蛋白質核酸酵素

分析法による生体高分子の分析梅田芳久
質 量 分 析 計 と液 体 ク ロ マ トグラ フ ィー を連 結 す る イ ン タ ーフ エー ス と して 開 発 され た イ
オ ンス プ レー ・イオ ン化 法 は,
これ まで 質 量 分 析 に お い て 困難 な対 象 と さ れ て き た 極 性 の
高 い, 熱 に不 安 定 な化 合 物 に対 す る画 期 的 な ソ フ トイ オ ン化 法 で あ る 。 さ らに,
プ レー 質 量 分 析 計 に よ り150Kに
も お よぶ 蛋 白 質 の 分 子 量 がpmol
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試 料 量 で 測定 で き る こと が示 され,
は じめ に
(10^<-12>mol) レベ ル の
質 量 分析 法 が 生 化 学 分 野 で 熱 い 注 目を あ び て い る。
(5)ISま
近 年, イ オ ン ス プ レー (IS) また は エ レ ク
トロス プ レー (ES)
イオ ンス
イ オ ン源 を装 着 した タ ン デ ム 四重 極
型 質量 分 析 装 置 の 出現 に よ り, ペ プ チ ド, 蛋 白質
オリ
ゴ ヌ ク レオ チ ド, 糖 鎖 な どの生 体 関連 高分 子物 質 の分 析
に 飛 躍 的 な 進 歩 が もた らさ れ た^<1∼4)>。ISま
た はESと
た はESイ
オ ン源 で 生 成 す る イ オ ン は, 溶
液 中 の試 料 の イオ ン化 状 態 に 近 似 して お り, これ ま で 質
量 分 析 にか か りに くい とされ て い た極 性化 合 物 ほ ど逆 に
イオ ン化 に有 利 であ る。
(6)正 イオ ン, 負 イオ ン モ ー ドの切 り替 え が容 易 で あ
よ
る。
ば れ る イオ ン化法 の特 徴 は,
(1)多 価 イナ ン (multiply charged
ion)
(7)グ リセ リンな ど の マ トリ ッ クス を用 い な い た め に
を生 成す る
た め に, 質 量 分 析 計 の 質 量 範 囲
(通 常m/z=2,400∼
鮮 明 な ス ペ ク トルが 得 られ る, な どを あ げ る こ とが で き
4,000)
高 分 子 量の 試 料 で も
る。
を は るか に 超 え た 数 十Kの
精 度 よ く測 定 す る こ とが で き る。 た とえ ば60K程
こ の ソフ トイ オ ン源 を タ ンデ ム 四 重 極 型 質 量 分 析 計 に
度の
蛋 白質 の場 合, 多 数 の プ ロ トン の付 加 した 準 分 子 イオ ン
取 り付 け, 衝 突 活 性 化 開 裂 (collision induced
が35∼45価
tion ;CID)
のチ ャ ー ジを もつ 複 数 の多 価 イオ ンス ペ ク
トル と してm/z=1,300∼1,800の
質 量 範 囲 で観 測 され
dissocia
の手 法 を 組 み 合 わ せ る こ とに よ り, 目的 イ
オ ン の構 造 に関 す る 情報 が 得 られ る。 た とえ ば, ペ プ チ
ドの ア ミノ酸 配列 の 確認 (も しくは 決 定) を は じめ, 薬
る。
(2)
イ オ ン化 過 程 にお い て加 熱 を伴 わ な い ため に, 熱
(3)大 気 圧 下 で イ オ ン化 す るた め に イ オ ン化 効 率 が 高
く, pmol
物 代 謝 物 の 同 定 やLCか
らの 選 択 的 高 感 度 モ ニ タ リン グ
が可 能 で あ る^<10)>。
これ ら の特 徴 は, ISやESイ
に不 安 定 な物 質 の分 析 が可 能 で あ る^<5)>。
(10^<-12>mol)∼fmol(10^<-15>mol)レベ ル の試 料 量
オ ン化 法
が, 生 体 高分 子 や極 性 で か つ 熱 に不 安 定 な物 質 の分 析 に
お い て, FAB
(高速 原 子衝 撃)^<11)>,
SIMS
(分子 二 次 イ オ
ンMS),
(プ ラ ズ マ脱 離)^<12)>,
TSP
(サ ー モ ス プ レ
で の分 析 や 高 感 度 検 出 が 可 能 で あ る。
PD
ー)^<13)>
, LDMS
(4)溶 液 状 態 の試 料 を 直 接 イオ ン化す る こ とが で き る
(レ ーザ ー脱 離) な どの ソフ トイ オ ン化 法
の で, 液 体 ク ロマ トグ ラ フ ィー (LC)^<6,7)>や
キ ャ ピラ リー
で は で きな か った 新 しい可 能 性 を開 く もの と して 注 目を
電 気 泳動
あ び て い る理 由 であ る。
(MS)
Yoshihisa
(CZE)^<8,9)>などの 液 相 分 離 手 段 と 質量 分 析 計
現 在, ISやESイ
の イ ン タ ー フ ェー ス と して 利 用 で き る。
Umeda,
Laboratories,
宝 酒 造 (株) バ イ オ 研 究 所
Seta,
Ohtsu,
Shiga
520-21,
(〒520-21
大 津 市 瀬 田3-4-1)
[Takara
オ ン源 を 四重 極 型 質 量分 析 計 に 装
Shuzo
Co.,
Ltd.,
Biotechnology
Research
Japan]Ionspray Mass Spctrometry for Biopolymers
Key【質
word
量 分 析 】 【イ オ ン ス プ レ ー ・イ オ ン化 法 】 【LC/MS/MS】
【多 価 イオ ン】
1655
I
74
蛋 白 質
備 した 装 置 と して, PE-Sciex
700, VG
Bio-Q
核 酸
API-III, Finnigan
酵 素
TSQ-
な どが 開発 され て い る。四 重 極 型 質 量 分
析 計 は10^<-5>Torrレ ベ ル の 真空 度 で作 動 す る こ とか ら,
大 気 圧 下 で イ オ ン化 す るISやESイ
オ ン源 との適 合 性
No.9
(1991)
た め に 噴霧 の方 法 や 気 化 器 の構 造,
夫 が凝 らされ,
そ れ らの 構 造 に 応 じて イ オ ン ス プ レー
計 (MS/MS)
図2にISイ
さ らに イオ
とよび 分 け られ
て い る。両 者 の最 も大 きな 相 違 点 は, ISで は気 化 ガ ス を
用 い て い るが, ESで
モ ー ドで の操 作 性 がす ぐれ,
電場 の かけ方 に 工
(IS) ま た は エ レ ク トロス プ レー (ES)
が よ く, 装 置 の 小型 化 が 可 能 で あ り, タ ンデ ム質 量分 析
は 気 化 ガス を 用 い な い こ とであ る。
オ ン源 とESイ
オ ン源 の構 造 を示 す 。IS
ン の飛 行 距 離 が短 い た め に 高感 度 で あ るな どの 特 徴 が 多
法^<1,2)>で
は 数mm∼1cmは
い 。 これ らの装 置 は, 生 体 高分 子 を取 り扱 う生 化学, 医
ス ・プ レー ト) に対 して 液 体 噴 霧 ノズ ル に (+/-)3∼6
学, 薬 学, 農 学, 生 命 科 学, 環 境科 学 分 野 の研 究 者 に と
kVの
っ て非 常 に使 いや す い も の とな っ て い る。
を 流 量 約1l/分
筆 者 は, 短 期 間 で は あ るが イ オ ンス プ レー 質量 分 析 計
(ISMS)
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Vol. 36
を 使 用 して, 蛋 白質, ペ プチ ド, 核 酸, 糖 質 を
なれ た対 極 (イ ンタ ー フ ェ ー
電 圧 をか け, ノ ズ ル外 筒 に気 化 ガス
(圧搾 空 気)
(30∼60psi) 幽で流 す こ とに よ り霧 化 す
る。ISは い わ ゆ る “気 化 ガ ス つ きES” で あ り, これ に よ
り液 体 の 流速 が1∼200μl/分
の範 囲 で イ オ ン化 で き る よ
は じめ さ ま ざ ま な生 体 関連 試 料 を分 析 して き た。 そ の経
うに な っ て い る。 一方, ES^<3,4b)>で
は対 極
験 を 織 り混 ぜ な が ら, イ ナ ンス プ レー質 量会 析 法 を, と
壁 面) に対 して ノ ズ ル に数kVの
くに 蛋 白 質 の分 析 例 を中 心 に して紹 介 した い。 なお, 質
を用 いず に クー ロン力 のみ で液 体 の霧 化 を起 こ させ る。
(チ ャ ンバ ー
電 圧 をか け, 気 化 ガス
量 分 析 に よ る蛋 白質 の一 次 構 造 解 析 につ い て本 誌 にす ぐ
した が っ て, ES法
れ た 総 説^<22)>が
あ るの で あわ せ て参 照 され た い 。
と いわ れ る。 これ ら のほ か に, メ タ ノ ール を 外 筒 に 流 し
の 最適 流速 範 囲 は1∼20μl/分 であ る
て霧 化 す る方 法 もあ る。
.
IS (ES)
イオ ン源 と質 量 分 析 装 置 の概 略
試 料 を含 む 液 体 は, 試 料 注 入 器 (syringe
LCの
ISお
よびESイ
オ ン化 法 の原 理 は,「強 電 場 の も と で
試 料 を含 む溶 液 を 噴 霧す る と帯 電 した 液 滴 が 生 成 し, こ
の液 滴 か ら溶 媒 が 蒸 発す るに した が って 動 力 学 的
(ki
溶 出 液か ら熔融 石英 毛 細 管
100μmな
pump)
(外 径160μm
や
, 内径
ど) な ど に よ り導 入 され る。イ オ ン源 プ ロー ブ
近 辺 に溶 液 を 分 岐 す るス プ リ ッタ ー を 装 備す る とLCの
溶 出 液 (流 速 : 0.5∼1ml/分)
を そ の ま ま質 量 分 析 計 に
netically),エ ネ ル ギ ー的 (energetically) な 臨 界点 に 達
接 続 で き る。 イ オ ン化 を 促進 す る ため に は, 溶 液 に は メ
して イ オ ン が気 相 に放 出 され る」 とい うイ オ ン ・エバ ポ
タ ノー ル や ア セ トニ ト リル を混 合 し, ま た塩 は で き るか
レー シ ョン の現 象^<14)>
(図1)
ぎ り除去 して0.01M以
に 基 づ い て い る。ISやES
を 大 気 圧 下 で行 な うの に は い くつ か 理 由 が あ る が, 1つ
下 にす る の が望 ま しい 。
大 気 圧 下 で生 成 され た試 料 イ オ ン を高 真 空 で作 動 して
に は 減 圧 下 で強 電 場 をか け る と放 電 が起 こ る こ と と, 大
い る 質量 分 析 計 (MS)
気 圧 下 で は熱 伝 導 が よ く液 滴 か らの溶 媒 の気 化 効 率 が 高
ー フ ェー ス が考 案 され て い る。 大 別 して, 大 気 圧 と真 空
い た め であ る。
系 を1枚 の 隔 壁 で 隔離 す る一 段
イオ ン の放 出 を効 率 よ く, また 定 常 的 に起 こ させ るた
め に は, 液 滴 の微 粒 子 化 を図 る こ とが 重 要 であ る。 そ の
図1.
Iribarne-Thomson^<14)>の
(single-stage)
と, 2枚 以上 の 隔壁 か らな り差 動 排 気 す る多 段
ple-stage)
のもの
(multi
の も のが あ る。 イオ ン源 で生 成 した イ オ ンは
液 滴 か ら の イ オ ン放 出 プ 胃セ ス の模 式 図
イ オ ンエ バ ポ レー シ ョ ン作 業 仮 説 に よれ ば, 高 (正) 電 圧 のか か った ノズ ル か ら噴 霧 され た 微 細 水
滴 に は, 正 イ オ ンH^+, MH^+が
過 剰 に 存 在 し,
に イ オ ンが 気 相 に 放 出 され る 。
1656
に 導 入す るた め に, 各 種 イ ン タ
溶 媒 が 蒸 発 す るに つ れ 液 滴 半 径 が 減 少 して 表 面 の 正 電 荷 密 度 が 増 加 し, つ い
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イオ ンスプ レー質量分析法に よる生体高 分子の分析
図2.
(a)
イ オン ス プ レ ー (IS, a)^<1)>と
エ レ ク トロス プ レ(ES,
b)^<4b)>のイ オ ン源 とイン タ ー フ ェー ス
1 : 熔 融 石 英 毛 細 管, 2 : ス テン レス 細 管 (内 径0.20mm),
3 : 気 化 ガ ス外 筒 (内 径0.8mm),
イ オ ンス プ レー の 対 極 とな る) の 役 目を もつ イン タ ー フ ェ ー ス ・プ レー ト, 5 : 口径100μmの
4 : イ オ ン収 束 レ ンズ
円錐 状 オ リフ ィ ス支 持
板。
(b)
1 : 液 体 試 料 導 入 口, 2 : 注 射 針 (接 地 電 圧), 3 : 円 筒 電 極 (-3,500V),
け た ガ ラス 毛 細 管 (-4,500V,
10 : 四 重 極 質 量 分 析 計 。
隔 壁 に設 け られ た数 十 ∼100μmの
+40V),
6 : ス キ マ ー (-20V),
ピ ンホ ー ル (オ リフ
ィス, ス キ マ ーな ど と よば れ る) を 通 過 して 真 空 系 に 導
4 : 乾 燥 ガス, 5 : 入 口 と出 口に 金 属 電 極 を つ
7 : 静 電 レ ンズ,
8 : 第1段
排 気,
9 : 第2段
排 気,
ポ ン プ で系 外 に排 気 され る 。
Sciex
のAPI-IIIで
は窒素ガスをイ ンターフェース ・
入 され る。 これ ら の構 造 は 排 気 装 置 の能 力 に関 係 して お
プ レー トとオ リフ ィス (口 径 : 100μm)
り, 排 気 速 度 : 1,000l/秒 の オ イル 拡 散 ポ ン プだ と20∼
過 方 向 と逆 方 向 に 流 して お り. (ガ ス カ ーテ ン とよぶ),
25μmの
これ は溶 媒 分 子 の侵 入 を 防 ぐ と と もに ク ラ ス タ ー イ オ ン
細 口が 限 度 で あ るが, 100,000l/秒 の排 気 速 度
を もつ クラ イ オ ポ ン プ であ る と100μmの
細 口 が可 能 で
あ る。口 径 が大 き いほ ど イ オ ン の通 過 量 が増 加 し感 度 が
向 上す る。 クラ イ オ ポ ン プ シ ス テ ム とは, コン プ レ ッサ
ー で液 化 した ヘ リ ウム を真 空 系 内 に設 置 した 円筒 状 の気
体 トラ ップ 内 を循 環 させ て超 低 温 (<20K)
の表 面 をつ
(HM^+[H_2O]_nの
よ うに 溶 媒 分 子 が 付 加 した イ オ ン で ス
ペ ク トル解 析 を 複 雑 に す る) を 分 解 す る効 果 が あ る。
ノズ ル の 先 端 に 高 電 圧
kV,
(正 イオン の と き は+3∼6
負 イ オ ン の とき は-3∼5kV)
+/-600V,
を か け, 対 極 に は
オ リフ ィスに は+/-30∼150Vを
く り, 系 内 に侵 入 した気 体 をそ の低 温 表 面 で凝 縮 させ て
こ と に よ り電 場 が 形 成 され,
トラ ップす る排 気方 式 であ る。 トラ ップ され た 窒素, 酸
極 に 送 り込 ま れ る。 実 際 の 測 定 で は,
素, 二 酸 化 炭 素 は夜 間 の運 転 停 止時 に気 体 に も どされ,
の 間 に イ オ ン通
(orifice voltage ; OR)
かける
イ オン は 収 束 さ れ て 四 重
オ リ フ ィス電 圧
の 適切 な設 定 が 重 要 で, た とえ
1657
75
76
蛋 白 質
核 酸
酵 素
Vol. 36
No.9
(1991)
図3.
タ ンデ ム四 重 極 型 質 量 分 析 計 の概 略 図 (Sciex API-III)
1 : 大 気 圧 イオ ン化 源, 2 : 衝 突 活 性 化 開 裂 部位, 3 : オ リフ ィス, 4 : 超 低 温 真 空 ポ ン プ 円筒,
5 : 第1四
重 極 分析
管, 6 : 第2四 重 極 分 析 管 (衝 突 室), 7 : 第3四 重 極 分 析 管, 8 : イ オン レン ズ, 9 : チ ャ ンネ ル エ レ ク トロ ン ・マ ル
チ プ ラ イ ヤ ー, 10 : 乾 燥 窒 素導 入 口, 11 : イ オ ン加 連 ロ ッ ド, 12 : 衝 突 ガ ス導 入 口。
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ば 低 分 子 の1価 イ オ ンで はOR=35V,
OR=40∼80V,
ペ プチ ド で は
高分 子 蛋 白 質 ではOR=80∼150Vと
い
った 具 合 で あ る。
ロ マ トグ ラ フ ィ ー を トー タ ル イ オ ン カ ウ ン トで
モ ニ タ ー す る (total ion
counting
的 イ オ ン (複 数 個 選 択 可 能)
質 量分 析 計 は 直 列3連
成 され て い る (図3)。
の 四重 極 (quadrupole)
か ら構
こ の よ うに質 量 分 析 計 を直 列 に
結 合 した 装 置 を タ ン デ ム質 量 分 析 計 (MS/MS)
四 重 極 は 外 径 約1.5cm,
長 さ約20cmの4本
とい う。
の平 行 ロ
ッ ドか ら構 成 され, ラ ジオ 高 周 波 電 圧 (radio frequency
voltage ; RF-V)
か, (2)ク
と直 流 電 位 (U)
され る。 特 定 のVとU値
; TIC)
モ ー ド, (3)目
のみ を狭 い質 量 範 囲 で測 定
も し く は ク ロ マ ト的 に 検 索 す る 選 択 イ オ ン モ ニ タ リ ン グ
(selected
ion
MS/MS分
monitoring
; SIM)
モ ー ドが あ る。
析 モ ー ドで は, (1)特 定 の 親 イ オ ン を 選 択 し
てそ れ を衝 突 開裂
(CID)
させ 生 成 す る娘 イオ ンを ス キ
ャ ン す る ドー タ ー ス キ ャ ン, (2)特 定 の 娘 イ オ ン を 与 え る
を組み合わせて印加
親 イ オ ン を 検 索 す る ペ ア レン トス キ ャ ン, (3)特 定 の 親 イ
が 与 え られ た と き, 相 当す る特
オ ンか ら特 定 の 娘 イオ ンが 生 成す る こ とが 判 明 して い る
定 の イ オ ンの み が通 過 され, 他 の イオ ンは 免 れ て 通過 で
と きの 多 段 選 択 的 分 析
(マ ル チ プ ル ・ リア ク シ ョ ン ・モ
き な い。 こ の た め 四 重極 は “
マ ス フ ィル タ ー ” と も よぼ
ニ タ リ ン グ,
reaction
れ, 通 常1質 量 単 位 (ユ ニ ッ トマ ス) の分 離 を示 す 分 解
(4) CIDに
multiple
よ り特 定 の 中 性 分 子 が 失 わ れ る
ン酸 エ ス テ ル か ら リ ン酸,
能 を もつ 。
2個 の質 量 分 析 計 を 同 時 に使 用す るMS/MSモ
ー ド
; MRM),
(た と え ば リ
分 子 量^<98)>よ う な 親 イ ナ ン を
モ ニ タ ー す る ニ ュ ー ト ラ ル ・ ロ ス ・ス キ ャ ン
で は, 1番 目 のQポ ー ル で親 イ オ ンの分 離 を行 な い, 3
loss scan)
番 目 のQポ ー ル で娘 イ オ ン の分 析 を行 な う。 中央 の2番
る。
目 のQポ ー ル は衝 突 室 と して用 い られ, 高 周波RFの
monitoring
(neutral
な ど を 分 析 の 目的 に あ わ せ て 適 宜 に 選 択 で き
み
が か け られ て イ オ ン をQポ ー ル の中 心 軸 に収 束 させ る。
II.
こ こに アル ゴン, キ セ ノ ンな ど の不 活 性 ガス を導 入 し,
多 価 イ オ ンス ペ ク トル を 用 い た
分子量決定法
局 部 的 に10^<-3>∼10^<-4>Torr
の相 対 的 に “
高圧”な部位を
つ く りイ オ ンを 衝 突 開裂 (CID)
させ る。 衝 突 エ ネ ル ギ
高 分 子 量 物 質 の分 子 量 を 測 定 す る これ まで の 方法 は,
ー は 数十eVか
, い わ ゆ る低 エ ネ ル ギ
質 量 分 析 計 のマ ス レン ジを 高 質 量 域 に 可 能 なか ぎ り拡 大
ら200∼250eVで
ー 衝 突 解離 反 応 を 観 測 す る こ と にな る。 低 エ ネル ギ ー と
し^<15)>分
子 イ オ ン を検 出す る も の であ った 。 も うひ とつ の
高 エ ネ ル ギ ー (1keV以
劇 的 に 有 用 な 方 法 は, 多 価 イオ ンを 生 成す る イオ ン化 法
上) 衝 突 解 離 の是 非 の 論 議 は 別
と して, 得 られ る情報 は 大 き く異 な るの で そ れ ぞ れ の 特
を 用 い る こ とに よ り, 質 量 対 電 荷 比 (m/z)
徴 を理 解 して研 究 目的 に あ っ た 装 置 を 使用 す る こ とが 重
常 の 質 量分 析 計 のマ ス レン ジで 測 定す る こ とで あ り, IS
要 であ る。
やESMSは
四重 極 質 量分 析 計 は操 作 性 にす ぐれ てお り, 種 々 の モ
ー ドで測 定 が で き る。MSモ
1658
ー ドで は(1)通常 の分 析 の ほ
ま さ に こ の方 法 であ る。ISの
を下 げ て 通
正 イオンモ
ー ドで は , 複数 の プ ロ トンが 付 加 した 多 価 の 正 イ オ ン
(M+nH)^<n+>が
お も に 生 成 し, 溶 媒 組 成 に よ っ て は
77
イオ ンス プ レー質量分析法に よる生体高分子 の分析
Na^+, K^+, NH_4^+な ど の小 イオン が 付 加 した クラ ス タ ー
イ オ ンを 生 成す る。 蛋 白質 や ペ プチ ドで は, 酸 性 溶 液
(通常0.1∼5%ギ
酸 を メ タ ノー ル や ア セ トニ ト リル な
どの有 機 溶 媒 と混 合 して用 い る) 中 で, N末 端 ア ミノ基
とLys,
Arg,
Hisな
ど の側 鎖 塩 基 性 官 能 基 が プ ロ トン
受 容 基 とな り, 多 数 の プ ロ トンが 付 加 した 多 価 正 イ オ ン
を生 じ る。 しか し, プ ロ トン の付 加 は塩 基 性 官 能 基 に か
ぎ らず, 中性 糖 や, 塩 基 性 ア ミノ酸 を 含 有 しな い環 状 ペ
プ チ ドな どの 中 性 化 合 物 に お い て も, 極 性 結 合 (polar
bond)
の負 極 に プ ロ トン の付 加 が 起 こ る ら しく, 酸 性 溶
液 か ら で は1価 ∼ 数 価 の正 イオ ン と して 測 定 され る (事
実, 蛋 白質 のす べ て の Lys 残 基 を アセ チ ル 化 して も, 残
りのArg,
His残 基 数 以上 の プ ロ トン が付 加 した 多価 イ
オ ンが 観 測 され る)。 負 イ オ ンモ ー ドで は プ ロ トンが 失
わ れ た 多 価 の負 イ オ ン (M-nH)^<n->が
生 成 す る。酸 性 蛋
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白 質, オ リゴ ヌ ク レオ チ ド^<16)>,
ガ ン グ リオ シ ド^<17)>,
有機
酸 や 各 種 薬 物 の グル ク ロ ン酸 や 硫酸 抱合 体 な ど負 イオ ン
モ ー ドの 測 定 対
象 試料 は 多 い 。
)これより,n=(m_1-H)/(m_2-m_1)
(3)および,M=n(m_2-H)=(n+1)(m_1-H)
(4)(2)負イオン (プロトン損失)図4.
図4に
ミオ グ ロ ビ ンの正 イ オ ンス ペ ク トル を, 図5に
ミオ グ ロ ビ ンの 多価 イ オ ンマ ス ス ペ ク トル
ミオ グ ロ ビ 著溶 液 (2.1μM)
を4μl/分
の流 速 で7.5秒
間
オ リゴ ヌ ク レオ チ ド (14量 体) の負 イ オ ンス ペ ク トル を
導 入 して得 られ た マ ス ス ペ ク トル 。 試 料 消 費 量 は1pmolに
相 当す る 。 帰 属 した ピ ー クは ミオ グ ロ ビ ン の ペ プ チ ド部 分 に
示 した 。 隣 りあ っ た ピー ク ど う しは1価 ず つ 異 な っ て お
由来 す る。m/z=1,230は
り, 隣 接 した 最 少 限2本 の ピー クの 実 測値m1, m2か
ら
ヘ ムの2量
体 で あ る。
計 算 式 (3) に 従 って 物, m_1, m_2か
ら “raw n_2”が 得 られ る。
こ の 値 は 整 数 値n_2に 近 似 して お り, も し帰 属 を 誤 った ピー
ク な ら容 易 に 見 分 け られ る 。
下 式 に 従 って分 子量 が計 算 で き る。
(1) 正 イオ ン (プ ロ トン付 加)
(M+nH)^<n+>
こ こでM=分
子 量, n=電
(1)
価 数, H=プ
ロ トンの 質 量
数 で あ る。
隣 接 した ピー クは,
図5.
試 料 量200pmolを
量=4260.7,
オ リゴ ヌ ク レオ チ ド (14mer)
の 負 イ オ ン マ ス ス ペ ク トル
用 い た 。 計 算 式 (8) に よ り分 子 量 実 測 値4261.1が
得 られ た 。 モ ノ同位 体 分 子
平 均 分 子 量=4262.8。
1659
78
蛋 白 質
核 酸 酵
素
Vol. 36
No.9
上, 分 子量Mの
(1991)
測 定誤 差⊿Mはm/zの
測 定 誤 差⊿(m/
z) とチ ャー ジnの 積 とな る 。た とえ ば⊿(m/z)=0.1の
測 定誤 差 が あ る とす る と, 電 価n=20の
お い て⊿M=2amuの
⊿
とき, 分 子 量 に
誤 差 を生 む 。
M=d(m/z)×n
(9)
した が っ て, 測 定 に際 して正 確 な質 量 校 正 と ピー ク頂 点
の 帰属 が要 求 され る。 質 量 校 正 は, マ ス レ ンジ全 域 に校
正 用 シグ ナ ル を もつ ポ リプ ロ ピ レン グ リ コー ル (PPG,
+H)=(n+1)(m_1+H) (8)通 常,
蛋 白 質 で は10本
程 度 の ピ ー クか ら な る 多 価 イ
オ ン ス ペ ク トル の シ リ ー ズ
称 す る)
と し て 観 測 さ れ,
が用 い られ る。 ピー ク頂 点 の帰 属 に, ガ ウメ 曲線 の回 帰
の ピ ー クか らN-1個
の
式 を使 用 す れ ば, 精 度 は ミオ グ ロ ビ ンで0.0012%
N本
よ り測 定 精 度 が 向 上 す る 。 当 然,
計 算 結 果 は コン ピ ュ ー
タ で 瞬 時 に は じ き 出 さ れ る 。 得 られ た ミ オ グ ロ ビ ン の
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16939.4amu)
^<14>N=14.0031
質 量]
モ ノ同 位 体 分 子 量
(monoisotopic
と平 均 分 子 量
(average
16950.5amu)
成 元 素 の 平 均 質 量 か ら計 算 した 分 子 量]
位 体 分 布 中 の 最 も 高 い ピー クの 質量
mass)
[構
の 間 に あ り,
(most
も, 通 常, IS法 で は 日常 的 に, ±1amu程
同
abundant
に 相 当 して い る。
に関 して充 分 な情 報 が 得
セ ラ トウル ミン (Cerato-ulmin)
は植 物 トキ シ ンで,
微 細 気 泡 を安 定 化 させ るた め に栄 養 分 の移 行 を ブ ロ ッ ク
し植 物 を枯 死 させ るペ プチ ドであ る。ISMSに
原理
測 定 に よ り, 主 成 分 分 子量M_0=7618.4±0.3,
図6.
正 規 分 布 回 帰 式 か ら ピー ク頂 点 を 求 め る こ とに よ る正 確 な 分 子 量 決 定 法
ピ ー ク頂 点 付 近 の デ ー タ ポ イ ン トを 汎 用 グ ラ フ ィ ッ クプ ロ グ ラ ムで 計 算 させ る と, 容 易 に ガ ウス
分 布 曲線 に フィ ッ トさ せ る こ とが で きる 。
F(x;H,μ,σ^2)=H/(√<2π>σ)e-^((X-μ)^2)/(2σ^2)
こ こ で μは ピー ク位 置, σは 標 準 偏 差, (H÷√<2π>σ) は ピ ー ク高 で あ る 。
Mは 平 均 分 子 量 で, そ の 計 算 値=16,950.5,
実 測 値=16,950.4±0.2。
1660
よ り質 量
分 析 す る と, 主 成 分 の ほか に, わ ずか に 低 分 子量 の2成
分 が存 在 す る こ とが 認 め られ た (図7)。
多 価 イ オ ン ス ペ グ トル を 用 い る 分 子 量 計 算 で は,
度 の正 確 さ と
精 度 が 得 られ る。 分 子 量 測 定 に これ だ け の 精 度 が あ る
られ る。
ら 計 算 した 分 子 イ オ ン の
mass,
(12
ppm), に 向 上 す る (図6)。 こ の よ うな計 算 を用 い な くて
と, 蛋 白 質 の変 種 (variants)
mass,
[^<12>C=12, ^1H=1.0078, ^<16>O=15.9949,
, ^<32>S=31.9721か
や ポ リエ チ レン グ リ コー ル な ど
と
では
分 子 量 計 算 値 が 得 られ る 。 こ れ ら の 平 均 値 を と る こ と に
測 定 値 は,
平 均 分 子量1Kと2K)
HyperMass
(Sciex
精 密 な分 子量
変種分子
イオ ンスプ レー質量分析法に よる生体高分子の分析 79
量M_1=7531.3±0.1,
れ,
とM_2=7,416.2±0.3と
決定さ
±0.2か
ら, マ イ ナ ー 成 分 は そ れ ぞ れSer
とAsp
(分 子 量115.1)
(分 子 量87.1)
還 元 した の ち に, す べ て のSH基
(-CH_2CONH_2,
が 主 成 分 蛋 白質 か ら 順 次欠 落
し た も の で あ る こ と が 判 明 し た 。 こ の 結 果 は エ ドマン 法
に よ るN末
に 示 した とお りであ る。(1)まず, す べ て のS-S結
SHに
分 子 量 差M_0-M_1=87.1±0.2とM_1-M_2=115.1
端 分 析 の結 果 とも一 致 した。
質 量 数58.06)
合を
をI-CH_2CONH_2
で アル キ ル 化 す る。(2)S-S
結 合 の還 元 処 理 を せ ず に, 遊 離 のSH基
のみ を ア ル キ ル
化 す る。(3)も との蛋 白 質 の分 子 量 と, 上 記2と お りの処
理 を した蛋 白 質 の分 子 量 を 測 定 す る。
この方 法 に よ り, β-ラ ク ト グ ロ ブ リ ン (分 子 量
III.
18,278.0)
シス テ イ ン残 基 数, ジス ル フ ィ ド結
合 数 お よ び 遊 離SH基
の Cys の架 橋 度 を調 べ た 。還 元 体 (△) と天
然 (★) のISMSス
数の決定
ペ ク トル を 測 定 す る と図9に 示 した
よ うに, 測 定値 は0.01%以
酸 化 型 お よび還 元 型 Cys
残 基 は 蛋 白質 構 成 ア ミノ酸
れ だ け で は Cys の数, S-S結
合 数, お よび 遊 離SH基
の 中 で も特 異 な ア ミノ酸 で あ る。酸 化 型 は ジ ス ル フ ィ ド
の数 を 決 定 す るに は 不 充 分 であ る。図10に
(S-S)
ア ル キ ル 化 体 (○), 還 元+ア ル キ ル 化 体 (□) の マ ス ス
結 合 に よ り2個 の Cys 間 で 架橋 す る こ とに よ り
蛋 白 質 の 安 定 化 に寄 与 す る。還 元 型 は そ の遊 離SH基
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上 の精 度 を もつ が, まだ こ
が
ペ ク トル を 測 定 す る こ とに よ り,
酵 素 の 触 媒 活 性部 位 と して働 い た り (シ ス テ イン ・プ ロ
在 す る こ と, 遊 離 のSH基
テ ア ー ゼ),
す るこ とが 明 らか とな った 。
金 属 との キ レー ト部 位 とな っ た り, あ るい
が1個,
示 す よ うに,
5個 の Cys
残基 が存
S-S架 橋 が2個 存 在
は ジス ル フ ィ ド転 換 酵 素 の活 性 部 位 とな るな ど蛋 白 質 の
生 化 学 機 能 に か か わ っ て い るが, こ の 遊 離 と 架 橋Cys
を 区 別す るの はか な り困 難 で あ る。
しか し, ISMSに
遊 離SH基
よれ ば 全Cys残
LC/MSお
よびLC/MS/MSを
用 いた
蛋 白 質 の ア ミノ酸 配 列 の 決 定
基 数, S-S結 合 数,
数 を迅 速 で簡 便 に 決 定 で き る。実 験 法 は 図8
図7.
IV.
質量分 析に よ り, 遺伝子組換え蛋 白質 の同定や 品質管
正 確 な 分 子 量 測 定 に よる 植 物 トキ シ ン Cerato-ulmin のN末
端 ア ミノ酸 配 列 の決定
1661
80
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蛋 白 質
図8.
図9.
核 酸
酵 素
Cys, S-S,
Vol. 36
遊 離SHの
(1991)
数 の 決 定 手 順質量数とCys, S-S, SH基数の関係N_<cys>=(M_<r+a>-M_<nat>)/m M_<n
β-ラ ク トグ ロ ブ リンBの 天 然 型 と還 元 型 の マ ス ス ペ ク トル
β-ラ ク トグ ロ ブ リンBは18Kの
蛋 白 質 で, 162個
値 は, 0.01%以
上 の 精 度 を もつ が, ⊿M=3.8±0.8か
1662
No.9
の ア ミ ノ酸 の うち5個 が シ ス テ イ ンで あ る 。 分 子 量 実 測
ら では プ ロ トン4個 分 (2×S-S)
と確 定 で きな い 。β-ラクトグロブリンB (天然型)M_
1
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イオ ンス プレー質量分析法に よる生体高分子の分析
図10.
(a)
(b)
還 元 と アル キル 化 を組 み 合 わせ る こ とに よるS-S,
SHお
よ び シ ス テ イ ン残 基 数 の 決 定 法
還 元 後, 水 素 の 質 量 数 に 比 べ て 充 分 に 大 きい 質 量 数 を もつ アル キル 化 剤 (-CH_2CONH_2,
ル 化 す る こ とに よ り, シス テ イン 残 基 数 を 決 定 す る。
質 量 数58.06)
で アル キ
N_<cys>=(M_<r+a>-M_<nat>)/58=5.0
アル キ ル 化 の み に よ り遊 離 のSH基
の数を決定する。
N_<SH>=(M_<alk>-M_<nat>)/(58-1)=1.0
(c)
a)とb)を
N_<S-S>
組 み 合 わ せ, シス テ イン 残 基 数 と遊 離 のSH基
=(N_<cys>-N_<SH>)/2=2
数か らS-S数
を 決 定 す る。
理 の試 み が は じめ られ, 蛋 白 質や ペ プ チ ドの一 次構 造 解
CZE
析 に お け る 質 量分 析 計 の 利 用 は 近 年 急 速 に 増 えつ つ あ
を直 接 に質 量 分 析 計 に導 入 して, そ れ ぞ れ の ペ プチ ド断
(capillary zone electrophoresis) で 分 離 し, 溶 出 液
る^<18,19)>。
と くに, ア ミノ酸 の 置 換 や修 飾 を うけ た蛋 白 質
片 の分 子 量 と 溶 出時 間 を 測 定 す る。 つ ぎ に,
の 構造 解 析 に は 質 量分 析法 が す ぐれ て い る。 質 量 分 析 に
HPLCあ
よ る蛋 白 質 の 一 次 構 造 解 析 の これ まで の有 力 な 方 法 に つ
プチ ドの イオン を親 イ オ ンに選 択 してMS/MSモ
い て は, す ぐれ た 総 説^<20)>が
あ る の で参 照 され た い。 こ こ
に よ り娘 イオ ン を連 続 的 に測 定 す る こ とに よ り, そ れ ぞ
で はISイ
れ の ペ プチ ドの ア ミノ酸 配 列 に関 す る情 報 が 得 られ る。
オ ン源 とMS/MSに
よ る新 しい ア ミ ノ酸 配列
の 解析 法 を 紹 介す る。す で に50K程
て, 試 料 量0.1∼1nmolか
度 の蛋 白質 に お い
ら全 分 子 中 の30∼70%に
当す るア ミノ酸 配列 の 情報 を わず か1週
相
間 以 内 の 実験 で
るい はCZE分
細 か い こ と で はあ るが,
2回 目 の
離 で既 知 の時 間 に溶 出す る各 ペ
1回 目のHPLCで
分 取 した 画 分 を用 い てMS/MS測
ー ド
スプ リット
定 す れ ばHPLC分
離
は1回 で す む 。 ト リプ シ ン以 外 の酵 素 を用 い て 同様 の実
験 を 行 な い, 重 複 す る ア ミノ酸 配 列 を糸 口に して 解 析す
得 られ る とい う^<21)>。
まず, 高分 子蛋 白質 を基 質 特 異 性 の高 い トリプ シ シ な
る こ とに よ り, 蛋 白 質 全 体 の ア ミノ酸 配 列 決 定 が 可 能 で
どの エン ド型 蛋 白質 分 解 酵 素 で消 化 し, 分 析 に 容 易 な ペ
あ る。 以 下 に断 片 的 で は あ るが, ISMSに
プ チ ド断片 を 得 る。 酵 素 消 化 混 合 物 をHPLCあ
ク トル を例 示 して 本 法 の有 効 性 を 示 した い。
るいは
よる マ ス ス ペ
1663
82
蛋 白 質
図11.
ヘ モ グ ロ ビン は 分 子量 約64,500で,
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ル ー プ を もつ 。IS法
核 酸
酵 素
Vol. 36
No.9
ヒ ト ・ヘ モ グ ロ ビ ンの イオ ンス プ レ ー ・マ ス ス ペ ク トル
各2本 ず つ の α鎖 と β鎖 の4個 の サ ブユ ニ ッ トか らな る 。 各 サ ブユ ニ ッ トは1個
のヘ ムグ
で は, 非 共 有 結 合 で 集 合 して い る サ ブ ユ ニ ッ トとヘ ムは 解 離 して, そ れ ぞ れ の マ ス ス ペ ク トル を 与 え る。
図12.
ヒ ト ・ヘ モ グ ロ ビ ンの ト リプ シ ン消 化 物 のLCIMSト
分 離 条 件 : 1mm×10cm
C_8カ ラ ム, 5%ア セ トニ ト リル (0.1%TFA)
の グ ラ ジ エ ン ト溶 出 (流 速50μl/分)。
ヒ トヘ モ グ ロ ビ ンは 分 子 量61,983め
ヘ ム蛋 白 質 で2
ー タ ル イ オ ン ク ロマ トグ ラ ム (TIC)
か ら70%ア
セ トニ ト リル. (0.1%TFA)
る。
2価 イ オ ンを 親 イ オ ン と した 低 エ ネ ル ギ ー
個 の α鎖 と2個 の β鎖 の サ ブユ ニ ッ トか ち な る。ISMS
に よ り, そ れ ぞ れ の分 子 量 が15,126.6と15,865.2で
eV
あ る こ とが わか る (図11)。
この ト リプ シ ン消 化 物 を
ル は, B, Y系
C_8の 逆 相 カ ラム (1mm×10cm)
で 分離 し, LCMSを
測 定 す る と, 図12に
(TIC)
(1991)
Ar),
衝 突 活 性 化 開裂 (CID)
のMS/MSス
(20∼30
ペ クト
列 の フ ラ グ メ ン トイ オ ン (B_<1-n>
: N末 端
側 か ら の ア ミ ド結 合 とY_<1-n>: C末 端 側 か ら の ア ミ ド結
示 され る全 イオ ン クロ マ トグ ラ ム
が 得 られ る。全 域 にお いて 質 量 分 析 され てお り,
合 が 切 断 され た フ ラ グ メ ン ト) が 優 先 的 に 生 じ, 解 析 が
非 常 に容 易 であ る (図15)。
また 荷 電 部 位 が 両 端 にあ る
マ ス スペ ク トル か ら各 ピー ク (ペプ チ ド断 片) の分 子 量
た め に双 方 の フ ラ グ メ ン トが 娘 イ オ ン と して検 出 され,
が も とめ られ る (図13)。
また そ れ らが1価 であ る こ とも解 析 を容 易 にす る6さ
こ こ で トリプ シ ン は Arg
と
LysめC末
端 側 ア ミ ド結 合 を開 裂 す る の で, 各 ペ プチ ド
断 片 は2通
りの例 外 を除 い て両 端 に塩 基 性 官 能 基 を有 し
た2価
の イ オ ン どな る (図14)。
チ ド (1価)
9664
とHis残
例 外 とは, C末 端 ペ プ
基 を 含 む ペ プ チ ド (3価)
であ
に親 イ オ ンが2価 イ オ ンで あ る こ とがCID過
て有 利 で あ る点 は, イ オ ンの運 動 エ ネ ル ギー が1価
べ て2倍 で あ るた め 衝 突 エ ネ ル ギー が2倍
ら
程 にお い
に比
に なる こ と
と, 2個 の プ ロ トン化 部 位 の 電 気 的反 発 で 内部 で 歪 が生
83
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イオンスプ レー質量 分析法に よる生体高 分子の分析
図13.
ヒ ト ・ヘ モ グ ロ ビン の ト リプ シン 消 化 物 のISMSス
ペ ク トル
図12 の ピ ー クNo.111,
158, 178の マ ス ス ペ ク トル よ り各 ペ プチ ド断 片 の分 子量 が それ ぞれ
1314, 1070, 2058で あ る と決 定 され る。
じた不 安 定 イ オ ン であ る ため 断 片 化 を起 こ しや す い こ と
で あ ろ う。 本 稿 で は 誌 面 の都 合 で割 愛 した が, ISMSは
で あ る。 この事 実 の発 見 は比 較 的 最 近 の こ とであ り, こ
熱 不 安 定 物 質 や 極 性 化 合 物 の分 析 に お い て, HPLCと
の 手法 を用 い て 蛋 白 質 の 修飾 箇所 や 組 換 え蛋 白 質 の構 造
結す る と と くに 威 力 を 発 揮 す る。 医 薬 品分 野 に お い て は,
解 析 な ど, ま さに ピン ポ イン トの詳 細 な研 究 が 可 能 とな
薬物 とそ の 代 謝 物 質, 抱 合 物 質 の研 究 や 品質 管 理 に ル ー
連
チン に 使 わ れ は じめ た 。 臨 床 診 断 に お い て も, GCMS
った 。
で分 析 で き な か っ た 項 目 に 対 して, LCMSに
期 待 がか
か っ て い る。 化 学 工 業 分 野 で は有 機 金 属化 合 物, 表 面 活
お わ りに
ISやESの
イオ ン源 を 装 着 したMS/MS
性 剤, 高 分 子 化 合 物 な ど広 い応 用 が期 待 され る。 環 境 問
を用 い た生 体 高分 子 の分 析 は, す で に欧 米 で は驚 異 的 な
題 で は, 発 癌 性 ジ ア ゾ系 色 素, 農 薬, 有 機 金 属 化 合 物 の
速 度 で普 及 して い る。 装 置 的 に は, 質 量 範 囲 に上 限 の な
分 析 な ど適 用 性 が 広 く, イオ ンス プ レー質 量 分 析 法 の今
い飛 行 時 間 型 (time of flight; TOF)
後 の 広 い応 用 を期 待 した い 。
分 析計 (LDMS)
レーザ ー脱 離 質 量
が 一 方 では 発 展 して きた が, これ らは
競 合す る もの で は な く, 相 補 的 に用 い られ る よ うに な る
本稿 に掲載 したマススペ ク トルは Sciex 社 のデマタ ・フ ァイ
ルか ら引用 した。
1665
84
蛋 白 質
図14.
核 酸
酵 素
Vol. 36
トリプ シン 消 化 物 のペ プチ ド断 片 は Arg
含 有 す る の で常 に2価 イ オ ンを 生 成 す る 。
イ オ ン, (2) His
(1991)
また は Lys
残 基 と ア ミノ末 端 を
残 基 を含 む フ ラ グ メ ン ト=3価
お よ
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例 外 : (1)C末 端 フラ グ メ ン ト=1価
び2価 イ オ ン。
No.9
図15.
トリプ ジン 消 化 物 (T-14
: 図12の
ピー クNo.100)
のMS/MSス
ペ ク トル
2価 イ オン (m/z=575)
を 親 イ オ ン と して 選 択 し, 衝 突 ガ ス : ア ル ゴ ン, 衝 突 エ ネ ル ギ ー : 30eVで 測 定 。YとB系
の 断 片 化 が 優 先 して お り, 各 フ ヲ グ メ ン トピ ー ク の質 量 差 を 読 タ 取 る こ とに よ り, ア ミノ酸 配 列 を 決 定 で き る。
4b)
文
1)
2)
3)
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