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EzWestLumi 取扱説明書
EzWestLumi 取扱説明書 2012年07月17日 製品名 ：EzWestLumi 製品型番：AE-1495 第3版 原因 解決策 トラブル④ トラブル④：バックグランドが高 バックグランドが高いです ブロッキングが不充 ブロッキング反応が不充分な場合、バックグラウンドが高くなる原因となり 分です ます。適切なブロッキング剤の選択、界面活性剤や塩濃度の検討、ブロッキ ングの反応時間などをご検討ください。 洗浄が不十分です バックグラウンドを低減するためには洗浄操作前の「リンス」のステップが 重要です。洗浄直前の反応で使用した反応液を容器から完全に除去してくだ さい。同様に洗浄液の交換時には、前のステップの洗浄液が残らないように ご注意ください。洗浄操作を確実に行うようご注意ください。 抗体濃度が高いで す。 抗体の力価が高い場合、充分洗浄操作を行っても微量な抗体が残存し、バッ クグラウンドの原因になることがあります。事前にご使用になる抗体の適切 な抗体濃度をご検討ください。 トラブル⑤ トラブル⑤：バックグラウンドに模様 バックグラウンドに模様があります 模様があります 溶液量が少ないです ブロッキング溶液、抗体溶液、洗浄溶液などの溶液量が不充分な場合、バッ クグラウンドの上昇や反応ムラになる原因となります。ご使用になる溶液量 は充分量ご準備ください。 振とう速度が不適切 振とう速度が不適切な場合、溶液中に三角波が発生します。三角波の直下は です 液交換が不充分になり反応ムラの原因になります。三角波が発生しないよう に振とう速度をご検討ください。 お買い上げの製品及び本取扱説明書についてのご質問は下記までご遠慮 なくお問い合わせ下さい。 〒111-0041 東京都台東区元浅草３丁目２番2号 アトー株式会社 本社 顧客部 Tel (03) 5827 - 4861 （代表） FAX (03) 5827 - 6647 -12- 12. トラブルシューティング 目次 原因 解決策 トラブル① トラブル①：バンドが見 バンドが見えません ブロッティングが正 高分子量のタンパク質をブロッティングする場合、ブロッティング時間の延 しく行われていませ 長および泳動ゲルのアクリルアミド濃度の低下により改善されます。 低分子量のタンパク質をブロッティングする場合、ブロッティング試薬にメ ん タノールを添加すると改善されます。 検出系が正しくあり EzWestLumiはHRPの発光基質です。HRP以外の標識抗体を用いた場合には ません 検出できませんのでご注意ください。 アプライするサンプ サンプル中のターゲットタンパク質の含有量が検出限界以下の場合、正しく ル量が少ないです 操作が行われても検出できません。アプライするサンプル量の検討を行って ください。 抗体の力価が低い／ 抗体がターゲットタンパク質と反応することをドットブロット法などでご確 失活しています 認ください。抗体の適切な希釈率も合わせてご検討ください。 ブロッキング反応が 長時間のブロッキングやブロッキング試薬の濃度が高いとオーバーブロッキ 強すぎます ングの原因となり、検出感度が低下します。ブロッキング試薬の種類やブ ロッキング時間の検討を行ってください。 1. 本製品を安全にご使用いただく際の注意事項 1 2. 使用目的 1 3. 本製品の構成 1 4. 組成 1 5. 保存方法 2 6. 廃棄方法 2 7. 本製品以外に必要なもの 2 8. 使用上のご注意 2 ９. 使用方法 3 10. ウェスタンブロッティングの方法 4 抗体の濃度が低すぎ 抗体の力価が低い場合には希釈しすぎにより検出できない場合があります。 ます 抗体の希釈率および希釈液をご検討ください。 10－1 実験材料 4 10－2 サンプル調整 5 10－3 電気泳動操作 5 ゲルと膜の密着が不 ろ紙、ゲル、クリアブロットP膜を重ね合わせた後、グローブを付けた手で 十分です 上から押さえて余分なブロッティング溶液と気泡を除きます。ゲルとクリア ブロットP膜の間にブロッティング溶液が過剰に存在すると、溶液中にタン パク質が拡散しバンドが流れる原因となります。 10－4 ブロッティング操作 6 10－5 ブロッキング操作 7 トラブル③ トラブル③：非特異的なバンドが 非特異的なバンドが検出 なバンドが検出されます 検出されます 10－6 一次抗体との反応 8 10－7 洗浄操作 9 10－8 二次抗体との反応 9 10－9 洗浄操作 9 10－10 シグナルの検出 10 トラブル② トラブル②：バンドが流 バンドが流れています サンプル量が過剰で 過剰量のタンパク質が混在すると電気泳動のパターンがゆがんだり、ブロッ す ティングの際にバンドが流れる原因となります。1レーン当たりにアプライ するタンパク質量は5 µg以下を目安にしてください。 洗浄が不十分です 洗浄溶液の洗浄の強さは界面活性剤濃度、塩濃度とpHに依存します。非特 異的なバンドが多い場合には、界面活性剤濃度と塩濃度をご検討ください。 目的タンパク質の分 サンプル処理液（EzApply など）に含まれる還元剤（DTTなど）が失活して 解あるいは重合体で いる可能性が考えられます。不完全な還元サンプルは重合体を形成し、非特 異的なバンドとして検出される場合があります。またタンパク質サンプル調 す 整時に分解が生じた場合、分解産物が検出される可能性があります。サンプ ルの再調整をご検討ください。 抗体の非特異的反応 抗体のエピトープが他のタンパク質に非特異的に反応する場合があります。 です 抗体の希釈率やブロッキング条件の検討を行っても改善されない場合、別の 抗体へ変更していただくことを推奨します。 -11- 11. 参考資料 10 12. トラブルシューティング 11 ※発光試薬Aと発光試薬Bの必要量は、それぞれ 70～140µL/cm2 です。ミニ ゲルサイズの場合、Reagent AとReagent B をそれぞれ5mLずつ混合してください。 １. 本製品を 本製品を安全にご 安全にご利用 にご利用いただく 利用いただく際 いただく際の注意事項 本製品を安全にお使いいただくために、まず本取扱説明書をよくお読みください。本 取扱説明書の内容を十分に理解されるまで、操作はお控えください。また本取扱説明 書は、本製品を指定の目的に使用する方法のみ記載しております。本取扱説明書に記 載されていない目的・方法でのご使用はお控えください。万が一、本取扱説明書に記 載されていない目的、方法でご使用の場合、必要な安全対策及び不測の事態は全て操 作なさる方の責任となります。また、同時に使用する装置の取扱説明書も熟読しご理 解ください。 11. 参考資料 ブロッティングは同じプロトコールでもちょっとした手技の違いで大きく結果が異な ることがあります。最適な結果を得るためには「コツ」も重要です。 アトーホームページより「ウエスタンブロッティングのコツ」がダウンロードできま すので、ご一読ください。 http://www.atto.co.jp/ ２. 使用目的 本製品はウエスタンブロッティング解析において、HRP（西洋ワサビペルオキシダー ゼ）標識抗体で検出する際に用いるルミノール系発光基質です。 ３. 本製品の 本製品の構成 名称 Reagent A 発光試薬A Luminol/Enhancer solution 容量 個数 200mL １本 200mL １本 ルミノール/エンハンサ―溶液 Reagent B 発光試薬B Peroxide solution 過酸化水素溶液 ４. 組成 名称 Reagent A 発光試薬A Luminol/Enhancer solution 主成分 ルミノール、エンハンサ―、緩衝液 ルミノール/エンハンサ―溶液 Reagent B 発光試薬B Peroxide solution 過酸化水素、安定剤、緩衝液 過酸化水素溶液 本製品はPRTR法, 労働安全衛生法、毒劇法の除外規定量を超える通知対象物は含まれ ておりません。詳しくはアトーホームページ（http://www.atto.co.jp/）より本製品 のMSDSをダウンロードしてご確認ください。 -1- -10- とうします。通常は室温、4℃あるいは37℃で30 30分間以上 30分間以上振とうします。 分間以上 ５. 保存方法 ● 1010-7. 洗浄操作 1. 一次抗体との反応終了後、抗体溶液を捨てて希釈したTween 20 含有EzWashの ワーキング溶液を数mL加えて容器の内壁を軽くすすぎます（リンス操作）。 ● EzWestLumiは遮光・冷蔵（2-8℃）保存です。未開封の状態であれば使用期限 内は安定です。 EzWestLumi のReagent AとReagent B を混合したワーキング溶液は遮光・冷蔵保存 できます。徐々に活性が落ちますのでお早めにお使いください。 2. もう一回、１.のリンス操作を繰り返し行います。 3. 約30mLのTween 20 含有EzWashのワーキング溶液を注ぎ ３分間振とうします （洗浄操作）。 4. さらに２回、3.の洗浄操作を繰り返します。 ６. 廃棄方法 ● 各試薬の廃棄は、ご所属機関の廃棄方法に準拠してください。 ● ボトル材質 本体：ポリエチレン フタ：ポリプロピレン 1010-8. 二次抗体との 二次抗体との反応 との反応 1. ご使用になる抗体に添付された取扱説明書に従って、HRP標識二次抗体溶液を 調製します。 ※専用の抗体希釈液が指定されていない場合にはTween 20 含有EzWashのワーキン グ溶液、あるいは10-5 1.で作製したブロッキング溶液を用いて抗体を希釈しま す。 ７. 本製品以外に 本製品以外に必要なもの 必要なもの ● 電気泳動用ゲル（ePagel など） ● ブロッティング膜（WSE-4051 クリアブロット・Pプラス膜 等） ● ろ紙（CB-09A アブソーベントペーパー等） ● 電気泳動用試薬（AE-1430 EzApply、AE-1410 EzRun 等） ● ウェスタンブロッティング用試薬（AE-1465 EzFastBlot、AE-1480 EzWash等） ● 目的タンパク質に対する一次抗体（マウスIg）とHRP標識二次抗体 ● 電気泳動装置（WSE-1100P パジェラン-R 等） 1. 二次抗体との反応終了後、抗体溶液を捨てて希釈したTween 20 含有EzWashの ワーキング溶液を数mL加えて容器の内壁を軽くすすぎます（リンス操作）。 ● セミドライ式ブロッティング装置（WSE-4020 ホライズブロット2M –R等） ● シーソーシェーカー 2. もう一回、１.のリンス操作を繰り返し行います。 ● ピンセット ● ケミルミ撮影装置 （AE-9300 EzCapture MGなど） ※抗体希釈倍率は抗体に添付された取扱説明書を参考に検討してください。 2. 1010-7の洗浄操作後Tween 20 含有EzWashのワーキング溶液を捨てて希釈した HRP標識二次抗体を添加して30～60分間振とうします。 1010-9. 洗浄操作 3. 約30mLのTween 20 含有EzWashのワーキング溶液を注ぎ ３分間振とうします （洗浄操作）。 4. さらに２回、3.の洗浄操作を繰り返します。 ８. 使用上のご 使用上のご注意 のご注意 ● 1010-10. 10. シグナルの検出 シグナルの検出 9.使用方法 9.使用方法(3ページ)を参照して、EzWestLumiでシグナルを検出してください。 使用方法 ※EzWestLumiはReagent AとReagent B を１：１の等量で混合して使用してください。 -9- ● ● 本製品は遮光・冷蔵保存してください。室温に長時間放置すると劣化する原因と なりますのでご注意ください。 本製品はReagent AとReagent B を１：１の等量で混合して使用してください。 ボトルから試薬を採取する際には、Reagent AとReagent B が混ざらないように充 分ご注意ください。 -2- (b)EzBlock BSAのワーキング溶液 を50ｍL 作製するときは、EzBlock BSAの原 液10mL と蒸留水39.5ｍLを混合します。 9．使用方法 1. EzWestLumiを使用直前に冷蔵庫から取り出します。ミニゲルサイズ（85mm× ９0mm )のブロッティング膜1枚あたりの発光試薬Aと発光試薬Bの必要量は、 それぞれ5mLずつです。 ※発光試薬Aと発光試薬Bの必要量は、それぞれ 70～140µL/cm2 です。 2. ウェスタンブロッティングの2次抗体との反応後のブロッティング膜をEzWash （AE-1480) 等の洗浄バッファーで充分に洗浄します。 (c)EzBlock CASのワーキング溶液 を50ｍL 作製するときは、EzBlock CASの原 液10mL と蒸留水39.5mLを混合します。 2. EzBlock BSAおよび、EzBlock CASのワーキング溶液に製品に添付されている Tween 20を1/100容量添加します。上記(ｂ)あるいは(ｃ)の溶液(49.5mL)に Tween 20を0.5mL 添加します。 ※EzBlock Trial kitの各試薬のワーキング溶液を作製するときに、その他のブロッキン グ剤を添加することもできます。 ※洗浄が不充分な場合バックグラウンドが高くなることがあります。 ※各試薬のワーキング溶液をさらに希釈する際にはEzWashもしくはTBS-Tをご使用 ください。 3. 発光試薬Aと発光試薬Bを１：１の等量で混合してEzWestLumiのワーキング溶液 を作製します。ミニゲルサイズのブロッティング膜の場合、5mLの発光試薬A と 5mLの発光試薬Bを混合します。 3. ブロッティング膜が振とう方向に自由に動けるサイズの容器に各試薬のワーキン グ溶液を入れます。 4. 清潔なトレイに必要量のEzWestLumiのワーキング溶液を入れます。あるいは広 げたサランラップ®の上にEzWestLumiのワーキング溶液を滴下します。 4. ブロッティング終了後にブロッティング装置からクリアブロットP膜をピンセッ トを用いて取り出し、３.のブロッキング溶液に浸します。 5. 洗浄後のブロッティング膜を上述のEzWestLumiのワーキング溶液に浸漬します （５秒 ～ １分間）。ブロッティング膜全体にEzWestLumi のワーキング溶液が行 き渡ることをご確認ください。 6. ブロッティング膜を透明なフィルムあるいはサランラップ®に空気が入らないよ うに挟みます。 ※クリアブロットP膜が乾燥するとバックグランドの原因となりますので、以下の操 作で乾かないように十分ご注意ください。 5. ブロッティング膜を各ブロッキング試薬のワーキング溶液に浸漬し、室温で30 ～60分間振とうします。 ※ブロッキング時間が長くなる（１時間以上）とオーバーブロッキングの原因となり ますのでご注意ください。 ※ブロッティング膜とフィルムの間に空気が入ると、泡状のバックグラウンドやムラ になる原因となりますのでご注意ください。 1010-6. 一次抗体との 一次抗体との反応 との反応 ※サランラップ®に包む場合、サランラップ®の皺がブロッティング膜の表面側にでき ると皺状のバックグラウンドやムラが生じる原因になりますのでご注意ください。 7. EzWestLumiのワーキング溶液と反応後のブロッティング膜をケミルミ撮影装置 で撮影します。 ※撮影時間はサンプルの濃度と抗体の力価および希釈率により異なります。各実験ご とにご検討ください。 ※ケミルミ撮影装置の使用方法は各製造メーカーにお問い合わせください。 1. EzWashを30 mL量り取り、蒸留水(270 mL) で10倍に希釈してEzWashのワー キング溶液(300 mL) を作製します。 2. 1.のEzWashのワーキング溶液にTween 20 を0.3mL添加します。 ※ここで作製したTween 20 含有EzWashのワーキング溶液は、以下の操作で、抗体 の希釈液およびクリアブロットP膜の洗浄液としても使用します。 3. ご使用になる抗体に添付された取扱説明書に従って、一次抗体溶液を調製しま す。 ※専用の抗体希釈液が指定されていない場合にはTween 20 含有EzWashのワーキン グ溶液、あるいは 10-5 1.で作製したブロッキング溶液を用いて抗体を希釈しま す。 ※抗体希釈倍率は抗体に添付された取扱説明書を参考に検討してください。 3. ブロッキング終了後のクリアブロットP膜を希釈した一次抗体溶液に浸漬し、振 -3- -8- 10． 10．ウェスタンブロッティングの方法 ウェスタンブロッティングの方法 ① ブロッティングバッファー 数mL を下部電極板に滴下して、あら かじめ電極板を濡らします。 実験操作の流れ、および使用する試薬は下記のフローチャートの通りです。 5分 煮沸／95℃ 60～80分 20 mA／ミニゲル 5～15分 6-7mA／cm2 サンプル調整 サンプル調整 EzApply ↓ ② 下部電極板の上にブロッティン グバッファーに浸したろ紙を3枚 重ねて置きます。 EzRun, ePAGEL 電気泳動 EzStandard PrestainBlue ↓ ③ ブロッティング膜をろ紙上に重 ねて置きます。 ブロッティング ④ ブロッティングバッファー 数mL をブロッティング膜上に滴下します。 EzFastBlot, クリアブロットP膜 ↓ リンス ↓ １分 1回 ブロッキング 30分 1回 ↓ リンス ↓ １分 １回 一次抗体反応 60分 1回 1分 1回 EzWash 3分 3回 EzWash 30分 1回 1分 1回 EzWash 3分 3回 EzWash EzWash 常温 EzBlockシリーズ ⑤ ブロッティング膜とゲルの間に気泡を入れないで、ゲルを重ねて置きます。 ⑥ ブロッティングバッファーに浸したろ紙を3枚重ねて置きます。 ⑦ ゲルとブロッティング膜の密着性を高めるためにグローブをした手で上から強 く均等に押さえ、ゲルと膜間の余分なバッファーを押し出します（写真参 照）。 ※密着が不十分ですとパターンが流れたり、ブロッティング効率にムラが生じる原 因となります。 ↓ リンス ↓ 洗浄 ↓ 二次抗体反応 ⑧ 上部電極板を、重ねたろ紙上に静かに密着させ、ブロッティング装置と電源装 置をリード線で接続します。 ※ホライズブロット２Ｍ/４Ｍは下部電極が陽極（+）（赤色）です。下部電極 にはリード線の赤色端子を接続します。 ⑨ ゲルの面積当たり6～7mA/cm2の条件で5～15分通電します。この時の電圧 は約30V～40Vです。電圧は50V以上に上昇しないよう、電源装置の設定を 行ないます。 コンパクトゲル(60mm コンパクトゲル(60mm x 60mm)： 60mm)：250mA/枚 250mA/枚 ミニスラブゲル(85mm 90mm)： ：450mA/枚 ミニスラブゲル(85mm x 90mm) 450mA/枚 ↓ リンス ↓ 洗浄 ↓ EzWash 4℃／常温／37℃ 4℃／常温／37℃ EzBlock, EzWash EzWestLumi EzCapture II 5秒～30分 発光検出 EzBlock, EzWash 1010-1. 実験材料 ● AE-1430 EzApply SDSサンプル処理液 イージーアプライ ● 1010-5. ブロッキング操作 ブロッキング操作 ePAGEL プレキャストゲル イ―パジェル 1. EzBlock Chemi、EzBlock BSA、またはEzBlock CASを蒸留水でそれぞれ５倍希釈 します。最低使用量は0.65mL/cm2です。ミニスラブゲルでは約50mL必要で す。 ● AE-1410 EzRun SDS-PAGE泳動用バッファー イージーラン ● AE-1450 EzStandard PrestainBlue タンパク質有色分子量マーカー イージースタンダードプレステインブルー (a)EzBlock Chemiのワーキング溶液 を50ｍL 作製するときは、EzBlock Chemiの 原液10mL と蒸留水40ｍLを混合します。 ● AE-1465 EzFastBlot ウェスタンブロッティング溶液 イージーファストブロット -7- -4- ● WSE-4050/1/2/3 Clear Blot Membrane-P+ PVDF膜 1010-4. ブロッティング操作 ブロッティング操作 ろ紙 A. ブロッティング膜の親水化 クリアブロット・Ｐプラス膜 ● CB-06A/09A/13A/20A AbsorbentPaper アブソーベントペーパー ● AE-1475/76/77 EzBlock Chemi/BSA/CAS ブロッキング溶液 1. EzFastBlot を蒸留水で 1/10濃度に希釈し、ブロッティングバッファーを作製し ます。 洗浄用溶液（TBS溶液） 2. クリアブロットP膜より一回り大きい容器に数ｍLのメタノールを入れます。そ こにクリアブロットP膜を入れて約10秒間浸漬します。 HRP用発光基質 3. メタノールを捨てて、１．のブロッティングバッファーを約50mL添加し、30 分間以上振とうします。 イージーブロック ケミ/ビーエスエー/キャス ● AE-1480 EzWash イージーウォッシュ ● AE-1495 EzWestLumi イージーウェストルミ ※この時、必ずクリアブロットP膜が完全にEzFastBlotに浸っていることをご確認くだ さい。不完全な親水化処理はブロッティングのムラ、感度低下の原因となりますので ご注意ください。 1010-2. サンプル調整 サンプル調整 1. 5 mLのEzApplyをDTT分注ボトルに添加して溶解します。 mL 2. DTT添加後のEzApplyをタンパク質サンプルと等量加えて５分間煮沸します。 ※クリアブロットP膜は手の皮脂やタンパク質が吸着しやすい性質を持っています。 以下の操作でクリアブロットP膜を取り扱う際には手袋の着用あるいはピンセット等 を用いてください。 ※サンプルが固形物の場合は、あらかじめ蒸留水で2倍に希釈したEzApplyを適量加え て直接サンプルを溶解して下さい。 3. 軽く遠心してサンプルを回収します。 B. ブロッティング 1. ろ紙より一回り大きい容器を用意し、上述のブロッティングバッファーを約 50mL入れ、ろ紙を浸漬します。 1010-3. 電気泳動操作 1. EzRunの袋を開封し粉末を約1000mLの蒸留水に溶解して10倍濃度のSDSPAGE泳動用バッファーを作製します。 2. 1.の溶液100mLに蒸留水900mLを加えてSDS-PAGE泳動用バッファーを作 製します。 3. ePAGELの袋を開封し、ウェルに直接手を触れないよう慎重にコームを外してプ レートホル ダーにセットします。 ※ろ紙は6枚使用します。厚みの異なる他のろ紙の場合は、合計で約6mm厚となる枚 数を使用します。 2. 電気泳動が終了したらゲルを約50mLのブロッティングバッファーが入った容器 に入れ、表面を軽くすすぎ （数分以内）微細なゲル片やSDSの泡などを除きま す。ゲルを長時間浸漬や振とうする必要はありません。 3. 下図を参考にしてろ紙、膜、ゲルを順番に重ねます。 4. 泳動槽の下部槽に泳動バッファーを注ぎ、上部槽をセットします。 電極（－） 5. ウェルの上端から2～3mm上のところまで液面がくるように上部槽に泳動バッ ファーを注ぎます。 電極板 6. 5µLのEzStandard PrestainBlueと適当量の各サンプルをゲルの各ウェル内にアプラ イします。 ろ紙：3枚(3 mm) ゲル クリアブロットP膜 7. 電気泳動装置をセットし定電流 20mA/ゲルで約80分間、あるいはブロモフェ ノールブルーの青いラインがゲル下端から約5mmの部位にくるまで泳動しま す。 ろ紙：3枚(3 mm) 電極板 ※電気泳動の操作に関しましてはご使用になる電気泳動装置の取扱説明書をご参照下 さい。 -5- 電極（＋） -6-