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熊本大学学術リポジトリ Kumamoto University Repository System

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熊本大学学術リポジトリ Kumamoto University Repository System
熊本大学学術リポジトリ
Kumamoto University Repository System
Title
気道炎症治療薬の探索とその薬理学的特性に関する研究
: 漢方薬およびグリチルリチンのグルココルチコイド様
遺伝子発現調節作用
Author(s)
武井, 啓典
Citation
Issue date
2008-03-25
Type
Thesis or Dissertation
URL
http://hdl.handle.net/2298/9388
Right
熊本大学学位論文
気道炎症治療薬の探索とその薬理学的特性
に関する研究
—漢方薬およびグリチルリチンの
グルココルチコイド様遺伝子発現調節作用—
2008
武井
啓典
熊本大学学位論文
気道炎症治療薬の探索とその薬理学的特性
に関する研究
—漢方薬およびグリチルリチンの
グルココルチコイド様遺伝子発現調節作用—
2008
武井 啓典
Study on new anti-inflammatory drugs to treat
chronic airway diseases
-Glucocorticoid-like effects of herbal medicine and
glycyrrhizin on gene expression-
Hironori Takei
Study on new anti-inflammatory drugs to treat chronic airway diseases
-Glucocortioid-like effects of herbal medicine and
glycyrrhizin on gene expressionHironori Takei
Chronic inflammatory respiratory diseases, such as chronic obstructive pulmonary
diseases (COPD) are characterized by neutrophilia in the bronchoalveolar lavage fluid
(BALF) as well as by an increase of neutrophil chemoatractants, such as interleukin
(IL)-8. It is commonly believed that the treatment of the neutrophil-dependent
inflammation must be the most important to prevent the progression of these diseases.
However, the cellular inflammation or increased protease burden in COPD is often
insensitive to glucocorticoid, which is the most useful drug to treat other inflammatory
lung diseases, such as asthma. In addition, prolonged treatment of glucocorticoid causes
severe side effects even in glucocorticoid-sensitive patients. Therefore, there are only a
few therapeutic drugs for treatment of these diseases. On the other hand, clinical usage
of traditional herbal medicines for chronic diseases has been increasing. Herbal
medicines tend to have minor side effects and sometimes produce remarkable efficacy
on airway inflammation. Therefore, the first part of this study was designed to evaluate
the anti-inflammatory effect of Hochu-ekki-to in neutrophil-dependent lung
inflammation, using SO2 gas-exposed rats, and to examine the mechanism of
anti-inflammatory effect of Hochu-ekki-to with in vitro experiments. Then I have
characterized the regulatory effect of glycyrrhizin (GL), an active component of
Hochu-ekki-to, on IL-8 gene expression, comparing that of dexamethasone (DEX).
Firstly, I examined effects of Hochu-ekki-to on airway inflammation in SO2
gas-exposed rats. Hochu-ekki-to considerably inhibited the infiltration of neutrophils to
the BALF as well as DEX. In addition, Hochu-ekki-to inhibited IL-8 mRNA expression
and its promoter activation induced by tumor necrosis factor (TNF)-α, suggesting that
Hochu-ekki-to has inhibitory effect on the production of neutrophil chemotactic factors,
as well as glucocorticoids. However, Hochu-ekki-to did not activate murine mammary
tumor virus (MMTV) promoter, suggesting the effect of Hochu-ekki-to is not through
glucocorticoid receptor (GR). Hochu-ekki-to is composed of ten herbal extracts. Among
them, Glycyrrhizae Radix and Atractylodis Lanceae Rhizoma showed similar inhibitory
effects on IL-8 promoter activation, as well as Hochu-ekki-to. Finaly, I have identified
GL, as an active component of Hochu-ekki-to for the glucocorticoid-like regulatory
effect on IL-8 gene expression.
Next, I investigated glucocorticoiod-like effects by GL. Anti-inflammatory effect of GL
was assessed with SO2 gas-exposed rats. GL inhibited the increase in the number of
neutrophils and protein concentration in the BALF, confirming its anti-inflammatory
effect. In A549 cell culture, GL concentration-dependently decreased IL-8 production,
mRNA expression and promoter activation induced by TNF-α and IL-1β, as well as
DEX. Both GL and DEX also inhibited transactivation of NF-κB-dependent promoter,
without inhibiting translocation of nuclear factor (NF)-κB p65 subunit to nucleus.
Despite of the similarity between the effects of these drugs, GR antagonist RU486 and
GR siRNA did not inhibit the action of GL. In ChIP assay, GL but not DEX
significantly inhibited DNA binding of p65. These results indicated that GL inhibited
NF-κB via the mechanism independent on GR.
I assume that GL may be an useful lead compound to develop a novel therapeutic drug
to treat chronic airway inflammation, which inhibits NF-κB without major exhibit side
effects. The actions of GL were not dependent on GR. It is, therefore, possible that GL
might be effective in COPD patients who have resistance to glucocorticoids. These
findings may provide new insight to treat chronic inflammatory diseases.
略語表
本論文では以下の略語を使用した.
11β-HSD2
: 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase 2
BALF
: bronchoalveolar lavage fluid
ChIP
: chromatin immunoprecipitation
COPD
: chronic obstructive pulmonary disease
COX-2
: cyclooxygenase-2
CRP
: C-reactive protein
Ct
: threshold cycle
DEX
: dexamethasone
DMEM
: Dulbecco’s modified Eagle medium
ELISA
: enzyme-linked immunosorbent assay
FBS
: fetal bovine serum
GA
: glycyrrhetinic acid
GL
; glycyrrhizin
GR
: glucocorticoid receptor
GRE
: glucocorticoid-response element
HAT
: histone acetyletransferase
HDAC
: histone deacetylase
HMGB-1
: high-mobility group box-1 protein
HSP90
: heat shock protein90
i.p.
: intraperitoneally
ICAM-1
: intercellular adhesion molecule-1
IgG
: immunoglobulin G
IKKs
: IκB kinases
IL
: interleukin
iNOS
: inducible nitric-oxide synthase
IκB-α
: inhibitory κB-α
LPS
: lipopolysaccharide
LT
: leukotoriene
MMP
: matrix metalloproteinase
MMTV
: murine mammary tumor virus
MUC
: mucin
NF-κB
: nuclear factor κB
NSAIDs
: non-steroidal inflammatory drugs
OVA
: obalbumine
PG
: prostagrandin
PPAR
: peroxisome proliferator-activated receptor
RAGE
: receptor for advanced glycogen end-products
RAR
: retinoic acid receptor
RXR
: retinoic X receptor
siRNA
: small interfering RNA
TNF-α
: tumor necrosis factor-α
VCAM-1
: vascular adhesion molecule-1
目次
第1章 緒論 ................................................................................................ 1
第2章 補中益気湯の抗炎症作用の薬理学的特性についての検討...................... 6
2.1.本章の目的 ....................................................................................... 6
2.2.気管支炎モデルにおける補中益気湯の作用........................................... 7
1) SO2 ガス曝露ラット BALF 中の白血球数およびタンパク量に対する
補中益気湯の作用 .............................................................................. 7
2) SO2 ガス曝露ラットの気道分泌に対する補中益気湯の作用 ......................... 9
3) ラットの体重に対する補中益気湯の作用.................................................10
2.3.補中益気湯および構成生薬の IL-8 発現に対する作用............................11
1) 補中益気湯の IL-8 mRNA および IL-8 プロモーター活性に対する
作用 ..................................................................................................11
2) 補中益気湯の IL-8 転写抑制作用における GR の関与 .............................13
3) IL-8 プロモーター活性に対する PPARs 作用薬の作用..............................14
4) 補中益気湯の各生薬エキスの IL-8 プロモーター活性に対する作用 ...........15
5) GL の IL-8 プロモーター活性に対する作用 ............................................18
2.4.考察 ................................................................................................19
2.5.小括 ................................................................................................. 1
第3章 GL の抗炎症作用の薬理学的特性についての検討 ................................. 2
3.1.本章の目的 ....................................................................................... 2
3.2.気管支炎モデルにおける GL の作用 ..................................................... 4
1) SO2 ガス曝露ラット BALF 中の白血球数およびタンパク量に対する
GL の作用 ......................................................................................... 4
2) SO2 ガス曝露ラットの気道分泌に対する GL の作用 .................................... 8
3) ラットの体重および胸腺の形態に対する GL の作用 ..................................10
3.3.GL の IL-8 発現に対する作用 .............................................................12
1) GL の IL-8 産生に対する作用 .............................................................12
2) GL の IL-8 プロモーター活性に対する作用............................................15
3) GL の NF-κB の転写活性化に対する作用 ..............................................17
4) GL の NF-κB p65 の核内移行に対する作用 ...........................................19
5) GL の IL-8 転写抑制作用における GR の関与 ........................................21
6) GA の IL-8 プロモーター活性に対する作用 ............................................24
7) GL の IL-8 発現抑制における PPARs の関与 ..........................................25
8) NF-κB p65 の DNA 結合に対する GL の作用..........................................26
3.4.考察 ................................................................................................27
3.5.小括 ................................................................................................55
第4章 総括 ...............................................................................................56
第5章 実験の部.........................................................................................58
謝辞..........................................................................................................68
参考論文 ...................................................................................................70
第1章 緒論
近年,脳血管疾患や心臓疾患による死亡者数が徐々に減少する一方で,呼吸器疾
患による死亡者数は増加の一途をたどっている.呼吸器疾患といえば,かつては結核
や細菌性肺炎に代表される感染症が中心であったが,社会および医療環境の変化は
呼吸器疾患の疾病構造を著しく変化させた.すなわち,予防接種の普及や抗結核薬
の進歩は結核による死亡率を劇的に減少させ,また,抗生物質の開発は肺炎死を減
少させた.しかし一方で,これらの疾患に代わって,現在の呼吸器疾患では慢性閉塞
性肺疾患 (chronic obstructive pulmonary disease: COPD),気管支喘息および間質
性肺炎などが大半を占め,これらの慢性疾患が近年の呼吸器疾患の増加の要因とな
っている.平均寿命が延長し,超高齢化社会を迎える今世紀には,慢性呼吸器疾患
はさらに増加することが危惧されている.
慢性呼吸器疾患の成因は,環境因子,細菌,ウイルスおよびアレルギーなど様々で
あるが,慢性炎症を病態の基礎とするという点では共通する.炎症は感染,機械的お
よび化学的刺激もしくは損傷などが引き金になって生じる一種の生体防御反応である.
例えば,気道に細菌が感染すると,常在細胞の活性化に伴ってプロスタグランジン類
(prostaglandins: PGs),ロイコトリエン類 (leukotorienes: LTs) といったケミカルメディエ
ーターおよびサイトカイン類等が産生され,血管透過性の亢進が引き起こされる 1.そ
の結果,血漿成分の漏出,そして様々な白血球が血管内から気道の炎症部位へ移行
し,さらに様々なメディエーターが産生され炎症反応が進行する.ほとんどの炎症反応
は急性であり,最終的に異物が生体から除去されることによって炎症は終息する 1.し
かしながら,持続的に異物に曝され続けることによって,浸潤および活性化された白血
球および免疫担当細胞が病巣部に集積し,慢性的に組織破壊および修復を繰り返す.
これが慢性炎症である
2,3
.
慢性呼吸器疾患の中でも,近年の増加が著しいのがCOPDであり,過去の30年間で
COPDが原因で死亡した患者数は約3倍に増加している.2001年から始まった厚生労
働省が実施しているCOPDの大規模疫学調査報告では,我が国には40歳以上の8.5%,
実に530万人ものCOPD患者がいると推定されている
4,5
.また日本に限らず,欧州諸
国でも,COPDの罹患率およびCOPDが原因で死亡した患者数は近年増加傾向にあ
り,2020年までにCOPDは世界中の死亡原因の第3位になると推定され,今世紀の最
1
も重大な健康問題と位置づけられている
6,7
.COPDは喫煙を主な原因として,「完全
に可逆的ではない気流制限を特徴とする疾患であり,この気流制限は通常進行性で,
有害な粒子またはガスに対する異常な炎症反応と関連する」と定義されている
7,8
.現
にCOPD患者の気道内への炎症性細胞,とくに好中球の浸潤は著明であり,また
COPD患者の気管支肺洗浄液中におけるIL-8, TNF-α, 好中球エラスターゼおよび
E-selectinなどの炎症性メディエーター量も亢進しており,これら炎症性因子の量が換
気効率の指標であるforced expiratory volume in one second (FEV1) と負の相関を示
すことも報告されている
分けられる
7,8
9-13
.COPDは病態の進行に伴い慢性気管支炎と肺気腫型に
.すなわち,前者は気道の慢性的炎症により,気道粘膜の肥厚および
杯細胞の過形成に由来した粘液の過剰産生が見られ,喀出困難な粘液の貯留と気
道の閉塞を伴い呼吸困難を来す.また後者は,慢性の炎症によって肺胞が破壊,拡
張されこれにより肺内の細気管支や血管を圧迫して呼吸困難を生じる.また,気管支
平滑筋の過敏症,気道粘膜の浮腫や粘膜過形成および気道分泌の増加が認められ
る.いずれの病態も,病態形成の詳細な機序は解明されていないが,少なくとも慢性
炎症が病態形成の根底を担っていると考えられている.
COPD の治療は困難であり,現行の治療法では対症療法が中心である.たとえば気
道狭窄による呼吸困難には,気道確保を目的とした抗コリン薬,β2 刺激薬およびキサ
ンチン誘導体などの気管支拡張薬が用いられる
7,8
痰の喀出を容易にするために去痰薬も使用される
.また,気道粘液の過剰産生には,
7,8
.これらの薬物療法は患者の延
命,あるいは自覚症状を緩和し QOL を高めるという意味では確かに有効である.しか
しながら炎症による病気の進行を抑えるという点では無力である.むしろ抗結核薬や
抗生物質のように病気を根治させることが理想の治療とするならば,COPD の治療は
抗炎症作用に主眼を置くべきである.現在のところ慢性炎症を基礎とする慢性呼吸器
疾患の治療にはステロイド性抗炎症薬 (グルココルチコイド) が唯一の治療薬である
7,8
.グルココルチコイドは,グルココルチコイド受容体 (glucocorticoid receptor: GR) に
作用して遺伝子発現を亢進および抑制させ,その結果 PGs および LTs に加えて慢性
炎症に関わる炎症性タンパクの産生を抑制する
14
.つまり,上述した炎症反応のほぼ
全ての過程を阻害するために急性および慢性炎症に適応でき,いわば抗炎症薬の最
終手段といっても過言ではない.しかしながらグルココルチコイド受容体は全身に広く
分布しているため,感染症の増悪,骨粗鬆症およびクッシング症候群などの重篤な全
身性の副作用も生じる
14,15
.現在気管支喘息には,WHO から喘息管理の国際指針
2
(GLOBAL INITIATIVE FOR ASTHMA: GINA) が設定され,吸入ステロイド剤によっ
て厳密な病態のコントロールが可能になったものの,やはり長期投与が必要となる
COPD の治療では急性増悪時のパルス療法などの使用に限定されてしまう.したがっ
て COPD を始めとした慢性呼吸器疾患の根治を目指すためには,グルココルチコイド
のように奏功し副作用の少ない新規抗炎症薬の開発が強く望まれている.
グルココルチコイドの抗炎症作用は,lipocortin-1
inhibitor (SLPI) 17,IκB-α
18
16
,secretory leukocyte proteinase
および IL-1 receptor antagonist
の発現亢進に一部依存するものの,主に IL-8
nitric-oxide synthase (iNOS)
23
20
19
21
,eotaxin
などの抗炎症性遺伝子
,E-selectin
および cyclooxygenase-2 (COX-2)
24
22
, inducible
などの炎症性遺
伝子の発現抑制に基づくと考えられている.グルココルチコイドは,速やかに細胞膜を
透過して細胞質中に存在するステロイドホルモン受容体である GR に結合する
14
.グ
ルココルチコイドが結合した GR は構造変化を起こし分子シャペロンであ sheat shoch
protein (HSP) 90 から解離し,速やかに核内に移行する
14,25
.核内で GR は,転写亢進
および転写抑制作用によって種々の遺伝子発現を調節する
26
.転写亢進作用は,プ
ロモーター上に存在する GR 応答配列 (glucocorticoid response element: GRE) に結
合して特異的遺伝子の発現を亢進することである 27.一方転写抑制作用は,転写因子
NF-κB (p65/p50 heterodimers) とのタンパク結合によって,炎症性遺伝子の発現を抑
制することによって生じる
27
(Fig.1).グルココルチコイドの副作用が主に転写亢進作
用によって生じることを考え合わせると 14,15,副作用の少ないグルココルチコイド様の抗
炎症薬には,グルココルチコイド様の転写抑制作用をもち,転写亢進作用のない物質
が理想となる.
ところで既存の抗炎症薬の成分は,自然界および生体内から発見されている.アス
ピリンの成分であるサリチル酸が,セイヨウシロヤナギの樹皮に含まれていることはよく
知られている.グルココルチコイドの一つである cortison は,副腎の束状層から分泌さ
れるホルモンが慢性関節リウマチ患者に著効を示した背景から Edward Calvin Kendall
らによって発見された
28
.これら以外にも,天然物からは多くの抗炎症物質が発見さ
れている.赤ブドウの成分である resveratrol
31,32
29,30
や人参の主成分である ginsenoside
などはその代表的な例である.しかしながら,アスピリンなどの古典的薬物を除け
ば,天然物成分の抗炎症作用の分子機序を解明し,医薬品として応用した例は未だ
ほとんどないのが現状である.
3
このような背景のもと,本研究ではグルココルチコイドのように奏功し副作用が少ない
新規抗炎症薬の開発を究極的な目的として,まず第2章では,抗炎症候補物質を検
索する素材として漢方方剤である補中益気湯に着目し,その抗炎症作用の薬理学的
特性について in vivo および in vitro で検討した.次に第3章では,生薬甘草の主成分
であり多くの漢方薬に含まれている glycyrrhizin (GL) に着目し,その抗炎症作用の薬
理学的特性について in vivo および in vitro で検討するとともに,その分子機序につい
ても検討した.また,一連の実験は代表的グルココルチコイド製剤である
dexamethasone (DEX) を活性対照薬として用い,DEX との類似性および相違性につ
いて比較検討した.
以下に本研究で得られた知見を詳述する.
4
Glucocorticoid
Glucocorticoid
Transrepression
Transactivation
GR
GR
mRNA
HDAC2
CBP
p50
p65
κB
GRE
IL-8
TNF-α
MMPs
Lipocortin-1
SLPI
IκB-α
Nucleus
Nucleus
Fig. 1. Transcriptional Regulation by Glucocorticoid.
Glucocorticoid binds to GR, which readly tranaslocates into nucleus. Within the nucleus, GR
regulates gene expressions through two mechanism. The first is transactivation (right panel), and
the second is transrepression (left panel).
5
補中益気湯の抗炎症作用の薬理学的特性についての検討
2.1.本章の目的
グルココルチコイドが様々な炎症性疾患に用いられる代表的な抗炎症薬であること
は前章ですでに述べた.近年 COPD を始めとした慢性炎症を基礎とする慢性呼吸器
疾患の患者数は増加の一途をたどっているが,グルココルチコイドはこれら疾患に一
定の治療効果を示す.しかし,感染症の増悪,骨粗鬆症およびクッシング症候群など
の重篤な全身性の副作用が生じ.長期投与を必要とする慢性疾患の治療では必ず問
題となる.
補中益気湯は,10種類の生薬から構成される漢方方剤であり,日本では栄養状態
の改善を目的として様々な慢性疾患に用いられている
33,34
.例えば中程度もしくは重
度の COPD 患者は,痰,咳および労作性の呼吸困難等の症状に加えて,体力の減退,
栄養障害,体重減少等の全身症状も著明で,高齢者では免疫能の低下に基づく感染
とそれによる急性増悪なども問題となる
一定の臨床効果を得たという報告も多い
7,35
.そのため臨床上で補中益気湯を用い,
36,37
.さらに補中益気湯の有効性については,
厚生労働省の長寿科学研究の課題として,対照群を設けた臨床評価がなされ,気力
や栄養状態の改善が認められた.また興味深いことに,C-reractive protein (CRP),
tumor necrosis factor-α (TNF-α)といった血中の炎症性マーカーの低下も認められ
ている.このことは,補中益気湯が,単に気力や栄養状態を改善するばかりでなく,抗
炎症作用を併せ持つことを示唆している
38
.すなわち, 補中益気湯には慢性の気道
炎症に対して奏功する抗炎症物質が含まれている可能性が考えられる.
そこで本章では,補中益気湯の抗炎症作用について in vivo および in vitro の実験
系を用いて検討した.
6
2.2.気管支炎モデルにおける補中益気湯の作用
1) SO2 ガス曝露ラット BALF 中の白血球数およびタンパク量
に対する補中益気湯の作用
補中益気湯の気道炎症に対する作用の評価には,杯細胞の過形成,気道粘液の
産生亢進および気管支肺洗浄液 (bronchoalveolar lavage fluid: BALF) 中への炎症
性細胞の浸潤というヒトの気管支炎に類似した病態を呈する SO2 ガス曝露ラットを用い
た
39-41
.まず,SO2 ガス曝露よって惹起したラットの気管支炎に対する補中益気湯の作
用を,BALF 中に浸潤した白血球数により評価した.SO2 ガスに 21 日間曝露すると,
BALF 中の総細胞数は約 1.5 倍と著明に増加した.また BALF 中に含まれる白血球の
組成を調べると,健常ラットではほぼ 100%がマクロファージであったのに対して,SO2 ガ
ス曝露ラットではマクロファージの他にリンパ球および好中球が多く認められた (Fig.
2A).また気管支喘息等のアレルギー性疾患で著明となる好酸球の浸潤は認められな
かった.
この SO2 ガス曝露による白血球数の増加に対して,DEX は総細胞および好中球数を
有意に抑制した,一方,補中益気湯も同様の抑制作用を示し,さらに投与量依存性も
認められた (Fig. 2A).
気道炎症のもう一つの指標として BALF 上清中のタンパク量も測定した. SO2 ガス曝
露ラットの BALF 中のタンパク濃度は,健常ラットと比較して約 1.5 倍に亢進した (Fig.
2B).BALF 中のタンパク質の大部分がアルブミンであったことから,このタンパク質濃
度の増加は,気道炎症による血管透過性の亢進に伴う血漿タンパク質の漏出によると
考えられられた.またこのタンパク質濃度の増加に対して,DEX は有意な抑制作用を
示した (Fig. 2B).さらに,補中益気湯も同様の抑制作用を示し,血管透過性の亢進を
抑制すると考えられた.
7
Cell Number in BALF (x 103 cells)
A
70
*
60
50
*
Total cell
Macrophage
Neutrophil
Lymphocyte
#
40
#
#
30
20
*
#
10
0
#
#
*
Normal
Saline
0.1
1
DEX
Hochu-ekki-to (g/kg) (0.1 mg /kg)
SO2-exposed (21 days)
Protein Concentration (μg/ml)
B
#
300
*
200
100
0
Normal
Saline
0.1
1
DEX
Hochu-ekki-to (g/kg) (0.1 mg /kg)
SO2-exposed (21 days)
Fig. 2. Effects of Hochu-ekki-to and DEX on number of total and differential cells and
protein concentration in BALF from SO2-exposed rats.
Bronchoalveolar lavage was performed after SO2-exposure for 21 days. (A) The number of cells
in BALF was determined using cytospins and May-Grunwald stain. (B) The protein concentration
in BALF was measured. Results represent the means ± SE (n=5-7). * and #P<0.05 compared
with normal and saline group, respectively.
8
2) SO2 ガス曝露ラットの気道分泌に対する補中益気湯の作用
気道分泌に対する補中益気湯の作用を調べるために,BALF 中のフコースおよび
フォスファチジルコリン量を測定した.気道粘液は,高度に糖鎖付加されており,その
末端がフコシル化されていることから,フコース量は分泌された粘液量の指標となる
また,フォスファチジルコリンは肺サーファクタンンの主構成成分である
43
42
.
.
SO2 ガス曝露ラットの BALF 中のフコース量は,健常ラットに比べて約 1.3 倍と有意に
増加した.したがって,SO2 ガス曝露によって気道粘液の分泌が亢進していると考えら
れた.この増加に対して,今回投与した DEX および補中益気湯には有意な作用は認
められなかった (Fig. 3A).
フォスファチジルコリン量は,健常ラットに比べ, 約 2.5 倍と有意に増加した. したが
って,SO2 ガス曝露によって肺サーファクタントの分泌が亢進していると考えられた.こ
の増加に対して,フコース量と同様に今回投与した DEX および補中益気湯には有意
な作用は認められなかった (Fig. 3B).
B
5
Concentration (μg/ml)
Concentration (μg/ml)
A
4
*
*
3
*
*
2
1
0
Normal
Saline
0.1
1
DEX
Hochu-ekki-to (g/kg) (0.1 mg /kg)
400
350
300
*
*
250
*
*
200
150
100
50
0
Normal
Saline
0.1
1
DEX
Hochu-ekki-to (g/kg) (0.1 mg /kg)
SO2-exposed (21 days)
SO2-exposed (21 days)
Fig. 3. Effects of Hochu-ekki-to and DEX on airway secretion of SO2-exposed rats.
Bronchoalveolar lavage was performed after SO2-exposure for 21 days. The concentration of
fucose (A) and phosphatidylcholine (B) in BALF were measured. Results represent the means ±
SE (n=5-7). *P < 0.05 compared with normal group.
9
3) ラットの体重に対する補中益気湯の作用
グルココルチコイドは,気道炎症を著明に抑制する一方で,長期投与では体重減少
などの重篤な副作用が生じる.そこで本研究でも,補中益気湯および DEX の投与によ
るラットの体重変化について検討した.
21 日間 DEX を投与しながら SO2 ガス曝露したラットの体重は,生理食塩水の投与と
比べて著明な減少が認められた.一方,補中益気湯投与群では,0.1 g/kg 投与群で
は著明な変化は認められなかったが,1g/kg 投与群では減少傾向を示した (Fig. 4).
270
Body Weight (g)
control
Hochu-ekki-to ( 0.1g/kg)
240
Hochu-ekki-to (1g/kg)
DEX (0.1 mg/kg)
210
180
150
0
14
7
21
SO2-exposed (days)
Fig. 4. Effects of Hochu-ekki-to and DEX on body weight of SO2-exposed rats.
Rats were exposed to SO2 and administrated with saline ( ● ), DEX (0.1 mg /kg, ◇ ),
Hochu-ekki-to (0.I g/kg, ■) and Hochu-ekki-to(1 g/kg, ▲) for 21days. Results represent the
means ± SE (n=6-7).
10
2.3.補中益気湯および構成生薬の IL-8 発現に対する作用
1)
補中益気湯の IL-8 mRNA および IL-8 プロモーター活性に対する作用
前節の結果から,補中益気湯は気管支炎ラットに対して DEX に類似した抗炎症作
用をもつと考えられた.本研究で用いたモデルおよび COPD の特徴として,BALF 中
の好中球数が著明に亢進していることが挙げられる
因子である IL-8 の遺伝子発現を抑制し
考えられており
45
9,10,39,40
.また DEX は好中球遊走
20,44
,気道内への好中球の浸潤を抑制すると
,また前節の結果でも,DEX は BALF 中の好中球数を著明に減少さ
せた.つまり補中益気湯が DEX と同様に好中球数を減少させたことを考えると,補中
益気湯は DEX と同様に IL-8 の遺伝子発現を抑制する可能性が考えられる.そこでま
ず,補中益気湯の IL-8 mRNA の発現量およびプロモーター活性に対する作用を調べ
た.
ヒト肺上皮細胞株 A549 細胞に 2.5 ng/ml の濃度で TNF-αを4時間処理し,IL-8
mRNA の発現量を semi-quantitative RT-PCR によって調べた.その結果,IL-8 mRNA
の著明な発現亢進が確認された.この発現亢進に対して,100 nM の濃度で DEX を1
時間前処理し同様な実験を行なうと,IL-8 mRNA の発現亢進は著明に抑制された
(Fig.5 A). また IL-8 プロモーター遺伝子をルシフェラーゼベクターに組み込んだリポ
ーター遺伝子を細胞に導入し,IL-8 プロモーター活性をルシフェラーゼアッセイによ
って調べた.その結果,TNF-αを 6 時間処理すると IL-8 プロモーター活性は著明に
亢進した.この活性亢進は,DEX 処理によって著明に抑制された (Fig. 5B).一方,補
中益気湯については,1 mg/ml の濃度で1時間前処理すると,TNF-αによる IL-8
mRNA の発現亢進は DEX と同様に著明に抑制された (Fig. 5A).また IL-8 プロモータ
ー活性について調べると,0.03, 0.1, 0.3 および 1.0 mg/ml の濃度で 1 時間前処理
すると,TNF-αによる IL-8 プロモーター活性の亢進は用量依存的に抑制された.補
中益気湯による IL-8 プロモーター活性の抑制は,最大で約 30%であった (Fig. 5B).
これらの結果から,補中益気湯は DEX と同様な IL-8 の転写抑制作用をもつと考えら
れた.
11
A
TNF-α (2.5 ng/ml)
Control
Vehicle
DEX Hochu-ekki-to
(100 nM) (1 mg/ml)
IL-8
GAPDH
Relative Luciferase Activity
B
3.0
2.5
2.0
*
*
*
*
0.3
1.0
1.5
* *
1.0
0.5
0
Control Vehicle 0.03
0.1
Hochu-ekki-to (mg/ml)
DEX
(100 nM)
TNF-α (2.5 ng/ml)
Fig. 5. Effects of Hochu-ekki-to and DEX on TNF-α-induced IL-8 gene expression.
(A) Confluent A549 cells were serum-starved for 6 h and pretreated with either Hochu-ekki-to (1
mg/ml) or DEX (100 nM) for 1 h, after which, cells were treated with TNF-α (2.5 ng/ml) for 4 h.
IL-8 mRNA expression was assessed by semi-quantitative RT-PCR. GAPDH was used as
internal control. Result was representative of two independent experiments. (B) A549 cells were
transiently transfected with IL-8 promoter plasmid and incubated for 24 h. Cells were then
serum-starved for 6 h and pretreated with either Hochu-ekki-to (0.03, 0.1, 0.3, or 1.0 mg/ml) or
DEX (100 nM) for 1 h, after which, cells were treated with TNF-α (2.5 ng/ml) for 6 h.
Transcriptionl activity was assessed by luciferase assay. Results represent the means ± SE
(n=3-5) in three indepnednt experiments. *P<0.05 compared with TNF-α alone.
12
2) 補中益気湯の IL-8 転写抑制作用における GR の関与
補中益気湯は,DEX と同様な IL-8 の転写抑制作用を示した.では次に補中益気湯
が DEX と同様にグルココルチコイド受容体を活性化するか否かについて検討した.グ
ルココルチコイド感受性遺伝子である MMTV プロモーターを細胞に遺伝子導入して,
100 nM の濃度で DEX を 36 時間処理すると本プロモーター活性は著明に亢進した.
しかしながら,1mg/ml の濃度で補中益気湯を 36 時間処理してもプロモーター活性に
著明な影響は生じなかった.したがって,補中益気湯は DEX とは異なり GR の直接的
な ligand を含まないと考えられ,補中益気湯の IL-8 転写抑制作用は GR 非依存的で
Relative Luciferase Activity
あると考えられた.
350
Vehicle Control
300
with RU486 (100 nM)
250
200
150
100
50
0
Control
Hochu-ekki-to
(1 mg/ml)
DEX
(100 nM)
Fig. 6. Involvement of GR in the effects of Hochu-ekki-to and DEX.
A549 cells (80% confluent) were transfected with MMTV promoter plasmid and incubated for 24
h. Cells were then serum-starved for 6 h and treated with either Hochu-ekki-to (1 mg/ml) or DEX
(100 nM) combined with or without RU486 (100 nM) for 36 h. Transcriptional activity was
assessed by luciferase assay. Results represent the means ± SE (n=3) in three independent
experiments.
13
3) IL-8 プロモーター活性に対する PPARs 作用薬の作用
近年 GR 以外に炎症性遺伝子の転写抑制作用を示す標的として,核内受容体であ
る peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) が注目を集めてきている.
PPARs は本来脂質代謝に関わる分子として同定されたが
すことが示唆され,詳細な分子機序の解明がなされている
46,47
,近年抗炎症作用を示
46,48
.そこで,補中益気湯
が PPARs を活性化している可能性を考え,PPAR-α, および PPAR -γ両作用薬の
IL-8 プロモーター活性に対する作用を調べた.PPAR-αおよび PPAR -γ作用薬には,
それぞれ Wy14, 643 および 15d-PGJ2 を用いた.しかし,両薬物をそれぞれ 100 μM お
よび 10 μM の濃度で1時間処理しても TNF-αによる IL-8 プロモーター活性に著明な
影響は生じなかった (Fig. 7).この結果から,少なくとも本実験系において PPAR-αお
よび PPAR -γは IL-8 転写抑制作用を示さず,補中益気湯による IL-8 の転写抑制作
Relative Luciferase Activity
用は PPAR-αおよび PPAR -γに非依存的であると考えられた.
5
4
3
2
*
1
0
Control
Vehicle Wy14,643 15d-PGJ2 DEX
(100 μM) (10 μM) (100 nM)
TNF-α (2.5 ng/ml)
Fig. 7. Effects of PPAR-α or PPAR-γ agonist on TNF-α-induced transcriptional activity of
IL-8 promoter gene.
A549 cells (80% confluent) were transiently transfected with IL-8 promoter plasmid and
incubated for 24 h. Cells were then serum-starved for 6 h and pretreated with either Wy14, 643
(100 μM), 15d-PGJ2 (10 μM) or DEX (100 nM) for 1 h, after which, cells were treated with TNF-α
(2.5 ng/ml) for 6 h. Transcriptional activity was assessed by luciferase assay. Results represent
the means ± SE (n=3) in three independent experiments. *P <0.05 compared with TNF-α alone.
14
4) 補中益気湯の各生薬エキスの IL-8 プロモーター活性に対する作用
補中益気湯は黄耆 (Astragali Radix), 蒼朮 (Atractylodis Lanceae Rhizoma (ALR)),
人参(Ginseng Radix), 当帰 (Angelicae Radix), 柴胡 (Bupleuri Radix), 大棗 (Zizyphi
Fructus), 陳皮 (Aurantii Nobilis Pericarpium (ANP)), 甘草 (Glycyrrhizae Radix), 升
麻 (Cimicifugae Rhizoma)および生姜 (Zingiberis Rhizoma)の10種類の生薬エキスから
構成される漢方方剤である.次に,これら構成生薬のうち,どの生薬エキスがIL-8の転
写抑制作用をもつかを明らかにするために,各生薬エキスの作用についてIL-8プロモ
ーターを用いたリポーターアッセイにより検討した.まず,補中益気湯10 mg/ml の濃
度に相当する各生薬エキスを1時間前処理したところ,甘草および蒼朮が有意に
TNF-αによって惹起されたIL-8プロモーター活性を抑制した (Fig. 8).
また甘草,蒼朮および両エキスの一味抜き実験も同様に行なった.補中益気湯10
mg/ml の濃度に相当する各生薬エキスで調製した混合液を処理すると,有意にIL-8
プロモーター活性が抑制された.また,甘草もしくは蒼朮を一味抜きした混合液を処
理すると,抑制程度は弱いもののIL-8プロモーター活性は有意に抑制された.しかし
ながら両エキスを抜いた混合液を処理すると,IL-8プロモーター活性に有意な抑制は
認められなかった (Fig. 9).これらの結果から,補中益気湯によるIL-8の転写抑制作
用は甘草および蒼朮エキスに基づくと示唆された.
15
% Stimulation
150
100
*
50
*
*
*
0
TNF-α
DEX Hochu-ekki- Bupleuri Zizyphi
Radix
to
Fructus
(2.5 ng/ml) (100 mM)
(1mg/ml)
ANP Glycyrrhizae Zingiberis
Radix
Rhizoma
ALR Cimicifugae Astragali Ginseng Angelicae
Rhizoma
Radix
Radix
Radix
amount corresponding to Hochu-ekki-to (10 mg/ml)
Fig. 8. Effects of herbal extract of Hochu-ekki-to on TNF-α-induced transcriptional activity
of IL-8 promoter gene.
A549 cells (80% confluent) were transfected with IL-8 promoter plasmid and incubated for 24 h.
Cells were serum-starved for 6 h and pretreated with either Hochu-ekki-to (1 mg/ml), amount of
herbal extract corresponding to Hochu-ekki-to (10 mg/ml), or DEX (100 nM) for 1h, after which,
cells were treated with TNF-α for 6 h. Transcriptional activity was assessed by luciferase
assay. % Stimulation was based on ralative luciferase activity in TNF-α alone. Results represent
the means ± SE (n=3-5) in three independent expreriments. *P <0.05 compared with TNF-α
alone.
16
% Stimulation
150
#
100
*
*
*
*
50
0
TNF-α
DEX
A
B
C
mixture of herbal extract
(10 mg/ml)
Fig. 9. Effects of Glycyrrhizae Radix and ALR on TNF-α-induced transcriptional activity of
IL-8 promoter gene.
A549 cells (80% confluent) were transfected with IL-8 pmomoter plasmid and incubated for 24 h.
Cells were serum-starved for 6 h and pretreated with mixture of herbal extract (10 mg/ml) without
either Glycyrrhizae Radix (A), ALR (B), or Glycyrrhizae Radix and ALR (C) for 1 h, after which,
cells were treated with TNF-α for 6 h. Transcriptional activity was assessed by luciferase
assay. % Stimulation was based on ralative luciferase Activity in TNF-a alone. Results represent
the means ± SE (n=3-5) in three independent experiments. * and #P <0.05 compared with TNF-α
alone and mixture of herbal extract, respectively.
17
5) GL の IL-8 プロモーター活性に対する作用
前項の結果より,補中益気湯の甘草および蒼朮エキスが IL-8 転写抑制作用をもつ
と示唆された.ところで,GL が甘草エキスの主成分であることはよく知られている.そこ
で GL の IL-8 プロモーター活性に対する作用について検討した.0.1, 0.3 および 1 mM
の濃度で GL を1時間前処理すると,TNF-αによって惹起された IL-8 プロモーター活
性は用量依存的に抑制され,またその抑制作用は最大 50%であった (Fig. 10).この
結果から,少なくとも GL は甘草による IL-8 の転写抑制作用の一部を担っていると考え
Relative Luciferase Activity
られた.
8.0
6.0
4.0
*
*
2.0
0
Control Vehicle
0.1
0.3
GL (mM)
1
*
DEX
(100 nM)
TNF-α (2.5 ng/ml)
Fig. 10. Effects of GL and DEX on TNF-α-induced transcriptional activity of IL-8 promoter
gene.
A549 cells (80% confluent) were transiently transfected with IL-8 promoter plasmid and
incubated for 24 h. Cells were then serum-starved for 6 h and pretreated with either GL (0.1, 0.3,
or 1 mM) or DEX (100 nM) for 1 h, after which, cells were treated with TNF-α (2.5 ng/ml) for 6 h.
Transcriptional activity was assessed by luciferase assay. Results represent the means ± SE
(n=3-5) from three independent experiments. *P<0.05 compared with TNF-α alone.
18
2.4.考察
本章では,補中益気湯が in vivo および in vitro で抗炎症作用を示すことが明らかと
なった,以下に本作用について考察する.
まず,SO2 ガスに 3 週間曝露して作製した気管支炎ラットに対する補中益気湯の作用
を調べた.本モデルは,健常ラットに比べて BALF 中の白血球数,タンパク質,および
フコース量の著明な増加が認められ,血管透過性の亢進および気道粘液の分泌亢進
を伴う気道炎症が惹起されたことが確認された.さらに肺の著明な充血および浮腫を
伴い (データーは示さず),また BALF 中に浸潤した白血球のうち好中球数の増加が
著明であったことから,臨床上の慢性気道炎症と類似の好中球性の炎症を呈している
と考えられる (Fig. 2A, B).
今回補中益気湯の抗炎症作用は,SO2 曝露ラットの BALF 中の総細胞数およびタン
パク質量を白血球遊走および血管透過性亢進の指標として測定したが,補中益気湯
は DEX と同様に総細胞数および好中球数を著明に減少させた (Fig. 2A).さらにタン
パク質量の増加に対して,補中益気湯はコントロールと比べ著明に減少させた (Fig.
2B).また補中益気湯が好中球を主体とした気道炎症を抑制することは,LPS 惹起によ
る急性肺傷害モデルにおいて,補中益気湯が BALF 中の好中球数および血清中の
好中球遊走因子である KC 量を抑制したという報告からも支持される
49
.これらの結果
から,補中益気湯は DEX に類似した気道炎症抑制作用をもつと考えられる.
DEX 投与群では,著明な体重減少が認められた.一方,補中益気湯投与群では,1
g/kg で軽度の体重減少が認められたものの,好中球浸潤抑制作用が認められた 0.1
g/kg では著明な変化は見られなかった (Fig. 4).おそらく 1 g/kg での体重減少は,1
g/kg という高用量の胃内投与による摂食量の減少によると推定している.
グルココルチコイドの気道炎症抑制作用は,主に転写因子 NF-κB 阻害による IL-8
などの炎症性遺伝子の発現抑制と考えられている
44,50,51
.補中益気湯の IL-8 mRNA
発現量およびプロモーター活性に対する作用を調べると,DEX と同様に補中益気湯
はこれらを著明に抑制した.またプロモーター活性の抑制は用量依存的であった.つ
まり,補中益気湯に DEX と同様な IL-8 の転写抑制作用が確認された (Fig. 5A, B).
19
最近,補中益気湯が培養したヒト気管上皮細胞でのライノウイルス感染を抑制し,その
機序の一部はライノウイルスの受容体である ICAM-1 の発現抑制に基づくという報告
がされた
52
.また,DEX も補中益気湯と同様に ICAM-1 の発現を抑制し,ライノウイル
ス感染を抑制するという報告もされている
の標的遺伝子であることを考慮すると
54
53
.つまり ICAM-1 が IL-8 と同様に NF-κB
,本研究の結果とよく相関しており,補中益気
湯は DEX と同様に NF-κB 阻害作用をもつと推定される.
補中益気湯は,in vivo および in vitro で DEX と同様な抗炎症作用を示すものの,作
用機序は DEX とは異なる.グルココルチコイドは細胞質の GR に結合し,その後 GR
は速やかに核内に移行し,遺伝子発現を調節する
14,26
.本研究で,補中益気湯はグ
ルココルチコイド感受性遺伝子である MMTV プロモーターを活性化しなかった (Fig.
6).つまり,補中益気湯が直接 GR を活性化する可能性は排除できるであろう.また,
GR と同様な転写抑制作用を示す PPAR-αおよび PPAR-γ作用薬も IL-8 のプロモータ
ー活性に影響しなかったことから,補中益気湯が PPAR-αおよび PPAR-γを活性化す
る可能性も排除できるであろう (Fig. 7).したがって,補中益気湯の IL-8 転写抑制作
用は GR, PPAR-αおよび PPAR-γ に非依存的であると考えられ,従来知られている抗
炎症機序とは異なる機序が関わっていると考えられる.
10 mg/ml 補中益気湯相当量の甘草および蒼朮エキスが,IL-8 のプロモーター活
性を著明に抑制した.一方,甘草および蒼朮エキス抜きの生薬混合液は,IL-8 プロモ
ーター活性に対して有意な作用を示さなかった (Fig. 8, 9).これらの結果から,補中
益気湯の IL-8 転写抑制作用には甘草および蒼朮が重要と考えられる.しかし,1
mg/ml 補中益気湯相当量の甘草および蒼朮が抑制作用を示さなかったこと (データ
は示さず) から,他成分間との相互作用の可能性もまた重要と考えられる.甘草の主
成分である GL も IL-8 プロモーター活性を抑制した (Fig. 10).GL は in vitro で
eotaxin-1 および IL-8 の産生を抑制し,グルココルチコイド様の抗炎症作用を示すと
報告されている
55
.したがって,この結果は,GL が DEX と同様な遺伝子発現抑制作
用を示す可能性を示唆している.また,GL は生薬甘草の主成分であり,多くの漢方薬
に含まれている.例えば,補中益気湯と同様に慢性気道炎症に奏功する麦門冬湯も
そのひとつである.本研究の予備実験として,麦門冬湯が補中益気湯と同様に IL-8
プロモーター活性を著明に抑制した (データは示さず).麦門冬湯と補中益気湯の甘
草含量は異なるものの,この結果は漢方薬の抗炎症作用には一部 GL が寄与してい
る可能性を示唆しており興味深い.
1
2.5.
小括
本章では,補中益気湯の抗炎症作用の薬理学的特性に関する検討を行なった.得
られた知見を以下に要約する.
1.補中益気湯は,DEX に類似した気道炎症抑制作用を示した.
2.補中益気湯は,DEX と同様に IL-8 の転写抑制作用を示した.
3.補中益気湯は,GR, PPAR-αおよび PPAR-γを活性化しなかった.
4.IL-8 転写抑制作用には,甘草 (グリチルリチン) および蒼朮が重要と
考えられた.
以上の結果から,補中益気湯が in vivo および in vitro でグルココルチコイド様作用を
示すことが明らかとなった.また補中益気湯の作用機序が GR, PPAR-α および
PPAR-γに非依存的であることは,新規抗炎症薬になりえる創薬標的分子の存在を示
唆しており大変興味深い.
1
第3章 GL の抗炎症作用の薬理学的特性についての検討
3.1.本章の目的
GL は,1分子の glycyrrhetinic acid (GA) と2分子のグルクロン酸から構成されるトリ
テルペン配糖体である (Fig. 11).GL は種々の漢方方剤に広く含まれる生薬甘草の
主成分であり,抗炎症
56-59
,抗アレルギー
60
および抗ウイルス
61-63
作用など様々な薬
理作用をもつことが知られ,漢方薬の薬効の一部を担うと考えられている.前章に記し
た補中益気湯の作用でも,甘草の作用が一部関わっていると考えられ,その活性成
分が GL である可能性を示した.GL は日本では20年以上にわたって慢性肝炎の治療
薬として利用されている
64,65
.気道炎症に対する GL の作用についても,経口投与した
GL が,ovalbumin (OVA) 感作マウスの喘息性アレルギー反応を抑制するとともに,
BALF 中の IL-4 および IL-5 等の炎症性サイトカイン量を減少させるなどの報告があり
60
,グルココルチコイドと類似の効果を持つことが示されている.
GL は腸内細菌によって代謝され GA に変換される
66
.この GA はグルココルチコイド
の不活性化酵素である 11β-hydroxysteroid dehydrogenase2 (11β-HSD2) を阻害する
67,68
.したがって,GL による抗炎症作用は,GA が内因性のグルココルチコイドの分解
を抑制することによって生じると長年考えられてきた.しかしながら,前章で示したよう
に,GL は in vitro での実験系でも IL-8 のプロモーター活性を抑制し,GL 自身がグル
ココルチコイド様の転写調節作用をもつことが明らかとなった.また静脈投与した GL が
lipopolysaccharide (LPS) によって惹起したマウスの肺の急性炎症を抑制したという報
告もある
58
.これらのことを併せて考えると,GL のグルココルチコイド様の抗
炎症作用には,必ずしも GA への生物学的変換を必要とせず,GL 自身のもつ転
写調節作用が一部関わっている可能性が考えられる.
前章で示した補中益気湯の抗炎症作用については,少なくともグルココルチ
コチコイドの副作用が原因となる転写亢進作用は認められなかった.したがっ
て,GL の転写調節作用を詳細に調べれば,グルココルチコイドのように奏功し,
副作用の少ない抗炎症作用を考える上での,新たな機序を見出せる可能性があ
る.そこで本章では,GL の薬理学的特性について in vivo の実験系を用いて,気
道炎症に対する抑制作用を検証するとともに,抗炎症作用に繋がる遺伝子発現
2
調節作用の機序を in vitro の実験系により検討した.
Fig. 11. Chemical Structure of GL
3
3.2.気管支炎モデルにおける GL の作用
1) SO2 ガス曝露ラット BALF 中の白血球数およびタンパク量に対する GL の作用
GL の in vivo での作用の評価には,以下の二つのモデルを用いた.一つ目は,16
日間 SO2 ガス曝露した気管支炎モデルである.もう一つは,臨床上の慢性炎症性呼吸
器疾患に類似した病態モデルにおける治療効果を推定するために,ラットをまず 3 週
間の SO2 ガス曝露を施し気道炎症を惹起した後に,薬物を投与しながらさらに 4 週間
の計7週間 SO2 ガス曝露した気管支炎モデルである.
GL の作用は,気管支肺洗浄液中に浸潤してきた白血球数により評価した.16 日間
SO2 ガス曝露により,コントロール群での BALF 中の総白血球数は,健常ラットと比べ約
3.5 倍と著明に増加した.また総白血球数の組成は,健常ラットではほぼ 100 %がマク
ロファージであったのに対して,SO2 曝露によってマクロファージ以外に好中球および
リンパ球が認められ,これらの白血球数が著明に増加した.一方,気管支喘息等のア
レルギー性疾患で著明となる好酸球の浸潤はほとんど認められなかった (Fig. 12A).
これらの結果から,SO2 ガス曝露により臨床上の気管支炎と類似したマクロファージ,
好中球およびリンパ球依存的な気道炎症モデルが作製されたと考えられる.
この SO2 ガス曝露による白血球数の増加に対して,DEX および GL は総細胞数,マ
クロファージ,好中球およびリンパ球数をそれぞれ有意に抑制した.さらに GL には投
与量依存的な抑制作用が認められ (Fig. 12A),GL は DEX と同様の白血球の浸潤抑
制作用をもつと考えられた.
気道炎症のもう一つの指標として BALF 中のタンパク量について調べた.16 日間の
SO2 暴露ラットの BALF 中のタンパク量は,健常ラットに比べて約 2.2 と有意に増加した
(Fig. 12B).また BALF 中のタンパク質の大部分がアルブミンであったことを考慮すると,
SO2 ガス曝露によるタンパク質量の増加は,気道炎症による血管透過性の亢進に伴う
血漿成分の漏出によると考えられる.このタンパク質量の増加に対して,DEX および
15 および 45 mg /kg の投与量の GL には有意な作用は認められなかった.しかしなが
ら,135 mg/kg の投与量の GL には弱いながらも有意な抑制が認められた (Fig.
12B).
7週間の SO2 ガス曝露により,コントロール群では健常ラットに比べ,BALF 中の総細
4
胞数,マクロファージ,リンパ球および好中球数の増加が著明であり,16 日間曝露と同
様に好酸球はほとんど認められなかった (Fig. 13A).16 日間 SO2 ガス曝露を施したラ
ットの BALF 中の白血球数が,マクロファージ 70%, 好中球 21 %, リンパ球 8.3%であ
ったのに対して,7 週間曝露ではマクロファージ 40 %, 好中球 26%, リンパ球 34%と好
中球およびリンパ球の著明な増加が認められ (Fig. 12A, 13A),7週間曝露は臨床上
の慢性気管支炎患者の病態に類似していた
69
.
この白血球数の増加に対して,GL および DEX はマクロファージ数には統計学的な
有意な差を認めなかったものの,総細胞数,リンパ球および好中球をコントロール群と
比べて有意に減少した.すなわち,GL は DEX と同様の好中球およびリンパ球の浸潤
抑制作用をもつと考えられた (Fig. 13A).
血管透過性亢進の指標として,BALF 中のタンパク質量を測定した.7 週間の SO2 ガ
ス曝露により,タンパク質量は,コントロール群では健常ラットに比べ約 1.6 倍と有意に
増加した (Fig. 13B).この増加に対して,GL および DEX はともにタンパク質量の増加
を著明に抑制し,健常ラットのレベルまで低下させた (Fig. 13B).すなわち,GL は
DEX と同様の血管透過性を抑制する作用をもつと考えられ,白血球の浸潤抑制作用
を考えあわせると,少なくとも 135 mg/kg の投与では GL が DEX と同等の気道炎症抑
制作用をもつと考えられた.
5
Cell Number in BALF (x 103 cells)
A
100
Macrophag e
Lymphocyte
Total cell
*
Neutrophil
75
*
#
#
50
#
25
#
#
#
Normal
Saline
#
#
15
#
#
*
*
0
#
#
#
#
#
45
GL (mg/kg)
#
135
DEX
(1 mg/kg)
SO2-exposed (16 Days)
Protein Concentration (μg/ml)
B
#
300
*
*
200
*
*
*
100
0
Normal
Saline
15
45
GL (mg/kg)
135
DEX
(1 mg/kg)
SO2-exposed (16 Days)
Fig. 12. Effects of GL and DEX on number of total and differential cells and protein
concentration in BALF from SO2-exposed rats (16 days).
Bronchoalveolar lavage was performed after SO2-exposure for 16 days. (A) The number of
cells in BALF were determined using cytospins and May-Grunwald stain. (B) The protein
concentration in BALF was measured. Results represent the means ± SE (n=5-9).
* and #P <0.05 compared with normal and saline group, respectively.
6
Cell Number in BALF (x 103 cells)
A
25
*
20
Total cell
Macrophage
Lymphocyte
Neutrophil
15
#
**
10
#
*
5
##
# #
0
Normal
Saline
GL
DEX
(135 mg /kg) (1 mg/kg)
SO2-exposed (7 weeks)
Protein Concentration (μg/ml)
B
300
#
*
200
100
0
Normal
Saline
GL
DEX
(135 mg /kg) (1 mg/kg)
SO2-exposed (7 weeks)
Fig. 13. Effects of GL and DEX on number of total and differential cells and protein
concentration in BALF from SO2-exposed rats (7 weeks).
Bronchoalveolar lavage was performed after SO2-exposure for 7 weeks. (A) The number of
cells in BALF was determined using cytospins and May-Grunwald stain. (B) The protein
concentration in BALF was measured. Results represent the means ± SE (n=5-9).
* and #p<0.05 compared with normal and saline group, respectively.
7
2) SO2 ガス曝露ラットの気道分泌に対する GL の作用
気道分泌に対する GL の作用を調べるために,BALF 上清中のフコースおよびフォス
ファチジルコリン量を測定した.16 日間の SO2 曝露を施したラットの BALF 中のフコー
スおよびフォスファチジルコリン量は,健常ラットに比べてそれぞれ約2倍と有意に増
加した (Fig. 14A).今回投与した DEX はフコース量に有意な変化を示さなかったもの
の,GL は投与量依存的に減少させ,135 mg/kg では生理食塩水を投与したコントロー
ルと比べて有意であった (Fig. 14A, upper panel).一方フォスファチジルコリン量には
今回投与した GL および DEX は有意な変化を示さなかった (Fig. 14A, lower panel).
7週間の SO2 曝露を施したラットでも同様な測定を行なったところ,健常ラットに比べ
てフコースおよびフォスファチジルコリン量はそれぞれ約 1.4 および2倍と有意に増加
した (Fig. 14B).この増加に対して,DEX および GL ともにフコース量を有意に減少さ
せた (Fig.14B, upper panel).一方フォスファチジルコリン量には GL および DEX は 16
日間曝露と同様に有意な変化を示さなかった (Fig. 14B, lower pane).これらの結果か
ら,GL および DEX は肺サーファクタントの指標であるフォスファチジルコリン量には著
明な影響を与えず,肺サーファクタンンの分泌に影響しないと考えられた. また GL お
よび DEX は気道粘液の指標であるフコース量を減少させ,気道粘液の分泌を抑制す
ると考えられる.
8
B
9
8
7
6
5
4
3
2
1
#
*
*
*
*
0
300
250
*
*
200
*
*
*
150
Concentration (μg/ml)
Concentration (μg/ml)
A
#
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
250
50
45
135
GL (mg/kg)
0
DEX
(1 mg/ml)
SO2-exposed (16 days)
*
150
50
15
*
200
100
Normal Saline
*
300
100
0
*
Normal
Saline
GL
DEX
(135 mgkg) (1 mg/kg)
SO2-exposed (7 weeks)
Fig.14. Effects of GL and DEX on airway secretion of SO2-exposed rats.
Bronchoalveolar lavage was performed after SO2-exposure for 16days (A) and 7 weeks (B). The
concentration of fucose (upper panel) and phosphatydilcholinein (lower pannel) in BALF was
measured. Results represent the means ± SE (n=5-9). * and # p<0.05 compared with normal and
saline group, respectively.
9
3) ラットの体重および胸腺の形態に対する GL の作用
グルココルチコイドは著明な気道炎症抑制作用を示す一方で,長期投与による胸腺
の萎縮に伴う感染症および体重減少などの重篤な副作用が問題となる
15
.このことを
考慮して,本研究でも GL および DEX によるラットの体重および胸腺の形態への影響
を調べた.
7 週間 DEX を投与したラットでは,生理食塩水を投与したコントロールと比べて著明
な体重減少が生じた.一方 GL では DEX と同様な体重減少は認められず,むしろコン
トロールに比べて体重増加の傾向にあった (Fig. 15A). 16 日間 SO2 ガスに曝露したラ
ットでも同様な結果であった (データは示さず). また 16 日間 DEX を投与したラットの
胸腺の形態を観察すると,胸腺の萎縮は著明であり,ほぼ消失していた.しかし GL を
投与したラットでは GL の投与量に関わらずほぼ正常な形態を維持しており,コントロ
ールとの間に著明な差は観察されなかった (Fig. 15B).7週間 SO2 ガスに曝露したラッ
トでも同様な結果であった (データは示さず).
A
360
Body Weight (g)
saline
GL (135 mg/kg)
DEX (1 mg/kg)
320
280
240
200
1
14
7
SO2-exposed (days)
10
21
28
B
Control
GL (135 mg/kg)
DEX (1 mg/kg)
Fig. 15. Effects of GL and DEX on body weight and thymus morphology of SO2-exposed
rats.
Rats were exposed to SO2 for 7 weeks (A) or 16 days (B) and administrated with saline (●),
DEX (0.1 mg /kg, ◇) and GL (135 mg/kg, ▲). Arrowheads indicate thymus. Results represent
the means ± SE (n=5-9).
11
3.3.GL の IL-8 発現に対する作用
1) GL の IL-8 産生に対する作用
前節の結果から,GL は DEX に類似した抗気道炎症作用を示した.グルココルチコイ
ドの抗気道炎症作用は,IL-8 等の好中球遊走因子の産生抑制に基づくと考えられて
おり,DEX は IL-8 の産生を抑制し,気道内への好中球の浸潤を抑制する
45,54
.現に
前節の結果でも,DEX は BALF 中の好中球数を著明に減少させた.つまり GL が DEX
と同様に好中球数を減少させたことを考えると,GL は DEX と同様に IL-8 の産生を抑
制する可能性が考えられるので,GL が IL-8 の産生を抑制するか否かについて in
vitro の実験系を用いて検証した.
A549 細胞に TNF-α (2.5 ng/ml) および IL-1β (1.0 ng/ml) を 6 時間処理したのち
に,培養上清中の IL-8 タンパク量を ELISA 法によって測定した.TNF-αおよび IL-1β
の処理によって,IL-8 タンパク量はそれぞれ著明に増加した. また DEX (100 nM) を1
時間前処理すると,この増加はほぼコントロールまで著明に抑制された.DEX の作用
と同様に,GL (0.1, 0.3, 1.0 および 3.0 mM) を1時間前処理すると,用量依存的に抑
制され,また最大で 3 mM GL は TNF-αおよび IL-1β単独の 37 および 55%まで有意に
抑制した (Fig. 16).つまり GL は,DEX と同様に IL-8 の産生抑制作用を示すと考えら
れた.
では次に IL-8 mRNA 量についてリアルタイム PCR を用いて調べた.TNF-αおよび
IL-1βは,IL-8 mRNA 量をコントロールと比べてそれぞれ約 10 および 16 倍と著明に増
加させた.DEX の前処理によって,IL-8 mRNA 量は完全ではないものの著明に抑制
された.GL (0.3, 0.1 および 1 mM)も濃度依存的に抑制し,さらに最大で 1 mM GL は
TNF-αおよび IL-1β単独と比べて 30 および 50%まで有意に抑制した (Fig. 17).これら
の結果から,GL は IL-8 mRNA 量を抑制することにより IL-8 の産生を抑制すると示唆
された.
12
A
5
IL-8 (ng/ml)
4
*
3
*
*
2
1
*
0
Control Vehicle 0.1
0.3
1.0
3.0
GL (mM)
DEX
(100 nM)
TNF-α (2.5 ng/ml)
B
8
IL-8 (ng/ml)
6
*
4
*
2
*
0
Control Vehicle 0.1
0.3
1.0
GL (mM)
3.0
DEX
(100 nM)
IL-1β (1.0 ng/ml)
Fig. 16. Efffects of GL and DEX on IL-8 production.
Confluent A549 cells were serum-starved for 6 h, and pretreated with GL (0.1, 0.3, 1.0 or 3.0
mM) or DEX (100 nM) for 1 h, after which, cells were treated with either TNF-α (2.5 ng/ml, A) or
IL-1β (1 ng/ml, B) for 6 h. The level of IL-8 in culture media was measured by ELISA. Results
represent the means ± SE (n=3-5) from three independent experiments. *P <0.05 compared with
TNF-α or IL-1β alone.
13
A
IL-8 mRNA Level
(Fold of Control)
16
12
*
8
*
*
4
0
Control Vehicle
0.1
0.3
GL (mM)
1
DEX
(100 nM)
TNF-α (2.5 ng/ml)
B
IL-8 mRNA Level
(Fold of Control)
20
15
*
10
*
5
*
0
Control Vehicle
0.1
0.3
GL (mM)
1
DEX
(100 nM)
IL-1β (1.0 ng/ml)
Fig. 17. Effects of GL and DEX on IL-8 mRNA expression.
Confluent A549 cells were serum-starved for 6 h, and pretreated with either GL (0.1, 0.3 or 1
mM) or DEX (100 nM) for 1 h, after which, cells were treated with either TNF-α (2.5 ng/ml, A) or
IL-1β (1 ng/ml, B) for 4 h. Cells were then harvested and total RNA was prepared. The
expression levels of IL-8 mRNA were measured by real-time PCR and normalized to GAPDH.
Results represent the means ± SE (n=3-5) from three independent experiments. *P<0.05
compared with TNF-α or IL-1β alone.
14
2) GL の IL-8 プロモーター活性に対する作用
次に GL が IL-8 の転写活性化を阻害するか否かを検討するために,A549 細胞にヒ
ト IL-8 プロモーターを組み込んだリポーター遺伝子を遺伝子導入し,ルシフェラーゼ
アッセイ法によりプロモーター活性を測定した.IL-8 タンパクおよび mRNA 量の結果と
よく相関し,TNF-αおよび IL-1βは IL-8 プロモーター活性をそれぞれ 5 および 7 倍と
著明に増加させ,また DEX はこの活性を著明に抑制した.さらに GL は濃度依存的に
抑制し,最大で TNF-αおよび IL-1β単独の 50%と有意な抑制作用を示した (Fig. 18).
したがって,GL は DEX と同様に IL-8 の転写抑制作用をもつと示唆された.
15
Relative Luciferase Activity
A
8.0
6.0
4.0
*
*
2.0
0
Control Vehicle
0.1
0.3
GL (mM)
1
*
DEX
(100 nM)
TNF-α (2.5 ng/ml)
Relative Luciferase Activity
B
10.0
8.0
*
6.0
*
4.0
2.0
0
*
Control Vehicle
0.1
0.3
GL (mM)
1
DEX
(100 nM)
IL-1β (1.0 ng/ml)
Fig. 18. Effects of GL and DEX on transcriptional activity of IL-8 promoter gene.
A549 cells were transiently transfected with IL-8 promoter and incubated for 24 h. Cells were
then serum-starved for 6 h and pretreated wit either GL (0.1, 0.3 and 1 mM) or DEX (100 nM) for
1 h, after which, cells were treated with TNF-α (2.5 ng/ml, A) or IL-1β (1 g/ml, B) for 6 h. Cells
were lysed and luciferase activity in the cell lysates were measured. Results represent the
means ± SE (n=3-5) from three independent experiments. *P <0.05 compared with TNF-α or
IL-1β alone.
16
3) GL の NF-κB の転写活性化に対する作用
TNF-αおよび IL-1βは,NF-κB の活性化を介して IL-8 プロモーター活性を増加さ
せることが知られている
70
.また DEX による IL-8 プロモーター活性の抑制は,NF-κB
の活性化抑制に基づくと考えられている
44,50
.したがって,IL-8 リポーター遺伝子の代
わりに NF-κB の DNA 結合配列をルシフェレースベクターに組み込んだリポーター遺
伝子を遺伝子導入して,ルシフェラーゼアッセイ法によりプロモーター活性を測定した.
TNF-αおよび IL-1βは,プロモーター活性をそれぞれ著明に増加させ,また DEX はそ
の活性を著明に抑制した.GL は,DEX と同様に TNF-αおよび IL-1βによるプロモータ
ー活性亢進をそれぞれ著明に抑制し,さらにその抑制には濃度依存性も確認された
(Fig. 19).これらの結果から,GL が DEX と同様に NF-κB 依存的な転写を抑制すると
考えられた.
17
Relative Luciferase Activity
A
10
8
6
*
4
*
2
0
Control Vehicle
0.1
0.3
GL (mM)
1
DEX
(100 nM)
TNF-α (2.5 ng/ml)
Relative Luciferase Activity
B
10
8
6
*
*
4
*
2
*
0
Control Vehicle
0.1
0.3
GL (mM)
1
DEX
(100 nM)
IL-1β (1.0 ng/ml)
Fig. 19. Effects of GL and DEX on transactivation of NF-κB.
A549 cells (80% confluent) were transiently transfected with NF-κB-responseve luciferase
plasmid and incubated for 24 h. Cells were then serum-starved for 6 h and pretreated wit either
GL (0.1, 0.3 or 1 mM) or DEX (100 nM) for 1 h, after which, cells were treated with either
TNF-α(2.5 ng/ml, A) or IL-1β (1 ng/ml, B) for 6 h. Transcriptional activity was assessed by
luciferase assay. Results represent the means ± SE (n=3-5) from three independent experiments.
*P <0.05 compared with TNF-αor IL-1βalone.
18
4) GL の NF-κB p65 の核内移行に対する作用
TNF-αおよび IL-1βは,それぞれの受容体の下流シグナルとして IKKs を活性化し,
その後 IκB-αが分解される
70
.ついで,NF-κB のサブユニットである p65 は細胞質中
から核内に移行し,特異的 DNA 配列に結合して標的遺伝子の転写を活性化する
70
.
次に,GL が NF-κB p65 の核内移行に影響するか否かを検討するために,p65 の免疫
蛍光染色を行なった.無刺激の細胞では,p65 の蛍光はほとんど細胞質内に検出され
た.一方,TNF-αを1時間処理すると,細胞質の蛍光は減少し,核内の蛍光が検出さ
れた.総細胞数に対する核内に蛍光が検出された細胞数の割合から,TNF-α刺激で
は 87%であった.GL および DEX1時間前処理は,その移行に影響しなかった.一方で,
プロテオソーム分解阻害剤である MG132 はその移行を顕著に抑制した (Fig. 20).こ
れらの結果から,GL および DEX は核内移行した後に,NF-κB 依存的な遺伝子発現
を抑制すると示唆された.
A
Control
QuickTimeý Dz
TIFFÅià èkǻǵÅj êLí£ÉvÉçÉOÉâÉÄ
ǙDZÇÃÉsÉNÉ`ÉÉǾå©ÇÈǞǽDžÇÕïKóvÇ-Ç ÅB
TNF-α (2.5 ng /ml)
TNF-α
+
GL (1 mM)
QuickTimeý Dz
TIFFÅià èkǻǵÅj êLí£ÉvÉçÉOÉâÉÄ
ǙDZÇÃÉsÉNÉ`ÉÉǾå©ÇÈǞǽDžÇÕïKóvÇ-Ç ÅB
QuickTimeý Dz
TIFFÅià èkǻǵÅj êLí£ÉvÉçÉOÉâÉÄ
ǙDZÇÃÉsÉNÉ`ÉÉǾå©ÇÈǞǽDžÇÕïKóvÇ-Ç ÅB
p65
PI
Merge
19
TNF-α
+
DEX (100 nM)
QuickTimeý Dz
TIFFÅià èkǻǵÅj êLí£ÉvÉçÉOÉâÉÄ
ǙDZÇÃÉsÉNÉ`ÉÉǾå©ÇÈǞǽDžÇÕïKóvÇ-Ç ÅB
TNF-α
+
MG132 (10 μM)
QuickTimeý Dz
TIFFÅià èkǻǵÅj êLí£ÉvÉçÉOÉâÉÄ
ǙDZÇÃÉsÉNÉ`ÉÉǾå©ÇÈǞǽDžÇÕïKóvÇ-Ç ÅB
Nuclear p65 (% of Control)
B
120
#
100
*
*
80
*
60
40
20
0
Control
GL
(1.0 mM)
Vehicle
DEX
(100 nM)
MG132
(10 μM)
TNF-α (2.5 ng/ml)
Fig. 20. Effects of GL and DEX on nuclear translocation of p65.
A549 cells (80% confluent) were serum-starved for 6 h, pretreated with either GL (1 mM), DEX
(100 nM) or MG132 (10 µM) for 1 h, after which, cells were treated with TNF-α(2.5 ng/ml) for 1 h.
Cells were then fixed, permeabilized, and stained with anti-p65 antibody and propidium iodine
(PI). (A) Fluoresent images of p65 (green) and PI (red). (B) Quantification of the effect of GL on
nuclear translocation of p65. The percentage of cells with nuclear p65 is plotted relative to the
total cell number. Results represent the means ± SE (n=3) from three independent experiments.
* and #P<0.05 compared with control and TNF-α alone, respectivery. Scale bar: 20 μm.
20
5) GL の IL-8 転写抑制作用における GR の関与
ここまで GL は,DEX と同様な IL-8 の転写抑制作用を示した.そこで,GL の IL-8 の
転写抑制作用に GR が関わっている可能性が考え,GR 拮抗薬である RU486 および
GR siRNA の作用を調べた.IL-8 プロモーターアッセイにおいて,RU486 処理は DEX
による IL-8 プロモーター活性の抑制作用をほぼ完全に消失させた.一方で,GL によ
る抑制作用には有意な作用を示さなかった (Fig. 21A).また IL-8 のリアルタイム PCR
において,GR siRNA の導入によって DEX による IL-8 mRNA 量の抑制作用はほぼ完
全に消失した.Western Blotting によって GR siRNA の導入によって GR タンパク量が
顕著に減少したことが確認された (Fig. 21C).一方,GL は control および GR siRNR
の両導入細胞において TNF-αによる IL-8 mRNA 発現量の増加を著明に抑制した
(Fig. 21B). また,グルココルチコイド感受性遺伝子である MMTV プロモーターをルシ
フェラーゼベクターに組み込んだレポーター遺伝子を導入して,プロモーター活性に
対する GL の作用も検討した.MMTV プロモーター活性は,DEX によって著明に増加
し,さらにその活性は RU486 処理によってほぼ完全に消失した.一方,GL はプロモー
ター活性に有意な作用は示さなかった (Fig. 21D).これらの結果から,GL は GR を介
さずに NF-κB 依存的な転写活性化を抑制すると示唆された.
21
Relative Luciferase Activity
A
12
10
Vehicle Control
with RU486 (100 nM)
#
8
6
**
4
*
2
0
Control
TNF-α
(2.5 ng/ml)
TNF-α
TNF-α
+
+
GL
DEX
(1 mM) (100 nM)
B
9
IL-8 mRNA Level
(Fold of Control)
Control siRNA (25 nM)
#
GR siRNA (25 nM)
6
* *
3
*
0
C
Control
TNF-α
(2.5 ng/ml)
Control
siRNA
α GR
α Actin
22
TNF-α
TNF-α
+
+
GL
DEX
(1 mM) (100 nM)
GR
siRNA
Relative Luciferase Activity
D
350
Vehicle Control
300
with RU486 (100 nM)
250
200
150
100
50
0
GL
(1 mM)
Control
DEX
(100 nM)
Fig. 21. Involvement of GR in the effects of GL and DEX.
(A) A549 cells (80% confluent) were transfected with IL-8 promoter plasmid and incubated for 24
h. Cells were then serum-starved for 6 hr and pretreated with either GL (1 mM) or DEX (100 nM)
combined with or without RU486 (100 nM) for 1 h, after which, cells were treated with TNF-α (2.5
ng/ml) for 6 h. Transcriptional activity was assessed by luciferase assay. (B) A549 cells (50%
confluent) were trasfected with siRNA for either control or GR and cultured for 72 h. Cells were
then serum-starved for 6 h and pretreated with either GL (1 mM) or DEX (100 nM) for 1 h, after
which, cells were treated with TNF-α (2.5 ng/ml) for 4 h. Total RNA was prepared from the cells
and IL-8 mRNA expression was measured by real-time PCR. (C) A549 cells (50% confluent)
were transfected siRNA for either control or GR and cultured for 72 h. The cells were lysed and
GR protein expression was assessed by western blotting. (D) A549 cells (80% confluent) were
transfected with MMTV promoter plasmid and incubated for 24 h. Cells were then serum-starved
for 6 hr and treated with either GL (1 mM) or DEX (100 nM) combined with or without RU486
(100 nM) for 36 h. Transcriptional activity was assessed by luciferase assay. Results represent
the means ± SE (n=3-5). *P <0.05 compared with TNF-α, # p<0.05 vs. without inhibitor.
23
6) GA の IL-8 プロモーター活性に対する作用
以前の研究から,GL の薬理作用はその主生物学的代謝産物である glycyrrhetinic
acid (GA) によって担われており,その機序は,グルココルチコイド不活性化酵素であ
る 11β-hydroxysteroiddehydrogenase2 (11β−HSD2) の阻害であると示唆されている
67,68
.そこで GA の IL-8 プロモーター活性に対する作用を調べた.1, 3 および 10 μM
GA は,TNF-αによる IL-8 プロモーター活性の亢進に著明な作用を示さず,さらに高
濃度処理すると細胞毒性を生じた (Fig. 22.).この結果は,本研究で見出した GL の
Relative Luciferase Activity
作用が GA によるものではないと示唆している.
5.0
4.0
3.0
*
2.0
*
1.0
0
Control Vehicle
1
GL
DEX
3
10
(1mM) (100 nM)
GA ( μM)
TNF- α (2.5 ng/ml)
Fig. 22. Effects of GL and GA on TNF-α-induced transcriptional activity of IL-8 promoter
gene.
A549 cells (80% confluent) were transiently transfected with IL-8 promoter plasmid and
incubated for 24 h. Cells were then serum-starved for 6 h and pretreated with either GA (1, 3 or
10 μM), GL (1 mM) or DEX (100 nM) for 1 h, after which, cells were treated with TNF-α (2.5
ng/ml) for 6 h. Transcriptional activity was assessed by luciferase assay. Results represent the
means ± SE (n=3). *P <0.05 compared with TNF-α alone.
24
7) GL の IL-8 発現抑制における PPARs の関与
近年,GR 以外に NF-κB 依存的な遺伝子発現を抑制する標的として,核内受容体
である PPARs が注目を集めてきている.PPARs は本来脂質代謝に関わる分子として同
定されてきたが
47
がなされている
46,48
,近年抗炎症作用を示すことが示唆され,詳細な分子機序の解明
.そこで,GL の IL-8 発現抑制における PPARs の関与を検討する
ために,PPAR-αおよび PPAR -γ作用薬の IL-8 プロモーター活性に対する作用を調
べた.PPAR-αおよび PPAR -γ作用薬には Wy14, 643 および 15d-PGJ2 を用いた.両
薬物をそれぞれ 100 μM および 10 μM 処理しても TNF-αによる IL-8 プロモーター活
性に有意な変化は生じなかった (Fig. 23).この結果から,少なくとも本実験系におい
て PPAR-αおよび PPAR -γは IL-8 転写抑制作用を示さず,GL が PPAR-αおよび
PPAR -γを介して NF-κB 依存的な遺伝子発現を抑制する可能性も排除できると考え
Relative Luciferase Activity
られる.
5
4
3
2
*
1
0
Control
Vehicle Wy14,643 15d-PGJ2 DEX
(100 μM) (10 μM) (100 nM)
TNF-α (2.5 ng/ml)
Fig. 23. Effects of PPAR-α or PPAR-γ agonist on TNF-α-induced transcriptional activity of
IL-8 promoter gene.
A549 cells (80% confluent) were transiently transfected with IL-8 promoter plasmid and
incubated for 24 h. Cells were then serum-starved for 6 h and pretreated wit either Wy14, 643
(100 μM), 15d-PGJ2 (10 μM) or DEX (100 nM) for 1 h, after which, cells were treated with TNF-α
(2.5 ng/ml) for 6 h. Transcriptional activity was assessed by luciferase assay. Results represent
the means ± SE (n=3) from three independent experiments. *P<0.05 compared with TNF-α
alone.
25
8) NF-κB p65 の DNA 結合に対する GL の作用
ここまでの結果から,GL は核内移行後の NF-κB 依存的な遺伝子発現を抑制すると
考えられた.次に,GL が IL-8 のプロモーター領域内の NF-κB 結合配列への p65 の
結合量を阻害するか否かを検討するために,クロマチン免疫沈降 (ChIP) を行った.
まず試薬処理後に,A549 細胞をホルムアルデヒドで固定し,可溶化クロマチンを調製
した.さらに,抗 p65 抗体で免疫沈降し,p65 と共沈した DNA を鋳型としてリアルタイム
PCR に用いた.また p65 の DNA 結合量は,免疫沈降前の可溶化クロマチン (INPUT)
によって標準化した.その結果,TNF-αを2時間処理すると p65 の IL-8 プロモーター
DNA への結合量は,コントロールと比べて約 6 倍と著明に増加した.GL はこの増加を
有意に抑制したが,DEX は影響しなかった (Fig. 24).GL による IL-8 プロモーター活
性の抑制程度とよく相関していたことから,GL による IL-8 の転写抑制作用は,p65 の
DNA 結合阻害によると示唆された.
8
% of INPUT
7
#
IgG
p65
6
*
*
5
*
4
3
2
1
0
Control
TNF- α
(2.5 ng/ml)
TNF-α
+
GL
(1 mM)
TNF-α
+
DEX
(100 nM)
Fig. 24. Effects of GL and DEX on DNA-binding of p65.
Confluent A549 cells were serum-starved for 6 h and pretreated with either GL (1 mM) or DEX
(100 nM) for 1 h, after which, cells were treated with TNF-α(2.5 ng/ml) for 2 h. The soluble
chromatin extracts from the cells were immunoprecipitated with anti-p65 or control IgG, and then
subjected to real-time PCR with primer pairs for IL-8 promoter gene. The amount of DNA binding
was normalized by “Input” that was the crude chromatin extracts prior to immunoprecipitation.
Results represent the means ± SE (n=4) from three independent experiments. * and #P<0.05
compared with control and TNF-α alone, respectively.
26
3.4.考察
本章では,GL が in vivo および in vitro でグルココルチコイド様作用を示すことを明ら
かにした.以下にこれについて考察する.
まず,短期 (16 日) および長期 (7 週間) SO2 ガス曝露を施して作製した気管支炎ラ
ットに対する GL の作用を調べた.いずれの SO2 ガス曝露ラットでも,健常ラットに比べ
BALF 中の白血球数,タンパク質量およびフコース量の著明な増加が認められ,血管
透過性の亢進および気道粘液の分泌亢進を伴う気道炎症が惹起されたことが確認さ
れた.両曝露モデルでは,BALF 中の好中球数の増加が著明であり,臨床上の慢性
気道炎症と類似の好中球性の炎症症状を呈していると考えられる.さらに,長期曝露
モデルは,短期で認められた浮腫などの症状は消え,細気管支への痰の貯留および
一部に気腫肺を生じ (データは示さず),BALF 中に浸潤した白血球の組成では,好
中球に加えてリンパ球の増加も著明であった.これらの所見から,長期曝露モデルは
COPD を始めとした慢性炎症性呼吸器疾患の病態により類似していると考えられる.
GL の作用は,SO2 ガス曝露ラット BALF 中の細胞数およびタンパク質量を白血球遊
走および血管透過性亢進の指標として測定したが,GL は DEX と同様に,総細胞数,
マクロファージ,リンパ球および好中球数を著明に抑制した (Fig. 12A, 13A).また,タ
ンパク質量についても同様で,GL はコントロールに比べて著明に減少させた(Fig. 12B,
13B).これらの結果から,GL は短期および長期の気道炎症モデルに対し DEX に類似
した気道炎症抑制作用をもつと考えられた.特に 7 週間の長期 SO2 ガス曝露で惹起し
た気道炎症に GL が奏功したことは興味深い.上述のように長期曝露による気道炎症
は難治性の慢性炎症性呼吸器疾患の病態に類似しており,薬理学的にもグルココル
チコイド以外にはほとんどの治療薬が奏功しないと言っても過言ではない.さらに,当
研究室ではこれまで本モデルを用いて様々な抗炎症物質の作用を調べてきたが,著
明な治療効果を示したのはグルココルチコイド以外になかった.つまり,今回用いた
GL は 135 mg/kg と投与量は多いが,その抗炎症作用は DEX に匹敵したことから,GL
が難治性の気道炎症に対し,強力な抗炎症作用をもつことが示唆された.
本研究で対照薬として用いた DEX は,強力に気道炎症を抑制した一方で,体重減
少や胸腺萎縮などの重篤な副作用が生じた.そのため,投与期間中に死亡した動物
さえ存在した.しかし,GL を投与した動物の体重は,コントロールと比べてむしろ増加
27
する傾向を示した.また胸腺の萎縮も全く生じなかった (Fig. 15).すなわち,GL はグ
ルココルチコイド様の副作用を生じないと推定された.
グルココルチコイドは,気道炎症だけでなく気道粘液の産生および分泌も抑制する
71,72
.本モデルにおいて,短期曝露では統計学的有意差は確認されなかったものの,
長期暴露では DEX は BALF 中の気道粘液の指標であるフコース含量を有意に抑制し
た (Fig. 15).さらに GL の作用についても同様の検討を行なうと,GL も有意に抑制し
(Fig. 14),DEX と同様に気道粘液産生抑制作用をもつことが示唆された.気道粘液の
主成分はムチンと呼ばれる高分子タンパク質である.コア蛋白質はムチン遺伝子によ
ってコードされており,現在までに 21 のサブタイプが報告されている
73
.呼吸器疾患
に伴う粘稠な痰の原因となる気道粘液は主として Muc5AC および Muc5B 遺伝子の産
物であり
74
,これらムチンの遺伝子発現はグルココルチコイドによって抑制されることが
知られている 72.本研究において,GL は肺ホモジネートを試料として肺実質中の粘液
糖タンパク質量を DEX と同様に減少させ ,また Muc5AC の mRNA 発現量も DEX と
同様に著明に抑制した (データーは示さず).すなわち,GL は DEX と同様に痰の原
因となる粘液糖タンパク質の発現を抑制し痰の産生そのものを抑制している可能性が
考えられる.従来の去痰薬は,アンブロキソールのような肺サーファクタントの分泌促
進作用により気道クリアランス能を高めるものや,カルボシステインのような気道粘液成
分の組成を正常化することにより粘液粘度を低下させるものなど,分泌後の痰出を促
進するものが一般的である
75
.しかし,GL は気道粘液産生抑制という従来の去痰薬と
は異なる機序により気道分泌の正常化作用をもつことを示唆しており興味深い.今後
この粘液産生抑制作用についてはさらなる検討が必要であろう.
気道上皮細胞は,外来からの異物の進入から宿主を防御する受動的バリアーとして
の機能に加えて,さまざまなメディエーターを産生することによって炎症反応にも重要
な役割を果たしている
76
.IL-8 は,気道上皮細胞から産生され,好中球の気道内へ
の浸潤を亢進する最も重要なメディエーターのひとつである
76
.グルココルチコイドの
気道炎症抑制作用は,主に NF-κB 阻害を介した IL-8 等の炎症性サイトカインの産生
抑制によると考えられている
26,54
.GL は,TNF-α および IL-1β によって誘導された
IL-8 タンパク量をそれぞれ著明に抑制した (Fig. 16).これらの結果から,GL がこれら
前炎症性サイトカインの受容体を阻害している可能性は排除できる.IL-8 の産生抑制
の結果とよく相関して,GL は TNF-αおよび IL-1βによる IL-8 mRNA 発現および IL-8
28
プロモーター活性をそれぞれ著明に抑制した (Fig. 17, 18).また予備実験として IL-8
以外の NF-κB の標的遺伝子である iNOS の mRNA 発現も GL は抑制した (データは
示さず).さらに,GL は NF-κB レポーター遺伝子のプロモーター活性も同様に抑制し
た (Fig. 19).これらの結果から,GL は DEX と同様に NF-κB 阻害を介して IL-8 の遺
伝子発現を抑制したと考えられる.
気道炎症を始めとした慢性炎症の発症には,マクロファージなどの白血球の活性化
もまた重要である.マクロファージは,TNF-αおよび IL-1βなどの前炎症性サイトカイン,
活性酸素種および matrix metalloproteinases (MMPs) などのプロテアーゼを産生して
組織破壊を引き起こすと考えられており,COPD の病態発症との関連性も多く報告さ
れている
77-79
.グルココルチコイドは,これらマクロファージの炎症性メディエーターの
遺伝子発現も抑制することが知られている
46
.また GL が本章で DEX と同様に BALF
中のマクロファージ数の増加を著明に抑制したことを考えると (Fig. 12, 13),GL はマク
ロファージでも NF-κB 阻害作用をもつと考えられる.そこで,予備実験として,マクロフ
ァージ細胞株である Raw 264.7 細胞で NF-κB の標的遺伝子である iNOS の mRNA 発
現に対する GL の作用を調べると,GL は DEX と同様に LPS によって惹起した iNOS
の mRNA 発現を著明に抑制した (データは示さず).つまり,GL は気道上皮細胞だけ
でなくマクロファージでも DEX と同様な NF-κB 阻害作用をもつと推定される.
グルココルチコイドは,核内で NF-κB を阻害すると考えられている
50,51
.グルココル
チコイドは細胞質内でグルココルチコイド受容体 (GR) に結合し,活性化された GR は
核内に移行する
25
.GR はヒストン脱アセチル化酵素-2 (HDAC2)をリクルートして p65
に会合しているヒストンアセチル化酵素 (HAT) の活性を阻害し,NF-κB 依存的な遺
伝子発現を抑制すると報告されている
80-82
.本研究でも,DEX は p65 の核内移行は阻
害せず (Fig. 20),やはり DEX による IL-8 プロモーター活性の阻害は核内で行われて
いると考えられた.同様に,GL も p65 の核内移行を阻害しなかった (Fig. 20).したが
って,GL は DEX と同様に核内で NF-κB 依存的な遺伝子発現を抑制したと推定され
た.
GL は in vivo および in vitro でグルココルチコイド様の抗炎症作用を示したが,GL
が GR に作用する可能性は排除された.GR 拮抗薬である RU486 の共処理および GR
siRNA による GR のノックダウンは,GL の作用を消失させなかった (Fig. 21A, B).また,
29
GL はグルココルチコイド感受性遺伝子である MMTV プロモーター活性に影響しなか
った (Fig. 21D). さらに,GL が DEX とは異なり NF-κB p65 の DNA 結合を阻害した結
果からも支持される (Fig. 24).GR 以外に核内で NF-κB を阻害する可能性としてその
他の核内受容体が考えられる.これまでに retinoic acid receptor (RAR)もしくは
retinoic X receptor (RXR)
46
, liver X receptor (LXR)
proliferator-activated receptors (PPARs)
48
83
お よ び peroxisome
が,NF-κB 依存的な遺伝子発現を抑制す
ることが報告されている.さらに PPARs については,PPAR-γ作用薬が A549 細胞にお
いて iNOS の発現を抑制すること
84
および PPAR-α 作用薬がヒト血管内皮細胞で
VCAM-185 の発現を抑制すること などが報告されており,盛んに研究がされている.し
たがって,本研究でも PPAR-αおよび PPAR-γ作用薬の IL-8 プロモーター活性に対す
る作用を調べたが,いずれも有意な作用を示さなかった (Fig. 23).したがって,GL の
作用に従来知られている抗炎症作用をもつ核内受容体とは異なる機序が関わってい
ると考えられる.また,以前の研究から GL の代謝産物である GA が 11β-HSD2 を阻害
してグルココルチコイドの作用を亢進することが報告されているが
67,68
,本研究では
GA が IL-8 プロモーター活性に著明な作用を示さなかった結果から,本研究で見出さ
れた GL の作用が GA の混入による可能性も排除できるであろう.
GL はグルココルチコイドと同様に NF-κB を阻害する一方で,グルココルチコイドに
見られる転写亢進作用を示さなかった (Fig.25.).グルココルチコイドは,主に NF-κB
の阻害によって IL-8 等の炎症性遺伝子を抑制して抗炎症作用を示し,また主に転写
亢進作用によっ種々の副作用を現わすと考えられている.GL はグルココルチコイドと
同様に NF-κB を阻害する一方で,その機序がグルココルチコイドとは異なっていた.
つまりこの機序の相違は,GL がグルココルチコイドと同様な抗炎症作用を示す一方で,
グルココルチコイドに見られる転写亢進作用および副作用を示さなかった理由と考え
られる.核内に GL 受容体ともいうべき標的分子が存在するかは不明であるであるが,
GL はグルココルチコイド様の NF-κB 阻害を示す一方で,グルココルチコイドにみられ
る副作用を現わさない新規気道炎症治療薬のリード化合物になる可能性が考えられ
る.
COPD 患者のマクロファージで,GR の HDACs のリクルートを介した NF-κB 阻害作
用が低下して COPD 患者のステロイド抵抗性が生じることが報告されている
54,82,86-88
.
これは,マクロファージでの活性酸素種等の過剰産生によって HDACs の活性が
30
低下することによると考えられている
54,88
.GL は,DEX とは異なる機序を介し
て NF-κB 阻害作用を示すことから,その抑制機序には少なくとも HDACs は関
与していないと考えられる.すなわち,GL はグルココルチコイドに抵抗性を示
す COPD 患者にも応用可能であることを示唆しており大変興味深い.またマクロ
ファージの活性化が著明な慢性炎症性疾患は,呼吸器疾患以外に関節リウマチおよ
び潰瘍性大腸炎症などが挙げられる.これら疾患にグルココルチコイドは使用される
が COPD と同様に長期投与による副作用が問題となる.したがって,GL がグルココル
チコイド様の副作用を現わずに NF-κB 阻害作用をもつことから,気道炎症と同様にこ
れら疾患に対しても GL は応用可能であることが推定される.
最近,GL が直接 high-mobility group box-1 protein (HMGB-1) に結合し,HMGB-1
による血管遊走活性を阻害することが報告された
合因子として作用する核内タンパクである
90,91
89
.HMGB-1 は,クロマチン構成結
.これまでに,HMGB-1 は NF-κB p50 と
直接結合し,NF-κB p65/p50 複合体の DNA への結合を促進すると示されおり
92
,さ
らに HMGB-1 欠損胎児繊維芽細胞では TNF-αによって誘導される VCAM-1 の発現
がコントロール細胞と比べて著明に減少したことが報告されている.核内での作用に
加えて,HMGB-1 は細胞外でも重要な炎症性メディエーターとして作用し,ネクローシ
ス細胞などから遊離される
93
.細胞外の HMGB-1 は,receptor for advanced glycogen
end-products (RAGE) などの受容体に結合し,toll-like receptors の細胞内シグナル
を活性化すると示されている
94
.このような HMGB-1 の炎症性反応における重要性を
考えると,本研究で示した GL の NF-κB 依存的な遺伝子発現抑制作用は,HMGB-1
阻害に基づく可能性が考えられる.GL は,p65 の核内移行には影響せず DNA 結合を
抑制した.さらに Mollica 等
89
は,繊維芽細胞において細胞外に添加した GL が,核
内の HMGB-1 の結合を阻害したと示している,従って,核内の HMGB-1 阻害が GL
による NF-κB 阻害機序である可能性は考えられるが,今後さらに詳細な検討が必要
であろう.
31
A. Transrepression
GL
Glucocorticoid
?
GR
p65
HDAC2
p50
p50
p65
κB
GL-R??
κB
IL-8
IL-8
Nucleus
Nucleus
B. Transactivation
GL
Glucocorticoid
?
GR
mRNA
mRNA
GL-R??
GRE
GRE
Nucleus
Nucleus
Fig.25. Shematic model of glucocorticoid-like gene expression by GL
A). GL inhibits IL-8 gene expression and NF-κB activity, not through GR. B). GL does not induce
glucocorticoid-sensitive gene expression. GL-R indicates a target molecule for GL.
32
3.5.小括
本章では,GL のグルココルチコイド様作用の薬理学特性および分子機序に関する
検討を行なった.得られた知見を以下に要約する.
1. GL は,DEX と同様に気道炎症を抑制した.
2.GL は,グルココルチコイド様の副作用を現わさなかった.
3.GL は,DEX と同様に NF-κB を阻害した.
4.GL は,DEX とは異なる NF-κB 阻害機序を有した.
以上の結果から,GL は,グルココルチコチコイドと類似した NF-κB 抑制作用を示す
一方で,グルココルチコイド様の副作用を現わさない新たな気道炎症治療薬を考える
上でのリード化合物となる可能性が示唆された.
33
第4章 総括
COPD を始めとする慢性炎症を基礎とする慢性呼吸器疾患に対する現行の治療で
は,気管支拡張薬や去痰薬を用いた気道狭窄の緩和を目的とした対症療法が中心で
ある.その背景には,代表的な抗炎症薬であるグルココルチコイドについてもその副作
用のために使用が制限されることが挙げられる.したがって,慢性炎症性呼吸器疾患
の根治あるいは病気の進行を抑制することを目的とした新規抗炎症薬の開発のため
には,グルココルチコイドのように炎症に関わる種々の遺伝子の転写抑制作用をもち,
その一方で副作用の原因となる転写亢進作用のない薬物の開発が求められる.本研
究では,このような理想の抗炎症薬を見出すことを目的とした.
まず第2章では,抗炎症候補物質を検索する素材として漢方薬,補中益気湯に着目
し,その抗炎症作用の薬理学特性について in vivo および in vitro の実験系を用いて
検討した.補中益気湯は,in vivo で DEX と同様に SO2 ガス曝露によって惹起した好中
球性の気道炎症を抑制した.また,in vitro で DEX と同様に IL-8 の転写抑制作用を
示した.これらの結果から,補中益気湯は,in vivo および in vitro でグルココルチコイ
ド様の抗炎症作用をもつことが明らかとなった.また補中益気湯は,グルココルチコイ
ド感受性遺伝子である MMTV プロモーターの活性に影響を与えなかったことから,直
接 GR を活性化する可能性は否定された.したがって,補中益気湯は GR 非依存的に
IL-8 の転写抑制作用を示すと考えられた.また,補中益気湯の構成生薬の作用につ
いて検討すると,甘草,その主成分である GL および蒼朮が補中益気湯と同様に IL-8
プロモーター活性を抑制したが,甘草および蒼朮抜きの生薬混合液では抑制作用が
認められなかった.つまり,これらの結果から,補中益気湯の IL-8 の転写抑制作用に
は甘草 (GL) および蒼朮が重要と考えられた.したがって,補中益気湯にはグルココ
ルチコイド様の抗炎症作用物質が含まれていると考えられた.
第3章では,生薬甘草の主成分であり,これまでの抗炎症作用に関する報告に加え
て第2章の結果からグルココルチコイド様作用をもつと推定される GL に着目して,GL
のグルココルチコイド様作用の薬理学的特性について in vivo および in vitro の実験系
を用いて検討した.実験開始時より GL を投与しながら SO2 ガス曝露した実験 (予防的
投与), および SO2 ガス3週間曝露により気道炎症を惹起した後に GL を投与しながら
さらに 4 週間 SO2 ガス曝露した実験 (治療的投与) 両実験で,GL は気道への好中球
34
の浸潤を著明に抑制し,抗炎症作用を示した.また GL は,in vitro で IL-8 の産生を
抑制し,転写因子 NF-κB の活性化を阻害し,DEX と同様に NF-κB 依存的な遺伝子
発現を抑制すると考えられた.これらの結果から,GL は in vivo および in vitro でグル
ココルチコイド様の抗炎症作用をもつことが明らかとなった.GL による IL-8 の転写抑
制作用は,グルココルチコイド拮抗薬 (RU486) および GR siRNA 処理によっても消
失せず,GR 非依存的に NF-κB 依存的な遺伝子発現を抑制することが明らかとなった.
さらに DEX とは異なり GL は,核内で NF-κB p65 の DNA 結合を抑制し.DEX とは異
なる NF-κB 阻害機序をもつと考えられた.
以上,本研究は補中益気湯および GL がグルココルチコイド様の抗炎症作用をもち,
さらに GL の分子機序はグルココルチコイドとは異なる NF- B 阻害であることを明らか
にした.すなわち,従来知られている抗炎症作用機序とは異なる新規機序の存在が提
唱され.GL はグルココルチコイドのような NF- B 抑制作用をもつ一方で,グルココル
チコイド様の副作用を現わさない新たな気道炎症治療薬を考える上での有効なリード
化合物となる可能性がある.本研究で得られた GL の抗炎症作用には 135 mg/kg と高
濃度を要することなどの問題点もあり,現在 GL そのものを医薬品開発に応用すること
は難しいかもしれない.しかし,今後 GL に対する創薬標的分子の同定が可能になれ
ば,より有効な低分子化合物の合成にも繋がり,最終的に新規気道炎症治療薬の開
発に大きく前進するはずである.そしてグルココルチコイドの問題点を改善することが
可能になるであろう.例えば,グルココルチコイドに抵抗性を示す COPD 患者の治療も
可能となる.また,呼吸器疾患以外のアトピー性皮膚炎,関節リウマチおよび潰瘍性
大腸炎などの難治性の慢性疾患にも有効であろう.このように,本研究で見出した GL
によって,グルココルチコイドでさえ治療が困難であった慢性炎症性疾患も新たに治
療できる可能性を多いに期待させる.したがって,本研究の成果は,COPD を始めとし
た慢性炎症性呼吸器疾患の治療におけるグルココルチコイドにかわる新規抗炎症薬
の開発に向けた有益な基礎データになると考えられる.
35
第5章 実験の部
5.1. 実験材料
1) 実験動物
Wister 系雄性ラット (6週齢;180-200g, 九動)
2) 試薬
本研究に際し,使用した主な試薬を以下に示す.その他の試薬は全て市販の特級
試薬を使用した.
glycyrrhizin (GL), dexamethasone (DEX), RU486, TNF-α, IL-1β, protease inhibitor
cocktail, MG132, normal rabbit IgG, Proteinase K (以上 Sigma), glycyrretinic acid
(Minophargen), 15-deoxy-Δ12,14-Prostaglandin J2 (BIOMOL), Wy14, 643 (Cayman) ,
Dulbecco’s modified Eagle medium (日水), penicillin-streptomycin (Gibco), Trypsin,
(Difco)
3) 抗体
rabbit polyclonal anti-p65 (clone: sc-109, Santa Cruz Biotechnology), mouse
monoclonal anti-p65 (clone: F-6, Santa Cruz Biotechnology), rabbit polyclonal
anti-GR (clone: E-20, Santa Cruz Biotechnology), mouse monoclonal anti-β-actin
(clone: AC-15, Sigma),Alexa FluorR 488-conjugated goat anti-mouse IgG (Molecular
Probes), horseradish peroxidase (HRP) -conjugated sheep anti-rabbit IgG (Jackson
labs.), HRP-conjugated rabbit anti- mouse IgG (Wako), normal rabbit IgG (Sigma)
36
5.2.実験方法
1) 亜急性気管支炎モデルの作製
当研究室が所有する SO2 ガス曝露装置 (美和製作所)を用いて,ラットに SO2 ガスを1
日2時間,16 もしくは 21 日間曝露し,亜急性気管支炎を惹起した.SO2 ガスの濃度は,
1-7 日目を 300 ppm, 8-14 日目を 400 ppm および 15,16 日目を 500 ppm とした.薬物
は,第1日目より SO2 ガス曝露の直前に GL と DEX は腹腔内,補中益気湯は経口投
与した.各薬物の濃度は,GL を 15, 45, 135 mg/kg, 補中益気湯を 0.1 もしくは 1 g/kg
および DEX を 1 mg/kg とした.
2) 慢性気管支炎モデルの作製
上述の亜急性モデルと同様に,ラットに8週間 SO2 ガスを曝露し,亜慢清気管支炎を
惹起した.SO2 ガスの濃度は,第1週を 200 ppm, 第2週を 300 ppm および第3週以降
を 500 ppm とした.なお,3週間の曝露の後,ラットを無作為に対照群および薬物投与
群に分け,第4週より SO2 ガス曝露の直前に薬物を腹腔内投与した.GL の投与量は
135 mg/kg とし,DEX の投与量は 1 mg/ml とした.
3) 薬物調製
GL および補中益気湯は,ミノファーゲン製薬およびツムラ株式会社より供与されたも
のを用いた.また DEX は, dexamethasone 21-phosphate disodium salt (Sigma)を用い
た.補中益気湯は,滅菌水で 0.25 および 0.025 g/ml に調製し,1 および 0.1g/kg の投
与に用いた.DEX は,滅菌生理食塩水で 0.1mg/ml に調製した.
4) 気管支肺洗浄液の調製
最終日の SO2 ガス曝露終了後,ラットを pentobarbital (50 mg/kg, i.p) 麻酔下に,腹
大動脈切断により放血死させ,気管カニューレを介して生理食塩水 10 ml をゆっくり注
入し,回収する操作を2回繰り返し,気管支肺洗浄を行った.回収した気管支肺洗浄
液 (bronchoalveolar lavage fluid: BALF) は,不溶性の痰をガーゼで濾別し,その濾
液は遠心 (450×g, 4℃, 5 min) により沈渣 (細胞成分)と上清に分離した.これらの試
料は,後述の方法により BALF 中の白血球数,総タンパク量,phosphatidylcholine 量
および fucose 量の測定に供した.
37
5) BALF 細胞分画の分析
BALF 中の細胞分画は,RPMI 培地 100 μl で懸濁した後,その 10 μl を分取,チュル
ク染色し,血球計数板を用いて光学顕微鏡下で細胞数を計測した.また残りの細胞懸
濁 液 は 1 ml に 調 製 し た 後 , サ イ ト ス ピ ン を 行 い ス ラ イ ド ガ ラ ス 上 に 固 定 ,
May-Gruuwald-Giemsa 染色を施し,形態学的にマクロファージ,好中球およびリンパ
球数を計測した.
6) BALF 中総タンパク量の測定
BALF 上清 10 μl を試料とし,Bradford 法により BALF 中の総タンパク量を測定した.
ウシ血清アルブミンの同様操作により検量線を作成し,タンパク質量は BSA 換算量と
した.
7) BALF 中リン脂質量の測定
BALF 上 清 40 μl を 試 料 と し , PL-EN カ イ ノ ス キ ッ ト ( カ イ ノ ス ) を 用 い て
phosphatidilcholin 量を測定した.なお,本キットに含まれる標準 phosphatidilcholin の
同様操作によって検量線を作成し,濃度を算出した.
8) BALF 中フコース量の測定
測定は,硫酸—チオグリコール酸反応を用いて行った.BALF 上清 500 μl と 30.9 N
H2SO4 (conc. H2SO4:H2O = 6:1) を 2ml 混和させた後,100℃で 10 分加温し,氷水中
で冷やした.その後,50 μl のチオグリコール酸液 (3.3% H2O sol. (v/v))を加え,室温,
暗所にて反応させた.3時間後,同サンプルの 400 および 430 nm の吸光度を測定し,
OD400-OD300 を算出し,測定値とした.なお,L-(-)-Fucose (ナカライ) の同様操作
によって検量線を作成し,濃度を算出した.
9) 細胞培養法
培養に用いた器具類はすべてオートクレーブによる滅菌処理を施し,溶液の調製に
は注射蒸留水 (大塚) あるいは超純水製造装置 (Milli-Q Labo, Millipore) により精
製した超純水を用いた.また,すべての操作は,クリーンベンチ内で無菌的に行った.
ヒト肺上皮細胞株 A549 細胞は,American Type Culture Collection より入手した.細
胞は,5% 牛胎仔血清 (FBS),100 units/ml penicillin G, 100 ug/ml streptomycin を含
む Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) を用いて 5% CO2,37℃下に静
38
置培養した.なお実験には,脱ホルモン化した FBS を用いた.
10) 薬物調製および処理
GL および DEX
GL は,DMSO にて 100 mM に用時調製した.また DEX は,ethanol にて 1 mM に調
製し,-20℃に保存した.A549 細胞を 5 % FBS, 100 units penicillin G, 100 μg /ml
streptomycin を含む DMEM にて培養した後,無血清状態にした.6 時間の無血清状
態後,各濃度の GL および DEX (vehicle: 0.1% ethanol, 1% DMSO), 100 units penicillin
G, 100 μg /ml streptomycin を含む DMEM にて,5%CO2,37℃下で静置培養した.
補中益気湯,各生薬エキスおよび生薬エキス混合液
補中益気湯 (ツムラ Lot No.2040041010) およびその生薬エキスは,株式会社ツム
ラより供与して頂いたものを用いた.また,各生薬エキスの組成は以下の Table.1 に示
す.補中益気湯は 10 mg,各生薬エキスおよび生薬エキス混合液は 10 mg 補中益気
湯相当量を 10 ml DMEM にて攪拌し,遠心 (1,000×g, 室温,5 min) を行い,上清を
回収した.なお上清はろ過フィルターによって滅菌処理を行い,さらに pH はメイロン
(大塚) にて約 7 に補正した.各濃度の補中益気湯および構成生薬の処理は,GL お
よび DEX と同様である.
39
Table.1. 補中益気湯構成生薬エキスの組成
生薬エキス
黄耆 (Astragali Radix )
蒼朮 (Atractylodis Lanceae Rhizoma
人参 (Ginseng Radix )
組成 (g)
4.0
(ALR))
当帰 (Angelicae Radix )
柴胡 (Bupleuri Radix )
4.0
4.0
3.0
2.0
大棗 (Zizyphi Fructus )
陳皮 (Aurantii Nobilis Pericarpium )
甘草 (Glycyrrhizae Radix )
升麻 (Cimicifugae Rhizoma )
生姜 (Zingiberis Rhizoma )
2.0
2.0
1.5
1.0
0.5
11) ELISA
24 well plate 上で 100%コンフルエント状態に培養した A549 細胞を,無血清状態にし
た.6時間の無血清状態の後に,各濃度の GL および DEX を含む 250 μl DMEM にて
培養した.1時間の培養後,TNF-αおよび IL-1βを加えてさらに6時間培養した.培養
上清は,遠心 (3,000×g, 4℃, 5 min) し死細胞を除去した.IL-8 タンパクの検出は,
IL-8 ELISA kit (R&D Systems) を用いて,そのプロトコールに準じて行った.なお,本
キットに含まれる標準 IL-8 の同様操作によって検量線を作成し,培養上清中の IL-8
濃度を算出した.
12) 細胞へのレポーター遺伝子導入およびプロモーター活性の測定
IL-8 および MMTV レポーター遺伝子は,IL-8 プロモーター領域 (-423/+53)
95
お
よび MMTV プロモーター領域 (-224/+100) を pGL2 basic ベクター (Promega) に
サブクローニングしたものを用いた.また NF-κB リポーター遺伝子は,Stratagene より
購入したもの用いた. 細胞への遺伝子導入は Hilly Max (Dojindo) を用い,そのプロ
トコールに準じて行った.レポーター遺伝子 (IL-8: 50 ng, MMTV: 250 ng) を
pcDNA3.1 (Invitrogen) によって全量 250 ng に合わせ,0.78 μl Hily Max と無血清培
地に混合し 15 分間室温に放置した.この混合液は,24 well plate 上で 80%コンフルエ
40
ント状態にある細胞に添加し,18 時間,37℃にて培養した.ついで,無血清培地に置
換しさらに 6 時間,37℃にて培養した.そして細胞を無血清培地で2回洗浄し,薬物を
含んだ DMEM を細胞に添加して,目的時間,37℃で培養した.なお,IL-8 および
NF-κB プロモーター活性の測定には,TNF-αおよび IL-1β を加えてさらに6時間,
37℃で培養した.レポーター遺伝子を導入した細胞におけるプロモーター活性は,
Dual-Luciferase assy system (Promega) を用いて測定した.培養した細胞から培地を
除き,冷 PBS にて2回細胞を洗浄し,100 μl の細胞溶解液を加え,室温にて 15 分間
穏やかに振盪させた.その後,細胞溶解液を回収し,この上清 10 μl と発光基質液
100 μl を室温で混和し,ルシフェラーゼ活性をルミノメーター (Lumat LB9507, eg&g
gerthtold) にて測定した.また細胞間の導入効率の補正を目的に,遺伝子導入した
pGL4.74 (hRluc/TK, Promega) の活性も同時に測定した.なお,ホタルルシフェラー
ゼ活性とシーパンジールシフェラーゼ活性の比によって Relative Luciferase Activity を
算出した.
13) siRNA の導入
細胞への siRNA の導入は,Lipofectamine (Invitrogen) を用い,そのプロトコールに
従った.まず GR siRNA (SMART-Pool, Dharmacon) 62.5 pmol を DMEM にて 250 μl
に希釈した (A 液).ついで,3 μl の Lipofectamine を DMEM にて 250 μl に希釈した (B
液). A 液および B 液を混合し,室温で 20 分間反応後,6 well plate 上,2 ml DMEM に
て培養された 50 %コンフルエント状態にある細胞に添加した.添加後 72 時間, 37℃に
て培養後,実験に用いた.
14) Total RNA の抽出,Semi-quantitative および Real-time RT-PCR
培養細胞からの total RNA の抽出は,TRIzol Reagent (Invitrogen) を用い,そのプロ
トコールに準じて行った.
Semi-quantitative RT-PCR
RNA PCR kit (AMV) ver3.0 (TaKaRa)を用い,そのプロトコールに従った.
まず,培養細胞から抽出した total RNA 0.5 μg を鋳型にして,random 9mers を用いて,
RT 反応 (1cycle at 42℃ for 60 min, 99℃ for 5 min, 5℃ for 5 min) を行なった.そ
の後,IL-8 および GAPDH のプライマーを用いて PCR (1 cycle at 94℃ for 2 min, X at
41
94℃ for 30 sec, 60℃, for 30 sec, 72℃ for 1 min, 25 and 20 cycle for IL-8 and
GAPDH) を行なった.各 PCR 産物は, 1.5 % アガロースゲルで電気泳動後,エチジュ
ウムブロマイドで染色することで検出した.
Real-time RT-PCR
PrimeScriptTM Reverse Transcriptase (TaKaRa) を用い RT 反応を行い,その産物の
1/10 量を鋳型として,Real-time PCR 反応に用いた.Real-tine PCR 反応は,SYBR
Premix Ex TaqTM (TaKaRa) を 用 い , Chrome4TM real-time PCR analysis system
(Biorad) にて行った.以下に反応条件を示す.1cycle at 95℃ for 3 min, 40 cycles at
95℃ for 15 sec, 60℃ for 1 min.{Yuan, 2006 #59}また反応の定量化は,目的 PCR 産
物が検出される最初の PCR cycle (threshold cycle (Ct)) を選択し,comparative Ct
Method (以下の式) にて定量解析した.
-[(CT, X-CT, R)TEST-(CT, X-CT, R)Control]
Fold Change= 2
CT, X: CT of the interest gene (IL-8)
CT, R: CT of the reference gene (GAPDH)
各プライマーは以下に示したものを使用した.
IL-8 Forward; 5’-catgacttccaagctggccg-3’
IL-8 Reverse; 5’- tttatgaattctcagccctc-3’
GAPDH Forward; 5’-accatcttccaggagcgaga-3’
GAPDH Reverse; 5’-cagtcttctgggtggcagtg-3’
15) Western Blotting
培養細胞から培地を除き,冷 PBS で2回洗浄した.冷 PBS を加え,セルスクレイパー
にて細胞を回収し,遠心 (1500×g, 4℃, 5 min) した.得られたペレットに冷 RIPA
buffer ( 50 mM Tris-HCl; pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 2.5 % sodium
deoxycholate, 1%v/v protease inhibitor cocktail) を加え,ピペッティングし,氷上にて
30 分間静置した.静置後,遠心 (15,000×g, 4℃, 15 min )し,上清を細胞溶解液とし
た.BCA 法により,ウシ血清アルブミンを検量線として用いてタンパク定量を行い,各
サンプルのタンパク量を一定にした.各サンプル 5 μg を常法に従い,8%ゲルを用いて
42
SDS-PAGE を行った後,PVDF 膜に転写 (250mA, 2.5 h) した.PVDF 膜を 8%スキムミ
ルクを含む 0.1% Tween 20 /PBS (-) (PBS-T) 中で室温1時間震盪し,ブロッキングし
た.その後, 5%スキムミルクを含む PBS-T で希釈した1次抗体 (GR: 200 倍希釈,
β-actin: 1,000 倍希釈) を用いて 4℃,一晩1次抗体反応を行った.その後,PBS-T を
用いて洗浄し,ブロッキング溶液で希釈した2次抗体 (rabbit: 5,000 倍希釈,mouse:
10,000 倍希釈) を用いて室温1時間,2次抗体反応を行った.抗体反応終了後,膜を
PBS-T により洗浄し,ECLTM advance Western blotting analysis system (GE Healthcare
Life Sciences) により抗体反応を検出した.ELC 反応の検出には,Bioimaging analyzer
LAS-1000 (Fuji Film)を用いた.
16) 免疫蛍光染色法
glass-bottom dish 上で 70%コンフルエント状態に培養した細胞を,無血清状態にした.
6 時間の無血清状態後,各濃度の GL, DEX and MG 132 を含む DMEM にて培養し
た.1 時間培養後,TNF-αを加えさらに1時間培養した.培養した細胞から培地を除き,
冷 PBS で2回細胞を洗浄後,4%パラホルムアルデヒドを加え,室温で10分間静置し,
細胞を固定した.固定後,冷 PBS で3回洗浄し,0.1% Triton X-100/PBS を加え,室温
で10分間静置することにより,細胞を permeabilize した.冷 PBS で 3 回細胞を洗浄後,
1.5% BSA/PBS で 250 倍希釈した p65 抗体 (F-6) を用いて,37℃,2時間で1次抗体
反応を行った.ついで, 1.5% BSA/PBS で 500 倍希釈した抗ヤギ抗体を用いて,37℃,
1時間で2次抗体反応を行った.2次抗体反応後,冷 PBS で3回洗浄し,1 μg/ml
propidium iodine (PI) および 10 μg/ml RNase A を含んだ PBS を加え,室温で 10 分間
静 置 す る こ と で , 細 胞 を 対 比 染 色 し た . そ の 後 , 冷 PBS で 3 回 洗 浄 し ,
VECTASHIELDR mounted medium (VECTO LABORATORIES)を滴下,細胞を封入
後,共焦点レーザー顕微鏡 (OLYMPUSLX70) にて細胞を観察した.なお,1視野あ
たり 100 細胞中に p65 が核に染色されている細胞を計測し,Nuclear p65 (% of Control)
を算出した.
17) Chromatin immunoprecipitation (ChIP)
100 mm ディッシュ上で 100%コンフルエント状態まで培養した A549 細胞を,無血清状
態にした.6 時間の無血清状態後,各濃度の GL および DEX を含む DMEM にて培
養した.1 時間培養後,TNF-αを加えさらに 2 時間培養した.培養液に 11×fixation
solution (37% paraformaldehyde, 1M HEPES; pH 8.0, 5 M NaCl, 0.5 M EDTA (pH8.0),
43
0,5 M EGTA (pH8.0)) を 1%になるように加え,37℃,10 分間静置することで,細胞を
固定した.固定後,グリシン (125 mM)を加え,10 分間静置することでクロスリンク反応
を停止させ,冷 PBS で2回洗浄した.冷 PBS を加え,セルスクレイパーにて細胞を回収
し,遠心 (3,000×g, 4℃, 5 min) した.得られたペレットに 200 μl の冷 SDS Lysis buffer
(50 mM Tris-HCl; pH8.0, 10 mM EDTA, 1% SDS, 1%v/v protease inhibitor cocktail)
を加え懸濁し,氷上にて20分間静置した.細胞溶解液を bioruptor UCD-250 (Cosmo
Bio) にて,超音波処理 (出力 250W; 15 cycle of 30 sec, resting on ice for 1 min
between cycoles) した.超音波処理後,遠心 (15,000×g, 4℃, 10 min) し,その上清
を 1800 μl の冷 ChIP dilution buffer (50 mM Tris-HCl; pH8.0, 167 mM NaCl, 1.1 %
Triton X-100, 0.11 % sodium deoxycholate, 1%v/v protease inhibitor cocktail) にて 10
倍に希釈した.この溶液 200 μl を INPUT 分画として用いた.また,残りの溶液 1800 μl
に 100 μl の salmon sperm DNA/protein G agarose 50% slurry を加え,4℃,3 時間反
応することで,溶液をプレクリーンした.さらに,p65 抗体 (sc-109)および control IgG を
それぞれ 4 μg 加え,クロマチン-抗体免疫複合体を形成 (4℃,overnight) させた.こ
の免疫複合体を 50 μl salmon sperm DNA/protein G agarose 50% slurry で免疫沈降
(4℃, 3 h) し,以下のバッファーにて1回ずつ順次洗浄した.Low salt wash buffer (50
mM Tris-HCl; pH8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% TritonX-100, 0.1 % SDS, 0.1 %
sodium deoxycholate); high salt wash buffer (50 mM Tris-HCl; pH8.0, 500 mM NaCl, 1
mM EDTA, 1% TritonX-100, 0.1 % SDS, 0.1 % sodium deoxycholate); LiCl wash buffer
(10 mM Tris-HCl; pH8.0, 0.25 M LiCl, 1mM EDTA, 0.5 % NP-40, 0.5% sodium
deoxycholate); Tris-EDTA buffer.洗浄後,200 μl の ChIP elution buffer (10 mM
Tris-HCl; pH8.0, 300 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% SDS) を加え攪拌し,免疫複合体
を溶出した.この溶液を 65℃で 6-12 時間 incubation し,DNA-タンパク質間のクロスリ
ンクを解除した.さらに,RNase A (37℃, 30 min), proteinase K (55℃,1 h) をそれぞれ
加え随時反応した後,phenol/chloroform 抽出および ethanol 沈殿により DNA を精製
し,TE に溶解した.精製した DNA を鋳型に用いて定量的 PCR 反応 (1cycle at 95℃
for 3 min, 40 cycles at 95℃ for 15 sec, 55℃ for 30 sec and 72℃ for 30 sec ) を行い,
INPUT DNA に対する免疫沈降されてきた IL-8 プロモーターの割合 (% of INPUT )
を算出した.なお PCR の増幅反応には,IL-8 (-121/+61)の領域を用い,以下に用い
たプライマーの配列を示す.
IL-8 (-121/+61) Forward; 5’-gggccatcagttgcaaatc-3’
IL-8 (-121/+61) Reverse; 5’-ttccttccggtggtttcttc-3’
1
19) 統計処理
実験データは平均値±標準偏差で示した.本研究では,2群間の有意差検定に
student’s t-検定を,3群間以上の有意差検定に student-Newman-Keuls 検定を用い,
5%以下の危険率をもって有意差とした.
1
謝辞
稿を終えるにあたり,終始多大なる御指導,御鞭撻および御校閲を賜りました 熊本
大学大学院医学薬学研究部 香月 博志 教授に心から感謝の意を表します.
本研究に際し,終始御指導と御鞭撻を賜り,本稿作製にあたり多大なる御教示,御
援助および御校閲を戴きました 熊本大学大学院医学薬学研究部 礒濱 洋一郎 准
教授に深甚たる感謝の意を表します.
本研究に際し,終始多大なる御指導,御鞭撻を賜りました 崇城大学薬学部 宮田
健 教授に心から感謝の意を表します.
本論文の審査にあたり,有益なる御助言と御校閲を賜りました 熊本大学大学院医
学薬学研究部 高濱 和夫 教授ならびに中川 和子 教授に厚く御礼申し上げま
す.
本研究に際し,有益なる御指導と御助力を賜りました 熊本大学大学院医学薬学研
究部 久恒 昭哲 助教に深く感謝致します.
研究生活に際し,数々の御指導と御協力を頂きました,大日向 輝 博士ならびに桑
原 一平 博士に心から感謝の意を表します.
本研究ならびに大学生活に際し,研究室配属当初より数々の御指導と御協力を頂き
ました,長井 一史 博士ならびに野村 城司 博士に心から感謝の意を表します
私の9年間の大学生活に際し,同級生,友人として苦楽を共にしてきた,古賀 豪
修士に心から感謝致します.
本研究および研究生活に際し,御協力,御助言を頂きました薬物活性学研究室の
諸氏に感謝の意を表します.特に,共同研究者としてご協力いただいた,馬場 祐一
郎 修士,西本 裕樹 修士,小黒 夏子 学士ならびに田代 ともみ 学士に心から感
謝致します.
2
最後に,あらゆる面からサポートし続けてくれた友人,両親,姉,そして最後に最愛な
る妻 智美に深く感謝致します.
平成 20 年 3 月
3
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