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Life Technologies - Thermo Fisher Scientific
ライフテクノロジーズ月刊情報誌 Life Technologies NEXT 2011 8月号 CONTENTS No.7 New 新製品情報 PRODUCT REVIEW プロダクトレビュー ELISA グレード・ウエスタンブロットグレード抗体に 新製品が加わりました！ ウサギ・リコンビナント抗体シリーズ P2 Ion PGM™シーケンサに Total RNA 用 SOLiD システムのワークフローに最適化された ターゲットエンリッチメント試薬 TargetSeq ™ エクソーム エンリッチメントキット 変異型 1 コピーを野生型 1,000,000 コピーの 混在中から検出 TaqMan® Mutation Detection Assays 有機溶媒不要の FFPE サンプルからの 「核酸」抽出キット MagMax™ FFPE kit コンタミネーションを防ぐ恒温槽用新コンセプトの メタリックビーズ LabArmor™ （ラボアーマー）ビーズ P3 P5 ライブラリ調製キット新登場！ Ion Total RNA-seq キット P4 P6 少量のサンプルで正確な測定！ 断片化した RNA の定量に！ Qubit® 2.0 Fluorometer P4 生細胞の GFP 発現を Tali ™で計測 Tali ™ イメージベースサイトメータ活用実例 P8 P7 TECHNICAL REVIEW テクニカルレビュー 教えてライフテクノロジーズ PCR 実験のコツ（3） ヒト正常ケラチノサイトとメラノサイト P10 P9 INFORMATION インフォメーション 学会展示会・セミナー セミナー・ワークショップ クイズ LTJ_NEXT_8月_110719.indd a2 P12 P12 P12 11.7.19 10:37:02 AM NEW 新製品情報 ELISA グレード・ウエスタンブロットグレード抗体に新製品が加わりました！ ウサギ・リコンビナント抗体シリーズ ABfinity™抗体はウサギのモノクローナル IgG 抗体を哺乳類細胞でリコンビナント作製した抗体分子です。Oligoclonal 抗体は ウサギのモノクローナル IgG 抗体のプールです。いずれも遺伝子レベルで管理されており、ロット間の一貫性が高く、再検証実 験の手間を省きます。 詳細は製品ページをご参照ください。 HIF1-alpha Oligoclonal HIF1-alpha Monoclonal kDa 180 115 82 64 49 37 26 PDI Oligoclonal kDa 260 kDa 260 kDa 180 82 64 49 37 kDa 180 115 82 110 60 50 40 30 20 15 10 3.5 110 60 50 40 30 20 15 10 3.5 115 Pyk2［pY402］ IL-22 64 49 37 26 製品名 サイズ 製品番号 価格 HIF1-alpha Rabbit Recombinant Oligoclonal Antibody – Purified 100 µg 710059 ¥52,000 HIF1-alpha Abfinity™ Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody - Purified 100 µg 700505 ¥52,000 PDI（ER Marker）Rabbit Recombinant Oligoclonal Antibody – Purified 100 µg 710081 ¥52,000 PDI（ER Marker）ABfinity™ Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody - Purified 100 µg 700782 ¥52,000 IL-22（Hu）Rabbit Recombinant Oligoclonal Antibody – Purified 100 µg 710084 ¥52,000 Pyk2［pY402］Rabbit Recombinant Oligoclonal Antibody – Purified 100 µg 710087 ¥52,000 読者募集のお知らせ BIOPROBES 郵便にてお届け 無料 BIOPROBES は、蛍光分子を用いる研究者の 皆様に向けたライフテクノロジーズの情報誌 です。最新技術、実験データ、ジャーナルのハ イライト、WEB ツールをはじめとした最先端 の情報を年に数回お届けいたします。 本誌は英語ですが、部分的に日本語に翻訳さ れています。 （カラ―全 28 ページ） お申込みは、会員専用サイトから。 http://www.invitrogen.jp/multi/ bioprobes.shtml 乳がん細胞（MCF7）における細胞骨格と細胞核のハイコン テントイメージング解析 2 LTJ_NEXT_8月_110719.indd 2 11.7.19 10:37:02 AM PRODUCT REVIEW プロダクトレビュー コンタミネーションを防ぐ 恒温槽用 新コンセプトのメタリックビーズ Lab Armor™（ラボアーマー）ビーズ Lab Armor™ ビーズは、まったく新しいコンセプトの恒温槽用メタリックビーズです。 いままでのウォーターバスの水を単純に置き換えることのできる非常に新しいコンセプトのラボサポート製品です。恒温槽で の細菌汚染等を防ぐため、面倒な水の交換を定期的に行うことが必須でしたが、この Lab Armor ™ ビーズに切り替えること で、ウォーターバスのメンテナンスが非常に簡便になります。また、環境上有害なウォーターバス用 Biocide（殺生物剤）も不要 になります。 微生物汚染された可能性のある水でインキュベーションをすることなく、大切な研究対象の細胞などをコンタミネーションの リスクから防ぐことができます。 細菌汚染のリスクを低減し、より再現性の高い結果が得られる信頼の GIBCO® 製品を、是非ご利用ください。 • 一切水が不要。ウォーターバスによる汚染リスクを低減 特長 • メタリック製ビーズ（下図）なので、水のようにウォーターバス 内の恒温域が低下したり、補充することなく、実験前の準備も 全く不要 • メンテナンスは 2‐4 週ごとにエタノールをビーズにスプレー するだけなので、とても簡単 • メタリックビーズなので、保温対象のチューブなどが浮いたり、 沈んだりせず、完全に保温状態にでき、転覆の心配も不要（右図） Lab Armor ™ビーズの使用例 Lab Armor ™ビーズは • メタリックビーズで、抗菌性があります。 • 直径 5∼8mm のビーズです。 • スムーズな球体構造で、液体のような挙動を示します。 • 熱伝導度と温度保持力（比熱）の高い素材です。 • 水蒸気やガスなどは浸透しません。 Lab Armor ™ビーズ拡大図 製品名 サイズ 温度 製品番号 価格 LAB ARMOR BEADS* 4L 室温 A1254301 ¥45,600 8L 室温 A1254302 ¥79,800 LAB ARMOR BEADS* * 装置特性上、循環型恒温槽では本製品はご使用いただけませんので、ご注意ください。 3 LTJ_NEXT_8月_110719.indd 3 11.7.19 10:37:03 AM PRODUCT REVIEW プロダクトレビュー Ion PGM™シーケンサに Total RNA 用ライブラリ調製キット新登場！ ホールトランスクリプトーム解析や Small RNA 解析に対応 Ion Total RNA-seq キット Ion PGM™シーケンサは、半導体マイクロチップを利用した新しいタイプの次世代シーケンサで す。目的にあったマイクロチップを選択することで、さまざまなゲノムサイズの生物種やアプリ ケーションを選択することができます。 また、ライブラリ調製キットに Ion Total RNA-seq キットが新しく加わり、ホールトランスクリ プトーム解析や small RNA 解析にも利用が可能になり、幅広いアプリケーションに対応します。 Ion Total RNA-seq キットは、マイクロアレイより広いダイナミックレンジを有し、非常に低コ ピーの Small RNA を検出することができます。既存のライブラリ調製プロトコールは高度な技 術を必要とし、非常に手間がかかる上、多量の RNA を必要とします。Ion Total RNA-Seq キット は、わずか 1-100 ng の RNA 量で、簡単にライブラリ調製を行うことができ、ホールトランスク リプトームライブラリ調製なら 1 日で完了することが可能です。 半導体型マイクロチップ次世代シーケンサ 特長 • 微量の RNA サンプルからライブラリ調製が可能 （Small RNA 1-100 ng、Poly （A）RNA 100-500 ng、ホールトランスク リプトーム 200 ng） • 非常に速い処理時間を実現 • ライブラリ調製は 4-6 時間で完了 • SOLiD ™ システムの Total RNA-Seq キットと同じプロトコールを採用 製品名 サイズ 製品番号 価格 Ion Total RNA-Seq キット（12 RNA ライブラリ） 12 反応 4466666 ¥144,000 製品の詳細は www.appliedbiosystems.jp/website/ion.htm 少量のサンプルで正確な測定！ 断片化した RNA の定量に！ Qubit® 2.0 Fluorometer Qubit® 2.0 Fluorometer は、貴重なサンプルを正確に定量するためのシステムです。 DNA、RNA、タンパク質用の専用蛍光試薬をラインナップしているので、1 台で様々な用途に ご使用いただけます。また、Ion PGM™システムでシーケンシングを行う前のビーズ調製における クオリティ評価などのプロトコールもご用意しています。 • Ion RNA-Seq キットで使用する断片化した RNA サンプルの定量に 特長 • 1 台で 2 本鎖 DNA、1 本鎖 DNA、RNA、タンパク質に対応 • 少量のサンプルでも高感度に、広いレンジで定量が可能 製品名 サイズ 製品番号 価格 Qubit 2.0 Fluorometer - Q32866 ¥170,000 Qubit® assay tubes“set of 500” 500 チューブ Q32856 ¥6,000 - 4468656 ¥42,000 ® Ion Sphere Quality Control Kit Ion PGM® テンプレート調製クオリティチェック用キット 4 LTJ_NEXT_8月_110719.indd 4 11.7.19 10:37:03 AM NEW 新製品情報 SOLiD システムのワークフローに最適化されたターゲットエンリッチメント試薬 TargetSeq™ エクソーム エンリッチメントキット ゲノム上の特定の領域を濃縮して回収することで、疾患に関連する遺伝子の詳細な解析をしたり、複数のサンプルを 1 度に解 析したり、次世代シーケンサのシーケンススループットを最大限活用した研究が可能となります。TargetSeq™エクソームエ ンリッチメントキットは、ベイラー医科大学により開発された、37.3Mb 領域のエクソームをキャプチャーするキットです。 5500 シリーズより採用された ECC（Exact Call Chemistry）モジュールを加えてシーケンスすることで、5000 以上にも上るエ クソンの詳細な SNPs 解析や Indel 解析を可能とします。ライブラリーの作製工程は、オートメーションシステム AB Library Builder システムを利用することができ、キャプチャー工程の自動化も今後予定されています。数ある次世代シーケンサの中で もマルチプレックス解析に優れたバーコードアダプターを利用することで、複数サンプルを同時にシーケンスすることも可能 です。TargetSeq™エクソームエンリッチメントキットは、精度を犠牲にすることなく、最もコストパフォーマンスの高いター ゲットリシーケンスを実現します。 • DNA プローブを用いた 65-100bp のベイト利用により高いコストパフォー 特長 マンスでターゲットキャプチャーを実現 • VCRome（VEGA,CCDS,Ref-Seq）をカバーする、45.1Mb 領域に 200 万以上の プローブを設計 • 1 反応あたり 4 バーコードライブラリーまでのマルチプレックスに対応 （2011 年 12 月予定） • ベイトのカスタムデザインにも対応（0.1Mb∼60Mb） AB Library Builder システム ライブラリ作製 ターゲットキャプチャー P1アダプター ビーズ調製 バーコードA P2 アダプター アダプター 付加 P1アダプター ゲノム DNA バーコードB 洗浄&単離 キャプチャー ePCR P2 DNA断片化 （100-165 bp） アダプター バーコード アダプター付加 および増幅 4 つまでのバーコードサ ンプルをビオチン化ベイ トDNAと結合（24∼72時 間）、ストレプトアビジン ビーズで結合 ビーズ上で 増幅し複製 ライブラリ定量および ePCR 後、SOLiD4 シ ステムもしくは 5500 シリーズでシーケンス AB Library Builder システム対応 AB Library Builder システム対応（開発中） 製品名 サイズ 製品番号 TargetSeq ™ Exome Enrichment キット 4 反応（16 サンプル） A14060 価格 ¥312,000 TargetSeq ™ Exome Enrichment キット 12 反応（48 サンプル） A14061 ¥864,000 TargetSeq ™ Exome Enrichment キット 48 反応（192 サンプル） A14062 ¥3,168,000 TargetSeq ™ Exome Enrichment キット 96 反応（384 サンプル） A14063 ¥5,760,000 TargetSeq ™ Enrichment Hybridization & Wash キット 24 反応（96 サンプル） A138230 ¥51,000 TargetSeq ™ Oligo Blocker キット 24 反応（96 サンプル） A14242 ¥54,000 5 LTJ_NEXT_8月_110719.indd 5 11.7.19 10:37:03 AM NEW 新製品情報 変異型 1 コピーを野生型 1,000,000 コピーの混在中から検出 TaqMan® Mutation Detection Assays 僅かな変異でも検出可能 KRAS EGFR BRAF データ解析が更に明確に、正確に TaqMan ® アッセイシリーズから腫瘍細胞における遺伝子変異解析キットが登場しまし た。腫瘍細胞を用いた多くの変異解析では、現在までに様々な形でリアルタイム PCR によ る解析やシーケンス解析による方法が製品化され、遺伝子変異の解析に使用されてきまし た。しかし、課題として感度、特異性、コストや検出にかかる時間などがありました。この TaqMan® Mutation Detection アッセイは、Competitive Allele-Specific TaqMan® PCR （castPCR）テクノロジーをベースに手軽で簡単なアッセイがデザインされています。また アレル特異性の高い MGB ブロッカーオリゴにより、ターゲット以外での非特異的な反応を 抑制することに成功しました。 特長 1. 特異性 2. 高感度 アレル特異プライマーによる変異検出と MGB ブロッカーに よる野生型の抑制。0.1％の変異アレルを検出。 野生型 100 万コピーのバックグラウンドから 1 コピーの変異 分子を検出。 Amplification Plot 1.000 E+1 40.0 0.1% mutant 35.0 1.000 y = -3.332x + 36.075 R = 0.9992 30.0 A Rn 1.000 E-1 wt gDNA Ct 1.000 E-2 1.000 E-3 Ct 1.000 E-4 Mutant 0 5 10 15 20 25 Cycle 30 35 40 25.0 Wild-type 20.0 Mutant 15.0 10.0 Wild-type 45 1 10 102 103 104 105 106 copies 106 10 6 106 106 106 106 106 copies 10 copies of mutant synthetic templates were spiked into 10,000 copies of cell line wild type gDNA. For every single assay, 1 – 1,000,000 copies of mutant synthetic templates were spiked into 1,000,000 copies of wild type synthetic templates. 3. 幅広いダイナミクスレンジと効率の良い PCR 4. 正確な再現性 7 桁におよぶ広範囲検出と 100％± 10％の PCR 効率 Amplification Plot 1.000 E+1 1.000 107 106 105 104 103 102 10 1 copies A Rn 1.000 E-1 NTC 1.000 E-2 1.000 E-3 1.000 E-4 0 5 10 15 20 25 Cycle 30 35 40 45 Each assay was tested with 1：10 serial dilutions, from 10,000,000 copies to 1 copy of synthetic template. 製品名 Copy number, target mutant allele 3,000 1,500 750 375 188 90 30 15 3 Expected （％） 100 50.0 25.0 12.5 6.3 3.0 1.0 0.5 0.1 Measured （％） 100 48.9 23.3 11.2 5.7 2.6 0.8 0.4 0.1 CV（％） from run to run 0.0 2.2 3.8 7.8 7.5 9.0 17.0 26.0 23.0 Precise quantification（CV ＜ 20％）is obtained from run to run when target allele copy is >30. Percent values represent the percentage of mutant DNA spiked into wild type DNA. サイズ 製品番号 価格 TaqMan Mutation Detection Assays 150 µ L, 10X 4465804 お問い合わせ TaqMan® Mutation Detection Reference Assays 150 µ L, 10X 4465807 お問い合わせ ® ® TaqMan EGFR Exon 19 Deletions Assay 150 µ L, 10X 4465805 お問い合わせ TaqMan® Mutation Detection IPC Reagent Kit 1 kit 4467538 お問い合わせ 6 LTJ_NEXT_8月_110719.indd 6 11.7.19 10:37:05 AM NEW 新製品情報 有機溶媒不要の FFPE サンプルからの「核酸」抽出キット MagMax™ FFPE kit MagMax ™テクノロジーは、磁気ビーズを利用した優れた技術です。目詰まりしないという磁気ビーズの利点を最大限に生か し、 FFPE サンプルからの Total RNA, DNA, 低分子 RNA を高収率で回収します。FFPE サンプルをキシレン処理後、このキット でプロテアーゼ処理を行ない、核酸抽出ステップへ進みます。 この改善されたキットでは、有機溶媒を除去し、脱パラフィン操作不要、キシレン不要のプロトコールになりました。さらに、 96well フォーマットで大量の FFPE サンプルからハイスループットで核酸抽出を可能にしました。 精製された核酸はリアルタイム PCR 解析をはじめ、マイクロアレイ解析、メチル化解析、miRNA 研究、シーケンシングなどの 多くのダウンストリームのアプリケーションに適しています。 DNA・RNA 抽出精製に MagMax ™ FFPE Total Nucleic Acid Isolation Kit FFPE サンプルから DNA と RNA 抽出精製の両方に使うなら・・・ • 1 つのキットで RNA と DNA の両方を単離可能 特長 • 新プロトコールにより 脱パラフィン操作・キシレンが不要 • RecoverAll ™ Kit に匹敵するクラス最高の高収量 • 磁気ビーズ法で、最大 96 サンプルまでのハイスループット処理が 対応可能 • 3.5 時間以内で操作が完了 DNA 抽出精製に MagMax ™ FFPE DNA Isolation Kit FFPE サンプルからの DNA 抽出精製専用なら・・・ • DNA 抽出にフォーカスした製品 特長 • 新プロトコールにより 脱パラフィン操作・キシレンが不要 • RecoverAll ™ Kit に匹敵するクラス最高の高収量 • 磁気ビーズ法で、最大 96 サンプルまでのハイスループット処理が 対応可能 • 3.5 時間以内で操作が完了 製品名 サイズ 製品番号 MagMAX ™ FFPE Total Nucleic Acid Isolation Kit 96 preps 4463365 MagMAX ™ FFPE DNA Isolation Kit 96 preps 価格 ¥85,000 4463578 ¥61,000 Magnetic Stand-96（24-magnet block） 1個 AM10027 ¥59,800 96-Well Magnetic-Ring Stand（96-ring magnet block） 2個 AM10050 ¥124,000 少ない検体数の場合は、Recover All kit（製品番号 AM1975）がお薦めです。脱パラフィン操作・キシレンは必要となります。 7 LTJ_NEXT_8月_110719.indd 7 11.7.19 10:37:06 AM PRODUCT REVIEW プロダクトレビュー 生細胞の GFP 発現を Tali™で計測 Tali ™ イメージベースサイトメーター活用実例 A 56 の場合、蛍光顕微鏡の画像を解析する方法や、フローサイトメーター を用いて解析する方法がとられていますが、時間や手間がかかるこ 0 RFU Fluorescence (RFU) とで導入が困難だったり、労力が割かれてしまいます。Tali ™の登場 によって、これらの実験を簡便かつスピーディーに行うことができ 10 723 # of cells 取得して定量的に解析する装置です。例えば GFP などの蛍光蛋白質 の発現の観察では、蛍光光度、細胞数、割合の情報を出力します。多く B GFP Fluorescence PI Fluorescence 10 # of cells Tali ™ イメージベースサイトメーターは細胞一つ一つの蛍光情報を 12287 RFU C 0 RFU Fluorescence (RFU) 4095 RFU D るようになりました。 本稿では、実際に蛍光蛋白質を用いたトランスフェクションの評価 実験を Tali™と一般的なフローサイトメーターとで比較した結果を ご紹介いたします。 293MSR 細胞の GFP 発現効率と生存率の評価を Tali ™ で行いました。 GFP 陽性細胞（A）と死細胞（B）のそれぞれの閾値設定。閾値を示す青い線 • 浮遊化した細胞を専用チャンバーに入れ蛍光を読み 特長 の右側が陽性。 写真表示（C）と結果の判定画面（D）。D の図中の丸は判定結果に基づいて 色分けされており、判定の検証を行なえます。 取る • 透過光・緑色蛍光量・赤色蛍光量の 3 パラメータで解析 • 約 1 分で解析結果を数値とヒストグラムで出力 サイズ：幅 29.2cm ×高さ 29.2cm ×奥行き 44.5cm 電源：100–240 VAC, 2.5 A, 120 V LED 光源：458 ± 20 nm、530 ± 20 nm 蛍光フィルター：緑（466/40 EX, 495 LP Di, 525/50） 赤（543/22 EX, 580 LP Di, 585 LP） Tali ™本体画面に表示される解析結果。生細胞、死細胞ごとの GFP 発現効 率。 % Cells expr essing GFP 90 Tali™ Image-Based Cytometer Flow cytometer 80 70 60 50 40 30 20 10 0 293MSR Viable 293MSR U2OS Viable U2OS CHO-S Viable CHO-S HEKn Viable HEKn 様々な細胞種における生存率とトランスフェクション効率解析データを Tali ™とフローサイトメーターで比較検証。同様の結果が得られることが 示されました。 製品名 製品番号 価格 1 unit T10791 ¥1,480,000 Tali ™ Cellular Analysis Slides *50 slides* 50 slides T10794 ¥20,000 Tali ™ Cellular Analysis Slides *500 slides* 500 slides T10795 ¥170,000 Tali ™ Apoptosis Kit - Annexin V Alexa Fluor 488 and Propidum Iodide 100 assays A10788 ¥32,000 Tali ™ Viability Kit - Dead Cell Green 100 assays A10787 ¥7,000 Tali ™ Viability Kit - Dead Cell Red 100 assays A10786 ¥7,000 T10790 ¥5,600 Tali ™ イメージベース サイトメーター（include Beads, 50 slides） Tali ™ Calibration Beads サイズ 1 ml 8 LTJ_NEXT_8月_110719.indd 8 11.7.19 10:37:06 AM 教えてライフテクノロジーズ PCR 実験のコツ（3） ライフテクノロジーズの製品について、よくある質問や知っていると便利な情報をご紹介します。 これまで Life Technologies NEXT 6 月 & 7 月号で、酵素と収量や特異性、フィデリティとの関係、PCR の温度条件などについて記載してきま した。今回は、 「プライマーの設計」について述べたいと思います。 実は PCR が成功するかどうかは、プライマー配列設計の時点で、ある程度決まっています。 逆に言えば、熟慮されて設計されたプライマーセットが設計できれば、PCR は最適化が比較的難しくないとも言えます。 ここではプライマーの配列上での役割と設計の際に留意することを記します。 プライマー塩基配列の役割 20-25 塩基程度で短い配列ですが、プライマー配列に無駄な部分はありません。プライマーの役割を大きく分けると 2 つの領域で異なる役割を 担います。まずは 3’末端側の約 8 塩基ですが、ここは酵素が結合して伸長反応をプロモートする領域と定義でき、最も特異性が要求されるとこ ろでもあります。プライマー設計では、3’末端側の約 8 塩基領域の塩基配列に特に注意を払う必要があります。 次に残りの 5’末端側領域ですが、この領域はプライマー自身の Tm 値と特異性を高める領域と定義できます。長さを調整したりすることでプ ライマー全体としての Tm 値を調整でき、またプライマー自身の特異性も高めることができます。このようにプライマー配列の中での役割分担 があることを理解していただいたうえで、以下の留意点を読み進めていただければと思います。 プライマーセットの設計時に留意すること ① プライマー同士の Tm 値を近似させる 先月号にも記しましたが、2 本のプライマーは固有の Tm 値をおのおのもち、Tm 値はアニーリング頻度の指標となります。したがって 2 つのプ ライマーセットの Tm 値を近似させることは、各々のプライマーの PCR 溶液中での動き（アニーリング確率とも言えます）をそろえることにな ります。一方のプライマーのみが活発に伸長したとしても、PCR の基本原理から考えると、十分な増幅が求められないことになります。そのた めプライマーの挙動をできる限り同様に（Tm 値をそろえるということ）は、効率的かつ特異性の高い PCR 増幅につながることになります。 ② プライマー配列内での 2 次構造をさける プライマーの設定位置は、増幅ターゲット領域により様々な制限等があることは、実際の研究過程においてしばしば起こります。また、 2 次構造 に関しては、目で見ただけではなかなか予測がつきにくいのも事実です。それゆえ、専用ソフトウェアを使用して 2 次構造の可能性があるかど うかを事前に確認することをお勧めします。あまりに 2 次構造が予想される配列を設定せざるを得ないケースでは、アニーリング温度の検討・ 設定において、 Tm 値より数℃高く設定することで緩和されます。 ③ 4 つの塩基をできるだけまんべんなく配列する 同じ塩基組成でも、配列の順番によって Tm 値は違ってきます。特に G （グアニン）と C （シトシン）の連続は、Tm 値を急激に引き上げるだけでな く、テンプレート DNA 中の CG クラスター等にもプライマーの一部分だけが、テンプレート DNA に強い親和性をもつことになります。 どうしても CG クラスターをプライマー中にもたなければいけない場合は、5’末端側に CG クラスターを寄せるデザインをして、3’末端側にユ ニークな配列を位置づけるようにした方がプライマー設計パターンとしてはより良くなります。3’末端に G や C を設定するという工夫ももち ろんですが、やはり重要なのは、目的とする PCR 増幅を対象とする領域に対するプライマー配列の「ユニークさ」です。 ④ ペアとなるプライマーセット配列を確認する プライマー同士で相補的な配列をもつ場合、それらは PCR 中に結合をして、PCR 副産物（プライマーダイマー）を生成します。 プライマーは PCR において一番多い分子になりますので、当然有意に PCR 産物として観察されてしまう結果となります。 プライマーダイマーは百害あって一利なしと言えます。その理由としては、PCR 増幅中に基質である dNTPs を大量に消費し、さらにポリメ ラーゼが本来のターゲットに働くことも妨げます。その結果、目的 PCR 産物の収量は減少する結果となります。また PCR 産物を精製する場合 も、このプライマーダイマーが 40 塩基近い産物であるために、目的 PCR 産物と分離するのが、難しくなるケースがよく起こります。 プライマーダイマーは、数 100 塩基レベルの非特異的 PCR 産物よりも非常に厄介な存在ですし、これは PCR 条件を変更してもなかなか消失さ せることが難しいことから、事前にソフトウェアにより、この厄介なプライマーダイマーが生成するかどうかの確認を必ずしていただくこと をお勧めします。 これまで 3 回にわたって PCR の最適化に関する記事を記載してまいりました。 初回にも記載しましたが、PCR は机上でのデザインで、高い成功率を導くことのできる数少ない技術です。そして現在では、分子生物学での解 析技術における必要不可欠な基礎的技術であると思います。ここで記したことだけでは、もちろんカバーできない特殊な PCR 条件やテクニッ クもたくさんあるかと思いますが、この記事がみなさまの研究活動の一助になることを切に願い、この連載の完結の言葉とさせていただきます。 ライフテクノロジーズのウェブサイトでは、お客様の研究・実験をサポートするQ&Aサイトをご用意しています。 幅広い製品やアプリケーション、 トラブル時の対処法など、豊富なコンテンツを提供しておりますので、ぜひご利用ください。 インビトロジェンサイト http://www.invitrogen.jp アプライドバイオシステムズサイト http://www.appliedbiosystems.jp トップページのSupportプルダウンメニューから トップページのサポートプルダウンメニューから FAQ（テクニカル）を選択 製品Q&Aを選択 LTJ_NEXT_8月_110719.indd 9 9 11.7.19 10:37:06 AM TECHNICAL REVIEW テクニカルレビュー ヒト正常ケラチノサイトとメラノサイト 6 月より Cascade Biologics™ ブランドの正 常ヒト表皮ケラチノサイト（角化細胞） （ human epidermal keratinocyte, HEK）とメラノサイト （human epidermal melanocyte, HEM）、およ びそれらを培養するための培地・サプリメントの 取り扱いを始めました。ここではこれらの製品の 特徴をご紹介いたします。 HEK HEM 図 1 ヒト皮膚由来のケラチノサイト（表皮角化細胞、HEK）とメラノサイト（HEM） 1. 正常細胞は寿命があります 表 1 細胞株と正常細胞との比較 HEK も HEM もそれぞれ正常な組織から得られ た正常細胞で、クローン化された細胞（細胞株）で はありません。クローン化された細胞株との大き な違いは正常細胞には寿命があることです。 2. 培地とサプリメント ケラチノサイトの場合、培地には標準的な培養 ができる Medium 154 とより長期間の培養に適 した EpiLife® とがあります。さらに培地にはカ ルシウム含有、カルシウム不含、フェノールレッ ド不含などの選択もできます（表 2）。またサプリ メントには通常のウシ脳下垂体抽出物（ bovine pituitary extract, BPE）含有タイプの Human Keratinocyte Growth Supplement（HKGS）、 HKGS の各成分が各バイアルに分かれている HKGS kit 、成分確定動物成分含有の EpiLife Defined Growth Supplement（EDGS）、そし て成分確定、動物由来成分不含（animal originfree, AOF）の S7 の 3 種類から選ぶことができま す。実験の目的によって、最も適した培地、サプ リメントの組み合わせを選ぶことができます。 細胞株 正常細胞 由来 がん組織、不死化した細胞 正常組織 生体との関連性 限定的 元の組織に近い 利用性 すぐに扱える 由来組織による 寿命 無限 有限 培養条件 通常の基礎培地＋血清 それぞれの細胞に適した培地と 成長因子などの添加物 表 2 細胞の種類とそれぞれの細胞に適した基礎培地 ヒト正常細胞（由来） 培地 サプリメント ケラチノサイト HEKa（ヒト成人表皮） HEKn-APF（新生児表皮、動物由来成分不含） HEKa-APF（成人表皮、動物由来成分不含） Medium 154 CF EDGS Medium 154 CF/PRF Supplement S7 EpiLife, EpiLife CF EpiLife CF/PRF メラノサイト HEMn-LP（新生児表皮、lightly pigmentated） Medium 254 HEMn-MP（新生児表皮、moderately pigmentated） Medium 254 CF HEMn-DP（新生児表皮、darkly pigmentated） HEMa-LP（成人表皮、lightly pigmentated） HMGS HMGS-2（PMA 不含） CF, calcium free; PRF, phenol red free 各製品のカタログ番号は http：//www.invitrogen.jp/gibco/cascade.shtml をご覧ください。 メラノサイトには、メラノサイト用の Medium 254 培地とホルボール -12- ミリスタート -13- アセタート（ phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA）含有の Human Melanocyte Growth Supplement（HMGS）と PMA 不含の HMGS-2 と があります。HMGS-2 は PMA の代わりにエンドセリン―1 を加えることにより同等の増殖を維持します（図 2）。HMGS-2 で培養したメラノサイトは、HMGS で培養した細胞に比較して樹状突起が短くなり細胞体が大きくなります（図 3）。また HMGS-2 で培養した細胞を HMGS 添加の培地に移すと、細胞体が細くなり樹状突起が長くなります（図 4）。 10 LTJ_NEXT_8月_110719.indd 10 11.7.19 10:37:07 AM TECHNICAL REVIEW テクニカルレビュー 70 4回目の培養からの累積集団倍加数 60 50 HMGS HMGS-2 図 3 HMGS 添加培地（左側）と HMGS-2 添加培地（右側）でのメラノサイトの形態。HMGS-2 で 培養したメラノサイトの方が、細胞体が大きく樹状突起が短い。 40 30 20 10 ◆HMGS-2で培養したHEMn-LP HMGS-2 ■HMGSで培養したHEMn-LP 0 0 20 40 60 80 100 120 140 培養日数 図 2 HMGS と HMGS-2 との増殖の比較。新生児包皮由来正常メラノサ イト（HEMn, Cat. #C-002-5C）を解凍し、HMGS（Cat. #S-0025）を添加した Medium 254（Cat. #M-254-500）に播種した。3 回 目の培養（ 2 回継代した後）の培養が終了した後に HMGS または HMGS-2 それぞれのサプリメントを添加した Medum 254 に継代 し、T-25 フラスコに密度が 5,000 cells/cm2 になるようにトリプ リケートで播いた。それぞれの継代ごとに細胞を回収し、集団倍加 数を計算し、新しいフラスコに最初の密度で播き直した。 HMGS-2 HMGS 図 4 HMGS-2 添加 Medium 254 培地で 6 継代培養した細胞をそれぞれ、新しい HMGS-2 添加培 地と HMGS 添加培地に播種し、7 日間培養した細胞の写真。HMGS で培養すると樹状突起が 長くなり、より放射状の形態に変化する。 3. 詳しい情報があります 細胞の各ロットには試験成績書があります。例に挙げたケラチノサイトの試 験成績書では、年齢、性別、色素の程度というドナーの情報と、バイアルに含 まれている生細胞数、細胞の生存率、増殖速度、長期間培養した場合の集団倍 加数、ウイルス・細菌の試験といった試験結果が記されています（図 5）。また もし必要があれば、各ロットの細胞と組織の写真を提供することができます。 メラノサイトについては試験成績書に組織の写真が掲載されています。 その他実験上必要な情報がありましたら弊社テクニカルサポートまでお問い 合わせください。 集団倍加（population doubling） 細胞数が 2 倍になることを「集団倍加（population doubling, pd）」とい い、その回数を「集団倍加数」といいます。数式で示すと Nt ＝ N0 2x N： t 時間 t における細胞数 N0：時間 0 における細胞数 X： 集団倍加数 になります。例えば“0.9 pd/day”という表記であれば、細胞が「1 日で 20.9 （≈ 1.87）倍になる」ということを意味しています。 図 5 HEKn の試験成績書の例 ご注意：ヒト由来の細胞の製品はすべて潜在的に病原体であるとして取り扱ってください。ご使用時にはディスポ―ザルの手袋と安全メガネ のご使用をお勧めいたします。 11 LTJ_NEXT_8月_110719.indd 11 11.7.19 10:37:07 AM INFORMATION 学会展示会・セミナー 展示会 Laser Microdissection 研究会 セミナー 日時：2011 年 8 月 25 日（木）13：00∼18：30 （予定） 会場：ニチイ学館 神戸ポートアイランドセンター3 階（神戸） http://www.dialogue2005.com/lmd/index.html 【弊社の企業講演】 演題： 「Applied Biosystems® ArcturusXT ™ レーザーキャプチャーマイクロダイセクションシステム（LCM）とアプリケーションの展望」 演者：大滝 真作（ライフテクノロジーズジャパン株式会社 テクニカルサポート フィールドアプリケーションサイエンティスト） 展示会 第 3 回日本 RNAi 研究会 セミナー 会期：2011 年 8 月 26 日（金）∼27 日（土） 会場：グランドプリンスホテル広島（広島） http://cell.pharm.hiroshima-u.ac.jp/JARI/JARI/Welcome.html 展示会 第 20 回日本組織適合性学会大会 会期：2011 年 8 月 28 日（日）∼30 日（火） 会場：ツインメッセ静岡（静岡） http://www.aeplan.co.jp/hla2011/ 展示会 日本防菌防黴学会第 38 回年次大会 セミナー 会期：2011 年 8 月 30 日（火）∼31 日（水） 会場：千里ライフサイエンスセンター（大阪） http://saaaj.jp/ 展示会 国際微生物学連合 2011 会議（前半） 会期：2011 年 9 月 6 日（火）∼9 日（金） 会場：札幌コンベンションセンター http://www.congre.co.jp/iums2011sapporo/ 展示会 第 34 回日本神経科学大会 会期：9 月 14 日（水）∼17 日（土） 会場：横浜・パシフィコ横浜 http://www.neuroscience2011.jp/ 展示会 第 8 回国際微量癌シンポジウム 会期：9 月 21 日（水）∼23 日（金） 会場：大阪国際会議場 http://www.secretariat.ne.jp/ismrc2011/ 展示会 第 84 回日本生化学会大会 セミナー 会期：2011 年 9 月 21 日（水）∼24 日（土） 会場：国立京都国際会館 http://www.aeplan.co.jp/jbs2011/ 学会展示会・セミナーの最新情報は http://www.appliedbiosystems.jp/website/jp/event/eventpage.jsp セミナー・ワークショップ 遺伝子解析の手法を用いた微生物同定 MicroSEQ を用いたハンズオン・ワークショップ 日時：2011 年 10 月 14 日（金） 9：30∼17：00 （予定） 会場：ライフテクノロジーズジャパン 本社 3 階 ラボ・ショールーム 定員：8 名 ※定員に達し次第締め切りとさせていただきます。 参加費：1 万円（税込） 申込方法：下記 Web site より、お申込みください。 セミナー・ワークショップの最新情報は http://www.lifetechnologies.co.jp/sem/index.html QUIZ クイズに答えてかわいいポッポちゃんを当てよう ! 以下のクイズに正解した方から抽選で 10 名様にポッポちゃんのぬいぐるみをプレゼントします。 Q A これまでのウォーターバスの水に代わる新しいコンセプトの恒温 槽用メタリックビーズ Lab Armor ™ビーズ。面倒な水の交換を 行う必要がなくなり、メンテナンスはエタノールをスプレーする だけ、と非常に簡単です。では、そのメンテナンスをする頻度は ? 2011 年 8 月 24 日（水） ※当 選 者 の 発 表 は 賞 品 の 発 送 を もってかえさせていただきます。 ① 3∼4 日ごと ② 1 週ごと ③ 2∼4 週ごと http://www.lifetechnologies.co.jp/quiz.htm からご応募ください。 応募締め切り： 7 月号のクイズの正解は、Tali でした。 http://www.lifetechnologies.co.jp 記載価格は2011年7月現在の価格です。消費税は含まれていません。価格は予告なしに変更する場合がありますのであらかじめ ご了承ください。 ＊本文中のオーダリングインフォメーションで マークがついている製品はアプライドバイオシステムズブランド、 マーク はインビトロジェンブランドでお取り扱いしています。 研究用にのみ使用できます。診断目的及びその手続上での使用は出来ません。 記載の社名および製品名は弊社または各社の商標または登録商標です。 販売店 The trademarks mentioned herein are the property of Life Technologies Corporation or their respective owners. © 2011, Life Technologies Japan Ltd. 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