった AFLP 法の赤痢
菌に対する，型別方法としての 能 力 の 位 置 付 け と
AFLP 法の問題点が明らかになったことは有意義なこ
2）寺嶋
淳，田村和満，広瀬健二，泉谷秀昌，渡
辺治雄，宮原美知子：輸入カキが原因と推定さ
れる Shigella sonnei による食中毒の発生，病原微
生物検出情報 2003；24：3.
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Amplified Fragment Length Polymorphism Genotyping of Shigellae and
Comparison to Pulsed-field Gel Electrophoresis and Colicin Typing
Tamie NODA１）, Koichi MURAKAMI１）, Mitsuhiro HAMASAKI１）,
Yasuhisa ISHIGURO１） & Michiko MIYAHARA２）
1)
Fukuoka Institute of Health and Environmental Sciences, 2)National Institute of Health Sciences
Shigella is an etiological agent of communicable and food-borne disease worldwide, so it is important to
develop typing for Shigella in epidemiological studies. We compared amplified fragment length polymorphism (AFLP), molecular epidemiological typing, to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and colicin typing
in typeability, reproducibility, discriminatory power, ease of interpretation, and ease of use for 51 Shigella isolates to determine AFLP applicability to Shigella. AFLP showed less reproducibility and ease of interpretation although it was superior to PFGE and colicin typing in typeability and discriminatory power. Specifying
the reproducibility of these typing methods, the intrastrain similarity of AFLP was 81.9％―90.5％ in each of
three strains tested in triplicate trials, while PFGE showed higher similarity, ranging from 92.3％―100％.
AFLP created a phylogenetic tree and classified four Shigella species taxonomically, despite its lower reproducibility. These results suggest that AFLP is inferior to PFGE as molecular typing for Shigella epidemiologically in outbreaks or sporadic cases, although AFLP can create a phylogenetic tree for taxonomical purposes.
平成18年 9 月20日