蛋白質核酸酵素:バクテリオロドプシンのプロトン輸送機構

R
e
v
e
バ クテリオロドプシンのプロトン輸送機構
蛋 白質 中の プロ トンと水分 子 の動 き
Proton transport
molecules
inside
mechanism
of protein
of bacteriorhodopsin:
movement
of a proton
and water
前 田章 夫 ・神 山 勉
高度 好塩 菌の紫 膜を横切 る レチナール蛋 白質 バクテ リオロ ドプ シンは,光 によ って駆 動 され るプ ロ トンポン プで あ
る.5段 階 にわた る一 方 向へむ けたプロ トンの移 動反 応 は,関 与 する解離 性基 のプ ロ トン親和性 の逐次 変化 に依存
して いる.そ の機構 を,蛋 白質の内部 にあ る水 分子 の変化 を中心 に,化 学 結合 の レベルか ら,お も にフー リエ変換
赤外 分光法,X線
回 折法 によ って解 明 して い った.そ の結果,プ ロ トン親和 性の変化 にお ける,蛋 白質内 部での水
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分子 再配置 の重要 性が見 いだされ た.
●バクテ リオロ ドプ シン
Key words
●プ ロ トン移 動
●フー リエ変換 赤外 分 光法
●X線 回折 法
●水分 子
る 変 化 か ら と ら え,蛋
は じめ に
う と い う の が,こ
バ ク テ リオ ロ ドプ シ ンは,光
に よ って 駆 動 され る微 生 物
型 ロ ドプ シ ンDの 原 型 で あ る.最 近,こ
の型 の ロ ドプ シ ン
白質 の分 子 内生 物 学 を追 求 してい こ
れ か ら も続 く流 れ で あ ろ う.
バ ク テ リオ ロ ドプ シ ン は 高 度 好 塩 菌(Halobacterium narum)の
sali-
細 胞 膜 の 紫 膜 と よ ば れ る パ ッチ 状 部 分 に 存 在 す
を使 っ て光 に よ り神 経 細 胞 の活 動 を操 作 す る試 みが は じま
る 蛋 白 質 で3),7本
っ た が2),こ れ まで も,基 礎 科 学 の対 象 と して膜 蛋 白質 の
1a).そ
研 究 を リー ドす る多 くのす ぐれ た成 果 を生 み だ して きた 蛋
を 横 切 る レ チ ナ ー ル が プ ロ ト ン化 シ ッ フ塩 基 で 結 合 して い
白 質 で あ る.研 究 対 象 と して な に よ りの よ さは,光
る.こ
によ り
の7本
の 膜 貫 通 ヘ リ ッ ク ス か ら で き て い る(図
目 の ヘ リ ッ ク ス に あ るLys216に,膜
の シ ッ フ塩 基 を境 に,蛋
白 質 部 分 を 細 胞 外 側 と細 胞
反 応 を開 始 で き,フ ェ ム ト秒 に は じ まる 反応 中 間 体 の 物 理
質 側 と に 分 け て 考 え る こ と が で き る.レ
化 学 的特 徴 を分 光 学 的 方 法 やX線
ン鎖 は 芳 香 族 残 基 で と りか こ ま れ て い て,そ
回折 法 で と らえ る こ とが
可 能 な こ とに あ る.ま た,も っ と も簡 単 な分 子 で あ る プ ロ
トンを基 質 と し,そ の動 きを カ ル ボ ン酸
ロ トン化,脱
シ ッ フ塩 基 の プ
プ ロ トン化 か ら と らえ る こ とが で きる.こ れ
らの利 点 を いか し,イ オ ン輸 送 の 素段 階 を化 学 結 合 に起 こ
性 体 構 造 は 強 く制 約 さ れ て い る.暗
の と13-cis,15-syn型
闇 で は 全trans型
の も の に な る.全trans型
の も
照射
の レチ
表 記 す る)だ け が プ ロ ト ン
輸 送 を 行 な う こ と が で き る.レ
チ ナ ール が 光 を吸収 す る と
合 に お い てcis型 へ の 異 性 化 が 起 こ り(図1b),
成 順 にK,L,M,N,0と
米 国Illinois大 学Urbana-Champaign校
体 を へ て も とのBRに
E-mail:[email protected]
胞 内 か ら細 胞 外 に 運 ば れ る.
Tsutomu の と り う る異
ナ ー ル を もつ 分 子(以 下,BRと
そ の の ち,生
Maeda
チ ナ ー ルの ポ リエ
の もの が 平 衡 に な っ て い る が,光
下 で は す べ て が 全trans型
Cl3=Cl4結
Akio の 中央
戻 る.こ
名 づ け られ た中 間
の あ い だ に プ ロ トン1個 が 細
Kouyama
名 古 屋 大 学 大 学 院 理 学 研 究 科 物 質 理 学 専 攻 生 体 超 分 子 物 理 研 究 室
プロ トンポンプの素過程
I
E-mail:[email protected]
URL:http://bio.phys.nagoya-u.ac.jp/
バ ク テ リ オ ロ ドプ シ ンの プ ロ ト ン輸 送 サ イ ク ル は,そ
1314
蛋 白質 核酸 酵素
Vol.52 No.11 (2007)
の反
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図1
バクテ リオロ ドプシンの立体構造 におけるプロ トン移 動経路(a),レ チナールの光異性 化(b)と,光
応 中 間 体 の 生 成 ・消 滅 の 詳 細 な 解 析 か ら よ く理 解 さ れ て い
に対 す る親和 性(pKa)の
る.図1(c)に,中
わ ち,pKaの
か らMに
性pH,室
温 で の 反 応 サ イ ク ル を 示 す.L
変 化 す る 過 程(1)で,シ
外 側 の す ぐ近 くに あ るAsp85に
程(2)で,細
方 向 の プ ロ トン輸 送 に適 した よ う に順 次pKa変
タ ー と い わ れ て い る4,5).こ こ で は,こ
塩 基 は,つ
ぎ のMか
らNへ
か ら プ ロ ト ン を 受 け 取 る.プ
ぎのNか
らOへ
な っ て い たC13=Cl4結
も と のBRに
ロ ト ンが な くな っ た シ ッ フ
合 はtrans型
な る 過 程(5)で,Asp85に
が プ ロ トン放 出 基 に 移 る.反
れ と と も に,cis型
に 戻 る.つ
ロ トン輸 送 に関 与 す る残 基 が一
の機 構 につ い て,X線
化 を誘 導 し
回折 法 と,フ ー リ
ぎ のOか
た結 果 を も とに考 察 す る.
あ る残 基 のpKaは,プ
ロ トンの 解 離 に と もな っ て変 化 す
る特徴 的 な物 理 量 が半 分 だけ変 化 した ときのpHと
して 定義
くの 場 合,可 視 スペ ク トル,赤 外 スペ ク トル な
どの分 光 学 的 な デー タに よって 求 め られ る.BRに
胞 質 側 か ら プ ロ トン を 受 け
戻 る.そ
て ゆ く(図2).そ
され る.多
胞 質 側 のAsp96
ロ トン を失 っ たAsp96は,つ
の 過 程(4)で,細
取 り プ ロ トン化 したAsp96に
の よ う な複 合 体 を ま
の 過 程(3)で,細
各 中 間 体 で は,プ
エ 変 換 赤 外 スペ ク トル 法 をは じめ とす る分 光 学 的方 法 で得
ロ トン を も っ た 水 分 子 の ク ラ ス
とめ て プ ロ トン放 出 基 と よぶ.プ
低 い残 基 か ら高 い残 基 へ と移 動 す る.L,M,
移 る.そ
の 部 位 はGlu194,Glu204,Arg82に
か こ ま れ た 領 域 に あ り,プ
変 化 に よっ て もた ら され る.す な
N,Oの
胞 外 側 の 表 面 に 近 い と こ ろ か ら細 胞 外 に プ ロ ト
ンが 放 出 さ れ る.そ
化学反 応サイ クル(c)
ッ フ 塩 基 の プ ロ トン が 細 胞
れ に 少 し遅 れ た 過
i e
v
ロ トン化 シ ッ フ塩 基 のpKaは,蛋
白質 が アル カ リ変性 す る
に
13以 上 と見 積 も られ る.こ の高 いpKa値
ら
す ぐそ ば に あ る解 離 したAsp85の
残 っ て い た プ ロ トン
応 サ イ ク ル 全 体 で い え ば,1個
の プ ロ ト ンが細 胞 質 側 か ら細 胞 外 側 に 輸 送 され る こ とに な る.
る水 分 子 との水 素 結合(図3)に
は,シ
ッフ塩 基 の
負 の電 荷 と,あ いだ にあ
よっ て もた ら され る.BRの
pHを 下 げて ゆ くと レチ ナ ール の色 は紫 か ら青 に変 わ る.こ
の色 変 化 は シ ッフ塩 基 の対 電 荷 で あ るAsp85が
された た め で,そ のpKaは3付
II pKaの 変化がプロ トン輸送を起 こす
お け るプ
レチ ナ ー ル のC13=C14結
プ ロ トン化
近 に あ る.
合 がcis型 に異 性 化 す る過 程 は
つ ぎの よ うに して起 こ る.光 照 射 前 にお い て細 胞 外 側 にむ
プ ロ トン輸 送 に 関与 す る残 基 のあ い だの プ ロ トン移 動 は,
熱 力 学 の要 請 に従 い,反 応 の進 行 と と もに生 じる プ ロ トン
い てい た シ ッフ塩 基 のN-H結
で あるKで
合 は,光 に よ る最 初 の 中 間 体
は,ほ ぼ90度 回 転 した状 態 にな る6).C13=C14
蛋白質 核酸 酵素
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結 合 の180度 回 転 が はた され るの はつ ぎのLに 移 行 す る と き
で,こ の とき,BRで
シ ッフ塩 基 と水 素 結合 を して い た水分
子 が 細 胞 質 側 に移 り,細 胞 質 側 をむ い た シ ッフ塩 基 のN-H
結 合 との あい だで水 素 結 合 をつ く り直 す7).Lの
ッフ塩 基 のpKaは,ア
ル カ リ性 で はMの
な る こ とか ら,か な り低 い もの と思 われ る.
移 行 す る過 程 が,一
ぎ りのpHで
pKaは3以
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らM,つ
い でNに
形 成 は酸 性 転 移 が起 こ る ぎ り
も観 測 され る こ とか ら,Mで
の シ ッフ塩 基 の
下 に大 き く低 下 して い る(図2).一
は シ ッフ塩 基 か らプ ロ トンが はず れAsp85が
プロ
トン化 してお り,両 者 の電 気 的 相 互 作 用 は弱 くなっ てい る.
で は熱 平 衡 に近 い状 態 にあ る9).
変 化 を もた ら し,L
の変換 を可 能 に して い る の だ ろ うか.
こ の謎 を解 くには,蛋
射 前 後 の 変 化 分(差 ス ペ ク トル)か ら議 論 す る こ とに な る.
反 応 に と もな う差 赤 外 ス ペ ク トル に現 わ れ たす べ て の 吸 収
の あ い だ に電 気 的 な 相 互 作 用 が あ るの に対 し
か らMへ
有 効 な手段 で あ る.背 景 に大 きな吸 収 帯 が あ るの で,光 照
バ ン ドが,な
基 とAsp85と
何 が シ ッフ塩 基 お よびAsp85のpKaの
外 分 光 法 は化 学 結 合 に生 じた極 性 変 化 を高 感 度 で検 出す る
は シ ッ フ塩
上 と大 き く上 昇 して い る8).Lで
に もか か わ らず,LとMと
の 変化 が 機 能 の発 現 に と もな っ て起 こ る.フ ー リエ 変換 赤
方,Asp85
のpKaは11以
て,Mで
赤 外 吸 収 は極 性 の化 学 結合 で 強 く起 こ る.蛋 白質 の機 能
に 直接 に 関 与 す る残 基 の多 くは極 性 残 基 で あ り,そ の 極 性
方 向へ の プ ロ トン移 動 を決 定 す る もっ
と も重 要 な段 階 で あ る.Mの
の再配置の検出
状 態 での シ
生 成 が 著 し く速 く
プ ロ トン輸 送 サ イ ク ル の なか で,Lか
III フー リ工変換赤外分光法 による水分子
白質 内 の 水 分 子 の再 配 置 につ い て
ん らか の意 味 でそ の 反 応 に 関与 してい る化 学
結 合 に由 来 して い る とい えそ うで あ る.着
目す る化 学 結合
の位 置 は,変 異 蛋 白質 の フー リエ変 換 赤 外 ス ペ ク トル測 定
お よびX線 回折 法 で得 られ た結 果 を参 考 にして考 察 す る.
フー リエ変 換 赤 外 ス ペ ク トル測 定 で もっ と もイ ンパ ク ト
を与 え たの は,Asp残
基 がMで
プ ロ トン化 す る こ とを示 す
シ グ ナ ルが と らえ られた こ とで あ っ た10).蛋 白質 の まわ り
の水 分 子(反 応 進 行 に不 可 欠)は3300cm-1を
中心 に大 きな
の理 解 が 不 可 欠 で あ る.以 下 で は,赤 外 ス ペ ク トル に現 わ
赤 外 吸 収 を示 す.前 田 らは,こ れ よ り高 い振 動 数 の領 域 に
れ る水 分 子 の振 動 バ ン ドの 解析 か ら得 られ た結 果 を紹 介 し
中 間 体 形 成 に と もな う水 分 子 の振 動 バ ン ドの 変 化 を見 い だ
つ つ,プ
した11).こ れ らは,普 通 の水 素 結 合 をつ くっ て い る水 分 子
ロ トン移 動 の本 質 につ いて 論 ず る.
に比 べ 弱 い水 素 結 合 を形 成 してい る水 分 子 で あ る.
図2
中 間 体 で の プ ロ トン放 出 基(PRG),Asp85,
シ ッフ塩 基,Asp96のpKaの
変遷
黒色の残基および水分子はpKaの 上昇に寄与 していることを
示す.青 色 はそれがなくな った残基を示す.矢 印は直前に起
こったプロ トン移 動.切 断された矢印はpKaの 変化でプロ ト
ン移動 が阻害された経路.黄 緑色の両矢印は静電相互作用.
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蛋 白質 核酸 酵素
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図3
Asp85か
e
i
v
らAsp96に
e
い
た る 領 域 のBR,L,M
の構 造 比 較
結晶構造 解析で確認 された水分子
は青 色 の球 で,存 在 が推 定 さ れる水
分 子 は灰 色 の 球 で示 した.
[PDBID:1iw6,1ucq,1iw9]
図4(a)は,170Kで
の 光 照 射 でLが
ク トル の な か の,水
分 子 のO-H伸
生 じ る と きの 差 ス ペ
縮 振 動 が 変 化(実 線)す
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振 動 数 の 領 域 を 示 す.3642cm-1,3575cm-1に
る
あ った振 動
て い る15).
こ の フ ー リ エ 変 換 赤 外 分 光 法 に よ る 結 果 は,神
晶 構 造 解 析7)の 結 果 と よ くあ う.X線
バ ン ドが 消 え,3550∼3450cm-1に
また が る 幅広 い振 動 バ
注 意 し た こ の 結 果 で は,Lは
ン ド と,そ
鋭 い バ ン ドが 現 わ れ た
な か に シ ッ フ 塩 基 と相 互 作 用 しThr46に
の 上 に の っ た3486cm-1の
こ と を 意 味 す る.H2160をH218Oに
ル で は,Trp182の
3486cm-1の
入 れ換 えて得 たスペ ク ト
イ ン ドー ルN-H結
バ ン ドを 除 き,質
フ トが 観 測 さ れ,こ
合の伸縮振 動 による
で,シ
ッ フ 塩 基 のNlH結
の
い た る水 分 子 の ク
発 色 団 は13-cis,15-
合 は 細 胞 質 側 を む き,細
の バ ン ドは,図5に
縮振動 によ
示 し た,室
で の 時 間 分 解 法 で 得 ら れ た 時 定 数0.04msのLが
な す 中 間 体 の ス ペ ク トル で は,3610cm-1を
振 動 数 の と こ ろ に 現 わ れ る12).こ
バ ン ドは,Lで
細 胞 質 側 に 空 洞 を も ち,そ
量 差 に あ った低 波 数側 へ の シ
の バ ン ドが 水 分 子 のO-H伸
る こ と が 確 認 さ れ た.こ
傷 害 の影 響 に 十 分 に
ラ ス タ ー が 示 さ れ て い る(図3).Lの
trans型
山 らの 結
温
主成分 を
中 心 とす る 高 い
の 領 域 で の 幅 広 い 大 きな
は 複 数 の 水 分 子 が 水 素 結 合 で 連 な り,水
子 の 実 質 的 な 極 性 が 増 した(吸 光 度 が 増 大 す る)こ
分
とで 生 じ
た も の で あ る.
こ の 水 分 子 が ど こ に あ る か に つ い て,野
生型蛋 白質の示
す ス ペ ク トル に 対 す る ア ミ ノ 酸 置 換 の 影 響 か ら議 論 す る(図
4b).上
を む い た 広 い バ ン ドは,Asp96の
(図3)の
変 異 蛋 白 質 で あ るT46Vで
そ ば に あ るThr46
消 失 す る こ と か ら,シ
ッフ塩 基 の 細 胞 質側 にあ る水 分 子 に由 来 して い る こ とが 示
唆 さ れ た13).室
ら,T46V変
温 で の中 間 体 の あい だ の変 換 速 度 の測 定 か
異 蛋 白 質 で はLとMと
れ る こ と が 知 ら れ て い る.一
白 質 で は,こ
の 平 衡 がMの
方,T46V D96N二
ほ う にず
重変異 蛋
の 平 衡 が も との 野 生 型 蛋 白 質 の よ う にLの
い 方 向 に 戻 さ れ,水
多
分 子 の 振 動 バ ン ドの 強 度 も も と に戻 る.
図4
シ ッ フ 塩 基 の そ ば に あ るVal49の
で は,水
変 異 蛋 白 質 で あ るV49A
分 子 に よ る 振 動 バ ン ドが さ ら に 増 加 す る と と も に,
Lが 著 し く安 定 に な る14).別
種 の ア プ ロー チ に よる証 拠 と
170Kで のLの 生成 にともな うフー リエ変 換赤外 差 スペ ク
トルでの水分子 の変化を示す振 動数領 域
(a)野 生 型 蛋 白 質の スペ ク トル.
(b)野 生 型 蛋 白 質 のス ペ ク トル に変 異型 蛋 白質 の ス ペ ク トル を重 ね た もの.
ゼ ロ ライ ン よ り下 はBRか
あ わ せ て,Lで
は,シ
の 連 鎖 が あ り,Lの
ッ フ塩 基 の 細 胞 質 側 に 数 個 の 水 分 子
構 造 を 安 定 に し て い る こ とが 推 測 さ れ
らLに な った とき に消 失 した 振 動 バ ン ド,ゼ ロラ イ
ンよ り上 はLで 生 成 したバ ン ド.実 線 はH2160中,点
線 はH2180中
で得たス
ペ ク トル.
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w
胞 外 側 を む い た 暗 黒 中 で 存 在 す る13-cis,15-Syn型16)と
な る.細
胞 質 側 のLeu93の
の 近 くか ら離 れ,で
化 がLの
側 鎖 が む きを変 えて シ ッフ塩 基
き た 空 洞 に 水 分 子 が 入 る.こ
れ らの変
そ ば に移 動 し,シ
はLeu93の
蛋 白 質 でLが
分子 は
ッフ塩 基 の細 胞 質側 の スペ ース
側 鎖 で 埋 め られ る(図3).こ
れ は,L93M変
異
著 し く安 定 に な る こ と17)と 関 連 して い る よ う
示 した,室
温,時
を む い た3645cm-1の
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Phe219の
寄 与 が 大 きい12).下
振 動 バ ン ドは,Asp85の
消 失 す る.こ
合 した 水 分 子 の,水
よ る5,18).上
が そ れ をか こ む空 洞 を埋 め,プ
ロ トン化 した シ ッフ塩 基 を
Lか らMへ
の変 換 で は,シ
ッ フ塩 基 か ら離 れ た と ころ に 空
洞 が で き,そ れ を水 分子 が埋 め てMに
特 異 的 な構 造 を安 定
に して いる と思 わ れ る.BRか
らにMに
の総 和 と して,図3に
らL,さ
よ る3671cm-1の
こ と か ら19),Phe219の
バ ン ドは,
大 き く強 度 を 下 げ る
シ ッ フ 塩 基 と相 互 作 用 し
て い た 水 分 子 の ク ラ ス ター が 消 え,シ
らに,シ ッ フ塩 基 か ら
クテ リオ ロ
ドプ シ ンが水 ポ ンプ20)と いわ れ る ゆ えんで あ る.
IV プロ トン放出基の正体
合 に
近 くに あ る 水 分 子 で あ る こ とが 示 唆
結 晶 構 造 で は,Lで
ど離 れ たThr46,Phe219に
側
水素結
素 結 合 に 関 与 し な い ほ うのO-H結
側 に む い たMに
い た る過 程
示 した,水 分 子 を入 れ た空 洞 が シ ッ
変 異 蛋 白質
の バ ン ド は,Asp85に
変 異 蛋 白 質 で あ るF219Lで
さ れ る.Mの
ッ フ塩 基 の細 胞 質側 に あ る水 分 子 ク ラス ター
離 れ た細 胞 質側 に移 っ て い る こ とが わ か る.バ
定 数0.13ms,0.54ms,1.6ms
で の 中 間 体 の ス ペ ク トル で は,Mの
で あ るD85Nで
Lで は,シ
フ塩 基 の 細 胞 外 側 か ら細 胞 質 側,さ
に 思 わ れ る.
図5に
分 子 の 水 が入 っ て い る20)(図3).
もつLに 特 異 的 な構 造 を安 定 に して い る もの と考 え られ る.
構造 を 特 徴 づ け る重 要 な も の と考 え られ る.Mで
は シ ッ フ 塩 基 の プ ロ ト ン が な く な る と と も に,水
Phe219の
は異
ッ フ塩 基 か ら1nmほ
囲 ま れ た 領 域 に で き た 空 洞 に2
蛋 白 質 の 構 造 形 成 に お い て は 水 素 結 合 とい う弱 い 相 互 作
用 が 非 常 に 重 要 な 役 割 を して い る が,こ
の 相 互 作 用 は,む
きあ う2つ の 極 性 基 の あ い だ を プ ロ トン が ゆ き か う こ と に よ
り生 じ る,と
と ら え る こ と も で き る.普
通 の水 素 結 合 で は
片 方 の 極 性 基 に 滞 在 す る 時 間 が 圧 倒 的 に 長 く,プ
動 き を あ ま り気 に す る 必 要 は な い.し
か し,な
ロ トンの
か に は両 方
の 極 性 基 の あ い だ を プ ロ ト ンが 激 し く ゆ き か う場 合 もあ り,
あ る い は,ど
の 極 性 基 に も 強 く束 縛 さ れ る こ と な く プ ロ ト
ンが か な り 自 由 に 動 き 回 っ て い る 場 合 も あ る.
BRとMの
フ ー リ エ 変 換 赤 外 差 ス ペ ク トル に は,Mで
え る2400∼1800cm-1に
測 さ れ,こ
わ た る 幅 広 く弱 い 振 動 バ ン ドが 観
れ は プ ロ ト ン放 出 基 に よ る も の と 同 定 さ れ て い
る4,5,21).こ の バ ン ドは,プ
(H502+)あ
た5).他
消
ロ ト ン化 し た 水 分 子 の2量
る い は3量 体(H703+)22)に
方,Mの
結 晶 構造 解 析(図6)か
ロ ト ン化 す る と,レ
変 化 でGヘ
よ る も の と提 唱 さ れ
ら は,Asp85が
あ る い は,脱
の さ きに あ る
相 互 作 用 が 乱 さ れ て,プ
さ れ る こ とが 示 さ れ て い る20).ま
ペ ア構 造 が,プ
ロ ト ンが 放 出
た,Glu194とGlu204の
ロ ト ン放 出 基 が プ ロ ト ン化 す るpH3以
プ ロ ト ン化 す るpH1O以
さ れ て い る23).こ
プ
チ ナ ー ル と そ れ に つ な が っ たLys216の
リ ッ ク ス が 細 胞 外 側 に 動 き,そ
Glu204とGlu194の
体
下,
上 で 壊 れ る こ とが 示
れ ら の 実 験 結 果 を あ わ せ て 考 え る と,上
述 の 幅 広 い 振 動 バ ン ドは,Glu194,Glu204にH502+や
H703+な
ど の 吸 収 バ ン ドが 連 な っ て 生 じ た 連 続 体 バ ン ド
(continuum 図5
室温 での光 サイクル の各 中間状態 におけるフー リエ変換 赤
外差 スペ ク トルでの水分 子の変化 を示 す振動数 領域
1318
線 はH2180中
蛋白質 核酸 酵素
で 得 た ス ペ ク トル.
Vol.52 No.11 す な わ ち,Glu194とGlu204の
あ る と 考 え る の が 妥 当 で あ ろ う.
ペ ア 構 造 は,プ
ロ トン 放 出
基 内 を 動 き 回 っ て い る プ ロ トン(非 局 在 化 し た プ ロ ト ン)に
時 定 数 が,(a)0.14ms,(b)0.13ms,(c)0.54ms,(d)1.6ms,(e)5ms,
実 線 はH216O中,点
band)24)で
(2007)
よ り安 定 化 さ れ る と解 釈 す る の で あ る.
R e v i
e
レチナールか らプロ トン放 出基 にいたる
領域でのBRとMの
構造 比較
図6
数 字 は 水 分 子.
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[PDBID:1iw6,1iw9]
プロ トンの逆流 を防 ぐAsp85の
V
高い
pKa
の 生 成 が 早 くな る こ と25,27),ア ル カ リ性 で のBRの
解 析 で は,Arg82がAsp212か
Mに
Asp85の
電 荷 状 態 は,静
電 的 な 相 互 作 用 に よ り プ ロ トン
放 出 基 の 電 荷 状 態 と密 接 に 関 連 して い る.こ
は,一
方 の プ ロ ト ン化 状 態 に 依 存 し た,互
2つ のpKa値
を 示 す25).BRの
部 分 の プ ロ トン 放 出 基
あ っ て プ ロ ト ン化 し て い る.し
が プ ロ ト ン化 さ れ る と,プ
な り,中
い に か け離 れ た
状 態 で 中 性 付 近 でAsp85が
脱 プ ロ ト ン化 し て い る と き に は,大
のpKaは9で
れ らの 解 離 基
性pHで
か し,Asp85
ロ ト ン放 出 基 のpKaは5以
は プ ロ ト ンが 外 に で て 光 サ イ ク ル を つ う じ
て 脱 プ ロ ト ン化 状 態 に 保 た れ る(図2).一
方,BRの
プ ロ トン 放 出 基 が 解 離 す る と,Asp85のpKaは7に
が る.し
か し,実
さ ら に11以
が,Nで
下 と
際 の 光 サ イ ク ル に お い て,Mで
上 に 上 昇 し て い る8).こ
のAsp85の
ト ン輸 送 を 行 な う の に は た ら い て い る.こ
あ る.D212N R82Q二
短 く26),Asp212がMで
低 い た めMの
のAsp85の
はArg82がAsp212か
さ ら に,Asp85近
き な い.図6に
BRで
傍 で の 水 分 子 の 再 配 置 の 影 響 も無 視 で
示 した 結 晶 構 造 解 析 の 結 果 で は,Asp212は
は水 分 子 を介 し てArg82と
な る と,Asp212がArg82と
結 果,2個
相 互 作 用 し て い る.Mに
相 互 作 用 を し な く な る.そ
の 水 分 子 とTrp86を
高 いpKa
の ひ と つ に あ た る もの と 思 わ れ る.
温 で のMで
振 動 バ ン ドの 水 分 子 が28),こ
さ ら に 斬 新 な と ら え 方 と し て,水
の 原 子 が 接 近 し,共
の 寄 与 が あ げ ら れ る29).Asp85と
合 の 場 合 に は,水
のpKaで
の水分子
素 原 子 を は さ みpKaが
有 結 合 的 な 結 合 を生 じ
る 低 障 壁 水 素 結 合(low barrier hydrogen pKaを
プ ロ ト ン化 型
安 定 にす る と考 え る の で あ る.室
互 い に 近 い2つ
の
介 して 最 適 な 形 で の 水 素 結
消 え る3645cm-1の
影響 で
昇が起 こ
る こ と を 示 唆 し て い る.
はpKaは
昇 に寄
れ
ら離 れ て プ ロ ト
ン放 出 基 の ほ う に ひ き寄 せ ら れ,Asp85のpKa上
(O=C-OH)を
重 変 異 蛋 白 質 で は プ ロ ト ン輸 送 は 起
こ る も の の,Asp85のpKaが
上 昇(pKaの
の 電 荷 を も つAsp212の
ら は い ず れ も,Mで
まで 上
与 し て い る 因 子 に つ い て く わ し く分 析 し て み よ う.
まず 考 え ら れ る の は,負
似 た 構 造 を と っ て い る こ と が 観 測 さ れ て い る23).こ
合 を つ く る 自 由 度 が あ た え ら れ,Asp85の
方 向へ の プ ロ
のpKa上
ら離iれて い る な ど,図6の
状態で
シ ッ フ塩 基 が 再 び プ ロ ト ン化 す る と き にAsp85か
ら シ ッ フ 塩 基 へ の プ ロ ト ン の 逆 流 を 防 ぎ,一
結晶構造
bond : LBHB)
水 分 子 の あ い だの 水 素 結
あ る14に
見 合 っ てAsp85が
高い
も つ こ とで こ れ が 生 成 し て い る可 能 性 が 考 え られ る.
寿 命 は きわめ て
プ ロ トンへ の 親 和 性 の
上 昇)に 重 要 な 役 割 を は た し て い る こ とが 示 唆
VI Nの 生成から光サイクルカ院 結するま
でのAsp96
さ れ る.
ま た,Arg82側
る.た
鎖 の 動 きの 重 要 性 を示 す 実 験 デ ー タ も あ
と え ば,Arg82をAla残
リ性 で プ ロ トン放 出 基(pKaは9)を
基 な ど に 変 え た り,ア
ル カ
解 離 さ せ た りす る と,M
Nを 冷却 トラ ップ し80Kで
の水 分 子 の 振 動 バ ン ドは,Lの
ドを示 す30).ま た,Nの
の 光 反応 を利 用 して得 たNで
そ れ とよ く似 た 幅 広 い バ ン
シ ッフ塩 基 がLと 同 じよ う な水 素
蛋白質 核酸 酵素
Vol.52 No.11 (2007)
1319
w
結 合 を 示 す こ と か ら12),Lと
同 じよ うな水 分 子 の ク ラス タ
プ ロ ト ン化 さ れ る と い う 反 応 経 路 を と
る 可 能 性 も残 さ れ て い る.な
(図2).
異 蛋 白 質 で は,Cl3=C14結
Asp96が
Nで
解 離 し て い な い 状 態 と 同 じD96N変
は,ア
て31),そ
のpKaは8.2と
方,野
観 測 され る33卸.こ
生型
の 電荷 との静 電 相 互作 用 に よる もの と
の 静 電 相 互 作 用 は,シ
へ の プ ロ トン の 逆 流 を 防 ぐ(Nの
の ま ま蛋 白 質 部 分 が
よ う に な っ た 状 態 が 見 い だ さ れ て い る38).
細 胞 外 側 が 弱 酸 性(pH4以
状 態 か らMに
基(pKaは5)か
下)に
は 戻 れ な い)
な る と,プ
成
時 で は な く反 応 サ イ ク ル の 最 後 の 段 階 で 起 こ る.こ
段 階 で のAsp85のpKaの
き な い の で,プ
の 条件
大 幅 な上 昇 が 期 待 で
ロ ト ン 輸 送 が 保 障 さ れ る に は,LとMと
熱 平 衡 状 態 か ら一 気 にNに
ト ン化 さ れ0に
移 行 し,た
進 行 す る,と
の
だ ち にAsp96が
プロ
上),Nで
大 幅 に 下 が る35)(7以
を解 き 明 か す こ とが,プ
ト と な る.Nで
は異 常
下)の
はなぜ か
ロ ト ン輸 送 の 理 解 に 重 要 な ポ イ ン
シ ッ フ塩 基 と の あ い だ に か け わ た さ れ て い る
水 分 子 の 連 鎖30,36)が 関 与 し て い る可 能 性 が あ る.あ
のThr46と
る い は,
の あ い だ の低 障 壁 水 素 結 合 に よる と考 え
る こ と も で き る.こ
Asp96のpKaが7く
の 場 合,わ
及 ぶAsp96か
らNへ の 転 移 時 の1nmに
ら シ ッフ塩 基 へ の プ ロ トン移 動 で あ る(図1).
分 子 の 連 鎖 を 介 して 行 な わ れ る と い う
Grotthus機 構39)を もと に した機 構 が考 え られ てい る.こ れ
結 晶構造 で シ ッフ塩 基 か らAsp96の
い だ に も見 い だ さ れ て い る(図3).Nで
ず か な構 造 変 化 だ け で
も,こ のLの 水 分
子 ク ラス ター に よ く似 た フ ー リエ 変 換 赤 外 ス ペ ク トルの シ
グ ナ ルが と ら え られ てい るの で,Nに
もAsp96か
塩 基 にい た る水 分 子 の 連 鎖 が あ る と思 わ れ る.こ の よ う な
水 分 子 の 連 鎖 はV49A変
異 蛋 白 質 のNの 結 晶構 造 で み られ
るが36),シ ッフ塩 基 の そ ば の水 分 子 は,Va149がAla残
のLでLeu93の
VII Oの 生成 とレチナールの再異性化
野 生 型 蛋 白質 のNで はVal49の
側 鎖 が 回 転 して水 分 子 を入
れ る場 所 が で きる の で は な い か と思 わ れ る.Nに
トル測 定 に よって示 されて い る19).野 生 型 蛋 白質 のNの 結
晶 構 造 解 析 が 待 た れ る.
シ ッフ塩 基 か らAsp85に
プ ロ トンが 送 られ るLか らMへ
ロ トン を与 え るほ うの シ ッフ塩 基 のN-H
結 合 は受 け取 るほ うのAsp85の
ロ ト ン輸 送 サ イ ク ル の 後 半,
再 プ ロ ト ン化 に よ り シ ッ フ 塩 基 と
の 相 互 作 用 が 弱 ま っ た 状 態 で あ るOで
で のAsp96のpKaは
比 較 的 高 い(7以
下)の で,中
酸 素 原 子 と は別 の ほ うを む
とつ の考
え として,こ のあ い だの プ ロ トン移 動 に は3つ の可 能 な経 路
が あ り,供 与 体 ・受 容 体 もそ れ ぞ れ時 間 的 にゆ れ て い て,
両 者 が つ なが る瞬 間 に プ ロ トンが移 動 す る,と い う機 構 が
起 こ る.N
性以下で
提 案 されて い る40).
チナ
プ ロ トン輸 送 が 行 なわ れ る の は遷 移 状 態 で あ り,実 験 的
に戻 る .こ
の 異性 化
に は と らえ られ て い ない.現 状 で は,反 応 前 後 の状 態 に つ
ミ リ秒 で 起 こ る の は,Asp85とAsp212と
の
い ての 結 晶構 造 解 析 のデ ー タを もとに した量 子 力 学/分 子 力
は 外 液 か ら容 易 に プ ロ ト ン を受 け 入 れ てOに
ー ル のC13=Cl4結
(熱 的 反 応)が
おいて
Val49-Pro50の 骨 格 が ゆが む こ とが フー リエ変 換 赤 外 ス ペ ク
い て いて,両 者 が連 な っ て い る わ けで は な い.ひ
Asp96と
基
側 鎖 が 回 転 して水 分 子 を入 れ た7)よ うに,
しか しLで は,プ
具 体 的 に は,Asp96の
らシ ッ フ
の過 程 で は,こ の よ うな 長 い 距 離 を移 動 す る必 要 は な い.
ら い ま で 低 下 す る こ と が あ り う る.
レチ ナ ー ル の 再 異 性 化 は,プ
あ
に置 き換 え られ た とき にで きた隙 間 に あ る.野 生 型 蛋 白質
想 定 す る 必 要 が あ る.
こ の よ う に 考 え て み る と,Asp96のpKaがBRで
に 高 く(13以
こ こで 問題 に な るの は,Mか
に 近 い構 造 は,Lの
ロ トン放 出
ら の プ ロ ト ン の 遊 離(図1の(3))は,M生
下 で は,Mの
VIII可能なプロ トン移動機構
こ れ に は,水
ッ フ 塩 基 か らAsp96
しか け の一 部 として は た ら い て い る とみ るこ と もで き る(図2).
BRで
Oの
合 がcis型
寿 命 が 長 いL93M変
の シ ッ フ塩
ロ トン を シ ッ フ塩 基 に移 した の ち の
生 じる,負
考 え ら れ る.こ
求 め ら れ て い る32).一
もNが
基 の 高 いpKaは,プ
Asp96に
異 蛋 白質 の
お,Nの
ル カ リ性 で は シ ッ フ 塩 基 が 脱 プ ロ ト ン化 し て い
蛋 白 質 で はpH1Oで
Database Center for Life Science Online Service
こ っ て か ら)Asp96が
ー が シ ッ フ 塩 基 の プ ロ ト ン化 状 態 を 支 え て い る よ う で あ る
合 は も と のtrans型
な り,レ
あ い だ で の プ ロ ト ンの や り と りが 関 与 して い る か らだ と考 え
学(QM/MM)シ
ら れ て い る37).ま
る41).そ の 際,モ デ ル構築 に は か な りの任 意性 が はい っ て
た,こ
の 異 性 化 反 応 はAsp96の
化 状 態 と 関 連 して い て,pH1Oの
はNが
がBRに
1320
長 寿 命 で 存 在 しOが
プ ロ トン
よ う な ア ル カ リ性 領 域 で
検 出 で き な い.し
か し,す
べて
近 い 状 態 に 戻 っ て か ら(レ チ ナ ー ル の 再 異 性 化 が 起
蛋白質 核酸 酵素
Vol.52 No.11 (2007)
ミュ レー シ ョンに よる議 論 が行 なわ れて い
くる ので,実 験 に よる ブ レイ クス ル ーが 必 要 で あ る.
R
v
i
e
13) Yamazaki, Y. et al.: Biochemistry, 34, 7088-7093 (1995)
お わ りに
使 え る もの をす べ て使 うのが 生 物 の した た か さで,バ
ク
テ リオ ロ ドプ シ ンで は水 分 子 の よ う に極 性 を もつ 小 さ な動
く分 子 を補 因 子 と して機 能 を い と なん で い る.各 個 の 蛋 白
14) Yamazaki, Y. et al.: Biochemistry, 35, 4063-4068 (1996)
15) Maeda, A. et al.: Biochemistry, 42, 14122-14129(2003)
16) Nishikawa, T. et al.:J. Mot. Biol.,352, 319-328 (2005)
17) Maeda, A. et al.: Biochemistry, 42, 2535-2541 (2003)
18) Maeda, A. et al.:Biochemistry, 33, 1713-1717(1994)
質 の い と な む機 能 は,お の お の に特 異 な物 理 的機 構 ・化 学
19) Yamazaki, Y. et al.: Biochemistry, 37, 1559-1564 (1998)
的 機 構 の組 合 せ で で きて い るの で,あ る蛋 白 質 で の成 果 か
20) Takeda, K. et al.:J. Mot Biol.,341, 1023-1037 (2004)
らた だ ち に一 般 則 をみ つ け る に は,も う一 段,掘
り下 げ る
21) Rammelsberg, R. et al.: Appt Spectrosc., 51, 558-562 (1997)
こ との で き る研 究 方 法 が必 要 で あ る.バ ク テ リオ ロ ドプ シ
22) Headrich, J. M. et al.: Science, 308, 1765-1769 (2005)
23) Okumura, H. et al.:J. Mot Biol.,351, 481-495 (2005)
ンは扱 いや す く,よ くデザ イ ンされ たメ カニ ズ ム を内蔵 して
24) Zundel, G.:Adv. Chem. Phys., 111, 1-217 (2000)
い て,新
25) Balashov, S. P. et al.: Biochemistry, 32, 10331-10343(1993)
しい ア イ デ ア,プ ロの技 術 を適 用 す る に はす ぐれ
た材 料 で あ り,深
Database Center for Life Science Online Service
e
く掘 り下 げた研 究 を行 な う こ とで蛋 白 質
26) Brown, L. S. et al.: Biochemistry, 34, 12903-12911(1995)
の い とな み に関 す る最 先 端 の情 報 を提 供 す る こ とが 可 能 だ
27) Balashov, S. P. et al.: Biophys. J., 60, 475-490 (1991)
28) Maeda, A. et al.: Biochemistry, 39, 10154-10162 (2000)
と思 わ れ る.隠 さ れ た問 題 はむず か しい が,生 物 の神 秘 の
29) Cleland, W. W., Kreevoy, M. M.: Science, 264, 1887-1890 (1994)
深 い ところ にチ ャ レンジす る研 究材 料 としてのバ クテ リオロ
30) Maeda, A. et al.: Biochemistry, 44, 5960-5968 (2005)
ドプ シ ンの 価 値 は,ま す ます あが って い る と思 って い る.
31) Sasaki, J. et al.:J. Biol. Chem., 267, 20782-20786(1992)
32) Brown, L. S., Lanyi, J. K.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1731-1734
本 稿 の 執 筆 を勧 め て い た だ い た津 田 基 之 教 授 に 感 謝 し ま す.本
べ た 研 究 の 一 部 は,T.G.Ebrey教
授,R
.B.Gennis教
す る米 国Illinois大 学Urbana-Champaign校
よ る もの で す.ま
た,反
稿 で述
授 を は じめ と
の グ ル ー プ の サ ポ ー トに
応 中 間 体 の構 造 解 析 お よ び 赤 外 分 光 測 定 に尽
力 し て くれ た 多 くの 大 学 院 生 に 感 謝 し ま す.
(1996)
33) Kouyama, T. et al.: Biochemistry, 27, 5855-5863 (1988)
34) Pfefferle, J.-M. et al.: Biochemistry, 30, 6548-6556 (1991)
35) Zscherp, C. et al.:Proc. Natt Acad. Sci. USA,96, 5498-5503(1999)
36) Schobert, B. et al.: J. Mot Biol.,330, 553-570 (2003)
37) Dioumaev, A. K. et al.: Biochemistry, 38, 10070-10078 (1999)
38) Kandori, H. et al.:Biochemistry, 36, 5134-5141 (1997)
文
献
1) Spudich, J. L. et al.: Annu. Rev. Dev. Biol., 16, 363-392 (2000)
2) Zhang, F. et al.: Nature, 446, 633-639 (2007)
39) Marx, D.: Chem. Phys. Chem., 7, 1848-1870(2006)
40) Bondar, A.-N. et al.:J. Am. Chem. Soc., 126, 14668-14677(2004)
41) Lee, Y.-L.,Krauss, M.: J. Am. Chem. Soc., 126, 2225-2230 (2004)
3)
Oesterhelt, D., Stockenius, W.: Nature New Biol., 233, 149-152
4)
(1971)
Garczarek, F. et al.: Proc. Natt Acad. Sci. USA, 102, 3633-3638
(2005)
前 田 章 夫
5)
6)
Garczarek, F., Gerwert, K.: Nature, 439, 109-112 (2006)
Matsui, Y. et al.:J. Mot Biol.,324, 469-481 (2002)
略 歴:1961年
7)
Kouyama, T. et al.:J. Mot Biol.,335, 531-546 (2004)
8)
Braiman, M. S. et al.: Biophys. J., 70, 939-947 (1996)
9) Chizhov, I. et al.: Biophys. J., 71, 2329-2345 (1996)
10) Rothschild, K. J. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun ., 103,
483-489 (1981)
11) Maeda, A. et al.: Biochemistry, 31, 462-467 (1992)
名 古 屋 大 学 大 学 院 理 学 研 究 科 修 了,東
学 部 助 手,京
都 大 学 理 学 部 助 教 授 を 経 て,1993年
学 部 教 授,1997年
京 大学 理
京都 大学 理
米 国Illinois大 学Urbana-Champaign校
訪
問 教 授.
神 山
勉
略 歴:1979年
名 古 屋 大 学 理 学 研 究 科 博 士 課 程 満 了,米
California大 学San
を経 て,1984年
Francisco校
国
での ポ ス ドク トラ ル フ ェ ロ ー な ど
理 化 学 研 究 所 研 究 員,1995年
名古 屋大 学大 学
院理学研 究科 教 授.
12) Morgan, J. E. et al.:Biochemistry, 46, 2787-2796 (2007)
蛋 白質 核酸 酵素
Vol.52 No.11 (2007)
1321
w