ストレプトゾトシン糖尿病ラットの腎糸球体基底膜における 糖

(
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奈医誌. (
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2，407~424 ，平 3
ストレプトゾトシン糖尿病ラットの腎糸球体基底膜における
糖蛋白組成の分析:レクチンによる解析
奈良県立医科大学第 1内科学教室
真井久夫
ANALYSISOFGLYCOPROTEINSINTHEGLOMERULARBASEMENT
MEMBRANEOFSTREPTOZOTOCINDIABETICRATS:
USEOFLECTINSFORDETECTIONOF
ELECTROPHORETICALLYSEPARATEDGLYCOPROTEINS
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緒
宅冨~
日
尿細管上皮細胞の空胞変性および乳頭壊死などが報告さ
れており，その初期病変として糸球体硬化に先行する糸
糖尿病性腎症は，網膜症とともに糖尿病性細小血管病
球体基底膜 (GBM)肥厚が指摘されてきた.しかも腎糸球
変C
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)に起因する障害として知
体以外の網膜，皮膚，筋肉など全身の諸臓器における毛
られており，糖尿病患者の予後を左右する重要な合併症
細血管も基底膜肥厚を示すことから，基底膜肥厚は糖尿
である.その腎病変としては，糸球体硬化，細動脈硬化，
病性細小血管病変の初期変化と考えられている.
(
4
0
8
)
真 井 久 夫
Krakower& Greenspon'
)
による GBM精製の成功以
チニン，総蛋白，血清アルブミン，総コレステローノレお
降，各種の GBMが生化学的に分析されており，実験糖
よびトリグリセライドを生化学自動分析器 (TBA60S，
尿病動物およびヒト糖尿病の GBMについてもその組成
東芝社製〉で測定した.尿検体は 2
4時間蓄尿，血液検体
が検討されてきた.ヒト糖尿病性腎症について， Lazarow
は随時に採血したものを用いた.
& S
p
e
i
d
ej2)は，
ヒト糖尿病性糸球体硬化症における
GBMのアミノ酸および糖組成が健常人と差を示さない
ことから， GBM肥厚の発生機序を正常構成成分の絶対
e
i
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g
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r&S
p
i
r
o3)
的増加によると最初に報告した.B
3
. GBMの精製と可溶化
(
1
) GBMの精製
STZ糖尿病ラットおよび対照ラットは，それぞれ 3カ
月および 6カ月後に 1
0匹ずつ屠殺した.腹部大動脈にカ
は，ヒト糖尿病性腎症ではハイドロキシリジン，グノレコ
テーテルを挿入して血液を採取し，生理食塩水で腎を潅
ースおよびガラクトース濃度の上昇が認められたという.
流したのちに両腎を摘出した.摘出した腎から腎皮質を
K
e
f
a
l
i
d
巴S4)は，シスチンとシアノレ酸の構成比率に低下を
分離して約 1m m角に細切したのち， S
p
i
r
oの方法 11)に
認めたが，グノレコースとガラクトース濃度には変化がな
準じ s
i
e
v
i
n
g methodで腎糸球体を単離した
かったと報告している.同様に，実験糖尿病ラットの
methodに使用したふるい(飯田製作所社製〉は，投与 3
GBMも報告によって大きく異なっている 5)-8). つまり，
カ月後 (
2
0週齢〉のラットには 6
0，1
0
0および 2
0
0メツシ
糖尿病性糸球体硬化症にみられる GBM肥厚の生化学的
ュ
， 6カ月後 (
3
2週齢〉のラットには 6
0，8
3および 1
6
6メ
s
i
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i
n
g
組成変化については，まだ統ーした見解が得られていな
ッシュのものである. 2
0
0あるいは 1
6
6メッシュのふる
いといえる.
い上に残った糸球体を生理食塩水で、十分に洗浄した後，
レクチンは，特定の糖鎖構造に対して特異的に結合す
1
.0MNaClを滴下してシャーレ上に集めた.つぎに位相
る蛋白質である.現在までに植物，動物および微生物か
差顕微鏡で糸球体以外の混在物がないことを確認してか
ら多種類のものが単離されており，それらの糖結合特異
ModelUS-50，出力 50W
，
ら，超音波ホモジナイザー (
性が細胞分化や癌化に伴う細胞表面複合糖質の変化の解
0分間実施して
日本精機製作所製〉による超音波処理を 1
析および細胞機能の検索などに広く利用されている 9)10).
GBMを精製した.再び位相差顕微鏡で基底膜以外の細
そこで今回著者は，ストレプトゾトシン (STZ)糖尿病
胞成分が完全に除去されたのを確認してから，得られた
ラットを作製して GBMを精製し，その糖蛋白組成をレ
GBMを蒸留水で洗浄したのち，凍結乾燥して保存した
グチン染色による電気泳動法で解析することにより糖尿
(
F
i
g
. 1).
病性腎性にみられる GBM肥厚の成因を検討した.
法
方
なお，摘出した腎の一部は， 1
0%ホノレマリンで固定
後，パラフィン包埋後に 4μmに薄切し， P
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o
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i
ca
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i
d
S
c
h
i
f
f
(
P
A
S
)染色を行なった圃また摘出腎の残る一部と
1
， STZ糖尿病ラットの作製
精製した GBMの一部は， 2
.
5%グルターノレアルデヒド
2時間絶食させておいた 8週齢
糖尿病ラットは，予め 1
と 1%四酸化オスミウムで固定後，エポン包埋して超薄
20-250g)の Wistar系雄ラットに，全量で 65mg
〔体重 2
切片を作成し，酢酸ウラニウムとクエン酸鉛による二重
/kgになるよう 5mM"エン酸緩衝液 (
p
H
4
.
2
)
0
.
5
m
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こ
染色後に透過型電子顕微鏡(JEM1200EX，日本電子製〉
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o
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i
n
，和光純薬工業〉を頚静脈
溶解した STZC
で観察した.さらに精製した GBMの一部はイオンスパ
内に単回注入して作製した.STZ注入ラット中， 2
4時間
ッタで金をコーティングした後，走査型電子顕微鏡 CS
後の血糖値が 3
50mg/dl以上を示したラットを選んで以
8
0
0， 日立製作所製〉で観察した.
.
5
m
lの Fエン酸緩衝液のみ
下の実験に供し，対照には 0
istar系雄ラットを用い
を頚静脈内注入した同週齢の W
(
2
) GBMの可溶化
STZ投与群および対照群ラットの GBMに，蛋白分解
た. STZ投与群および対照群ラットはオリエンタノレ M F
酵素阻害薬 C25mMEDTA
，10mMN エチノレマレイミド，
固形飼料(オリエンタノレ酵母工業社製〉と水道水を自由に
1mMベンズアミジン塩酸塩， 1mMフッ化フェニノレメチ
尿素， 50mM トリス塩酸緩
ノレスノレフォエノレ〉を含む 8 M
摂取させた.
2
. 検査項目
衝液 C
p
H
8
.
6
)を 1mlづっ加え，
4'
cで 2
4時間混和して
2週毎に体重，尿量，血糖，尿糖および尿蛋白を測定
可溶化させた.つぎにその懸濁液を 1
8，
000rpmで 1
5分
した.血糖および尿糖はグノレコースオキシダーゼ法，尿
遠心後，上清を採取して GBM溶解液とした. STZ投与
P
i
e
r
c
eChemical社製〉を
蛋白は BCA蛋白定量用試薬 C
群および対照群から得られた GBM溶解液を蛋白濃度が
1カ月毎に BUN，血清 P レア
1mg/mlになるように 8 M尿素， 50mMトリス塩酸緩
用いて測定した.さらに
ストレプトゾトシン糖尿病ラットの腎糸球体基底膜における糖蛋白組成の分析.レクチンによる解析
Ratr
巴n
a
lc
o
r
t
巴X
衝液 (
p
H
8
.
6
)を加えて調製し，以後の実験に供した.
↓
4 糖蛋白成分の分析
F
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g
h6
0and1
0
0(
o
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)meshs
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(
1
) SDS ポリアクリノレアミドゲノレ電気泳動 (sodium
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(
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)
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SDS-PAGE)
蛋白濃度を 1mg/mlに調製した GBM溶解液は
↓
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u
g
h2
0
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r1
6
6
)meshs
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v
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8
↓
M尿素， 1% SDS，1% 2ーメノレカプトエタノーノレを含む
↓
↓
u
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f
i
l
t
e
r
e
d
O.lMリン酸緩衝液 (
p
H
7
.
2
)を等量加え， 1
0
0
'
Cで 3分加
熱して泳動用試料に用いた. SDS-PAGEは，支持体に
f
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l
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u
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0
0
r
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mf
o
r5min
SDS ポリアグリルアミドゲノレプレート 00%均一ゲノレ，
厚さ 1m m
，第一化学社製)，泳動用緩衝液に 0
.
1%
Col
1e
c
ti
n1
.OMNa
C
l
↓
.
1
9
2M グリシン含有 5mM トリス塩酸緩衝液
SDS， 0
S
o
n
i
c
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ef
o
r1
0
m
i
n
.
(
卜
ト
一ω t
(pH 8.4)を用いて，各ウエノレあたり 7
μ
lの試料を SDSー
2
0
ポリアクリノレアミドゲノレに添加し，室温で 60mAを 1
Mω
m
吋叫叩一仕
日
i
f
抑
凶
附
凶山岬
叫リ3
…
分通電して実施した.なお分子量マーカーは分子量
1
7，
0
0
0，2
7，
0
0
0，3
9，
0
0
0，5
0，
0
0
0，7
5，
0
0
0および 1
3
0，
0
0
0
↓
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の 6種の Pr
巴s
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巴dSDS-PAGEstandards(Bio-Rad
呂
↓
社製〉を用いた.
Washf
o
r2t
i
m
e
sw
i
t
h1
.
0
MNaCl
Washf
o
r3t
i
m
e
sw
i
t
hH20
(
2
)
糖蛋白のニトロセノレロース (NC)膜への転写 (
W
e
s
t
.
↓
巴r
nb
l
o
t
t
i
n
g
)
GBM
・
1
.Methodo
fp
r
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i
o
no
ft
h
eGBM.
F
i
g
Towbine
ta.
l12)の方法に準じて SDS-PAGE後のゲ
.
45μm，Advantec社製〕に密着させ，
ノ
レ
を NC膜〔膜孔 0
， Atto社製〕を
トランスプロッティング装置 (AE3280型
巴1. L巴c
t
i
n
su
s
巴df
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dg
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s
用い， 4'
c，35Vで 180分通電し，羽T
e
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nb
l
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n
gを
実施した.転写用緩衝液には 0
.
1
9
2M グリシン， 2
0%メ
p
H
8
.
3
)を用い
タノーノレ含有 25mM トリス塩酸緩衝液 (
た.
(
3
) レクチン染色
NC膜の染色に使用した 4種類のレクチンは，小麦座
L
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WGA G1
cNAcβ1→4GlcNAc
ConA αD-Man，α-D-Glc
RCA.120β.D.Gal
PHAE，
GaINAc
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巴
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Mannose，
GlcNAc:N.ac
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G
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l:G
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l
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c
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o
s
e
悶
芽 ・ レ ク チ ン (WGA)， タ チ ナ タ マ メ ・ レ ク チ ン
(ConA)，ヒママメ・レグチン (RCA-120)およびアカイン
，)のベノレオキシターゼ標識
ゲンマメ・レクチン (PHA-E
レタチン(豊年製油社製〉である.各レクチンの特徴を
5分ベノレオキシダーゼ反応を実施後，蒸留水で洗浄して
Table 1に示す.各レグチンは予めそれぞれの濃度が
反応を停止させた.
5μg/mlとなるように， 1mMCaC12，1mMMgC12，0
.
9%
染色した糖蛋白の分子量および濃度分布は，二波長グ
.
4
)で希釈し，
NaCl含有 50mM トリス塩酸緩衝液 (pH7
ロマトスキャナー (ModelCS-920，島津製作所製〉を用
以下の手順で NC膜を染色した.
.
0
4m mの走査で測定し
いて波長 370nm，スリット幅 0
West
巴r
nb
l
o
t
t
i
n
g終了後， SDSを除去するために NC
膜を 0.9%NaCl，0.05%Tween2
0含有 10mM トリス塩
た.
5
. 糖蛋白バンドのアミノ酸分析
酸緩衝液 (pH7
.
4
)
で l回 1
0分
， 3回振渥洗浄した.つぎ
(
1
) SDS-PAGE
0分反応後，
にレクチン溶液で NC膜を覆い，室温で 3
支持体には 1ウェノレの SDS ポリアクリノレアミドゲノレ
0.05% Twe
巴n2
0含有 10mMリγ 酸緩衝液 (pH7
.
4
)
で
1回 5分
6回振渥洗浄した.ついで、基質に DAB溶液
プレート 00%均一ゲル，厚さ 1mm)，泳動用緩衝液に
は 0.1%SDS含有 O.lMリン酸緩衝液 (pH7
.
2
)を用い，
(0.5mg/m13，
3
'一diaminob巴z
i
d
i
n
et
e
t
r
a
h
y
d
r
o
c
h
l
o
r
i
d
，
巴
泳動用試料には STZ投与群〔投与 6カ月後〉の GBM溶
0
.
0
0
5% H202含有リン酸緩衝液，pH7
.
2
)を用いて室温，
0
0
μ
lに 8 M尿素， 1%SDS，1% 2ーメノレカプトエ
解液 1
(
4
1
0
)
真 井 久 夫
f
o
rl
e
c
t
i
ns
t
a
i
n
i
n
g
タノーノレを含む O.lMリン酸緩衝液 (pH7
.
2
)を等量加え
③
0
0
'
C， 3分間加熱処理をして作製したものを用い
て， 1
た. SDS-PAGEは泳動用試料の全量をウェノレに添加し，
PVDFm
e
m
b
r
a
n
e
2
0分通電して実施した.
室温で 60mAを 1
(
2
) 糖蛋白の PVDF(polyvinylidened
i
f
l
u
o
r
i
d
e
)膜へ
.
.
.
.
.
一
一
一6
0
k
のW
esternb
l
o
t
t
i
n
g
Western b
l
o
t
t
i
n
gは Matsudaira13)の方法に準じて，
SDS-PAGE終了後のゲノレを PVDF膜(膜孔 0
.
45μm
，
A
p
p
l
i
e
dB
i
o
s
y
s
t
e
m社製〕に密着させ， 4o
C，3
5Vで 1
8
0
分通電して実施した.なお転写用緩衝液には 1
0%メタノ
ーノレ含有 10mM CAPS緩衝液 C
3-cydohexylamino-1
propan
巴s
u
l
f
o
n
i
ca
c
i
d，pH1
1
)を用いた.
(
3
) WGAレクチン染色
⑤
f
o
ra
m
i
n
oa
c
i
da
n
a
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s
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F
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g
.2
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Threep
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巴u
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g(①，②，③)， and
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e
i
n
s(④，⑤〉
W 巴s
t
e
r
nb
l
o
t
t
i
n
g後の PVDF膜は Fig.2のように 5
分割した. 2片は蒸留水で 6
0分洗浄後
2枚の漉紙〔ワ
ットマン 3MM)にはさんで乾燥させ，次項で示すアミノ
動相には酢酸ナトリウム・トリエチルアミン緩衝液 (pH
6
.4)およびアセトニトリノレ・水溶液 (pH7
.4)を用いた.
酸分析に供した.残りの 3片は B
a
r
t
l
e
sら14)の方法に準
成 績
じて以下の手順でレタチン染色した.
PVDF膜 を 2% PVP-3
6
0(
p
o
l
y
v
i
n
y
l
p
y
r
r
o
l
i
d
o
n
e.
2
)に
3
6
0，和光純薬社製〕含有 O.lMリγ 酸緩衝液 (pH7
4
5分浸したのち， WGA溶液で覆い，室温で 3
0分反応さ
せた.つぎに PVDF膜 を 0
.1% T
r
i
t
o
n
X-100含 有
25mM トリス塩酸緩衝液 (pH7
.
4
)
で 1回 1
0分
3回洗
浄後，室温で 5分 DAB溶液中に浸して発色させ，蒸留水
で反応を停止させた.
1
. 糖尿病ラット
STZ投与群における死亡率は 1カ月後 4
0例中 5例
(
1
2
.
5%
)
， 3カ月後 4
0例中 7例 (
1
7
.
5%
)
， 6カ月後 4
0
例中 8例 (
2
0%)であった. STZ糖尿病ラットと対照群
able2に
の体重，腎重量，尿および血液所見の推移を T
示す.
(
1
) 体重
(
4
) アミノ酸分析
STZ投与群の体重は 3カ月後 2
8
0士5
0
.
3
g， 6カ月後
非蛍光プレラベノレ法のフェニノレチオカノレバモイノレアミ
2
6
7土3
9
.
8
gであり，対照群のそれぞれ 5
2
1土7
6
.
5
g，5
8
2士
ノ酸法 (PTC アミノ酸法〉により， PVDF膜に転写した
7
2
.
0
gに比して有意に軽かった.つまり， STZ投与群は対
糖蛋白のアミノ酸を分析した.プレラベノレ装置には
照群に比して体重増加が有意に抑制されていたことにな
PICO-TAGワークステイシヨン (Waters社製)，高速液
る.
体クロマトグラフィー (HPLC)には PICO-TAG分析装
巴r
s社製〉を用いた.
置 (Wat
(
2
) 腎重量
屠殺時における STZ投与群の腎重量は 3カ月後 4
.
0
F
i
g
.2i
こ示すようにレクチン染色を施行した PVDF
膜の 3片 (
F
i
g
.
2の①，②，③〕とアミノ酸分析用に乾燥
させた 2片 (
F
i
g
.
2の④，⑤〉を復元し，後者の 2片から
土0
.
2
6
g，6カ月後 4.
4
土0
.
3
2
gであり，対照群のそれぞれ
3
.
8i
:0
.
2
3
g，
4
.
0i
:0
.
3
0
gに比して有意に増加していた.
(
3
) 尿所見
目的とするバンドを注意深く切り出した.切り出した
STZ投与群の尿量は投与 3カ月後 1
53
i
:2
1
.4ml
/
日
，
PVDF膜を加水分解用試験管に入れて 1%フェノーノレ
6カ月後 1
7
8i
:3
6
.
5ml/日であり，対照群では実験期聞
1
0oC，2
4時間，加水
を含む 6KHClを加え，減圧下に 1
0ml/日以下であったのと比べて有意に増加
を通して 2
.
l
NHClを含む 2
0%メタノール溶液
分解した.つぎに O
g
/日
していた. STZ投与群の尿糖も，全期聞を通して 3
でアミノ酸を抽出し， PTC試薬(和光純薬社製〉を加えて
9
/日以下であった対照群に比して有意に
以上であり， 1
PTC誘導体とした後，試料を減圧乾固させた.ついで乾
増加していた.さらに STZ投与群の尿蛋白は投与 3カ
固 さ せ た 試 料 を 波 長 254nm
，温度 4
0Cの 条 件 下 に
6.
5i
:3
.2mg/日
月後 1
HPLCを実施し，糖蛋白のアミノ酸組成を決定した.な
0
.
2士1.9mg/日
， 1
1
.
3土3.1mg
り，対照群がそれぞれ 1
お HPLCのカラムには PICO-TAGアミノ酸分析用カ
/日であったのと比べて有意に増加していた.
0
ラム(カラム長 150mm
，直径 3.9mm
，Wat
巴r
s社製)，移
(
4
) 血液所見
6カ月後 2
3
.
5i
:
6.7mg/日であ
(
4
1
1
)
ストレプトゾトシン糖尿病ラットの腎糸球体基底膜における糖蛋白組成の分析ーレクチンによる解析
Table2
. Laboratorydatai
nnormalandSTZd
i
a
b
e
t
i
cr
a
t
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b
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f
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I
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(n=20)
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0
)
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c
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)
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g
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.
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.
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.
2
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.
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.
2
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.
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叫
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l
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.
5
1
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1
2土l.7 1
Cmg/day) 1
6
.
5土 3
.
2
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.
5土 2
.
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.
2:tl.9 1
.
8
.
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C
g
/
d
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.
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.
0
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.
0
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.
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m
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)
5
.
4
1
6
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6
.
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.
1
9
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.
5土 0
.
2
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.
3
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.
0
7
.
5
2
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5
.
4土 2
4
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.
5士5
.
3
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l
.9
6
8
.
5土 2
1
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.
6
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.
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.
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.
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2
4
.
3土 2
.
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l
.2
士6
.
0
7
5
43土 1
82
目
目
5
7
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.
5
5
.
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.
3
3
.
3土 0
.
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.
3
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3
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.
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.
2
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.
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.
5
*
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.
2
付
日付
村
5
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2
.
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*
*
.
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.
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2
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4
.
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目
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.
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1
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.
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.
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.
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.
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1 2
.
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.
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.
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2
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.
2
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.
4
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2
2
2
5
.
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.
7
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6
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.
4土 1
5
.
3
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6
2
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6
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.
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.
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.
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5
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se
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c
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m
X4
，
5
0
0
対照群における血糖値は全期聞を適して 3
0
0mg/d
l
STZ投与 3カ月後.腎糸球体光顕像は，対照群と比較
4
0匹〉が 2
4時
以下であった.一方， STZ投与群は全例 (
してメサンギウム域がごく軽度に拡大しているにとどま
間後に 3
5
0mg/dl以上 (
4
6
0:
t2
8
.
3mg/dI)の血糖値を示
っており，メサンギウム細胞の増生や GBM肥厚を示さ
していた.以後の血糖値は 3カ月後が 5
7
4土 9
5
.
5mg/dl，
なかった.しかし電顕では， STZ投与群において GBM
6カ月後が 6
2
3士1
0
6mg/dlであり，高値を持続してい
の一部に明らかな肥厚が観察された.
た. STZ投与群の BUNは 3カ月後 3
0
.
8士6.2mg/dl，
STZ投与 6カ月後，光顕像では，対照群とは異なり中
6カ月後 3
2
.
8土 7
.
4
3mg/dlであり，対照群のそれぞれ
等度のメサンギウム拡大と GBM肥厚が認められ，さら
2
43:
t2
.
0
9mg/dl，2
5
.
3:
t22
2mg/dlと比べて有意の高
に血管極を中心とした係蹄壁およびメサンギウム域に硝
目
目
値を示した.一方，血清クレアチニン値は両群問に差が
子様物質の沈着が観察された .STZ投与 6カ月後の電顕
なかった.また血清総蛋白および血清アノレブミン値は，
像では，投与 3カ月後に比して GBM肥厚は顕著になり，
STZ投与群において週齢とともに低下する傾向を示し
その厚さは対照群のおよそ1.4-2.0倍に達していた.ま
た.STZ投与群の総コレステローノレ値は， 3カ月後 6
7
.
3
た，一部の足突起は癒合していた (
F
i
g
.3
，4
)
.
士1
7
.
5mg/d
，l 6カ月後 7
6
.
9土 1
4
.
0mg/dlであり，対照
2
. GBMの精製
1
.2
士6
.
0
7mg/d
，l 4
8
.
6土 5
.
7
9mg/dlに
群のそれぞれ 5
s
i巴v
i
n
gmethodは
， 1
0匹のラットを 1群として屠殺
比して有意に増加していた .STZ投与群のトリグリセラ
し，得られた腎皮質を 4分割して GBMの精製を行なっ
イドも， STZ投与 3カ月後 2
0
1土 3
6
.
2mg/dl， 6カ月後
た.したがって，今回の実験では
1
6
7士3
75mg/dlであり，対照群のそれぞれ 5
4
.3:
t1
8
.2
の両時期に各 1
0匹計 4群の屠殺を行なっているので，
mg/dl，6
9
.
4士1
5
.
3mg/dlに比して有意の高値を示し
s
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6回実施したことになる.しかし，
た.
6回の操作中，不純物の混入を位相差顕微鏡による
この 1
目
(
5
) 腎組織所見
3カ月後と 6カ月後
観察で認められたのはわずか 2回であった.この
2回以
ストレプトゾトシン糖尿病ラットの腎糸球体基底膜における糖蛋白組成の分析:レグチンによる解析
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レグチンによる解析
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精 製 し た GBMの 走 査 電 顕 像 お よ び 透 過 電 顕 像 を
Fig.5と 6に示す.走査電顕像では上皮細胞の剥奪した
単離糸球体が観察されており，透過電顕像では細胞成分
は基底膜上に観察されなかった.
3
. レクチン染色
(
1
)
WGA
GBMの尿素可溶性糖蛋白成分に対する WGA染色で
は，対照群および STZ投与群の両群において多数のノ〈
ンドが検出された.対照群の染色像は 3カ月および 6カ
月の両者聞に差を示さなかった. WGAで濃染さわしたノミ
ンドは，マーカーからの概算では，分子量 6
8，
0
0
0，
1
2
0，
0
0
0，1
5
0，
0
0
0，1
8
0，
0
0
0および 2
2
0，
0
0
0の 5つが主要
なものであった.一方， STZ投与群では上記のパンドは
対照群と差異を示さなかったが，投与 3カ月後には分子
0，
0
0
0に相当するバンド〔矢印〉が出現しており，投与
量6
6カ月後には分子量 6
0，
0
0
0のバンドはさらに濃染され
ていた (
F
i
g
.7
)
. WGA染色のテンシトグラムでは STZ
投与 3カ月および 6カ月の両時期において，対照群には
0，
0
0
0の部位にピ -17が出現して
認められない分子量 6
いた (
F
i
g
.8
)
.
(
2
) ConA
ストレプトゾトシン糖尿病ラットの腎糸球体基底膜における糖蛋白組成の分析.レクチンによる解析
ConA染色においても WGAと同様に多数のバンド
が検出された.対照群および STZ投与群の両群におい
(
4
1
9
)
.
3
3モノレ%の低比率，ハイドロキシリジンは測定感
ンは 0
度以下の微量であった (
Table3
)
.
て分子量 7
0，
0
0
0以上の濃染バンド数は， 3カ月および 6
考 察
カ月ともに差がなかった.分子量 7
0，
0
0
0以下の染色像で
8，
0
0
0に相当する濃染バンドを示し
は，対照群は分子量 6
1 糖尿病性細小血管病変と糖原病性腎症について
た.一方， STZ投与群では， 3カ月および 6カ月の両時
糖尿病性細小血管病変:前述のように，糖尿病性細小
0
0のバンドが優位に濃染されて
期において分子量的， 0
血管病変は従来から網膜の毛細血管癌と糖尿病性糸球体
8，
0
0
0の バ ン ド は 不 明 瞭 に な っ て い た
おり，分子量 6
硬化症が特徴とされてきた.しかし，現在では糖尿病性
(
F
i
g
.
9
)
. またテ、ンシトグラムで寸土，対照群に認められな
細小血管病変が締膜と腎に限らず皮膚，筋肉など全身諸
0，
0
0
0のピークが STZ投与群において新た
い分子量 6
臓器の細小血管にも認められることが判明しており，糖
8，
0
0
0
に出現しており，逆に対照群で認められた分子量 6
尿病性細小血管病変に共通した形態学的変化は毛細血管
のピークは STZ投与群ではノッチを形成するにとどま
における基底膜肥厚であるとされている同同.
F
i
g
.1
0
)
.
っていた (
糖尿病性腎症:これは糖尿病の病態に随伴して出現す
(
3
) RCA-120
る腎障害の総称である. とくに糖尿病性糸球体硬化症は，
F
i
g
.
1
1に RCA-120染色像を示す.対照群では分子量
腎機能低下の原因であり，生命予後を決定する重要な病
5
7，
0
0
0， 6
8，
0
0
0， 1
3
0，
0
0
0， 1
5
0，
0
0
0， 1
8
0，
0
0
0お よ び
変と考えられている.糖尿病性糸球体硬化症は通常，次
2
5
0，
0
0
0の位置に濃染されたバンドが 3カ月および 6カ
の 3型に分類される，メサンギウム域の拡大と基底膜肥
月の両時期に認められた .STZ投与群で観察されたノミン
d
i
f
f
u
s
el
e
s
i
o
n
)，一部のメサン
厚を呈するびまん性病変 (
ドは対照群と同様であり， WGAおよび ConA染色で認
ギウム域が分葉状に拡大して結節を形成する結節性病変
0，
0
0
0のパンドは消失していた.またデ
められた分子量 6
(
n
o
d
u
l
a
rl
e
s
i
o
n
)，輸出入動脈， Bowman襲あるいは糸
シシトグラムでも 3カ月および 6ヵ月の両時期に検出さ
球体係蹄内に硝子様物質の沈着を認める硝子様病変
F
i
g
.1
2
)
れたピークは両群で一致していた (
司
(
4
) PHA-E4
PHA-E
4染色像で確認された対照群および STZ投与
群の両群におけるバンドは，他のレクチン染色でのバン
(
巴
x
u
d
a
t
i
v
巴I
巴s
i
o
n
)である.しかし，糖尿病性糸球体硬化
症の基本となる初期病変は糖尿病性細小血管病変に基づ
く GBM肥厚と考えられており， GBM肥厚は糖尿病性
糸球体硬化症のいずれの病型においても観察される.
ドに比して不明瞭であった.デンシトメトリーで検出さ
糖尿病における GBM肥厚の成因:この問題について
れたピーク高は両群間において 3ヵ月および 6ヵ月とも
検討した従来の報告では， GBMの生化学的組成の変化
差を示さなかった.加えて WGAおよび ConA染色で認
について結論が一致しておらず，さらに発生機序も依然
められた分子量 6
0，
0
0
0のピークも PHA-E
4染色では存
として不明のままである.
F
i
g
.1
3，1
4
)
在しなかった (
以上の 4種類のレクチン染色像力、ら， STZ投与群にお
nAで認識
ける GBMの糖蛋白組成は， WGAおよび Co
そこで木研究では，糖尿病における GBM肥厚の成因
を
， STZ糖尿病ラットと正常対照ラットの GBMにおけ
る糖蛋白組成の相違から検討することにした.
0，
0
0
0の糖蛋白を認めた点で
される糖鎖をもっ分子量 6
2
. STZ糖尿病ラット
対照群と異なったことになる.
実験的糖尿病モデノレの作製-糖尿病ラットの作製には，
なお著者は， SDS-PAGEとレクチン染色を同一条件
勝島 B細胞を選択的に破壊して高血糖状態を惹起するア
で 4回実施しており，いずれの成績も上記と相違のない
ロキサンまたはストレプトゾトシン (STZ)が使用され
ことを確認している.
る17)18) 特に STZは，勝島 B細胞に対する特異性が強い
4
. 糖蛋白のアミノ酸分析
こと，肝および腎に対する毒性がきわめて少ないこと，
STZ投 与 6カ 月 後 の 糖 尿 病 ラ ッ ト か ら 精 製 し た
さらに投与量に比例した高血糖状態を作り出せることか
GBMから， WGAおよび ConA染色で濃染される分子
ら，実験的糖尿病動物の作成に頻用されている.
0，
0
0
0の糖蛋白を抽出してアミノ酸組成を分析した.
量6
5mg/kgの STZを単回
著者は，ラットの頚静脈内に 6
そのグ戸マトグラムを F
i
g
.1
5に示す.アミノ酸組成は，
注入する方法を用いて STZ糖尿病ラットを作製したが，
モノレ%で、検討すると，プロリン (
1
1
.
7
3モノレ%)，グルタミ
STZ投 与 2
4時間後にはラット全例 (
4
0匹〉が高血糖状
ン酸 (
1
1
.
7
1モノレ%)およびグリシン (
1
0
.
2
8モル%)の 3
態を呈しており，死亡例を除き実験終了時点の 6カ月後
者が主要構成成分であった.一方，ハイドロキシプロリ
まで高血糖を持続し得た.また今回の STZ投与ラット
(
4
2
0
)
真 井 久 夫
は，血中コレステロールの増加と著明なトリグリセライ
azarow&
ていないのが現況である.前述したように， L
ドの増加を呈していた. したがって著者は， ラットにつ
S
p
e
i
d
巴j2Iはヒト糖尿病性腎症における GBMのアミノ酸
いては STZの単回静注でヒト糖尿病に類似の病態を示
組成および糖組成が健常人における組成と異ならないと
す糖尿病モデノレの作成が可能と考える.
e
i
s
s
w
e
n
g
e
r& S
p
i
r
o3)は健
最初に報告している.以後， B
STZ糖尿病ラットの糸球体病変:これまでに報告さ
常人に比して糖尿病性腎症ではハイドロキシリジン，グ
れた多数の知見 19)ー21)をまとめてみると， STZ糖尿病ラ
ルコースおよびガラクトース含量の増加が認められたと
ットに共通の糸球体病変は GBM肥厚とメサンギウム内
e
f
a
l
i
d
e
s4)は，シスチンとシアノレ酸含量の減
いう.また K
PAS陽性物質の沈着といえる.さらに糸球体毛細血管内
少を認めたが，グルコースとガラクトース含量には変化
に硝子様物質の沈着が加わるとする報告もみられる叫.
がみられなかったとしている.
木研究におけるラット腎糸球体の電顕像は STZ投与
3カ月後には対照群に認められない GBM肥厚を示して
おり， 6カ月後にはその肥厚が対照群の約1.4-2.0倍に
(
2
) STZ糖尿病ラットにおける GBMの生化学的組
成
アミノ酸組成について， B
e
i
s
s
w
e
n
g
e
r引は，正常ラット
達していた.また STZ投与 6カ月後の光顕像では GBM
に比して STZ糖尿病ラットの GBMではプロリンとア
肥厚とメサンギウム域の拡大が認められ，さらには血管
ノレギユン含量が減少していると報告している.小出的は，
極を中心に係蹄内およびメサンギウム域に硝子様物質の
ハイドロキシプロリン，プロリンおよびグリシン含量の
沈着，すなわち硝子様病変も観察された. これらの病変
減少が認められたが，それ以外のアミノ酸含量がすべて
は先人の報告と一致しており，本法が糖尿病性腎症のモ
tal
.
'
)
は
， STZ糖尿病ラ
増加していたという. Romane
デノレとして有用なことを裏づけている.
ットの GBMで、はノ、イドロキシプロリン/プロリン比が
3
. GBMの精製について
糸球体の単離方法
s
i
e
v
i
n
gmethodは Krakower&
低下をしていたと述べている.
糖組成に関して，小出町は STZ糖尿病ラット GBMで
Greenspon1)によって考案され， S
p
i
r
o叫が発展させたも
は正常ラットに比してグノレコースとガラクトース含量の
のであり，腎皮質をメッシュサイズの異なるふるいを通
e
i
s
s
w
e
n
g
e
r5)はガラクトース含量のみの増加を報
増加， B
i
e
v
i
n
g
過させて単離糸球体を得る手段である.また， s
告している.一方，冠木 7)は，グノレコースおよびガラタト
methodは，メッシュサイズを変更することにより種の
ース含量に変化がみられなかったという.
異なる動物から糸球体を単離することが可能であり，生
つまり， STZ糖尿病ラットの GBMについても，アミ
体材料から単離糸球体を多量に採取する方法として今日
ノ酸および糖組成に関してヒト糖尿病性腎症と同様に一
では一般に用いられている.
定した結論がみられない.このような報告による不一致
しかし，実験動物の発育過程で糸球体を採取する場合
は，種，週齢，糖尿病状態の程度， GBMの分離および抽
には，週齢とともに糸球体が増大することに留意しなけ
出方法の相異に起因するものと思われる.また不一致を
ればならない.著者は本研究において，実験開始 3カ月
生じる最大の要因は，分析試料が微量であることに加え，
2
0週齢〉と 6カ月後 (
3
2週齢〉とでメッシュサイズを
後(
GBMの構成成分を糖蛋白レベルより以下の最小単位で
6回の s
i
e
v
i
n
gで得
変更するように工夫した.その結果 1
あるアミノ駿や単糖まで分解して検討するためであると
られた糸球体上に糸球体以外の混在を認めたのはわずか
推測される.
2固にすぎなかった.
GBMの精製方法:糸球体から GBMを精製する方法
(
3
) 糖尿病性腎症における GBMのコラーゲンおよび
非コラーゲン成分の変化
として水酸化ナトリウム処理と超音波処理の 2法がある
GBMはコラーゲン成分と非コラーゲン成分から構成
が，化学組成の分析には一般に後者が用いられている.
されていることは周知のことであり，その両者はすべて
0分の超音波処理法を用いたが，位相差顕微鏡に
著者は 1
糖蛋白から成る. コラーゲン成分はI
V
型コラーゲン，非
よる観察範闘では細胞成分の除去は完全であり，高純度
コラーゲン成分はラミニン，プロテオグリカン，ファイ
の GBMを得ることができた.
4 糖尿病性腎症における GBMの生化学的組成につ
いて
ブロネグチン，エンタクチンとニドゲンが主要構成成分
である.
1
) コラーゲン成分
(
1
) ヒト糖尿病性腎症における GBMの生化学的組成
1
4
Cあるいは3Hでラベノレしたプロリンあるいはリジ
ヒト糖尿病性腎症における GBMの生化学的組成は報
ンを STZ糖尿病ラットに投与して GBMのハイドロキ
告によって大きく相具しており，統ーした見解が得られ
シプロリンおよびハイドロキシリジンへの摂取率から糖
ストレプトゾトシン糖尿病ラットの腎糸球体基底膜における糖蛋白組成の分析
尿病における I
V型 コ ラ ー ゲ ン の 生 合 成 を 検 討 し た 報
告制
がすでにみられる.これらの報告によると， STZ
25)
レタチンによる解析
(
4
2
1
)
ら，N一結合型糖蛋白と O 結合型糖蛋白の 2種類に分類
される.さらにN結合型糖蛋白は，その結合している糖
V
型コラーゲンの
投与後 6週間以内の糖尿病ラットでは I
鎖の種類から複合 (
c
o
m
p
l
e
x
)型，混成 (
h
y
b
r
i
d
)型および
生合成は充進しているが，長期権病の STZ糖尿病ラッ
高マンノース (
h
i
g
h-mannose)型の 3型に分類されてい
トでは充進がみられなかったという.
る. WGAが認識する糖は，複数の N-アセチルグノレコサ
2
) 非コラーゲン成分
ミン (
GlcNAc)が β(1
.4
) グリコシド結合したいわゆる
tal
.
田
)
は STZ
非コラーゲン成分について， Kanware
キチンオリゴ糖である.また WGAは分岐した GlcNAc
糖尿病ラットの GBMにおけるプロテオグリカン生合成
(
b
i
s
e
c
t
i
n
gGlcNAc)を有する混成型の糖鎖の N-結合型
は低下していたと報告している.また， R
ohrbache
tal
.
2
7
)
糖 蛋 白 に 親 和 性 が 強 く ，N アセチノレノイラミン酸
HS(Engelbeth
は，基底膜成分を産生するマウス E
(NeuNAc)がクラスターを形成している O 結合型糖蛋
Horn，Swarm)肉腫 28)を自然発症糖尿病マウスの筋肉内
自にも親和性を示す叫. ConAは，単糖に対しては a-D
に移植させた実験から， EHS肉腫の産生する基底膜では
マンノース (Man)あるいは a-D グノレコース (
G
l
c
)に親
へパラン硫酸プロテオグリカン含量の減少とラミニン含
和性が強く，糖蛋白については高マンノース型の糖鎖を
量の増加が認められたとしている.
3
) コラーゲンと非コラーゲン成分の糖化(
g
l
y
c
a
t
i
o
n
)
一方，糖尿病ではへそグロビン A，
Cに代表されるよう
有する N 結合型蛋白に親和性が強い，しかし ConAは
b
i
s
e
c
t
i
n
gGlcNAcの存在するもの， 3本側鎖あるいは 4
本側鎖の複合型糖鎖をもっN 一結合型糖蛋白には親和性
を示さない叫.RCA-120は糖鎖の非還元末端に β-D
ーガ
に，種々の蛋白は糖化を受けることが知られている.近
GaI)残基を含む糖蛋白を認識する叫 .PHA
ラクトース (
年
， GBMについてもコラーゲンおよび非コラーゲン成
E
4は，単糖の N-アセチノレガラクトサミン (GalNAc)と
分の糖化が GBM肥厚やアノレブミン尿の出現に関与して
b
i
s
e
c
t
i
n
gGlcNAcの存在する複合型糖鎖を有する N 結
いるとの報告 29)-31)も散見される.
合型糖蛋白に親和性を示す日).
以上の事柄から，糖尿病における GBM肥厚の成因に
したがって，本研究において WGAおよび ConAで染
は，既存の基底膜成分の量的変化のみならず，高血糖状
0，
0
0
0の糖蛋白は，糖鎖に GlcNAcと
色された分子量 6
態において修飾された成分の蓄積，すなわち質的変化の
a-D-Glcあるいは a-D-Manを高率に含有しているこ
関与も示唆される.
(
4
) 本研究における STZ糖尿病ラットの GBM糖 蛋
白組成
本研究では，以上の点を踏まえて STZ糖尿病ラット
の GBMを尿素で可溶化したのち，尿素可溶化成分を
SDS-PAGEで糖蛋白として分離し，糖蛋白結合物質で
あるレグチンを用いて糖蛋白レベノレで組成変化を検討し
た.なお GBMの糖蛋白組成をレクチン染色による SDS
PAGEで検討した報告は従来にはみられない.
1
) レクチン染色像
とが示唆された.加えて，混成型， b
i
s
e
c
t
i
n
gGlcNAcが
存在しない複合型および高マンノース型の糖鎖を有する
N-結合型糖蛋白あるいは NeuNAcを多く結合する O
結合型糖蛋白であることが推測される.
つぎにこの分子量 6
0，
0
0
0の糖蛋自のアミノ酸組成に
ついて考察する.
2
) 分子量 6
0，
0
0
0の糖蛋自のアミノ酸組成
I
V型コラーゲンのハイドロキシプロリンおよびノ、ィド
ロキシリジン組成比率はそれぞれ約 1
1モノレ%， 3
.
7モノレ
%である.今回の分子量 6
0，
0
0
0の糖蛋白は，ハイドロキ
レグチン染色での主要バンドは， STZ糖尿病ラットと
シプロリンが 0
.
3
3モノレ%の低比率，ハイドロキシリジン
対照ラット闘でほぼ一致しており，とくに RCA-120お
が検出感度以下の低濃度であった.すなわち，この糖蛋
よび PHA-E
の糖蛋白染色では STZ糖尿病ラットと対
4
白は少なくとも I
V
型コラーゲン分子の変性あるいは分解
照ラットの両者聞に差がなかった.この所見は，別の機
したものの一部ではないことも推測される.また，既知
会に 4回検討したが，一致した結果が得られた.つまり，
の GBM構成成分間
今回の成績は， GBMの精製方法に再現性があることを
著者が分離した糖蛋白と分子量が異なっている.さらに，
は，分子量が 8
0，
0
0
0以上であり，
3
9
)
明らかにしている.なお，今回の実験から判明した唯一
この糖蛋自のアミノ酸組成は既知の GBM構成成分とも
の事項は， WGAお よ び ConAで 染 色 さ れ る 分 子 量
一致
(
4
2
2
)
真 井 久 夫
たものか，あるいは GBMの構成成分以外の糖化された
に公衆衛生学教室森山忠重教授に深謝いたします.さら
物質またはその一部が GBMに捕獲されたもののいずれ
に直接の御指導，御教示を賜りました土肥和紘講師に感
かと考えられる.すなわち，この分子量 6
0，
0
0
0の糖蛋白
謝いたします。また木研究を行なうにあたり多大な御助
は
， GBM糖蛋白組成の質的変化に伴って出現する物質
言を頂いた公衆衛生学教室土肥祥子助教授に感謝いたし
と考えられ， STZ糖尿病ラットにおける GBM肥厚の成
ます.また終始ご協力頂きました第 1内科腎研究班の諸
因に関与しているものと判断してよいようである.
先生方に感謝いたします.
生体における蛋白生合成にはメッセンジャー RNAが
最後に走査電子顕微鏡写真を撮影して頂いた浜松医科
鋳型として介在している.一方，糖鎖は，生合成に対す
大学中央電子顕微鏡室室長村中祥悟博士に感謝いたしま
る鋳型が介在せず，蛋白生合成後，多数の糖転移酵素に
す.
よる基質特異性反応の連係によって生合成される.加え
受ける.つまり，糖蛋白の糖鎖はペプチド部分に比して
献
文
て糖鎖は過酸化物，活性酸素，糖化などによって修飾を
1)区 r
akower，C
.A
. andGreenspon，S
.A
.:L
o
c
a
l
i
目
性状変化を受け易いものと判断される.したがって，本
z
a
t
i
o
no
ft
h
en
e
p
h
r
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t
o
x
i
ca
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t
i
g
e
nw
i
t
h
i
nt
h
ei
s
o
-
研究で確認された分子量 6
0，
0
0
0の糖蛋白が，正常の
l
a
t
e
dr
e
n
a
lg
l
o
m
e
r
u
l
u
s
.A
r
c
h
.P
a
t
h
o.
l5
16
2
9，
GBMにも存在する成分が性状変化を受けた物質で、ある
1
9
51
.
とすれば，蛋白部分よりも糖鎖部分に修飾を受けている
目
の Lazarow， A. and Speidel， E.:The chemical
c
o
m
p
o
s
i
t
i
o
no
ft
h
eg
l
o
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r
u
l
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rbasementmem
可能性が高い
【
結
語
b
r
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eandi
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n
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i
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cc
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c
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o
n
s i
nSmal
1b
l
o
o
dv巴s
s
e
l
目
ストレプトゾトシン (
STZ)糖尿病ラットモデノレを
i
n
v
o
l
v
巴m
enti
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i
a
b
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t
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sm
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C
S
i
p
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r
s
t
e
i
n，M.
W
i
s
t
a
r系ラットで作製し，その GBMの糖蛋白組成をレ
D
.
， Colw
巴1
，A
.R
. andMeyer，K
.
， e
d
sふ Amer-
Fチン染色による電気泳動法で解析して以下の結論を得
i
c
a
nI
n
s
t
i
t
u
t
eo
fB
i
o
l
o
g
i
c
a
lS
c
i
e
n
c
巴s
，
Washington
1
. STZ糖尿病ラットの GBMには，正常対照ラット
D
.C
. p1
2
7，1
9
6
4
3
) Beisswenger，P
.J
. andS
p
i
r
o，R
.G
.:S
t
u
d
i
e
son
に認められない WGAおよび ConAで染色される分子
t
h
巴 h
uman glom
巴r
u
l
a
r basement m巴m
b
r
a
n
e
.
量6
0，
0
0
0の糖蛋白が存在していた
C
o
m
p
o
s
i
t
i
o
n，n
a
t
u
r
eo
ft
h
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b
o
h
y
d
r
a
t
eu
n
i
t
s
た
2 分子量 6
0，
0
0
0の糖蛋白の糖鎖には GlcNAc， aD-Glcおよび a-D-Manが存在していた
and c
h
e
m
i
c
a
lc
h
a
n
g
e
si
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i
a
b
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t
e
sm
e
1
1
i
t
u
s
D
i
a
b
e
t
e
s2
2・1
8
0，1
9
7
3
.
3
. この糖蛋白のアミノ酸組成の 1
0モノレ%以上を占
4
)K
e
f
a
l
i
d
e
s， N.A
. :B
i
o
c
h
e
m
i
c
a
lp
r
o
p
e
r
t
i巴s o
f
めるアミノ酸はプロリン (
11
.7
3モノレ%)，グルタミン酸
humang
l
o
m
e
r
u
l
a
rbasementmembran
巴 i
nn
o
r
-
(
1
1
.
7
1モノレ%)およびグリシン(10
.
2
8モル%)であった
malandd
i
a
b
e
t
i
ck
i
d
n
e
y
s J
.C
l
i
n
. I
n
v
e
s
t 5
3:
一方，ハイドロキシプロリンは 0
.
3
3モル%の低組成比
4
0
3，1
9
7
4
.
率，ハイドロキシリジンは検出感度以下の低組成比率で
あった
以上，木研究により， STZ糖尿病ラットの GBM構成
成分として，正常対照ラットに認められない分子量
0
0
0の糖蛋白が存在し， STZ糖尿病ラットの GBM
6
0，
に組成変化があることが確認された
目
5
) Beisswenger，P
.J
. :Glomerularbasementmemb
r
a
n
巴. B
i
o
s
y
n
t
h
e
s
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sandc
h
巴m
i
c
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c
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b
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i
cr
a
t
. J
.C
l
i
n
. I
n
v
e
s
t
5
8・8
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本論文の要旨は第 3
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