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特 許 公 報 特許第5759176号
〔実 53 頁〕 特 許 公 報（Ｂ２） (19)日本国特許庁（ＪＰ） (12) (11)特許番号 特許第5759176号 (45)発行日 （Ｐ５７５９１７６） (24)登録日 平成27年6月12日(2015.6.12) 平成27年8月5日(2015.8.5) (51)Int.Cl. Ｃ１２Ｎ ＦＩ 5/10 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 5/00 １０３ Ｃ１２Ｎ 15/09 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ａ０１Ｈ 5/00 (2006.01) Ａ０１Ｈ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 19/04 (2006.01) Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｚ Ａ２３Ｌ (2006.01) Ａ２３Ｌ 1/10 Ｚ 1/10 請求項の数13 （全71頁） 最終頁に続く (21)出願番号 特願2010-538283(P2010-538283) (73)特許権者 510174130 (86)(22)出願日 平成20年12月24日(2008.12.24) ザ (65)公表番号 特表2011-509072(P2011-509072A) オーストラリア国 ユニバーシティ (43)公表日 平成23年3月24日(2011.3.24) (86)国際出願番号 PCT/AU2008/001906 (87)国際公開番号 WO2009/079714 コモンウェルス (87)国際公開日 平成21年7月2日(2009.7.2) アンド 平成23年12月15日(2011.12.15) ーガナイゼーション (31)優先権主張番号 2007907071 オーストラリア国 (32)優先日 平成19年12月24日(2007.12.24) (33)優先権主張国 オーストラリア(AU) 審査請求日 ア，グラッタン オブ メルボルン ３０１０ ヴィクトリ ストリート (73)特許権者 590003283 サイエンティフィック インダストリアル サウス リサーチ ３１６９ ロックト バッグ オ クレイトン １０ (73)特許権者 504265042 ザ ユニバーシティー オーストラリア ストラリア オブ アデレード ５０００ アデレード サウス オー ノーステラス 最終頁に続く (54)【発明の名称】多糖シンターゼ（Ｈ） 1 2 (57)【特許請求の範囲】 核酸の発現を増加させることにより増加される、請求項 【請求項１】 １に記載の方法。 植物細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ 【請求項３】 −グルカンのレベルを増加させる方法であって、該植物 （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの生成方法であ 細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４ って、単離されたＣｓｌＨ核酸で植物細胞を形質転換す ）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／また るステップ、および該植物細胞に該単離されたＣｓｌＨ は活性を増加させるステップを含み、該ＣｓｌＨにより 核酸を発現させるステップを含み、該ＣｓｌＨ核酸は、 コードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシ （ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むか；ま ンターゼは、 たは、 （ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むか；ま 10 （ｉｉ）配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミ たは、 ノ酸配列を含み、かつ（１，３；１，４）−β−Ｄ−グ （ｉｉ）配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミ ルカンの合成を触媒するか、またはグルコピラノシル単 ノ酸配列を含み、かつ（１，３；１，４）−β−Ｄ−グ 量体の重合を触媒する、 ルカンの合成を触媒するか、またはグルコピラノシル単 （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコ 量体の重合を触媒する、 ードする、前記方法。 前記方法。 【請求項４】 【請求項２】 前記植物細胞が穀類植物細胞である、請求項１∼３のい 前記（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ ずれか１項に記載の方法。 のレベルおよび／または活性が、植物細胞中のＣｓｌＨ 【請求項５】 ( 2 ) JP 3 5759176 B2 2015.8.5 4 以下： 記載の多細胞構造物。 同じ分類群の野生型植物細胞と比較してそのレベルおよ 【請求項１３】 び／または活性が増加された、ＣｓｌＨによりコードさ 同じ分類群の野生型細胞と比較して（１，３；１，４） れる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ −β−Ｄ−グルカンレベルが増加し、かつ同じ分類群の であって、該ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１ 野生型細胞と比較して食物繊維含有量が増加した細胞を ，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼは、 含む、請求項１２に記載の多細胞構造物。 （ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むか；ま 【発明の詳細な説明】 たは、 【技術分野】 （ｉｉ）配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミ 【０００１】 ノ酸配列を含み、かつ（１，３；１，４）−β−Ｄ−グ 10 優先権主張 ルカンの合成を触媒するか、またはグルコピラノシル単 本発明は、オーストラリア仮特許出願2007907071の優先 量体の重合を触媒する、 権を主張するものであり、その内容を参照により本明細 前記レベルおよび／または活性が増加されたＣｓｌＨに 書に援用する。 よりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカ 【０００２】 ンシンターゼ；ならびに／あるいは 発明の分野 同じ分類群の野生型植物細胞と比較してその発現が増加 本発明は、一般的には多糖シンターゼに関する。より具 されたＣｓｌＨ核酸であって、該ＣｓｌＨ核酸は、 体的には、本発明は（１，３；１，４）−β−Ｄ−グル （ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むか；ま カンシンターゼに関する。 たは、 【背景技術】 （ｉｉ）配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミ 20 【０００３】 ノ酸配列を含み、かつ（１，３；１，４）−β−Ｄ−グ 穀類の各種組織は、穀粒成長中、休眠中および発芽後に ルカンの合成を触媒するか、またはグルコピラノシル単 おいて、多様な機能を有する。 量体の重合を触媒する、 【０００４】 （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコ 例えば、果皮膜および種皮の組織は、発育中および休眠 ードする、前記発現が増加されたＣｓｌＨ核酸 中に種を保護することに係わる。しかし、穀粒が成熟し のいずれか１以上を含む植物細胞であって、同じ分類群 、穀粒のこれらの外側組織が死んだ後、組織内残留物は の野生型植物細胞と比較してそのレベルが増加された（ 、ほぼ全体が細胞壁残留物から構成される。種皮とアリ １，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを含む、前記植物 ューロン表面との間にある核組織は、穀粒成長のために 細胞。 栄養素の伝達に関与するが、成熟と同時にこの組織もま 【請求項６】 30 た、細胞壁断片を残すのみで崩壊する。成熟した穀粒の 請求項１または２に記載の方法により作製された、請求 デンプン質の胚乳の薄い有壁細胞は死ぬが、デンプンと 項５に記載の植物細胞。 貯蔵タンパク質が充満する。対照的に、厚い有壁かつ有 【請求項７】 核のアリューロン細胞は、穀粒の成熟時点でも生きてお 穀類植物細胞である、請求項５または６に記載の植物細 り、タンパク体および脂肪滴が充満している。デンプン 胞。 質胚乳の接触面には胚盤があり、胚乳を発育させるため 【請求項８】 の栄養素を運ぶ役割をすると共に、発芽中に胚乳の貯蔵 請求項５∼７のいずれか１項に記載の１以上の植物細胞 物の消化産物を成長する胚に輸送する。 を含む多細胞構造物。 【０００５】 【請求項９】 穀粒中の各組織の異なる構造と機能は、少なくとも１つ 植物全体、植物組織、植物器官、植物部分、植物繁殖材 40 には、これらの細胞種それぞれの細胞壁組成によって決 料、または培養植物組織からなるリストより選択される まる。 、請求項８に記載の多細胞構造物。 【０００６】 【請求項１０】 非セルロース多糖類は、穀類組織の細胞壁における主要 穀類植物、またはその組織、器官もしくは部分を含む、 な成分であり、例えば（１，３；１，４）−β−Ｄ−グ 請求項８または９に記載の多細胞構造物。 ルカン、ヘテロキシラン（主にアラビノキシラン）、グ 【請求項１１】 ルコマンナン、キシログルカン、ペクチン多糖類および 穀粒を含む、請求項１０に記載の多細胞構造物。 カロースなどを含む。これら非セルロース多糖類は、通 【請求項１２】 常、穀粒全重量の１０％未満を構成するにすぎないが、 同じ分類群の野生型細胞と比較して食物繊維含有量が増 穀粒品質の重要な決定因子である。 加された細胞を含む、請求項９∼１１のいずれか１項に 50 【０００７】 ( 3 ) JP 5759176 B2 2015.8.5 5 6 個々の非セルロース多糖類とその他の壁構成成分との正 飼料製造業者を含む大規模食品加工活動において重要で 確な物理的関係は述べられてこなかったが、壁中で、セ ある。さらには、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカ ルロースの微小線維は非セルロース多糖類およびタンパ ンなど、穀類の非デンプン質多糖類は、ヒトの栄養素と ク質のマトリックス相に組み込まれいる。壁の完全性は して潜在的に有用な効果があることから、近年新たな関 、主にマトリックス相と微小線維構成素との間の広範な 心を引き寄せている。 非共有結合相互作用、特に水素結合によって維持される 【００１４】 。いくつかの穀粒組織の壁中に、ヘテロキシラン、リグ しかしながら、このような関心の高さにもかかわらず、 ニンおよびタンパク質の間に共有結合が存在する。各成 （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン生合成をはじめ 分間の共有結合の範囲は、壁の種類および遺伝子型によ っても異なる。 として、穀類中の非セルロース多糖類生合成を制御する 10 遺伝子および酵素の知識には大きな隔たりがある。 【０００８】 【００１５】 非セルロース多糖類、特にヘテロキシランおよび（１， 穀粒中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン濃度は ３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、アリューロンおよ 、遺伝子型および環境の両者により影響を受けると考え びデンプン質胚乳の壁、また恐らくは、胚盤においても られている。例えば、穀類中の（１，３；１，４）−β 、比較的高い割合を占める。これらの組織において、セ −Ｄ−グルカンの濃度は、遺伝子型、穂の穀粒の位置、 ルロース含量はそれに応じて低くなる。該してセルロー ならびに植え付け場所、成長中の気候条件および土壌窒 ス含有量が低い壁は、リグニンを全く含まないという事 素などの環境条件に左右される。 実の他、穀粒の中央部の壁の構造的な硬さに関する限定 【発明の概要】 的な要件、および穀粒の発芽後に壁成分を急速に脱重合 【発明が解決しようとする課題】 するための要件に関係すると考えられている。 20 【００１６】 【０００９】 細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グ 対照的に、果皮膜の細胞壁は、胚および胚乳のための保 ルカンのレベルの調節を促し、これによって穀粒または 護膜を提供し、発芽中に動員されないものであるが、同 栄養組織の品質を変えられるので、（１，３；１，４） 細胞壁中のセルロースおよびリグニンの含有量は非常に −β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードする遺伝子の同 高く、非セルロース多糖類の濃度は、それに応じて低い 定は望ましいと言える。そこで、細胞内の（１，３；１ 。 ，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルの調節を可能にし、 【００１０】 それに伴う穀類または栄養組織品質の変化を可能にする （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、混合結合も ため、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンター しくは穀類β−グルカンとも呼ばれ、非セルロース多糖 ゼをコードする遺伝子の特定は、是非とも必要である。 類であるが、穀類および牧草が属する単子葉植物イネ科 30 【００１７】 （Poaceae）の植物、および同類のイネ目（Poales）の 本明細書における従来技術の参照は、従来技術がいかな 近縁ファミリーに天然に存在する。 る国においても共通する一般知識の一部を形成すること 【００１１】 の同意と、またはいかなる形態の示唆と解釈されるべき これらの非セルロース多糖類は、ほとんどの穀粒のデン ではない。 プン質胚乳およびアリューロン細胞壁において重要な構 【課題を解決するための手段】 成物質であり、細胞壁の最高で７０重量％から９０％重 【００１８】 量までを占めることがよくある。 本発明により、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン 【００１２】 シンターゼのファミリーをコードするヌクレオチド配列 オオムギ、オートムギおよびライムギは（１，３；１， 及び対応のアミノ酸配列が提供される。本発明により、 ４）−β−Ｄ−グルカンの豊富な供与源であるが、これ 40 （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼはＣ らに比べ、コムギ、イネおよびトウモロコシは、この多 ｓｌＨ遺伝子ファミリーのメンバーによってコードされ 糖類濃度が低い。（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカ ることが明らかにされた。 ンはまた、穀類および牧草の栄養組織にある細胞壁の比 【００１９】 較的微量な成分である。栄養組織において比較的微量な （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコ 成分として現れるが、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グ ードするヌクレオチド配列、および対応するアミノ酸配 ルカンは、例えば、動物による栄養組織の消化率の観点 列の同定の結果として、本発明はとりわけ、細胞中の（ から、またバイオエタノール生産用に作物残滓を使用す １，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベ る観点からもなお重要である。 ルおよび／または活性を調節する、ならびに／あるいは 【００１３】 細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グ （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、酒造および 50 ルカンのレベルを調節するための方法および組成物を提 ( 4 ) JP 7 5759176 B2 2015.8.5 8 供する。 らびに／あるいは 【００２０】 同じ分類群の野生型細胞と比較してその発現が調節され したがって、第１の態様において、本発明は、細胞によ たＣｓｌＨ核酸 り生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの を含む細胞を提供する。 レベルを調節する方法であって、該細胞中のＣｓｌＨに 【００２６】 よりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカ いくつかの実施形態において、細胞は、同じ分類群の野 ンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節するス 生型細胞と比較してそのレベルが調節された（１，３； テップを含む方法を提供する。 １，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをさらに含む。 【００２１】 【００２７】 いくつかの実施形態において、（１，３；１，４）−β 10 さらに、第６の態様において、本発明は、本発明の第５ −Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性 の態様に係る１以上の細胞を含む多細胞構造物を提供す は、細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現を調節することによっ る。 て調節する。従って、第２の態様において、本発明は、 【００２８】 細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンタ 本発明はまた、本発明の第５の態様に係る１以上の細胞 ーゼのレベルおよび／または活性を調節する方法であっ を含む穀粒を提供する。したがって、第７の態様におい て、該細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現を調節するステップ て、本発明は、そのレベルが調節された（１，３；１， を含む方法を提供する。 ４）−β−Ｄ−グルカンを含む穀粒であって、そのレベ 【００２２】 ルおよび／または活性が調節された、ＣｓｌＨによりコ いくつかの実施形態において、本発明は、細胞において ードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシン ＣｓｌＨ核酸を発現させる、過剰発現させる又は導入す 20 ターゼ、ならびに／あるいはその発現が調節されたＣｓ ることにより、細胞により生成される（１，３；１，４ ｌＨ核酸分子を含む１以上の細胞を含む、上記穀粒を提 ）−β−Ｄ−グルカンのレベルを増大させることを包含 供する。 する。あるいは、別の実施形態において、本発明は、細 【００２９】 胞におけるＣｓｌＨ核酸のノックアウトまたはノックダ 第８の態様において、本発明は、以下： ウンにより細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１， 本発明の第７の態様に記載の穀粒を製粉することにより ３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの発現をダ 製造される穀粉；および ウンレギュレートする方法を提供する。 任意により、１以上の他の穀粒を製粉することにより製 【００２３】 造されたる穀粉 本発明はまた、組換え発現系における（１，３；１，４ を含む穀粉も提供する。 ）−β−Ｄ−グルカンの生成を促進する。例えば、（１ 30 【００３０】 ，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、プロモーター制 上記の通り、本発明は、部分的には、（１，３；１，４ 御下にてＣｓｌＨ核酸を細胞に導入することにより組換 ）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードするＣｓｌＨ え技術によって生成することもでき、続いてこの細胞は ヌクレオチド配列およびＣｓｌＨアミノ酸配列の同定お ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β− よび単離に基づく。 Ｄ−グルカンシンターゼを発現し、（１，３；１，４） 【００３１】 −β−Ｄ−グルカンを生成する。したがって、第３の態 したがって、第９の態様において、本発明は、単離され 様において、本発明は、（１，３；１，４）−β−Ｄ− たＣｓｌＨ核酸分子、又はその相補体、逆相補体若しく グルカンの生成方法であって、単離されたＣｓｌＨ核酸 は断片を提供する。 で細胞を形質転換するステップおよびその単離されたＣ 【００３２】 ｓｌＨ核酸を細胞に発現させるステップを含む方法を提 40 第１０の態様において、本発明は、本発明の第９の態様 供する。 に記載の単離された核酸分子を含む遺伝子構築物または 【００２４】 ベクターを提供する。 第４の態様において、本発明は、本発明の第３の態様の 【００３３】 方法により生成された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グ 第１１の態様において、本発明は、本発明の第９の態様 ルカンを提供する。 に記載の単離された核酸分子または本発明の第１０の態 【００２５】 様に記載の遺伝子構築物を含む細胞を提供する。 第５の態様において、本発明は、 【００３４】 同じ分類群の野生型細胞と比較してそのレベルおよび／ 第１２の態様において、本発明は、本発明の第１１の態 または活性が調節された、ＣｓｌＨによりコードされる 様に記載の１以上の細胞を含む多細胞構造物を提供する （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ；な 50 。 ( 5 ) JP 9 5759176 B2 2015.8.5 10 【００３５】 上記の通り、本発明は同様に、ＣｓｌＨによりコードさ れる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ のアミノ酸配列を提供する。 【００３６】 したがって、第１３の態様において、本発明は、Ｃｓｌ Ｈによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グ ルカンシンターゼポリペプチド又はその断片を規定する アミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する 。 10 【００３７】 第１４の態様において、本発明は、上記に定義の単離さ れたＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）− β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドまたはそのエ ピトープに対して生起された、抗体またはそのエピトー プ結合性フラグメントを提供する。 【００３８】 本明細書を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除 き、単語「含む（comprise）」または「含む（comprise s）」もしくは「含む（comprising）」などの、その変 20 化形は、記述された要素もしくは整数または要素もしく は整数の群の包含を示唆するが、 その他任意の要素も 【００４０】 しくは整数または要素もしくは整数の群の排除を示唆す るものではないと理解されよう。 【００３９】 ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、本明細書において 配列識別子番号（配列番号）により示される。配列番号 は、配列識別子＜４００＞１（配列番号１）、＜４００ ＞２（配列番号２）などに数値的に対応する。配列識別 子の概要を表１に示す。配列のリストは、本明細書の最 30 後に示されている。 【表１】 【図面の簡単な説明】 【００４１】 【図１】（Ａ）は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）に おける機能獲得実験に使用した、ＨｖＣｓｌＨ１：：ｐ ＧＢＷ１５構築体のＴ−ＤＮＡの概略を示す図である。 Ｇａｔｅｗａｙクローニング後、３×ＨＡタグを、全長 ＨｖＣｓｌＨ１ ＯＲＦのＮＨ２ 末端に結合した。（Ｂ ）は、ノーザンブロット分析により決定された、成熟Ｈ 50 ｖＣｓｌＨ１トランスジェニックＴ１植物の葉における ( 6 ) JP 11 5759176 B2 2015.8.5 12 転写産物レベルの図である。上のパネル、Ｘ線フィルム レベルの図である。対照遺伝子は、ＧＡＰＤＨ、α−チ 撮影；下のパネル、対応する、臭化エチジウム染色した ューブリンおよび伸長因子１ａとした。（Ｃ）１０日齢 ゲル。観察された２．５ｋｂの転写産物のサイズは、タ の第１葉中のＨｖＣｓｌＨ１の転写産物の正規化レベル グ付加ＨｖＣｓｌＨ１ の図である。対照遺伝子は、ＧＡＰＤＨ、サイクロフィ ｍＲＮＡの予想されたサイズに 一致する。 リンおよびＨＳＰ７０とした。ＱＰＣＲプロットのエラ （Ｃ）ウェスタンブロット分析により決定された、３週 ーバーは、標準偏差を示す。（Ｄ∼Ｆ）１８Ｓ 齢のプールされたＨｖＣｓｌＨ１トランスジェニックＴ （陽性対照、Ｄ）、ＨｖＣｓｌＨ１（Ｆ）および陰性対 系統における３×ＨＡタグ付加ＨｖＣｓｌＨ１タンパ 照（Ｅ）のためのプローブを使用する、７日齢の第１葉 ２ ク質レベルの図である。３０マイクログラムの混合ミク の成熟域のｉｎ ロソーム膜タンパク質を各レーンに添加し、抗ＨＡ抗体 10 ルバー＝１００μｍ。 でブロットをプロービングした。ＢおよびＣ；番号はト 【図６】ＨｖＣｓｌＨ１の構造的特徴を示す図である。 ランスジェニック系統を指し、Ｃｏｌ−０は、野生型の （Ａ）ＨｖＣｓｌＨ１のエクソン−イントロン構造であ 非形質転換系統を指す。Ｃｏｌ−０、８および１４系統 る。黒いバーがエクソンを示し、細い黒線がイントロン は同じブロット由来であり、他の系統はすべて異なるブ と５’および３’ＵＴＲを示す。四角形の上の数字はエ ロット由来である。 クソンのサイズを示し、線の下の数字はイントロンのサ 【図２】β−グルカン特異的モノクローナル抗体を用い イズを示す。イタリック体の数字は、５’および３’の た、ＨｖＣｓｌＨ１発現系の細胞壁におけるβ−グルカ ＵＴＲのサイズを指し、下線のある太字は、開始コドン ンの検出を示す透過型電子顕微鏡写真を示す（Meikle e の上流の公知の配列の長さを指す。数字は塩基対で表さ t al., Plant J 5:1-9, 1994）。（Ａ∼Ｃ）８、１６、 れている。太い黒いバーは、ＡＲＡＭＥＭＮＯＮ（http １１系統；（Ｄ）野生型Ｃｏｌ−０対照；（Ｅ）６系統 20 ://aramemnon.botanik.uni-koeln.de/）により予測され 。ＡおよびＤは維管束の細胞；ＢおよびＣは葉肉細胞； る、６つのコンセンサス膜貫通ドメインを示す。（Ｂ） Ｅは上皮細胞を示す。 ＨｖＣｓｌＨ１のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの疎水 スケールバー＝０．５μｍ（Ａ∼Ｃ、Ｅ）、１μｍ（Ｄ 性プロット（Kyte and Doolittle, J Mol Biol 157: 10 ）。 5-132, 1982）の図である。＋１．６のカットオフを用 【図３】１４５日齢のシロイヌナズナ系統１６−１ロゼ いた１９個のアミノ酸ウィンドウを使用した。６つの予 ット葉組織から調製されたアルコール不溶性画分（ＡＩ 測膜貫通ドメインを黒いバーで示す。数字はアミノ酸を Ｒ）の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒ 示す。（Ｃ）ＨｖＣｓｌＨ１の予測膜トポロジーの図で ドロラーゼ消化により放出されたオリゴ糖のＨＰＡＥＣ ある。ＮＨ２ 、アミノ末端；ＣＯＯＨ、カルボキシ末端 プロファイルを示す図である（青色線）。１６−１を予 ；ｌｕｍｅｎ、ＥＲの内部、ゴルジ体または小胞体；ｃ め酵素処理し、緩衝液洗浄した（ピンク色線）。オオム 30 ｙｔ、細胞質、ｍｅｍ、膜、Ｄ，Ｄ，Ｄ，ＱＸＸＲＷ、 ギ（Ｂａｒｌｅｙ）成葉（全葉鞘）のＡＩＲを、陽性対 ＣＡＺｙ 照試料として使用した（黄緑色線）。Ｇ４Ｇ３ＧＲ （３ ｓｌＨ１におけるＱＸＸＲＷモチーフの配列は、ＱＦＫ −Ｏ−β−セロビオシルＤ−グルコース、ＤＰ３）およ ＲＷである。 びＧ４Ｇ４Ｇ３ＧＲ （３−Ｏ−β−セロトリオシルＤ− 【図７】全長のオオムギ（Hordeum vulgare）およびコ グルコース、ＤＰ４）のピークを示す。 メ（Oryza sativa）のＣＳＬＨ配列の系統樹を示す図で 【図４】シロイヌナズナトランスジェニック系統１１の ある。ＣＳＬＢファミリーは、ＣＳＬファミリーの中で 高圧凍結葉の切片における、金標識抗ＨＡ抗体による３ ＣＳＬＨファミリーと最も密接に関係しているので、シ ×ＨＡタグ付加ＨｖＣｓｌＨ１タンパク質の検出を示す ロイヌナズナ（A. thaliana）およびポプラ（Populus t 透過型電子顕微鏡写真を示す。（ＡおよびＢ）葉肉細胞 richocarpa）のＣＳＬＢタンパク質配列もまた含まれる 。Ｇ、ゴルジ体、ｃｗ、細胞壁、ｖ、液胞、ｅｒ、小胞 40 。アライメントはＣｌｕｓｔａｌＸを使用して作成し、 体。スケールバー＝０．５μｍ（Ａ）、０．２μｍ（Ｂ 近隣結合を用いる固有距離アルゴリズムを使用した。 ）。矢印は、ゴルジ関連小胞の標識を示す。 各分岐群を支持するブートストラップ反復の数（総数１ 【図５】ＱＰＣＲおよびｉｎ ＰＣＲ分析に ，０００から）を、その分岐群の節間の下に示す。アク より決定された、オオムギにおけるＨｖＣｓｌＨ１の発 セッション番号は、ＨｖＣｓｌＨ１（ＦＪ４５９５８１ 現を示す図である。（Ａ）さまざまなオオムギ組織中の ）、ＯｓＣＳＬＨ１（Ｏｓ１０ｇ２００９０、ＡＣ１１ ＨｖＣｓｌＨ１の転写産物の正規化レベル（コピー／マ ９１４８）、ＯｓＣＳＬＨ２（Ｏｓ０４ｇ３５０２０、 イクロリットルｃＤＮＡ）の図である。正規化のための ＡＬ６０６６３２）、ＯｓＣＳＬＨ３（Ｏｓ０４ｇ３５ 対照遺伝子は、ＧＡＰＤＨ、サイクロフィリンおよびα ０３０、ＡＬ６０６６３２）、ＰｔＣＳＬＢ１（http:/ −チューブリンとした。（Ｂ）受粉後０∼２４日の成長 /genome.jgi-psf.org/Poptr1_1/Poptr1_1.home.html; 中の胚乳における、ＨｖＣｓｌＨ１の転写産物の正規化 50 ＩＤ ｓｉｔｕ ｓｉｔｕ ＲＮＡ ＰＣＲ画像である。スケー ＧＴ２ファミリーの特徴的モチーフ。ＨｖＣ ｎｏ．５７２９８２）、ＰｔＣＳＬＢ２（ＩＤ ( 7 ) JP 13 5759176 B2 2015.8.5 14 ｎｏ．６８４２１４）、ＡｔＣＳＬＢ１（Ａｔ２Ｇ３２ およびポプラ（Populus trichocarpa）に由来するＣｓ ６１０、ＮＭ＿１２８８２０）、ＡｔＣＳＬＢ２（Ａｔ １Ｂ、ＦおよびＨの全長アミノ酸配列の関係を示す系統 ２Ｇ３２６２０、ＮＭ＿１２８８２１）、ＡｔＣＳＬＢ 樹である。 ３（Ａｔ２Ｇ３２５３０、ＮＭ＿１７９８５９）、Ａｔ 【図１３】ＯｓＣＳＬＦ２×ＨｖＣｓｌＨ１トランスジ ＣＳＬＢ４（Ａｔ２Ｇ３２５４０、ＮＭ＿１２８８１３ ェニック植物交配の親として使用された４種のトランス ）、ＡｔＣＳＬＢ５（Ａｔ４Ｇ１５２９０、ＮＭ＿１１ ジェニックシロイヌナズナ植物系統の表皮細胞壁におけ ７６１７、ＡｔＣＳＬＢ６（Ａｔ４Ｇ１５３２０、ＮＭ る、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン特異的モノ ＿１１７６２０）である。 クローナル抗体を用いた、（１，３；１，４）−β−Ｄ 【図８】ＨｖＣｓｌＨ１が位置する、２Ｈ染色体の短腕 −グルカンの検出を例示する透過型電子顕微鏡写真であ の部分的ゲノムマップを示す図である。ＨｖＣｓｌＨ１ 10 る。ＨｖＣｓｌＨ１系統個体１５−８−３および１５− および４つのＨｖＣＳＬＦ遺伝子のクラスターを、セン １１−７を、それぞれパネルＡおよびＢに、ＯｓＣＳＬ トロメア（黒丸により表示）に近接するＳｔｅｐｔｏｅ Ｆ２系統個体Ｈ３７−５およびＨ１７−４−４を、それ ×Ｍｏｒｅｘのビンマップ上の６９．２∼７１．５Ｍｂ ぞれパネルＣおよびＤに示す。 に相当する区間にマッピングした。ＨｖＣｓｌＨ１はビ 【図１４】ＯｓＣＳＬＦ２×ＨｖＣｓｌＨ１トランスジ ン８に配置され、ｗｇ９９６マーカーと同時分離する。 ェニック植物交配から得られた子孫の細胞壁における、 Ｓｔｅｐｔｏｅ×Ｍｏｒｅｘの参照マップにおいて、ｗ （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン特異的モノクロ ｇ９９６はａｂｃ１６２と同時分離し、ａｂｃ４６８の ーナル抗体を用いた（１，３；１，４）−β−Ｄ−グル ２．３ｃＭ南であり、４つのＨｖＣＳＬＦ遺伝子と同時 カンの検出を例示する透過型電子顕微鏡写真である。１ 分離するマーカーである（Burton et al., Plant Physi ５−８−３×Ｈ３７−５の交配による個体を（Ａ）、１ ol 146: 1821-1833, 2008）。鍵となるマーカーを、染 20 ５−８−３×Ｈ３７−５の同胞を（Ｂ）、１５−８−３ 色体の上部からのそれらの距離をセンチモルガン（ｃＭ ×Ｈ３７−７を（Ｃ）、１５−８−３×Ｈ３７−７の同 ）で左に示し、Ｈａｎらの麦芽β−グルカンＱＴＬ分析 胞を（Ｄ）、５−８−１５×Ｈ３７−１６を（Ｅおよび （Theor Appl Genet 91: 921-927, 1995）におけるＬＯ Ｆ）に、１５−１１−１３×Ｈ３７−１１を（Ｇ）に、 Ｄ（塩基１０に対する対数オッズ）スコアを右に示す。 １５−１１−７×Ｈ１７−４を（Ｈ）に示す。パネルＡ 【図９】（Ａ）シロイヌナズナ系統１６−２由来の１４ ∼Ｅ、Ｇ∼Ｈは、表皮細胞を示し、パネルＦは葉肉細胞 ５日齢の葉および茎を組み合わせた材料から調製された を示す。 ＡＩＲの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンド 【図１５】シロイヌナズナにおけるＣｓｌＨ遺伝子の発 ヒドロラーゼ消化により放出されたオリゴ糖のＨＰＡＥ 現に使用したｐＧＷＢ１５ベクターのベクターマップを Ｃプロファイルを示す図である（青色線）。 示す図である。 １６−２を予め酵素処理し、緩衝液洗浄した（ピンク色 30 【図１６−１】オオムギ品種ヒマラヤ（cv. Himalaya） 線）。オオムギ成葉（全葉鞘）のＡＩＲを、陽性対照試 由来のＣｓｌＨ１遺伝子ｃＤＮＡのＤＮＡ配列および翻 料として使用した（黄緑色線）。ラミナリビオース標準 訳アミノ酸配列を示す図である。ＤＮＡ配列は１０塩基 （水色線）。マルトース（Ｇα４Ｇ）およびセロビオー ごとに番号を付け、単一の大文字オープンリーディング ス（Ｇβ４Ｇ）の保持時間を矢印により印を付けた。（ フレームの翻訳アミノ酸配列を、下に１文字で示す。 Ｂ）Ａの試料の酵素消化ＡＩＲのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 【図１６−２】図１６−１の続き。 ＭＳクロマトグラムを表す図である。ＤＰ２（ラミナリ 【図１６−３】図１６−１の続き。 ビオース）、ＤＰ３（３−Ｏ−β−セロビオシルＤ−グ 【図１７−１】オオムギＣｓｌＨ１遺伝子ｃＤＮＡおよ ルコース）およびＤＰ４（３−Ｏ−β−セロトリオシル びゲノム配列と、３種のコムギＣｓｌＨ１遺伝子ホモロ Ｄ−グルコース）のピークを示す。 グ（ＴａＣｓｌＨ１−１、１−２および１−３）のゲノ 【図１０】オオムギ（Hordeum vulgare）およびコメ（O 40 ム配列との比較を示す図である。オオムギｃＤＮＡ（上 ryza sativa）に由来するＣｓｌＨ配列の間の、ヌクレ から、品種スクーナー（cv. Schooner）由来のＨｖＣｓ オチド配列同一性、タンパク質配列同一性およびタンパ ｌＨ１（配列番号１）および品種ヒマラヤ由来のＨｖＣ ク質配列類似性を示す図である。 ｓｌＨ１Ｈｉｍ（配列番号６９））ならびにゲノムクロ 【図１１−１】オオムギ（Hordeum vulgare）およびコ ーン（品種モレックス（cv.Morex）由来のＨｖＣｓｌＨ メ（Oryza sativa）に由来するＣｓｌＨアミノ酸配列の １ｇ（配列番号９）および品種ヒマラヤ由来のＨｖＣｓ ＣｌｕｓｔａｌＷマルチプル配列アライメントを示す図 ｌＨ１ｇＨｉｍ（配列番号７１））のＤＮＡ配列を、３ である。 種のコムギ配列（ＴａＣｓｌＨ１−１、１−２および１ 【図１１−２】図１１−１の続き。 −３（それぞれ、配列番号７８、８０および８１）とと 【図１２】オオムギ（Hordeum vulgare）、コメ（Oryza もに、Ｍｕｓｃｌｅの比較プログラムを使用してＢｉｏ sativa）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana） 50 Ｅｄｉｔでアライメントした。アライメントの位置を配 ( 8 ) JP 15 5759176 B2 2015.8.5 16 列の上に番号付けし、ダッシュはアライメントを最適化 【図２２】胚乳成長期のオオムギ品種ヒマラヤおよびコ するために導入されたギャップを示す。コムギゲノム配 ムギＣｓｌＨ１遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析の 列（ＴａＣｓｌＨ１−１）と同一のヌクレオチドは、点 結果を示す図である。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ で表す。エクソン／イントロンの境界は、コムギゲノム は、成長中の胚乳における、コムギＣｓｌＨ１遺伝子と 配列（ＴａＣｓｌＨ１−１）において太字で示す。参照 比較したオオムギＣｓｌＨ１遺伝子の発現パターンの差 用に、ＣｓｌＨコード領域のＡＴＧ開始コドンは、アラ を示す。Ｔａ０ イメント位置９８において始まり、終止コドンＴＡＡは ベルはこれに対して相対的レベルである。 位置３３２０において始まり、双方とも下線を付けてあ 【図２３】Ｂｘ１７プロモーターの制御下におけるオオ る。 【図１７−２】図１７−１の続き。 ｄｐａ試料を１に設定し、他の発現レ ムギ品種ヒマラヤのＣｓｌＨ１ゲノム配列の発現に使用 10 した、植物形質転換ベクターのプラスミドマップを示す 【図１７−３】図１７−１の続き。 図である。 【図１７−４】図１７−１の続き。 ｐＺＬＢｘ１７ＨｖｇＨ１と称する植物形質転換ベクタ 【図１７−５】図１７−１の続き。 ーの略図である。環状プラスミド内部のボックスは、さ 【図１７−６】図１７−１の続き。 まざまな遺伝エレメントを表す：Ｂｘｌ７ｐｒｏｍ＝オ 【図１８−１】オオムギ品種ヒマラヤと、コムギのＣｓ オムギＨｖＣｓｌＨ１ゲノム配列の発現を駆動するＢｘ ｌＨ１タンパク質のアミノ酸配列の比較を示す図である １７プロモーター；Ｈｖｇ９１８５＿１＝プライマー対 。オオムギ遺伝子の翻訳アミノ酸配列（最上段、ＨｖＣ ＳＪ９１およびＳＪ８５を用いて単離されたＨｖＣｓｌ ｓｌＨ１（Ｈｉｍ））を、３種のコムギ配列（ＴａＣｓ Ｈ１ゲノムクローン１番；Ｎｏｓ３’＝ノパリンシンタ ｌＨ１−１ｐｒｏ、１−２ｐｒｏおよび１−３ｐｒｏと ーゼポリアデニル化配列；ＮＰＴＩＩ＝細菌カナマイシ して示す）とともに、Ｍｕｓｃｌｅの比較プログラムを 20 ン耐性遺伝子。選択された制限部位の位置は、プラスミ 使用してＢｉｏＥｄｉｔでアライメントした。アライメ ドマップの外側に示す。 ントの位置を配列の上に番号付けし、アライメントを最 【図２４】カナマイシン耐性を付与する、植物の選択可 適化するために導入されたオオムギ配列に単一のダッシ 能なマーカープラスミドのプラスミドマップを示す図で ュ（ギャップを示す）が存在する。アミノ酸は、それら ある。ｐＣＭＳＴＬＳｎｅｏと称する植物形質転換ベク の一文字形式で示し、オオムギ配列（ＨｖＣｓｌＨ１（ ターの略図である。環状プラスミド内部のボックスは、 Ｈｉｍ））と同一のアミノ酸は点で示す。 さまざまな遺伝要素を表す：３５Ｓｐｒｏｍ＝植物の選 【図１８−２】図１８−１の続き。 択可能なマーカー遺伝子の発現を駆動するＣａＭＶ 【図１９】子葉鞘の成長の間のオオムギ品種ヒマラヤの ５Ｓプロモーター；ＮＰＴＩＩ＝植物カナマイシン耐性 ＣｓｌＨ１遺伝子の半定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびＱ−Ｐ 遺伝子；ＳＴＬＳイントロン＝ジャガイモ（Solanum tu ＣＲ発現分析の結果を示す図である。パネルＡは、子葉 30 berosum）大型サブユニットイントロン；３５Ｓ 鞘の成長の間ならびに若葉（Ｌ）、根（Ｒ）および中期 ｌｙＡ＝ＣａＭＶ 胚乳（Ｅ）におけるオオムギＣｓｌＨ１遺伝子の発現パ ３ ｐｏ ３５Ｓポリアデニル化配列；Ａｍｐ ｒｅｓ＝細菌アンピシリン耐性遺伝子。選択された制 ターンを示す半定量的ＲＴ−ＰＣＲの図である。構成的 限部位の位置は、プラスミドマップの外側に示す。 に発現される遺伝子（α−チューブリン）を対照として 【図２５】オオムギ品種ヒマラヤＣｓｌＨ１遺伝子を発 示す。パネルＢは、発芽開始後のさまざまな時点（日） 現するＴ０植物系統１０由来の単一コムギ穀粒のβグル における、成長中の子葉鞘中のＨｖＣｓｌＨ１に関する カン含有量を示す図である。グラフは、Ｔ０系統１０番 、正規化発現レベル（Ｑ−ＰＣＲ）を示す。 由来の個体コムギ穀粒のβグルカン含有量を示す。βグ 【図２０】葉の成長の間のオオムギのＣｓｌＦおよびＣ ルカンは、粉末重量のパーセントとして示す。 ｓｌＨ１遺伝子の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析の結果 【図２６】空ベクター対照（２０８）およびトランスジ を示す図である。オオムギＣｓｌＨ１遺伝子の発現パタ 40 ェニック（２３６）オオムギ中のＣｓｌＨ１遺伝子の定 ーンを示す半定量的ＲＴ−ＰＣＲを、他のオオムギＣｓ 量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分析を示す図である。発現は、受 ｌＦ遺伝子と比較した。構成的に発現した遺伝子（α− 粉７日後（７Ｄ）および受粉１４日後（１４Ｄ）におけ チューブリン）を対照として示す。 る葉および成長中の穀粒において示す。 【図２１】胚乳成長の間のオオムギ品種ヒマラヤおよび 【図２７】オオムギおよびコムギのＣｓｌＨ配列に関す コムギＣｓｌＨ１遺伝子の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ発現分 る、ＤＮＡコード配列およびアミノ酸配列の同一性／類 析の結果を示す図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲは、コ 似性の比較を示す図である。ＨｖＣｓｌＨ１＝オオムギ ムギ品種ウェストニア（下のパネル）と比較したオオム 品種スクーナー由来のＤＮＡコード配列（配列番号１） ギ品種ヒマラヤ遺伝子（上のパネル）の成長中の胚乳に および対応するアミノ酸配列（配列番号２）；ＨｖＣｓ おけるＣｓｌＨ１遺伝子の発現パターンの差を示す。Ｄ ｌＨ１（Ｈｉｍ）オオムギ品種ヒマラヤ由来のＤＮＡコ ＰＡ＝開花後の日数である。 50 ード配列（配列番号６９）および対応するアミノ酸配列 ( 9 ) JP 17 5759176 B2 2015.8.5 18 （配列番号７０）；ＴａＣｓｌＨ１−１＝コムギ品種チ −グルカン抽出の温度および条件によっても異なる可能 ャイニーズ・スプリング（Chinese Spring）由来のＤＮ 性がある。 Ａコード配列（配列番号７２）および対応するアミノ酸 【００４７】 配列（配列番号７５）；ＴａＣｓｌＨ１−２＝コムギ品 穀類の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンについて 種チャイニーズ・スプリング由来のＤＮＡコード配列（ 報告されている平均分子量は、穀物種、細胞壁の種類、 配列番号７３）および対応するアミノ酸配列（配列番号 抽出手順および分子量判定に用いた手順によるが、４８ ７６）；ＴａＣｓｌＨ１−３＝コムギ品種チャイニーズ ，０００（ＤＰ約３００）から３，０００，０００（Ｄ ・スプリング由来のＤＮＡコード配列（配列番号７４） Ｐ∼１８５０）に及ぶ。これらは、分子量に関して常に および対応するアミノ酸配列（配列番号７７）。 【発明を実施するための形態】 多分散であって、これはオオムギ（１，３；１，４）− 10 β−Ｄ−グルカンに関し、数平均分子量（Ｍｗ／Ｍｎ） 【００４２】 １．１８に対する加重平均により説明される。ある種の 以下の説明は、特定の実施形態のみを説明することを目 オオムギ （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンはま 的とするが、上記の説明に関する限定であることを意図 た、少量のタンパク質と共有結合しており、推定分子量 しないと理解されるべきである。 最大４０，０００，０００を有している。 【００４３】 【００４８】 本発明は、部分的には、（１，３；１，４）−β−Ｄ− 穀粒壁からの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン抽 グルカンの生合成酵素をコードする遺伝子の同定に基づ 出率は、自己会合、ならびに他の細胞壁多糖類およびタ く。 ンパク質との会合の関数である。特に抽出率は、（１， 【００４４】 ３；１，４）−β−Ｄ−グルカン連鎖における分子量お 「（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン」は、β−Ｄ 20 よび結合分布に依存する。他のポリマーとの過剰な結合 −グルコピラノシル単量体が（１→４）結合および（１ および高分子量が、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グル →３）結合の両者によって重合された直鎖の非分枝状多 カンを穀粒から抽出することをさらに困難にしている。 糖類を含むと理解されるべきである。 【００４９】 【００４５】 例えば、オオムギ、オートムギおよびライムギ粉の（１ 天然の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンにおける ，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの一部は、ｐＨ７． （１→４）結合と（１→３）結合の比率は、一般に２． ０、４０℃の水で抽出することができる。さらなる画分 ２∼２．６：１の範囲である。ただし、比率はこの範囲 は、より高温で溶解度を高めることができる。４０℃に 以外のこともある。たとえば、ソルガム胚乳の（１，３ おいて水溶性の総（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカ ；１，４）−β−Ｄ−グルカン中、同比率は、１．１５ ンの割合は、植物種内でも、また植物種によっても異な ：１である。２種類の結合は、規則的な繰り返し配列に 30 る。例えば、ロウ質の多い（アミロース分が高い）オオ はならない。（１→３）結合単位は、２以上の（１→４ ムギは、通常のオオムギよりも水溶性の（１，３；１， ）結合により分離される。２ないし３つの隣り合う（１ ４）−β−Ｄ−グルカンの割合がより高い。４０℃でオ →４）結合の領域が優勢であるが、これら単位の配置に オムギから抽出された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グ は規則性がない。結合配列は、２つのグルコース単位よ ルカンは、６５℃で抽出されたもの（２．０：１）より り、さらに前記結合への依存がなく、二次マルコフ連鎖 、三糖：四糖の比率がわずかに低い（１．７：１）。穀 分布に従っている。さらに、１０％以下の連鎖は、５か 粒からの穀物（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンを ら２０の隣り合う（１→４）結合の長いストレッチから 完全に抽出するためには、還元末端によるアルカリ性誘 なる場合がある。したがって、穀類の（１，３；１，４ 導の分解を防ぐために、ＮａＢＨ４ を含む４Ｍ ）−β−Ｄ−グルカンは、セロトリオシル（cellotrios ＨまたはＢａ（ＯＨ）２ 水溶液などのアルカリ性抽出剤 yl）（Ｇ４Ｇ４ＧR e d ）、セロテトラオシル（cellotetr 40 を使用する必要がある。アルカリで抽出されたオオムギ aosyl）（Ｇ４Ｇ４Ｇ４ＧR e d ）単位、およびより長い（ （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン画分は、分子量 １→４）−β−Ｄ−オリゴグルコシル単位の（１→３） が高く、（１→４）:（１→３）結合の比率が高く、よ −β−結合した共重合体とみなすことができる。 り多くの、連続的に結合した（１→４）結合のセグメン 【００４６】 トを有し、水による抽出物よりも三糖：四糖の比率が高 内在性（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン中、三糖 い。ジメチルスルホキシド、高温の過塩素酸、トリクロ 単位と四糖単位の比率は、穀物種によって異なる。例え ロ酢酸、Ｎ−メチルモルホリノ−Ｎ−オキシドおよびジ ば、コムギではその比率は３．０∼４．５：１であるが メチルアセトアミド−ＬｉＣｌなどの他の抽出剤も、（ 、オオムギでは２．９∼３．４：１、ライムギでは２． １，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの溶解度を高める ７：１およびオートムギでは１．８∼２．３：１である ために使用してもよい。しかしこれら抽出剤は、脱重合 。さらに、実際の比率は、（１，３；１，４）−β−Ｄ 50 、またはポリマーの分解を生じる可能性がある。温水ま ＮａＯ ( 10 ) JP 19 5759176 B2 2015.8.5 20 たはアルカリで抽出後、（１，３；１，４）−β−Ｄ− レベルを調節する方法であって、該細胞中のＣｓｌＨに グルカンは、中性ｐＨおよび室温でよく溶解するように よりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカ なる。しかし、冷却時に、（１，３；１，４）−β−Ｄ ンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節するス −グルカンは会合し、沈着する可能性がある。 テップを含む方法を提供する。 【００５０】 【００５７】 上記の通り、本発明は、１つには（１，３；１，４）− 「細胞」は、任意の適当な真核細胞または原核細胞とす β−Ｄ−グルカンの合成を触媒する生合成酵素の同定お ることができる。したがって、本明細書において言及さ よびそれをコードする遺伝子に基づく。かかる酵素を本 れる「細胞」とは、酵母細胞もしくは菌糸真菌細胞など 明細書において「（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカ ンシンターゼ」と称する。 の真菌細胞；哺乳動物細胞などの動物細胞もしくは昆虫 10 細胞；または植物細胞をはじめとする真核細胞とするこ 【００５１】 とができる。あるいは、細胞は、大腸菌（E. coli）細 本発明は、ＥＳＴ（expressed sequence tag）ライブラ 胞を含む細菌細胞または古細菌細胞などの原核細胞とす リーおよびセルロースシンターゼ（ＣｅｓＡ）遺伝子を ることもできる。 含む他の配列データベースの分析に、一部起因する。さ 【００５８】 らに具体的には、ＣｅｓＡ遺伝子は、事実上、非常に大 いくつかの実施形態において、細胞は、植物細胞、線維 きな遺伝子スーパーファミリー（ＣｅｓＡ遺伝子および 束植物細胞、例えば単子葉被子植物細胞もしくは双子葉 セルロースシンターゼ様（Ｃｓｌ）遺伝子ファミリーの 被子植物細胞、または裸子植物細胞などである。いくつ 両者を含む）のメンバーであることが、これら研究にお かの実施形態において、植物は単子葉植物細胞である。 いて確認された。 いくつかの実施形態において、植物は、イネ目のメンバ 【００５２】 20 ーである。いくつかの実施形態において、単子葉植物細 しかし、ほとんどの線維束植物のＣｓｌ遺伝子ファミリ 胞は、穀類植物細胞である。 ーは非常に大きく、ＣｓｌＡからＣｓｌＨと称するいく 【００５９】 つかのグループに分類されている。シロイヌナズナでは 本明細書において用いられる「穀類植物」という用語は 、２９のＣｓｌ遺伝子が知られており、イネにおいては 、ヒトまたは動物の食料用の食用穀類を作出するイネ目 ３７の同遺伝子が知られている。シロイヌナズナのゲノ （イネ科植物属）のメンバーを含む。イネ目穀類植物の ムは、細胞壁代謝に関与する７００超の遺伝子を含むと 例としては、決して本発明を限定するものではないが、 概ね考えられている。しかし、基本的に、これら遺伝子 コムギ、イネ、トウモロコシ、キビ、ソルガム、ライム の具体的な機能はあまり明らかにされていない。 ギ、トリチカレ、オートムギ、オオムギ、テフ、野生米 【００５３】 、スペルトコムギなどが挙げられる。しかしながら、穀 さらに、ＣｅｓＡ遺伝子とは対照的に、Ｃｓｌ遺伝子の 30 類植物という用語は同様に、アマランス、ソバ、キノア 機能を特定することは困難であることが分かっている。 などの、食用穀類を作出しかつ偽穀類（pseudocereal） 事実、高等植物の複数のＣｓｌ遺伝子のうち、ＣｓｌＡ としても知られる非イネ目種のいくつかの植物を含むと 及びＣｓｌＦグループのみに、一定の機能が割り当てら 理解されるべきである。 れている。 【００６０】 【００５４】 他の実施形態において、本発明は、他の単子葉植物、例 本発明によって、ＣｓｌＨ遺伝子ファミリーのメンバー えばロリウム種(Lolium spp)などの牧草を含むイネ目の が（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼを 他の非穀類植物などの使用を包含する。 コードすることが明らかにされた。 【００６１】 【００５５】 上記の通り、本発明は、１つには、細胞中のＣｓｌＨに （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコ 40 よりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカ ードする、ＣｓｌＨヌクレオチド配列および対応するア ンシンターゼのレベルおよび／または活性を調節するこ ミノ酸配列の同定の結果、本発明はとりわけ、細胞中の とに基づく。 （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレ 【００６２】 ベルおよび／または活性を調節し、ならびに／あるいは 「ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β 細胞により生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グ −Ｄ−グルカンシンターゼ」は、（１，３；１，４）− ルカンのレベルを調節するための方法および組成物を提 β−Ｄ−グルカンの合成を触媒し、任意により、グルコ 供する。 ピラノシル単量体の重合を触媒することができる、Ｃｓ 【００５６】 ｌＨによりコードされる任意のタンパク質とみなされる したがって、第１の態様において、本発明は、細胞によ べきである。 り生成される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの 50 【００６３】 ( 11 ) JP 21 5759176 B2 2015.8.5 22 いくつかの実施形態において、ＣｓｌＨによりコードさ 【００６６】 れる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ 本発明により想定されるさらなるＣｓｌＨによりコード は、配列番号２に示されるアミノ酸配列又はそれに対し される（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンター 少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む ゼの例としては、配列番号２のＣｓｌＨによりコードさ 。 れる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ 【００６４】 のオーソログが含まれる。 いくつかの実施形態において、ＣｓｌＨによりコードさ 【００６７】 れる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ 例えば、配列番号２のオオムギ（Hordeum vulgare）オ は、配列番号２に対して少なくとも５０％、少なくとも ーソログ又は対立遺伝子変異体には、例えば、配列番号 ５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なく 10 ７０に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドがある とも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少 。配列番号２のイネ（Oryza sativa）オーソログには、 なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％ 例えば、配列番号４、配列番号６および配列番号８に示 、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６ されるアミノ酸配列を含むポリペプチドがある。配列番 ２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくと 号２のコムギ（Triticum aestivum）オーソログには、 も６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少な 例えば、配列番号７５、配列番号７６および配列番号７ くとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、 ７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドがある。 少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３ 【００６８】 ％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも 本明細書に記載の通り、ＣｓｌＨによりコードされる（ ７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なく １，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの「レ とも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少 20 ベル」の調節は、細胞中のＣｓｌＨ転写産物および／ま なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％ たはＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）− 、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８ β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドのレベルの調 ７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくと 節を含むと理解されるべきである。ＣｓｌＨによりコー も９０％、少なくとも９０．５％、少なくとも９１％、 ドされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンタ 少なくとも９１．５％、少なくとも９２％、少なくとも ーゼの「活性」の調節は、細胞中のＣｓｌＨによりコー ９２．５％、少なくとも９３％、少なくとも９３．５％ ドされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンタ 、少なくとも９４％、少なくとも９４．５％、少なくと ーゼの総活性、比活性、半減期および／または安定性の も９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、 調節を含むと理解されるべきである。 少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも 【００６９】 ９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％ 30 ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β− 、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％又は１００ Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性に ％のアミノ酸配列同一性を含む。 関する「調節」によって、細胞中のＣｓｌＨによりコー 【００６５】 ドされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンタ アミノ酸配列を比較する場合に、比較される配列は、配 ーゼのレベルおよび／または活性を減少または増加させ 列番号２の少なくとも１００個のアミノ酸残基、少なく ることを意図する。「減少させる」とは、例えば、細胞 とも２００個のアミノ酸残基、少なくとも４００個のア 中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）− ミノ酸残基、少なくとも８００個のアミノ酸残基、又は β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルまたは活性の１％ 全長にわたる比較ウィンドウと比較しうる。比較ウィン 、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６ ドウは、２つの配列の最適アライメントのための基準配 ０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３ 列（付加または欠失を含まない）と比較して、約２０％ 40 ％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含む場 、１００％の低下を意図する。「増加させる」とは、例 合がある。比較ウィンドウをアライメントするための配 えば、細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３； 列の最適アライメントは、Altschul et al.（Nucl. Aci １，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルまたは ds Res. 25: 3389-3402, 1997）が開示したプログラム 活性の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、 のＢＬＡＳＴファミリーのようなアルゴリズムをコンピ ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、 ュータに実装して実施することができる。 ２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍の増加 配列分析の詳細な検討は、Ausubel et al.のUnit 19.3 を意図する。「調節」とは同様に、ＣｓｌＨによりコー に記載されている（"Current Protocols in Molecular ドされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンタ Biology" John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15,1998）。 50 ーゼを、この導入される酵素を通常は発現していない細 胞に導入すること、またはそのような活性を通常有する ( 12 ) JP 23 5759176 B2 2015.8.5 24 細胞におけるＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１ （ｉｉ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対し ，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの実質的に完全な て少なくとも５０％の同一性を有するヌクレオチド配列 阻害を含む。 を含む核酸分子；および／または 【００７０】 （ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下で、配列番号１に いくつかの実施形態において、細胞により生成される（ 示されるヌクレオチド配列の１以上を含む核酸分子にハ １，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルは、細胞 イブリダイズする核酸分子 中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）− を含むと理解されるべきである。 β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活 【００７５】 性を増加させることにより増加される。別の実施形態に いくつかの実施形態において、ＣｓｌＨ核酸は、配列番 おいて、細胞により生成される（１，３；１，４）−β 10 号１に対して少なくとも５０％、少なくとも５１％、少 −Ｄ−グルカンのレベルは、細胞中のＣｓｌＨによりコ なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％ ードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシン 、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５ ターゼのレベルおよび／または活性を減少させることに ７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくと より減少される。 も６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少な 【００７１】 くとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、 本発明の方法は、細胞中のＣｓｌＨによりコードされる 少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８ （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレ ％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも ベルおよび／または活性を調節することができる、当技 ７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なく 術分野において公知の任意の手段を包含する。これには とも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少 、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β 20 なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％ −Ｄ−グルカンシンターゼアゴニストもしくはアンタゴ 、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８ ニストの適用のような、細胞中でのＣｓｌＨによりコー ２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくと ドされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンタ も８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少な ーゼの活性を調節する薬剤の適用、細胞中でのＣｓｌＨ くとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、 によりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グル 少なくとも９０．５％、少なくとも９１％、少なくとも カンシンターゼ活性を模擬する薬剤の適用、細胞中での ９１．５％、少なくとも９２％、少なくとも９２．５％ ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β− 、少なくとも９３％、少なくとも９３．５％、少なくと Ｄ−グルカンシンターゼをコードするＣｓｌＨ核酸の発 も９４％、少なくとも９４．５％、少なくとも９５％、 現の調節、または比活性、半減期および／もしくは安定 少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも 性の増加したもしくは減少した（１，３；１，４）−β 30 ９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％ −Ｄ−グルカンシンターゼが細胞によって発現されるよ 、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくと うな、細胞中での改変型もしくは変異型ＣｓｌＨ核酸の も９９％、少なくとも９９．５％又は１００％の配列同 発現の達成などが含まれる。 一性を含む。 【００７２】 【００７６】 いくつかの実施形態において、（１，３；１，４）−β 同一性の％を計算するために、核酸配列を配列番号１と −Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活性 比較する際に、比較されるヌクレオチド配列は、配列番 は、細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現を調節することにより 号１の少なくとも３００個のヌクレオチド残基、少なく 調節する。 とも６００個のヌクレオチド残基、少なくとも１２００ 【００７３】 個のヌクレオチド残基、少なくとも２４００個のヌクレ したがって、第２の態様において、本発明は、細胞中の 40 オチド残基、又は全長にわたる比較ウィンドウに対して （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレ 比較されるべきである。比較ウィンドウは、２個の配列 ベルおよび／または活性を調節する方法であって、細胞 の最適アライメントのための基準配列（付加または欠失 中のＣｓｌＨ核酸の発現を調節するステップを含む方法 を含まない）に対して比較したときに、約２０％以下の を提供する。 付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含む場合があ 【００７４】 る。比較ウィンドウをアライメントするための配列の最 本明細書において用いられる「ＣｓｌＨ核酸」という用 適アライメントは、Altschul et al.（Nucl. Acids Res 語は、以下： . 25: 3389-3402, 1997）が開示したプログラムのＢＬ （ｉ）本明細書において定義されるＣｓｌＨによりコー ＡＳＴファミリーのようなアルゴリズムをコンピュータ ドされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンタ に実装して実施することができる。配列分析の詳細な検 ーゼをコードする核酸分子；および／または 50 討は、Ausubel et al.のユニット１９．３に記載されて ( 13 ) JP 25 5759176 B2 2015.8.5 26 いる（"Current Protocols in Molecular Biology" Joh ゼーションおよび／または洗浄条件は、異なる度合いの n Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15,1998）。 相補性を有する配列に対してハイブリダイズするために 【００７７】 調整することができる。例えば、９０％以上の同一性を 上述したように、ＣｓｌＨ核酸は、ストリンジェントな 有する配列は、Ｔｍ を約１０℃下げることによりハイブ 条件下で配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む リダイズできる。一般に、ストリンジェントな条件は、 核酸分子に対してハイブリダイズする核酸を含みうる。 定義されたイオン強度およびｐＨにおける特定の配列お 本明細書において用いられる「ストリンジェントな」ハ よびその相補体の熱融解点（Ｔｍ ）よりも低くなるよう イブリダイゼーション条件とは、塩濃度が約１．５Ｍ 選択される。例えば、高ストリンジェンシー条件では、 Ｎａイオン未満であり、通常は約０．０１から１．０Ｍ 熱融解点（Ｔｍ ）よりも、例えば１、２、３、４または Ｎａイオン濃度（または他の塩）、ｐＨ７．０∼８． 10 ５℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／また ３であって、温度は少なくとも３０℃を条件とする。 は洗浄を利用することができる。中程度のストリンジェ ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安 ンシー条件では、熱融解点（Ｔｍ ）よりも、例えば６、 定化剤の添加によっても達成できる。ストリンジェント ７、８、９または１０℃低い温度でのハイブリダイゼー なハイブリダイゼーション条件は、低ストリンジェンシ ションおよび／または洗浄を利用することができる。低 ー条件、中程度のストリンジェンシー条件、または高ス ストリンジェンシー条件では、熱融解点（Ｔｍ ）よりも トリンジェンシー条件であってもよい。典型的な低スト 、例えば１２、１３、１４、１５または２０℃低い温度 リンジェンシー条件には、３７℃で３０％∼３５％ホル でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用 ムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸 することができる。上記式、ハイブリダイゼーションお ナトリウム）の緩衝溶液を使用するハイブリダイゼーシ よび洗浄組成と望ましいＴｍ を使用することにより、当 ョンと、５０∼５５℃で１×∼２×ＳＳＣ中での洗浄（ 20 業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶 ２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸 液のストリンジェンシーにおけるバリエーションが本来 三ナトリウム）を含む。典型的な中程度のストリンジェ 的に記載されていることを理解するだろう。望ましい程 ンシー条件には、３７℃で４０％∼４５％ホルムアミド 度のミスマッチは、４５℃未満（水溶性溶液）または３ 、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝溶液中でのハ ２℃未満（ホルムアミド溶液）のＴｍ の結果になるとす イブリダイゼーションと、５５℃∼６０℃で０．５×∼ れば、より高温を利用できるようにＳＳＣ濃度を高める １×ＳＳＣ中での洗浄を含む。典型的な高ストリンジェ ことができる。核酸のハイブリダイゼーションに関する ンシー条件には、３７℃で５０％ホルムアミド、１Ｍ 広範なガイドは、Tijssen（Laboratory Techniques in ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝溶液中でのハイブリダイゼ Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization w ーションと、６０℃∼６５℃での０．１×ＳＳＣの洗浄 ith Nucleic Acid Probes, Pt I, Chapter2, Elsevier, を含む。任意により、洗浄緩衝溶液は、約０．１％から 30 New York, 1993）、Ausubel et al.編（Current Proto 約１％のＳＤＳを含む場合もある。ハイブリダイゼーシ cols in MolecularBiology, Chapter 2, Greene Publis ョンの時間は、一般に約２４時間未満であり、通常は約 hing and Wiley-Interscience, New York, 1995）およ ４時間∼約１２時間である。 びSambrook et al.（Molecular Cloning: A Laboratory 【００７８】 Manual, 2 n d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pre ハイブリダイゼーションの特異性は、ハイブリダイゼー ss, Plainview, NY, 1989）に述べられている。 ション後の洗浄の関数でもあり、最終洗浄液のイオン強 【００７９】 度および温度により影響を受ける。ＤＮＡ−ＤＮＡハイ 本発明により想定されるさらなるＣｓｌＨ核酸の例とし ブリッドの場合、Ｔｍ はMeinkothおよびWahlの式（Anal ては、配列番号１のオーソログであるコード領域を有す . Biochem. 138: 267-284, 1984）から概算される。す なわち、Ｔｍ ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ Ｍ）＋ る核酸が含まれる。 40 【００８０】 ０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−５ 例えば、配列番号１のオオムギ（Hordeum vulgare）コ ００／Ｌである。ここでＭは、一価の陽イオンのモル濃 ード領域オーソログ又は対立遺伝子変異体には、例えば 度、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌ 、配列番号６９に示されるヌクレオチド配列を含む核酸 クレオチドの割合、％ホルムアミドは、ハイブリダイゼ がある。 ーション溶液中のホルムアミドの割合であり、Ｌは、塩 配列番号１のイネ（Oryza sativa）コード領域オーソロ 基対中のハイブリッド長さである。Ｔｍ は、相補的なタ グには、例えば、配列番号３、配列番号５および配列番 ーゲット配列の５０％が完全にマッチするプローブに対 号７に示されるヌクレオチド配列を含む核酸がある。配 してハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度お 列番号１のコムギ（Triticum aestivum）コード領域オ よびｐＨに基づく）である。Ｔｍ は、１％のミスマッチ ーソログには、例えば、配列番号７２、配列番号７３お ごとに約１℃下がる。したがって、Ｔｍ 、ハイブリダイ 50 よび配列番号７４に示されるヌクレオチド配列を含む核 ( 14 ) JP 27 5759176 B2 2015.8.5 28 酸がある。 的な方法は、内在性ＣｓｌＨ核酸の発現をアップレギュ 【００８１】 レーションまたはダウンレギュレーションさせるような 本発明により想定されるＣｓｌＨ核酸はまた、１以上の 細胞の遺伝的改変、ＣｓｌＨ核酸での形質転換による遺 非翻訳領域、例えば３’および５’非翻訳領域、および 伝的改変、細胞中での内在性ＣｓｌＨ核酸の発現を調節 ／またはイントロンを含んでもよい。例えば、本発明に する核酸分子の細胞への投与などを含む。 より想定されるＣｓｌＨ核酸は、例えば、ｍＲＮＡ配列 【００８６】 、ｃＤＮＡ配列またはゲノムヌクレオチド配列を含む。 いくつかの実施形態において、ＣｓｌＨ核酸の発現を、 【００８２】 細胞の遺伝子的改変により調節する。本明細書において いくつかの特定の実施形態において、ＣｓｌＨ核酸は、 用いられる「遺伝的に改変された」という用語は、細胞 １以上の非タンパク質コード領域および／または１以上 10 の遺伝的に改変されていない形態に比べて、遺伝的に改 のイントロンを含んでもよい、生物由来のゲノムヌクレ 変された細胞中でのＣｓｌＨ核酸の発現の改変に影響を オチド配列を含む。ＣｓｌＨ核酸を含むゲノムヌクレオ 及ぼす任意の遺伝的改変を含むと理解されるべきである チド配列としては、例えば以下が挙げられる： 。本明細書において包含される遺伝的改変の典型的なタ オオムギ（Hordeum vulgare）ＣｓｌＨゲノムヌクレオ イプとしては、トランスポゾン、化学物質、紫外線また チド配列、例えば配列番号９および／または配列番号７ はファージ突然変異誘発などのランダム突然変異誘発と １に示される配列； 、内在性ＣｓｌＨ核酸を過剰発現または過小発現する変 イネ（Oryza sativ）ＣｓｌＨゲノムヌクレオチド配列 異体の選別；細胞中でのＣｓｌＨ核酸の発現および／ま 、例えば配列番号１０、配列番号１１および／または配 たは過剰発現を指令する１以上の核酸分子の、細胞への 列番号１２のいずれか１以上に示される配列；ならびに 一過的または安定的導入；内在性ＣｓｌＨ核酸の部位特 ／あるいは 20 異的突然変異誘発；細胞中での内在性ＣｓｌＨ核酸の発 コムギ（Triticum aestivum）ＣｓｌＨゲノムヌクレオ 現を阻害する１以上の核酸分子、例えば、コサプレッシ チド配列、例えば配列番号７８、配列番号７９および／ ョン構築物またはＲＮＡｉ構築物の導入などが挙げられ または配列番号８０のいずれか１以上に示される配列。 る。 【００８３】 【００８７】 上記の通り、本発明は、細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現を 1つの特定の実施形態において、遺伝的改変は対象とな 調節する方法を提供する。本発明は、細胞中のＣｓｌＨ る細胞への核酸の導入を含む。 核酸の発現を調節することができる任意の方法を包含す 【００８８】 る。 核酸は、例えば、SambrookおよびRussell（Molecular C 【００８４】 loning - A Laboratory Manual, 3 ＣｓｌＨ核酸の発現に関して「調節する」という用語は 30 Harbor Laboratory Press, 2000）に述べられたものな 、一般的に、ＣｓｌＨ核酸の転写および／または翻訳を ど、使用される細胞種に適した、当技術分野において公 増加または減少させることを指す。「減少させる」とは 知の任意の方法を用いて導入することができる。 、例えば、ＣｓｌＨ核酸の転写および／または翻訳の１ 【００８９】 ％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、 細胞が植物細胞である本発明のいくつかの実施形態にお ６０％、７０％、８０％、９０％、 ９１％、９２％、 いて、核酸分子の導入のための適切な方法には、アグロ ９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９ バクテリウム（Agrobacterium）媒介性の形質転換、マ ９％、１００％の低下を包含している。「増加させる」 イクロプロジェクタイルボンバードメントに基づく形質 とは、例えば、ＣｓｌＨ核酸の転写および／または翻訳 転換方法および直接的ＤＮＡ取り込みに基づく方法が挙 の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０ げられる。Roa-Rodriguez et al.（Agrobacterium-medi ％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍 40 ated transformation of plants, 3 、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍以上の増加 lectual Property Resource, Canberra, Australia,200 を包含している。調節することはまた、通常特定の細胞 3）は、広範な植物種について、適切なアグロバクテリ 中では見いだされないＣｓｌＨ核酸の発現を導入するこ ウム（Agrobacterium）媒介性の植物形質転換方法を総 と、または通常当該活性を有する細胞中のＣｓｌＨ核酸 説している。マイクロプロジェクタイルボンバードメン の発現の実質的に完全な阻害（例、ノックアウト）を含 トは、植物組織を形質転換したり、植物、特に穀類植物 む。 の形質転換方法に使用されている。また、当該方法は、 【００８５】 Casas et al.（Plant Breeding Rev. 13: 235-264, 199 細胞中の特定の核酸分子の発現を調節する方法は、当技 5）により総説されている。プロトプラスト形質転換お 術分野において公知であり、本発明ではそのような任意 よびエレクトロポレーションなどの直接的なＤＮＡ取り の方法を包含する。ＣｓｌＨ核酸の発現を調節する典型 50 込みによる形質転換プロトコルは、Galbraith et al.（ r d Ed., Cold Spring r d Ed. CAMBIA Intel ( 15 ) JP 29 5759176 B2 2015.8.5 30 編）（Methods in Cell Biology Vol. 50, Academic Pr ，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのノック ess, San Diego, 1995）に詳しく述べられている。上記 アウトまたはノックダウンなどの方法を容易にする： 方法に加えて、さまざまな他の形質転換プロトコルを用 ノックアウト構築物との相同組換えによる、細胞中のＣ いてもよい。例えば、浸潤、細胞および組織のエレクト ｓｌＨ核酸のノックアウトまたはノックダウンを含む、 ロポレーション、胚のエレクトロポレーション、マイク 細胞中のＣｓｌＨ核酸の挿入突然変異（植物での標的化 ロインジェクション、花粉管経路、炭化ケイ素およびリ 遺伝子破壊の例としては、Terada et al., Nat. Biotec ポソーム媒介による形質転換が挙げられる。これらのよ hnol. 20: 1030-1034, 2002を参照）； うな方法は、Rakoczy-Trojanowska（Cell. Mol. Biol. 細胞中のＣｓｌＨ核酸の転写後遺伝子抑制（ＰＴＧＳ） Lett. 7: 849-858, 2002）により総説されている。他の またはＲＮＡｉ（ＰＴＳＧおよびＲＮＡｉの総説につい さまざまな植物形質転換方法もまた、当業者にとって明 10 ては、Sharp, Genes Dev. 15(5): 485-490, 2001、およ らかなものである。 びHannon, Nature 418: 244-51, 2002を参照）； 【００９０】 ＣｓｌＨ核酸を標的とするアンチセンス構築物での細胞 導入される核酸は、一本鎖であってもまたは二本鎖でも の形質転換（植物のアンチセンス抑制の例については、 よい。核酸は、ｍＲＮＡに転写され、ＣｓｌＨによりコ van der Krol et al.、Nature 333: 866-869、van der ードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシン Krol et al.、BioTechniques 6: 958-967、およびvan d ターゼまたは別のタンパク質に翻訳される。また核酸は er Krol et al.、Gen. Genet. 220: 204-212を参照）； 、ＲＮＡｉ構築物、コサプレッション構築物、アンチセ ＣｓｌＨ核酸を標的とするコサプレッション構築物での ンスＲＮＡ，ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ，ｎｔ 細胞の形質転換（植物のコサプレッションの例について ＲＮＡなどのような非翻訳ＲＮＡをコードしてもよく、 は、van der Krol et al.、Plant Cell 2(4): 291-299 あるいは、直接細胞中で作用してもよい。導入された核 20 を参照）； 酸は、未修飾のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはヌクレオ ＣｓｌＨ核酸を標的とする二本鎖ＲＮＡをコードする構 チド塩基、糖もしくはリン酸骨格に対する修飾を含むが 築物での細胞の形質転換（ｄｓＲＮＡ介在遺伝子抑制の 、核酸に対する機能的等価性を保持する修飾ＤＮＡもし 例については、Waterhouse et al.、Proc. Natl. Acad. くはＲＮＡの場合がある。導入された核酸は、細胞中で Sci. USA 95: 13959-13964, 1998を参照）； 任意により複製されてもよいし、細胞の染色体または染 ＣｓｌＨ核酸を標的とするｓｉＲＮＡまたはヘアピンＲ 色体外エレメントに組み込まれてもよいし、ならびに／ ＮＡをコードする構築物での細胞の形質転換（ｓｉＲＮ あるいは、細胞により転写されてもよい。導入された核 ＡまたはヘアピンＲＮＡ介在遺伝子抑制の例については 酸はまた、宿主細胞に関して同種または異種のいずれか 、Lu et al.、Nucl. Acids Res. 32(21): e171、doi:10 でよい。すなわち、導入された核酸は、遺伝的に改変さ .1093/nar/gnh170, 2004を参照）；ならびに／あるいは れた細胞と同じ生物種の細胞から得られるか（すなわち 30 ＣｓｌＨ核酸と機能的に連結されるようなｍｉＮＲＡ標 同種）、または導入された核酸は、異なる生物種から得 的配列の挿入（例えば、ｍｉＲＮＡが媒介する遺伝子抑 られる（すなわち異種）。トランスジーンは、合成トラ 制の例については、Brown et al., Blood 110(13): 414 ンスジーンでもよい。 4-4152, 2007参照）。 【００９１】 【００９４】 １つの特定の実施形態において、本発明は、ＣｓｌＨ核 本発明は、細胞に投与されるＣｓｌＨ核酸を標的とする 酸を細胞において発現、過剰発現または細胞に導入する ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡなどの合成オリゴヌク ことにより、細胞により生成される（１，３；１，４） レオチドの利用によって、細胞中のＣｓｌＨ核酸のダウ −β−Ｄ−グルカンのレベルを増加させることを包含す ンレギュレーションも促進するものである（合成ｓｉＲ る。 【００９２】 ＮＡ介在抑制の例については、Caplen et al.、Proc. N 40 atl. Acad. Sci. USA 98: 9742-9747, 2001、Elbashir （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコ et al.、Genes Dev.15: 188-200, 2001、Elbashir et a ードするＣｓｌＨヌクレオチド配列を同定することによ l.、Nature 411: 494-498, 2001、Elbashir et al.、EM り、さらなる実施形態において、本発明は、細胞中のＣ BO J. 20: 6877-6888, 2001、およびElbashir et al.、 ｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ Methods 26: 199-213, 2002を参照）。 −グルカンシンターゼの発現をダウンレギュレーション 【００９５】 する方法も提供する。 上記例の他に、導入された核酸は、ＣｓｌＨ核酸に直接 【００９３】 関係しないヌクレオチド配列を含むこともあるが、それ 例えば、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンタ でも、細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現を直接的または間接 ーゼをコードするＣｓｌＨ遺伝子の同定は、以下などの 的に調節することがある。例としては、細胞中の内在性 方法による細胞中でのＣｓｌＨによりコードされる（１ 50 ＣｓｌＨ核酸分子の発現を促進するまたは抑制する転写 ( 16 ) JP 31 5759176 B2 2015.8.5 32 因子または他のタンパク質をコードする核酸分子、直接 ーターが典型的に使用される。 的または間接的に内在性のＣｓｌＨによりコードされる 【０１００】 （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの発 植物の構成的プロモーターは、通常植物のほぼ全ての組 現を促進または抑制する他の非翻訳ＲＮＡなどがある。 織での発現を指令し、環境および発生的要因からは、概 【００９６】 ね独立している。本発明に従い使用することができる構 遺伝的に改変された細胞中での導入核酸の発現を達成す 成的プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイ るため、必要に応じ、導入核酸は１以上の制御配列に機 ルス３５Ｓおよび１９Ｓ（ＣａＭＶ３５ＳおよびＣａＭ 能的に連結されてもよい。「制御配列」という用語は、 Ｖ１９Ｓ）プロモーターなどの植物ウイルス由来のプロ 機能的に連結された核酸またはそれによりコードされる モーター、例えばアグロバクテリウム（Agrobacterium 転写産物もしくはタンパク質の転写、翻訳およびまたは 10 ）から得られるノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）プロモー 翻訳後修飾に必要なまたは有利な任意のヌクレオチド配 ターなど、アグロバクテリウム種（Agrobacterium spp. 列を含むと理解されるべきである。各制御配列は、機能 ）より得られるオパインプロモーターなどの細菌性植物 的に連結された核酸に対し生来的でもまたは外来性でも 病原体由来のプロモーター、およびルビスコ小サブユニ よい。制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配 ット遺伝子（ｒｂｃＳ）プロモーター、植物ユビキチン 列、プロペプチドをコードする配列、プロモーター、エ プロモーター（Ｐｕｂｉ）、イネアクチンプロモーター ンハンサーまたは上流の活性化配列、シグナルペプチド （Ｐａｃｔ）およびオートムギグロブリンプロモーター をコードする配列、および転写ターミネーターが挙げら などの植物由来のプロモーターが含まれる。 れるが、これらに限定されない。典型的には、制御配列 【０１０１】 はプロモーターを少なくとも含む。 「誘導性」プロモーターには、化学的に誘導可能なプロ 【００９７】 20 モーターおよび物理的に誘導可能なプロモーターが含ま 本明細書において用いられる「プロモーター」という用 れるが、これらに限定されない。化学的に誘導可能なプ 語は、細胞中の核酸分子の発現を実現する、活性化する ロモーターは、アルコール、抗生物質、ステロイド、金 、または増強する任意の核酸をいう。プロモーターは、 属イオンまたは他の化合物などの化学化合物により制御 一般的に、プロモーターが制御する遺伝子の５'（上流 される活性を有するプロモーターを含む。化学的に誘導 ）に位置させる。異種プロモーター／遺伝子の組み合わ 可能なプロモーターの例には、アルコール制御プロモー せである構築物において、プロモーターと遺伝子（該プ ター（例、欧州特許第６３７３３９号参照）、テトラサ ロモーターが自然環境において制御する遺伝子、すなわ イクリン制御プロモーター（例、米国特許第５，８５１ ち該プロモーターが由来する遺伝子）との間の距離にほ ，７９６号および米国特許第５，４６４，７５８号参照 ぼ等しい遺伝子転写開始部位からの距離に、プロモータ ）、グルココルチコイド受容体プロモーター（例、米国 ーを配置することが望ましい。 30 特許第５，５１２，４８３号参照）、エストロゲン受容 当技術分野において周知の通り、この距離の変更は、プ 体プロモーター（例、欧州特許出願第１ ２３２ ２７３ ロモーター機能を失うことなく収めることができる。 号参照）、エクジソン受容体プロモーター（例、米国特 【００９８】 許第６，３７９，９４５号参照）などのステロイド反応 プロモーターは、物理応力、病原体または特に金属イオ プロモーター、メタロチオネインプロモーター（例、米 ンなどの外部刺激に反応して、あるいは１以上の転写活 国特許４，９４０，６６１号、米国特許第４，５７９， 性化因子に反応して発現が生じる細胞、組織、器官また ８２１号および米国特許第４，６０１，９７８号参照） は発生段階に関し、構成的に、または特異的に、機能的 などの金属応答プロモーター、ならびにキチナーゼプロ に連結したヌクレオチドの発現を制御してもよい。つま モーターまたはリゾチームプロモーター（例、米国特許 り、本発明の方法に従って使用されるプロモーターは、 第５，６５４，４１４号参照）またはＰＲタンパク質プ 構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的 40 ロモーター（例、米国特許第５，６８９，０４４号、米 のプロモーターまたは活性化プロモーターを含んでもよ 国特許第５，７８９，２１４号、豪州特許第７０８８５ い。 ０号、米国特許第６，４２９，３６２号参照）などの病 【００９９】 因関連プロモーターを含む。 本発明は、対象となる細胞で活性を有する任意のプロモ 【０１０２】 ーターを使用することを包含している。つまり、細菌、 誘導性プロモーターは、温度（高温、低温とも）、光な 真菌、動物細胞または植物細胞のいずれかで活性を有す どの非化学的環境要因により制御される物理的に制御さ る多様なプロモーターは、当業者であれば容易に理解す れるプロモーターである場合もある。物理的に制御され るだろう。しかし、いくつかの実施形態においては、植 るプロモーターの例には、ヒートショックプロモーター 物細胞を使用する。これらの実施形態では、植物で活性 （例、米国特許第５,４４７８５８号、豪州特許第７３ な構成的、誘導性、組織特異的または活性可能なプロモ 50 ２８７２号、カナダ国特許出願第１３２４０９７号参照 ( 17 ) JP 33 5759176 B2 2015.8.5 34 ）、低温誘導性プロモーター（例、米国特許第６，４７ 例えば、Sorensen et al.、Mol.Gen. Genet. 250: 750- ９，２６０号、米国特許第６，０８４、０８号、米国特 760, 1996、Horvath et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. 許第６，１８４，４４３号および米国特許第５，８４７ USA 97: 1914-1919, 2000を参照）およびＷａｘｙ（Ｗ ，１０２号）、光誘導性プロモーター（例、米国特許第 ｘ）遺伝子プロモーター（例えば、Yao et al.、Acta P ５，７５０，３８５号およびカナダ国特許第１３２１５ hytophysiol. Sin. 22: 431-436, 1996、Terada et al. ６３号参照）、光抑制性プロモーター（例、ニュージー 、Plant Cell Physiol. 41: 881-888, 2000、Liu et al ランド特許第５０８１０３３号および米国特許第５，６ .、Transgenic Res. 12: 71-82, 2003を参照）がある。 ３９，９５２号）を含む。 １つの特定の実施形態において、種子特異的プロモータ 【０１０３】 ーは胚乳特異的プロモーターである。 「組織特異的プロモーター」には、選択的にまたは特異 10 【０１０６】 的に、生物中の１以上の特定の細胞、組織もしくは器官 プロモーターは、本明細書において「活性化可能プロモ 、および／または生物の１以上の発生段階で発現するプ ーター」と呼ばれる、１以上の所定の転写活性化因子に ロモーターが含まれる。組織特異的プロモーターは、場 より活性化可能であるプロモーターでもよい。例えば、 合によっては誘導性であってもよい。 活性化可能プロモーターは、上流活性化配列（ＵＡＳ） 【０１０４】 に機能的に連結された最小プロモーターを含む場合があ 植物の組織特異的プロモーターの例には、米国特許出願 る。これはとりわけ、１以上の転写活性化因子のＤＮＡ 第２００１０４７５２５号に記載された通りの根特異的 結合部位を含む。 プロモーター、欧州特許第３１６４４１号、米国特許第 【０１０７】 ５，７５３，４７５号および欧州特許出願第９７３９２ 本明細書に記載の通り、「最小プロモーター」という用 ２号に記載の通りの子房特異的および花托組織特異的プ 20 語は、少なくともＲＮＡポリメラーゼ結合部位、好まし ロモーターをはじめとする果実特異的プロモーター、な くはＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位および／また らびに豪州特許第６１２３２６号および欧州特許出願第 は１以上のＣＡＡＴボックスを組み入れた任意のプロモ ０７８１８４９号および豪州特許第７４６０３２号に記 ーターを含むと理解されるべきである。細胞が植物細胞 載の通りの種子特異的プロモーターが含まれる。 である場合、最小プロモーターは、例えばカリフラワー 【０１０５】 モザイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ ３５Ｓ）プロモー いくつかの実施形態において、組織特異的プロモーター ターに由来することができる。ＣａＭＶ ３５Ｓ由来の は、種子および／または穀粒特異的プロモーターである 最小プロモーターは、例えばＣａＭＶ ３５Ｓプロモー 。種子または穀粒特異的プロモーターの例には、ｐｕｒ ターの（転写開始部位の）−９０位から＋１位（−９０ ｏｉｎｄｏｌｉｎｅ−ｂ遺伝子プロモーター（例えば、 ＣａＭＶ ３５Ｓ最小プロモーターとも称される）、Ｃ Digeon et al.、Plant Mol. Biol. 39: 1101-1112, 199 30 ａＭＶ ３５Ｓプロモーターの−６０位から＋１位（− 9を参照）、Ｐｂｆ遺伝子プロモーター（例えば、Mena ６０ ＣａＭＶ ３５Ｓ最小プロモーターとも称される） et al.、Plant J. 16:53-62, 1998）、ＧＳ１ 遺伝 またはＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの−４５位から＋ 子プロモーター（例えば、Muhitch et al.、Plant Sci. １位（−４５ ＣａＭＶ３５Ｓ最小プロモーターとも称 − ２ 163:865-872, 2002）、グルテリンもしくはＧｔ１遺伝 される）に相当する配列を含むことができる。 子プロモーター（例えば、Okita et al., J. Biol. Che 【０１０８】 m. 264: 12573-12581, 1989、Zheng et al.、Plant J. 上述した通り、活性化可能プロモーターは、上流活性化 4: 357-366, 1993、Sindhu et al.、Plant Sci. 130: 1 配列（ＵＡＳ）に融合された最小プロモーターを含むこ 89-196, 1997、 Nandi et al.、Plant Sci. 163: 713-7 とがある。ＵＡＳは、最小プロモーターを活性化するた 22, 2002を参照）、Ｈｏｒ２−４遺伝子プロモーター（ 例えば、KnudsenおよびMuller, Planta 195: 330-336, めに転写活性因子を結合することが可能な任意の配列で 40 ありうる。転写活性因子の例として、例えば、Ｇａｌ４ 1991、Patel et al.、Mol. Breeding 6: 113-123, 2000 、Ｐｄｒ１、Ｇｃｎ４およびＡｃｅ１などの酵母由来の 、Wong et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 1632 転写活性因子、ＶＰ１６、Ｈａｐ１（Hach et al.、J B 5-16330, 2002を参照）、リポキシゲナーゼ１遺伝子プ iol Chem 278: 248-254, 2000）、Ｇａｆ１（Hoe et al ロモーター（例えば、Rouster et al.、Plant J. 15: 4 .、Gene 215(2): 319-328, 1998）、Ｅ２Ｆ（Albani et 35-440, 1998を参照）、Ｃｈｉ２６遺伝子プロモーター al.、J Biol Chem 275: 19258-19267, 2000）、ＨＡＮ （例えば、Leah et al.、Plant J. 6: 579-589, 1994を Ｄ２（Dai and Cserjesi, J Biol Chem 277: 12604-126 参照）、Ｇｌｕ−Ｄ１−１遺伝子プロモーター （例え 12, 2002）、ＮＲＦ−１およびＥＷＧ（Herzig et al. ば、Lamacchia et al.、J. Exp. Bot. 52: 243-250, 20 、J Cell Sci 113: 4263-4273, 2000）、Ｐ／ＣＡＦ（I 01、Zhang et al.、Theor. Appl. Genet. 106: 1139-11 toh et al.、Nucl Acids Res 28: 4291 - 4298, 2000） 46, 2003を参照）、Ｈｏｒ３−１遺伝子プロモーター（ 50 、ＭａｆＡ（Kataokaet al.、J Biol Chem 277: 49903- ( 18 ) JP 35 5759176 B2 2015.8.5 36 49910, 2002）、ヒト活性転写因子４（LiangおよびHai ーミネーター、ｐｉｎＩＩおよびｐｉｎＩＩＩターミネ 、J Biol Chem 272: 24088 - 24095, 1997）、Ｂｃｌ１ ーターなどのジャガイモのプロテイナーゼ阻害遺伝子（ ０（Liu et al.、Biochem Biophys Res Comm 320(1): 1 ｐｉｎ）ターミネーターが含まれる。 -6, 2004）、ＣＲＥＢ−Ｈ（Omori et al.、Nucl Acids 【０１１３】 Res 29: 2154 - 2162, 2001）、ＡＲＲ１およびＡＲＲ 細胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４ ２（Sakai et al.、Plant J 24(6): 703-711, 2000）、 ）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／また Ｆｏｓ（Szuts and Bienz, Proc Natl Acad Sci USA 97 は活性を調節することにより、細胞中の（１，３；１， : 5351-5356, 2000）、ＨＳＦ４（Tanabe et al.、J Bi ４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルを調節する ol Chem 274: 27845 - 27856, 1999）、ＭＡＭＬ１（Wu ことは、いくつかの産業上の用途がある。 et al.、Nat Genet 26: 484-489, 2000）などのウイル 10 【０１１４】 ス由来の転写活性因子が挙げられる。 例えば、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、粘 【０１０９】 性溶液を形成することで知られている。水溶性穀類（１ いくつかの実施形態において、ＵＡＳは、少なくともＧ ，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの粘性を生じる物性 ＡＬ４転写活性因子のＤＮＡ結合ドメインと結合可能な は穀類加工の多くの局面において重要な決定因子である ヌクレオチド配列を含む。ＵＡＳ配列は、少なくともＧ 。例えば、オオムギ麦芽および穀類添加物由来の不完全 ＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを含む転写活性因子と結合 に分解された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは する配列であり、本明細書において、ＵＡＳＧ と呼ぶ。 、麦汁およびビールの粘性に寄与できるが、麦汁分離お 特定の実施形態において、ＵＡＳＧ は、配列5’-CGGAGT よびビールのろ過における問題を伴う（例、Bamforth、 ACTGTCCTCCGAG-3’またはその機能的ホモログを含む。 Brew. Dig. 69 (5): 12-16, 1994を参照）。したがって 【０１１０】 20 、例えばいくつかの実施形態において、本発明は、ビー 本明細書に記載の通り、ＵＡＳＧ 配列の「機能的ホモロ ル製造への適性を高めるため、オオムギ粒の１以上の細 グ」は、少なくともＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと結 胞中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４） 合でき、ＵＡＳＧ ヌクレオチド配列と少なくとも５０％ −β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも８０ 活性を減じることにより、オオムギ粒中の（１，３；１ ％の同一性または少なくとも９０％の同一性を有するヌ ，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルを減じるために適用 クレオチド配列を含む任意のヌクレオチド配列をいうと することもできる。 理解されるべきである。 【０１１５】 【０１１１】 水溶性穀類（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、 活性化可能プロモーター中のＵＡＳ配列は、ＤＮＡ結合 ブタや家禽などの単胃動物に対して反栄養的な効果（an ドメイン標的配列の多数のタンデムリピートを含んでも 30 tinutritive effect）をもたらすとも考えられている。 よい。例えば、ＵＡＳＧ はその天然の状態においては、 「反栄養的」な効果は、胃内容物の粘度を高め、消化酵 ＤＮＡ結合ドメイン標的配列の４つのタンデムリピート 素の放散および酵素作用の分解産物の吸収を遅らせるこ を含む。したがって、ＤＮＡ結合ドメイン標的配列のタ とである。言い換えれば、これは成長率を遅らせること ンデムリピートの数に関して本明細書において用いられ につながる。さらに、家禽の飼料配合において、高い（ る「多数」という用語は、少なくとも２つ、少なくとも １，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン濃度は、「粘性の ３つまたは少なくとも４つのタンデムリピートを含むと 」糞に関係しており、これは（１，３；１，４）−β− 理解されるべきである。 Ｄ−グルカンの消化性が低いことを示し、かつ生産者に 【０１１２】 とって主要な取扱いおよび衛生上の問題になりうる。し 上記の通り、制御配列は、ターミネーターも含むことが たがって、別の実施形態において、本発明は、動物飼料 ある。「ターミネーター」という用語は、転写終了のシ 40 としての植物の適合性を改善するため、動物飼料に使用 グナルを示す転写ユニットの終端にあるＤＮＡ配列をい される植物の１以上の細胞中の（１，３；１，４）−β う。ターミネーターは、一般にポリアデニル化シグナル −Ｄ−グルカンのレベルを低下させるのに適用すること を含む３’非翻訳ＤＮＡ配列であって、一次転写産物の ができる。 ３’末端に対してポリアデニル化配列の付加を促進する 【０１１６】 。プロモーター配列と同様に、ターミネーターは、使用 しかしながら、穀類（１，３；１，４）−β−Ｄ−グル しようとする細胞、組織または器官で機能的な任意のタ カンは、ヒトおよび動物の食事における食物繊維の重要 ーミネーター配列であってもよい。植物細胞中で有用で な構成要素である。本明細書において用いられる「食物 ありうる適切なターミネーター配列の例には、ノパリン 繊維」という用語は、大腸における完全なもしくは部分 シンターゼ（ｎｏｓ）ターミネーター、ＣａＭＶ 的な発酵とともにヒト小腸での消化および吸収に抵抗性 ３５ Ｓターミネーター、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）タ 50 を示す植物の可食部または類似の炭水化物を含むと理解 ( 19 ) JP 37 5759176 B2 2015.8.5 38 されるべきである。 ＣｓｌＨ核酸を発現させるために使用することができる 「食物繊維」は、多糖類（特に（１，３；１，４）−β 多様な組換え発現系は当技術分野において周知である。 −Ｄ−グルカンを含む）、オリゴ糖、リグニンおよび関 組換え発現系の例は、大腸菌発現系などの細菌発現系（ 連する植物物質を含む。少なくともヒトの食事において Baneyx, Curr. Opin. Biotechnol. 10: 411-421, 1999 、食物繊維は、全般的な腸の調子、便通、血中コレステ おいて総説されている。例：Gene expression in recom ロールの低減、および／または血中グルコールの低減を binant microorganisms, Smith (編), Marcel Dekker, 含めた有益な生理的効果を促進する。 Inc. New York, 1994、およびProtein Expression Tech 【０１１７】 nologies: Current Status and Future Trends, Baneyx ヒトおよび単胃動物は、（１，３；１，４）−β−Ｄ− (編), Chapters 2 and 3, Horizon Bioscience, Norwi グルカンを分解する酵素を作らないが、いくぶんかの脱 10 ch, UK, 2004も参照）、バシラスｓｐｐ．発現系（例： 重合が胃および小腸で発生していることが示されている Protein Expression Technologies: Current Status an 。これは、片利共生微生物の活性によるものと推測され d FutureTrends, 前記, chapter 4を参照）、およびス る。水溶性（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンと他 トレプトミセスｓｐｐ．発現系（例：Practical Strept の非デンプン質の多糖類を比較すると、腸内細菌により omyces Genetics, Kieser 容易に発酵し、可消化エネルギーにわずかながら寄与す ohn Innes Foundation, Norwich, UK, 2000を参照）、 る。単胃動物における反栄養的効果とは対照的に、ヒト サッカロミセスｓｐｐ．、シゾサッカロミセス・ポンベ における高濃度のオートムギおよびオオムギ（１，３； 、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha） １，４）−β−Ｄ−グルカンは、特に食事後の血糖値お およびピチアｓｐｐ．の発現系、ならびに糸状菌発現系 よびインスリン反応を抑えることにより、非インスリン などの酵母発現系を含む真菌発現系（例：Protein Expr 依存の糖尿病にとって有益な効果をもたらす。食物中高 20 ession Technologies: Current Status and Future Tre 濃度の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン（例えば nds, 前記, chapters 5, 6および7、Buckholz and Glee ２０％ｗ／ｖ）は、食物から食物コレステロールまたは son, Bio/Technology 9(11): 1067-1072, 1991、Cregg 胆汁酸の吸収を抑えることにより、血清コレステロール et al.Mol. Biotechnol. 16(1): 23-52, 2000、Cereghi 濃度を下げることにも関連付けられている。 noおよびCregg, FEMS Microbiology Reviews 24: 45-66 【０１１８】 , 2000、Cregg したがって、別の実施形態において、本発明は、植物ま 0, 1993を参照）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ たはその部分中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカ Ｏ）細胞に基づく発現系（例：Protein Expression Tec ンレベルを高めることにより、食用植物または食用植物 hnologies: Current Status and Future Trends, 前記, 部分の食物繊維含有量を増加させることに適用すること chapter 9を参照）、バキュロウイルス発現系を含む昆 et al.(編), Chapter 17, J et al.、Bio/Technology 11: 905 - 91 もできる。いくつかの実施形態において、食用植物また 30 虫細胞培養（例：Protein Expression Technologies: C は植物の可食部分は、穀類植物またはその一部である。 urrent Status and Future Trends, 前記, chapter 8、 【０１１９】 KostおよびCondreay, Curr. Opin. Biotechnol. 10: 42 （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、特に（１→ 8-433, 1999、Baculovirus Expression Vectors: A Lab ３）−β−Ｄ−グルカンにおいて、他のいくつかの多糖 類と同じく、細網内系統の細胞の受容体との結合により oratory Manual WH Freeman & Co., New York, 1992、 およびThe Baculovirus Expression System: A Laborat 媒介されるプロセスにより、ヒトの免疫反応を変化させ ory Manual, Chapman & Hall, London, 1992を参照）、 るとも考えられている。さらに、血中の抗体が産生され タバコ、ダイズ、イネおよびトマト細胞発現系などの植 る前に、最初の防衛線として発動するシステムである、 物細胞発現系（例：Hellwig et al.、Nat Biotechnol 2 ヒトの補体経路のタンパク質を活性化する能力を有する ことがある。 2: 1415-1422, 2004の概説を参照）などを含む。 40 【０１２２】 【０１２０】 したがって、第３の態様において、本発明は、（１，３ 本発明は、組換え発現系における（１，３；１，４）− ；１，４）−β−Ｄ−グルカンの生成方法であって、単 β−Ｄ−グルカンの生成も促進する。例えば、（１，３ 離されたＣｓｌＨ核酸で細胞を形質転換するステップお ；１，４）−β−Ｄ−グルカンは、プロモーター制御下 よびその単離されたＣｓｌＨ核酸を細胞に発現させるス にてＣｓｌＨ核酸を細胞に導入することにより組換え技 テップを含む方法を提供する。 術によって生成することもでき、続いて細胞はＣｓｌＨ 【０１２３】 によりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グル いくつかの実施形態において、細胞は、先に定義された カンシンターゼを発現し、（１，３；１，４）−β−Ｄ 通りの組換え発現系から得られる細胞である。 −グルカンを生成する。 【０１２４】 【０１２１】 50 第４の態様において、本発明は、本発明の第３の態様の ( 20 ) JP 39 5759176 B2 2015.8.5 40 方法により生成された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グ ，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ、ならびに／ある ルカンも提供する。 いはその発現が調節されたＣｓｌＨ核酸分子を含む１以 【０１２５】 上の細胞を含む、上記穀粒を提供する。 第５の態様において、本発明は、 【０１３４】 同じ分類群の野生型細胞と比較してそのレベルおよび／ いくつかの実施形態において、穀粒は、同種と野生型穀 または活性が調節された、ＣｓｌＨによりコードされる 粒を比較した場合に、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グ （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ；な ルカンのレベルが高くてもよい。別の実施形態において らびに／あるいは 、穀粒は、同種由来の野生型穀粒と比較した場合に、（ 同じ分類群の野生型細胞と比較してその発現が調節され たＣｓｌＨ核酸 １，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンのレベルが低くて 10 もよい。 を含む細胞を提供する。 【０１３５】 【０１２６】 穀粒がコムギ粒であるいくつかの実施形態において、コ いくつかの実施形態において、細胞は、同じ分類群の野 ムギ粒は、風乾全粒の生体重基準で少なくとも１％、少 生型細胞と比較してそのレベルが調節された（１，３； なくとも１．１％、少なくとも１．２％、少なくとも１ １，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをさらに含む。 ．３％、少なくとも１．４％、少なくとも１．５％、少 【０１２７】 なくとも１．６％、少なくとも１．７％、少なくとも１ いくつかの実施形態において、本発明の第５の態様の細 ．８％または１．９％の（１，３；１，４）−β−Ｄ− 胞は、本明細書に記載された本発明の第１または第２の グルカンのレベルを含む。 態様の方法で作製される。別の実施形態において、細胞 【０１３６】 は植物細胞、単子葉植物細胞、イネ目植物細胞および／ 20 第８の態様において、本発明は、以下： または穀類植物細胞である。 本発明の第７の態様に記載の穀粒を製粉することにより 【０１２８】 製造される穀粉；および さらに、第６の態様において、本発明は、本発明の第５ 任意により、１以上の他の穀粒を製粉することにより製 の態様に係る１以上の細胞を含む多細胞構造物を提供す 造されたる穀粉 る。 を含む穀粉も提供する。 【０１２９】 【０１３７】 本明細書では、「多細胞構造物」は、１以上の細胞の任 したがって、本発明の第７の態様である穀粒を製粉して 意の凝集物を含む。したがって、「多細胞構造物」とい 生産される穀粉は、例えば、本発明の第９の態様の穀粉 う用語は特に組織、器官、生物全体およびその一部を包 の約１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％ 含する。 30 、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、 さらに、多細胞構造物は同様に、コロニー、植物カルス ９０重量％または１００重量％から構成されてもよい。 (plant calli)、懸濁培養物などの培養細胞の多細胞凝 【０１３８】 集物を包含すると理解されるべきである。 本明細書に述べるように、「製粉」は、Brennan et al. 【０１３０】 （Manual of Flour and Husk Milling, Brennan et al. 上記の通り、本発明のいくつかの実施形態において、細 （編）、 AgriMedia, ISBN: 3-86037-277-7）に述べら 胞は植物細胞であり、したがって本発明は、本発明の第 れた製粉などの、穀粒を製粉する当技術分野において周 ６の態様に係る１以上の植物細胞を含む植物全体、植物 知の任意の方法を包含する。 組織、植物器官、植物部分、植物繁殖材料または培養植 【０１３９】 物組織を含む。 【０１３１】 いくつかの実施形態において、穀粉に使用される本発明 40 の第７の態様である穀粒を製粉して製造される穀粉は、 別の実施形態において、本発明は、本発明の第５の態様 野生型粉と比較した場合により高いレベルの（１，３； に係る１以上の細胞を含む穀類植物を提供する。 １，４）−β−Ｄ−グルカンを含む。 【０１３２】 【０１４０】 特定の実施形態において、本発明は、本発明の第５の態 「１以上の他の穀粒を製粉して製造される穀粉」は、先 様に係る１以上の細胞を含む穀粒を提供する。 に定義された任意の穀類植物から得られる穀粒を製粉し 【０１３３】 て製造される穀粉である。本発明の第８の態様である穀 したがって、第７の態様において、本発明は、そのレベ 粉の成分は、例えば０重量％、１０重量％、２０重量％ ルが調節された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン 、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、 を含む穀粒であって、そのレベルおよび／または活性が ７０重量％、８０重量％または９０重量％を構成しても 調節された、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１ 50 よい。 ( 21 ) JP 41 5759176 B2 2015.8.5 42 【０１４１】 上記の通り、本発明は、ヌクレオチド配列の断片を提供 いくつかの実施形態において、１以上の他の穀粒を製粉 する。ヌクレオチド配列の「断片」とは、少なくとも１ して製造される穀粉は、小麦粉である。また、これによ ５、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００ り本発明の第８の態様の穀粉は、パン、ケーキ、ビスケ 、２５０、３００、３２５、３５０、３７５、４００、 ットなどを調理するのに特に適している。 ４５０、５００、５５０または６００ヌクレオチド（ｎ 【０１４２】 ｔ）長とすべきである。これらの断片には、以下に限定 上記の通り、本発明は、部分的には、（１，３；１，４ されないが、診断用プローブおよびプライマーを含む多 ）−β−Ｄ−グルカンシンターゼをコードするＣｓｌＨ 数の用途がある。もちろん、６０１∼３０００ｎｔ長の ヌクレオチド配列およびＣｓｌＨアミノ酸配列の同定お よび単離に基づく。 ものなどのより大きな断片も、全てではないが、Ｃｓｌ 10 Ｈ核酸の大部分に対応する断片と同様、本発明において 【０１４３】 有用である。 したがって、第９の態様において、本発明は、本明細書 【０１４７】 において上で定義した単離されたＣｓｌＨ核酸分子、又 いくつかの実施形態において、断片は、ＣｓｌＨ核酸の はその相補体、逆相補体若しくは断片を提供する。 機能的断片を含みうる。すなわち、本発明のポリヌクレ 【０１４４】 オチド断片は、本明細書に定義される通りの（１，３； 本発明において、「単離された」とは、元の環境（例え １，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの機能的活性を ば、それが天然に存在するならば天然の環境）から取り 有するポリペプチドをコードしうる。 出された物質をいい、したがって、「人の手によって」 【０１４８】 その天然の状態から改変されている。例えば、単離され 第１０の態様において、本発明は、本発明の第９の態様 たポリヌクレオチドは、ベクターもしくは組成物の一部 20 の単離された核酸分子を含む遺伝子構築物またはベクタ とすることができ、又は細胞内に含まれてもよく、その ーを提供する。 ベクター、組成物、または特定の細胞は該ポリヌクレオ 【０１４９】 チドの元の環境ではないので、依然として単離されてい ベクターまたは構築物は、さらに１以上の宿主の複製起 る。「単離された」核酸分子は同様に、当技術分野にお 点、１以上の宿主中で活性である選択可能なマーカー遺 いて公知の方法を用いた化学合成によりまたはインビト 伝子、または細胞中で単離された核酸分子の転写を可能 ロでの増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応など）によ にする１以上の制御配列のうちの１以上を含んでもよい り作製されるものを含めて、合成核酸分子を含むと理解 。 されるべきである。 【０１５０】 【０１４５】 「選択可能なマーカー遺伝子」は、細胞により発現され 本発明の単離された核酸分子は、ポリリボヌクレオチド 30 る場合に、これら形質転換された細胞の同定および／ま またはポリデオキシリボヌクレオチドを含む。これは、 たは選択を促進する表現型を細胞に与える任意のヌクレ 未修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮ オチド配列を含む。適切な選択マーカーをコードするヌ ＡもしくはＤＮＡでもよい。例えば、本発明の単離され クレオチド配列の範囲は、当技術分野において周知であ た核酸分子は、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖お る。選択マーカーをコードするヌクレオチド配列の例は よび二本鎖領域の混合であるＤＮＡ、一本鎖および二本 、抗生物質耐性遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子 鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および／もしくは二本鎖領域 、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝 の混合であるＲＮＡ、一本鎖、またはより典型的には二 子、抗生物質オーレオバシジンＡに対する耐性を与える 本鎖、もしくは一本鎖および二本鎖領域の混合でよいＤ ＡＵＲＩ−Ｃ遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェ ＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子を含んでもよい。 ラーゼ遺伝子（例：ｎｐｔＩおよびｎｐｔＩＩ）および さらに、単離された核酸分子は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ 40 ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（例 、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両者を含む三本鎖領域か ：ｈｐｔ）など、除草剤耐性遺伝子、例えばグルホシネ ら構成されてもよい。単離された核酸分子は、安定性ま ート（glufosinate）、ホスフィノトリシンまたはビア たは他の理由により修飾された１以上の塩基、またはＤ ラホス耐性遺伝子、例えばホスフィノトリシンアセチル ＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含んでよい。「修飾」塩基は トランスフェラーゼコード遺伝子（例：ｂａｒ）、３− 、例えば、イノシンなどのトリチル塩基および通常のも エノイルピルビルシキミ酸（shikimate）５−リン酸塩 のでない塩基を含む。さまざまな修飾をＤＮＡおよびＲ シンターゼをコードする遺伝子をはじめとするグリホサ ＮＡに対して実施することができることから、「ポリヌ ート耐性遺伝子（例：ａｒｏＡ）、ブロミキシニル（br クレオチド」は、化学的、酵素的または代謝的に修飾さ omyxnil）ニトリラーゼをコードする遺伝子をはじめと れた形態を含む。 するブロミキシニル（bromyxnil）耐性遺伝子、ジヒド 【０１４６】 50 ロプテレート（dihydropterate）シンターゼをコードす ( 22 ) JP 43 5759176 B2 2015.8.5 44 る遺伝子をはじめとするスルホンアミド（salfonamide 【０１５６】 ）耐性遺伝子（例：ｓｕｌ）およびアセトラクテートシ 当業者は、所望であれば、本明細書に記載された構築物 ンターゼをコードする遺伝子をはじめとするスルホニル をどのように作製するか、また、所望の条件下で特定の 尿素耐性遺伝子、ＧＵＳおよびクロラムフェニコールア 細胞または細胞種でその発現を得るための必要条件を知 セチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする遺伝 るであろう。特に、本発明を実施するために必要な遺伝 子などの酵素コードレポーター遺伝子、緑色蛍光タンパ 子操作は、大腸菌細胞などの原核細胞または植物細胞も ク質コード遺伝子などの蛍光レポーター遺伝子、ならび しくは動物細胞での、本明細書に記載の遺伝子構築物ま に、とりわけルシフェラーゼ遺伝子などの発光に基づく たはその誘導体の増殖を必要とすることが、当業者に公 レポーター遺伝子を含む。 【０１５１】 知であろう。核酸分子をクローニングするための方法例 10 は、Sambrook et al.（2000, 前記）に述べられている さらに、選択可能なマーカー遺伝子は、構築物中の個々 。 のオープンリーディングフレームであるか、あるいはＣ 【０１５７】 ｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ 第１１の態様において、本発明は、本発明の第９の態様 −グルカンシンターゼポリペプチドとの融合タンパク質 の単離された核酸分子または本発明の第１０の態様の遺 として発現する場合もあることに注目すべきである。 伝子構築物を含む細胞を提供する。 【０１５２】 【０１５８】 本発明の第１０の態様は、本明細書に記載の通り、原核 本発明の第１０もしくは第１１の態様の単離された核酸 生物または真核生物中の遺伝子構築物の維持および／ま 分子、または本発明の第１２の態様の遺伝子構築物は、 たは複製、ならびに／あるいは遺伝子構築物またはその 当技術分野において周知の任意の手段を介して細胞中に 一部を原核生物または真核生物細胞のゲノムに組み込ま 20 導入することができる。 せることを意図した、ヌクレオチド配列をさらに含む、 【０１５９】 本質的に全ての遺伝子構築物に及ぶ。 上記に言及される単離された核酸分子または構築物は、 【０１５３】 エピソーム（例：プラスミド、コスミド、人工染色体ま いくつかの実施形態において、ベクターまたは構築物は たは同様のもの）の一部分として、ＤＮＡ分子として細 、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換 胞中に維持されてもよいし、あるいは細胞のゲノムＤＮ により植物細胞に少なくとも一部移入されるようにつく Ａに組み込まれてもよい。 られる。 【０１６０】 したがって、ベクターまたは構築物は、左および／また 本明細書において用いられる「ゲノムＤＮＡ」という用 は右Ｔ−ＤＮＡ境界配列を含む。 語は、その最も広義な背景において、細胞の遺伝子相補 【０１５４】 30 体を構成するあらゆるＤＮＡを含むと理解されるべきで 適切なＴ−ＤＮＡ境界配列は、当業者によって容易に確 ある。したがって、細胞のゲノムＤＮＡは、染色体、ミ 認されよう。しかしながら、「Ｔ−ＤＮＡ境界配列」と トコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ 、葉緑体ＤＮＡ、 いう用語は、アグロバクテリウム属の種（Agrobacteriu 内在性プラスミドＤＮＡなどを含むと理解されるべきで m sp）の細胞からアグロバクテリウム（Agrobacterium ある。したがって、「ゲノムに組み込まれた」という用 ）媒介性の形質転換を受けやすい植物細胞に移入される 語は、染色体への組み込み、ミトコンドリアＤＮＡへの 核酸分子の範囲を定める、実質的に相同のおよび実質的 組み込み、色素体ＤＮＡへの組み込み、葉緑体ＤＮＡへ に直接反復性のヌクレオチド配列を含む。例えば、Pera の組み込み、内在性プラスミドへの組み込みなどを包含 ltaおよびReamによる論文（Proc. Natl. Acad. Sci. US する。 A, 82(15): 5112-5116, 1985）およびGelvinの概説（Mi 【０１６１】 crobiology and Molecular Biology Reviews, 67(1): 1 40 単離された核酸分子は、とりわけ、細胞が単離された核 6-37, 2003）を参照されたい。 酸分子を発現するように、制御配列および／またはプロ 【０１５５】 モーターに機能的に連結することができる。 いくつかの実施形態において、ベクターまたは構築物は 【０１６２】 、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換 細胞は、原核細胞または真核細胞でありうる。したがっ を介して植物に移入するためにつくられているが、本発 て、細胞は大腸菌細胞もしくはアグロバクテリウム属の 明は、例えばBroothaerts et al.（Nature 433: 629-63 種（Agrobacterium spp.）の細胞を含む細菌細胞、また 3, 2005）に記載されているようなアグロバクテリウム は古細菌細胞などの原核細胞とすることができる。細胞 属の種（Agrobacterium sp.）以外の細菌を介して、細 は、酵母細胞または菌糸真菌細胞などの真菌細胞、哺乳 菌媒介による植物細胞への導入を促進する遺伝子構築物 類細胞または昆虫細胞などの動物細胞、または植物細胞 に対する任意の適切な改変も包含している。 50 を含む真核細胞であってもよい。特定の実施形態におい ( 23 ) JP 45 5759176 B2 2015.8.5 46 て、細胞は植物細胞である。いくつかの実施形態におい 修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、 て、植物細胞は、単子葉植物細胞、イネ目植物細胞また アミド化、ビオチン化、フラビンの共有結合、ヘム部分 は穀物植物細胞である。 の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の 【０１６３】 共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファ 第１２の態様において、本発明は、本発明の第１１の態 チジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフ 様の１以上の細胞を含む、本明細書において上で定義し ィド結合の形成、脱メチル反応、共有結合性架橋の形成 た多細胞構造物を提供する。 、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミ 【０１６４】 ル化、ガンマカルボキシル化、グルコシル化、ＧＰＩア 上記の通り、いくつかの実施形態において、細胞は植物 ンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、 細胞であり、したがって本発明は、本発明の第１１の態 10 ミリストイル化、酸化、ポリエチレングリコール（ＰＥ 様の１以上の細胞を含む植物全体、植物組織、植物器官 Ｇ）付加、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プ 、植物部分、植物繁殖材料または培養植物組織を特に含 レニル化、ラセミ化、セレノル化、硫酸化、アルギニル むと理解されるべきである。 化およびユビキンチン化などのトランスファーＲＮＡ媒 【０１６５】 介によるタンパク質へのアミノ酸付加が含まれる（例と 別の実施形態において、本発明は、本発明の第１１の態 しては、Proteins--Structure And Molecular Properti 様の１以上の細胞を含む、単子葉植物、イネ目植物もし es 2 くは穀類植物またはその部分を提供する。 ny, New York, 1993、Posttranslational Covalent Mod 【０１６６】 ification Of Proteins, Johnson (編), Academic Pres いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の第１ s, New York, 1983、Seifter et al., Meth Enzymol 18 １の態様の１以上の細胞を含む穀粒を提供する。 n d 20 Ed., Creighton (編), W. H. Freeman and Compa 2: 626-646, 1990、Rattan et al., Ann NY Acad Sci 6 【０１６７】 63: 48-62,1992を参照）。 上記の通り、本発明は、ＣｓｌＨによりコードされる（ 【０１７２】 １，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼのアミ 上記の通り、本発明は、単離されたポリペプチドの断片 ノ酸配列も提供する。したがって、第１３の態様におい も提供する。ポリペプチド断片は、該断片が「自立」す て、本発明は、本明細書において上で定義した、Ｃｓｌ るかまたは一部もしくは領域を形成する大きなポリペプ Ｈによりコードされる単離された（１，３；１，４）− チド内に含まれてもよい。 β−Ｄ−グルカンシンターゼ、またはその断片を提供す 【０１７３】 る。 ポリペプチド断片は、少なくとも３、４、５、６、８、 【０１６８】 ９、１０、１１、１２、１３、１５、２０、２５、３０ 単離されたポリペプチドは、ペプチド結合または修飾ペ 30 、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、 プチド結合、すなわちペプチドイソスター（isostere） １００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ によって互いに連結されたアミノ酸を含み、２０種の遺 アミノ酸長でありうる。 伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。本 【０１７４】 発明の単離されたポリペプチドは、翻訳後プロセシング いくつかの実施形態において、断片は、機能的断片であ などの天然のプロセス、または当技術分野において周知 り、従って、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシ である化学的修飾技術により修飾されてもよい。 ンターゼの機能的活性を含む。しかしながら、該断片は 【０１６９】 、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β 修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖および／または末 −Ｄ−グルカンシンターゼの１以上の生物学的機能を保 端を含めて、単離されたポリペプチドのどこで行われて 有しないにもかかわらず、他の機能的活性は依然として もよい。同じ種類の修飾は、所定の単離されたポリペプ 40 保有されてもよい。 チドの複数部位で同程度または種々の程度で存在しても 例えば、該断片はＣｓｌＨによりコードされる（１，３ よいことが理解されるだろう。また、本発明の単離され ；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの機能的活性 たポリペプチドは、多数の種類の修飾を含んでもよい。 を欠くが、ＣｓｌＨによりコードされる単離された（１ 【０１７０】 ，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプ ポリペプチドは、例えばユビキチン化の結果として分岐 チドの完全形態または成熟形態を認識する抗体に対して しても、および／または、分岐の有無にかかわらず環状 導入および／または結合する能力を保有する。ＣｓｌＨ でもよい。環状の、分岐した、および分岐した環状ポリ によりコードされる単離された（１，３；１，４）−β ペプチドは、翻訳後自然プロセスの結果であっても、あ −Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドの完全形態また るいは合成方法により作製されてもよい。 は成熟形態を認識する抗体を誘導するおよび／またはそ 【０１７１】 50 れに結合する能力を有するペプチド、ポリペプチドまた ( 24 ) JP 47 5759176 B2 2015.8.5 48 はタンパク質断片は、本明細書において「ＣｓｌＨによ たい。 りコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン 【０１７９】 シンターゼエピトープ」と呼ぶ。 したがって、第１４の態様において、本発明は、上記に 【０１７５】 定義の、ＣｓｌＨによりコードされる単離された（１， ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β− ３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチ Ｄ−グルカンシンターゼエピトープは、３∼４個の少な ドまたはそのエピトープに対して生起された、抗体また いアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、エピ はそのエピトープ結合性フラグメントを提供する。 トープは、例えば少なくとも５個、少なくとも１０個、 【０１８０】 少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１０ 本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル ０個または少なくとも２００個のアミノ酸残基を含んで 10 抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａ もよい。ＣｓｌＨによりコードされる単離された（１， ｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発 ３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチ 現ライブラリーにより産生されるフラグメントおよび上 ドの特定のエピトープが当該免疫学的活性を保有してい 記のいずれかのエピトープ結合性フラグメントを含むが るかどうかは、当技術分野で周知の方法により容易に判 、これらに限定されない。 定することができる。したがって、１つのＣｓｌＨによ 【０１８１】 りコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン 本明細書において用いられる「抗体」という用語は、免 シンターゼポリペプチド断片は、１以上の、ＣｓｌＨに 疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的 よりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカ 活性部分、すなわち、抗原に対して免疫特異的に結合す ンシンターゼエピトープを含むポリペプチドである。 る抗原結合部位を含む分子をいう。本発明の免疫グロブ 【０１７６】 20 リン分子は、免疫グロブリン分子の任意の種類（例、Ｉ １以上の、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１， ｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ） ４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを含むポ 、クラス（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ リペプチドは、当技術分野で周知の合成および組換え方 ４，ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり 法を含むポリペプチドを生成する慣用的な手段により作 うる。 製することができる。いくつかの実施形態において、Ｃ 【０１８２】 ｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ 本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性 −グルカンシンターゼエピトープを持つポリペプチドは またはより多重特異性でもよい。多重特異性抗体は、本 、化学合成の周知の方法を用いて合成されてもよい。 発明のポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的 例えば、Houghtenは、多数のペプチドを合成する単純な であってもよいし、あるいは異種ポリペプチドまたは固 方法を述べている（Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. 30 相担体材料などの異種エピトープと本発明のポリペプチ USA 82: 5131-5135, 1985）。 ドとの両者に対して特異的であってもよい。例えば、Ｐ 【０１７７】 ＣＴ公開ＷＯ９３／１７７１５号、ＷＯ９２／０８８０ ＣｓｌＨによりコードされる単離された（１，３；１， ２号、ＷＯ９１／００３６０号、ＷＯ９２／０５７９３ ４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチド、およ 号、Tutt et al.、J. Immunol. 147: 60-69, 1991、米 びＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β 国特許第４，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８ −Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを有するポリペプ １号、同第４，９２５，６４８号、同第５，５７３，９ チドは、例えば、本発明のＣｓｌＨによりコードされる ２０号、同第５，６０１，８１９号、およびKostelny e 単離された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシン t al.、J. Immunol. 148: 1547-1553, 1992を参照され ターゼポリペプチドと結合する抗体の生成において有用 である。 たい。 40 【０１８３】 【０１７８】 いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、Ｃｓｌ 当該抗体は、とりわけ（１，３；１，４）−β−Ｄ−グ Ｈによりコードされる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グ ルカンシンターゼポリペプチドの検出および局在決定に ルカンシンターゼのアゴニストまたはアンタゴニストと おいて、また、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン して作用してもよい。別の実施形態において、本発明の シンターゼポリペプチドのアフィニティ精製において有 抗体は、例えばインビトロおよびインビボ診断および治 用である。抗体は、当技術分野において周知の方法を用 療方法の両者をはじめとする本発明のポリペプチドの精 いて、多様な定性的または定量的イムノアッセイにおい 製、検出および標的化のために使用してもよい。例えば て、慣用的に使用することができる。例えば、Harlow e 、抗体は、生体サンプル中のＣｓｌＨによりコードされ t al.、Antibodies:A Laboratory Manual,（Cold Sprin る（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼの g Harbor Laboratory Press 2 n d Ed., 1988）を参照され 50 レベルを定性的にかつ定量的に測定するためのイムノア ( 25 ) JP 49 5759176 B2 2015.8.5 50 ッセイにおいて使用しうる。例として、Harlow et al. Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドまたは１以上の、 、Antibodies: A Laboratory Manual （Cold Spring Ha ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β− rbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988）を参照された Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを含むポリペプチド い。 に対するポリクローナル抗体は、当技術分野で周知の様 【０１８４】 々な手法により作製することができる。例えば、本発明 本明細書において用いられる「抗体」という用語は、例 のポリペプチドは、抗原に対し特異的なポリクローナル えば、共有結合によって抗体がＣｓｌＨによりコードさ 抗体を含む血清の産生を誘発するため、限定するもので れる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ はないが、ウサギ、マウス、ラット等の様々な宿主動物 またはそのエピトープと結合するのを妨げないような任 に投与することができる。例えばフロイントアジュバン 意のタイプの分子の抗体への共有結合により、修飾され 10 ト（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミ ている誘導体を包含すると理解されるべきである。例え ネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロ ば、抗体の誘導体は、例えばグルコシル化、アセチル化 ニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマル 、ＰＥＧ付加、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロ ジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロ ッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞 フェノール、およびＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌）お リガンドまたは他のタンパク質との結合などにより修飾 よびコリネバクテリウム・パルバムなど潜在的に有用な されている抗体を含む。さらに、多くの化学的修飾のい ヒトのアジュバントなど、様々なアジュバントを、宿主 ずれを公知の技術によって行ってもよい。これらは特定 動物種に応じて免疫反応を高めるために使用してもよい の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシ 。当該アジュバントもまた、当技術分野において周知で ンの代謝合成などを含む。さらに、誘導体は１以上の非 ある。 古典的アミノ酸を含んでもよい。 20 【０１８９】 【０１８５】 別の例として、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ 抗体は、当技術分野で公知の方法を用いて生成すること 、遺伝子組換えおよびファージディスプレイ技術、また ができる。 はその組み合わせの利用をはじめとする当技術分野で周 【０１８６】 知の多様な技術を使用して調製することができる。例え 例えば、インビボ免疫法を使用する場合、動物を遊離ペ ば、モノクローナル抗体は、当技術分野で周知であって プチドで免疫してもよいが、抗ペプチド抗体力価は、キ 、例えば、Harlow et al.、Antibodies: A Laboratory ーホールリンペットヘモシアニンまたは破傷風トキソイ Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd e ドなどの、高分子キャリアにペプチドを結合することに d., 1988）およびHammerling et al.、Monoclonal Anti より、増強させることができる。例えば、システイン残 bodies and T-Cell Hybridomas （Elsecier, NY, 1981 基を含むペプチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒド 30 ）などに教示されているものを含むハイブリドーマ技術 ロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）法などのリン を用いて作製することができる。本明細書において用い カーを用いてキャリアに結合させてもよく、一方、他の られる「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリ ペプチドは、グルタルアルデヒドなどのより一般的な架 ドーマ技術により産生される抗体に限定されるものでは 橋剤を用いてキャリアに結合させてもよい。 ない。「モノクローナル抗体」は、真核生物、原核生物 【０１８７】 およびファージクローンを含む任意の単一クローンから ウサギ、ラット、マウスなどの動物は、例えば遊離ペプ 誘導され、また抗体が生成される方法以外に由来する抗 チドまたはキャリアを結合したペプチドを用いて、約１ 体をいう。 ００マイクログラムのペプチドまたはキャリアタンパク 【０１９０】 質およびフロイントアジュバントを含むエマルジョンを ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を生成し、スク 腹腔内および／または皮内注射することにより、免疫す 40 リーニングする方法は、慣用的に行われ、当技術分野で ることができる。例えば固体表面に吸着する遊離ペプチ 周知である。例えば、マウスは、本発明のポリペプチド ドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより、約２週間隔で、 または当該ペプチドを発現する細胞により免疫すること 検出可能な抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するため ができる。免疫応答が検出されると、例えば、抗原に特 に、何回かの追加免疫注射が必要となることもある。免 異的な抗体がマウスの血清中で検出された後、マウスの 疫された動物の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペ 脾臓を摘出し、脾細胞を単離する。脾細胞は、周知の技 プチド抗体の選別により、例えば、当技術分野で周知の 術により、例えばＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２ 方法により固相支持体上へのペプチドの吸着と、選択さ ０由来の細胞などの適切な骨髄腫細胞に融合させる。ハ れた抗体の溶出により、高めてもよい。 イブリドーマを選択し、限界希釈によりクローニングす 【０１８８】 る。ハイブリドーマクローンは、本発明のポリペプチド ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）−β− 50 と結合することのできる抗体を分泌する細胞について、 ( 26 ) JP 51 5759176 B2 2015.8.5 52 当技術分野で周知の方法によりアッセイする。一般に高 号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２ レベルの抗体を含む腹水は、陽性ハイブリドーマクロー ７号、同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９ ンを有するマウスを免疫することにより生成することが ，１０８号により開示された方法が挙げられる。 できる。 【０１９４】 【０１９１】 ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域を単離 １以上の、ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１， し、全抗体または任意の望ましい他の抗原結合性フラグ ４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼエピトープを認識す メントを生成するために使用することができ、哺乳動物 る抗体フラグメントは、公知の技術によって作製するこ 細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌および細菌を含む、 とができる。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラ 任意の望ましい宿主で発現させることができる。例えば グメントは、（Ｆａｂフラグメントを生成するため）パ 10 、組換え技術によりＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’ パインなどの酵素、またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フ ）２フラグメントを生産するための技術はまた、ＰＣＴ ラグメントを生成するため）を用いて、免疫グロブリン 公開ＷＯ９２／２２３２４、Mullinax et al.（BioTech 分子のタンパク質分解性切断により生成することができ niques 12(6): 864-869, 1992）およびSawai et al.（A る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定 JRI 34:26-34, 1995）およびBetter et al.（Science 2 常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。 40: 1041-1043, 1988）に開示された方法など当技術分 【０１９２】 野で周知の方法を用いて、使用することも可能である。 本発明の抗体は、当技術分野において周知の種々のファ 【０１９５】 ージディスプレイ法を用いて生成することもできる。フ 一本鎖Ｆｖおよび抗体を生産するために使用可能な技術 ァージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは の例は、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５ 、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保持する 20 ，２５８，４９８号、Huston et al.（Methods in Enzy ファージ粒子の表面に提示（ディスプレイ）される。特 mology 203: 46-88, 1991）、Shu et al.（Proc. Natl. 定の実施形態において、当該ファージはレパートリーま Acad. Sci. USA 90: 7995-7999, 1993）およびSkerra たはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例：ヒトまた et al.（Science 240: 1038-1040, 1988）に記載されて はマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示する いる。 ために使用することができる。対象とする抗原と結合す 以下、本発明の実施形態を示す。 る抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば標識 （１）細胞により生成される（１，３；１，４）−β− 化された抗原、または固体表面もしくはビーズに結合も Ｄ−グルカンのレベルを調節する方法であって、該細胞 しくは捕捉された抗原などを使用し、選択または同定す 中のＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４）− ることができる。これら方法に使用されるファージは、 β−Ｄ−グルカンシンターゼのレベルおよび／または活 典型的には、該ファージにより発現されるｆｄおよびＭ 30 性を調節するステップを含む方法。 １３結合ドメインを、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝 （２）細胞中の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン 子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え技術によって シンターゼのレベルおよび／または活性を調節する方法 融合したＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗 であって、該細胞中のＣｓｌＨ核酸の発現を調節するス 体ドメインと共に含む、線状ファージである。 テップを含む方法。 【０１９３】 （３）（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの生成方 ファージディスプレイ法の例としては、Brinkman et al 法であって、単離されたＣｓｌＨ核酸で細胞を形質転換 .（J. Immunol. Methods 182: 41-50, 1995）、Ames et するステップ、および該細胞に該単離されたＣｓｌＨ核 al.（J. Immunol. Methods 184: 177-186, 1995）、Ke 酸を発現させるステップを含む方法。 ttleborough et al.（Eur. J. Immunol. 24: 952-958, （４）前記細胞が植物細胞である、（１）∼（３）のい 1994）、Persic et al.（Gene 187: 9-18,1997）、Burt 40 ずれか１に記載の方法。 on et al.（Advances in Immunology 57: 191-280, 199 （５）前記細胞が単子葉植物細胞である、（４）に記載 4）、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９号、ＷＯ９１／ の方法。 １０７３７号、ＷＯ９２／０１０４７号、ＷＯ９２／１ （６）前記細胞が穀類植物細胞である、（４）または（ ８６１９号、ＷＯ９３／１１２３６号、ＷＯ９５／１５ ５）に記載の方法。 ９８２号、ＷＯ９５／２０４０１号および米国特許第５ （７）（３）に記載の方法により生成された（１，３； ，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第 １，４）−β−Ｄ−グルカン。 ５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同 （８）以下： 第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、 同じ分類群の野生型細胞と比較してそのレベルおよび／ 同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号 または活性が調節された、ＣｓｌＨによりコードされる 、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７ 50 （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ；な ( 27 ) JP 53 5759176 B2 2015.8.5 54 らびに／あるいは 物繁殖材料、または培養植物組織からなるリストより選 同じ分類群の野生型細胞と比較してその発現が調節され 択される、（２６）に記載の多細胞構造物。 たＣｓｌＨ核酸 （２８）穀類植物、またはその組織、器官もしくは部分 のいずれか１以上を含む細胞。 を含む、（２６）または（２７）に記載の多細胞構造物 （９）同じ分類群の野生型細胞と比較してそのレベルが 。 調節された（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンをさ （２９）穀粒を含む、（２８）に記載の多細胞構造物。 らに含む、（８）に記載の細胞。 （３０）ＣｓｌＨによりコードされる（１，３；１，４ （１０）（１）または（２）に記載の方法により作製さ ）−β−Ｄ−グルカンシンターゼポリペプチドまたはそ れた、（８）または（９）に記載の細胞。 の断片を規定するアミノ酸配列を含む、単離されたポリ （１１）植物細胞である、（８）∼（１０）のいずれか 10 ペプチド。 １に記載の細胞。 （３１）ポリペプチドまたはその断片が、ＣｓｌＨによ （１２）単子葉植物細胞である、（１１）に記載の細胞 りコードされる１以上の（１，３；１，４）−β−Ｄ− 。 グルカンシンターゼエピトープを含む、（３１）に記載 （１３）穀類植物細胞である、（１１）または（１２） の単離されたポリペプチド。 に記載の細胞。 （３２）（３０）または（３１）に記載の単離されたポ （１４）（８）∼（１３）のいずれか１に記載の１以上 リペプチドまたはその断片に対して生起された抗体また の細胞を含む多細胞構造物。 はそのエプトープ結合性フラグメント。 （１５）植物全体、植物組織、植物器官、植物部分、植 【０１９６】 物繁殖材料、または培養植物組織からなるリストより選 本発明をさらに、以下の非限定的な実施例により説明す 択される、（１４）に記載の多細胞構造物。 20 る。 （１６）穀類植物、またはその組織、器官もしくは部分 【実施例１】 を含む、（１４）または（１５）に記載の多細胞構造物 【０１９７】 。 オオムギはＣＳＬＨ遺伝子を１種だけ有する （１７）穀粒を含む、（１６）に記載の多細胞構造物。 オオムギ中の候補ＣＳＬＨ遺伝子を、コメＣＳＬＨ配列 （１８）そのレベルが調節された（１，３；１，４）− とともに、中止になったStanford cell wall website、 β−Ｄ−グルカンを含む穀粒であって、そのレベルおよ NCBI、HarvEST、GrainGenes、Barley Gene Indexおよび び／または活性が調節された、ＣｓｌＨによりコードさ Barley BaseなどのオンラインＥＳＴデータベースに照 れる（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ 会することによりまず同定する。オオムギ由来の全ＣＳ 、ならびに／あるいはその発現が調節されたＣｓｌＨ核 ＬＨ関連ＥＳＴは、全長３’非翻訳領域（ＵＴＲ）およ 酸を含む１以上の細胞を含む、上記穀粒。 30 びタンパク質のＣＯＯＨ末端の４８８個の（予測では約 （１９）以下： ７５０の）アミノ酸残基をコードする領域に含まれる約 （１７）または（１８）に記載の穀粒を製粉することに １，５００ｂｐの単一の連続配列にアライメントできた より製造される穀粉；および （表２）。この遺伝子をＨｖＣｓｌＨ１と名付けた。Ｈ 任意により、１以上の他の穀粒を製粉することにより製 ｖＣｓｌＨ１由来プローブを用いたオオムギＢＡＣライ 造される穀粉 ブラリのスクリーニングにより、すべてがＨｖＣｓｌＨ を含む穀粉。 １を含むいくつかのゲノムクローンが同定され、これに （２０）単離されたＣｓｌＨ核酸、又はその相補体、逆 より、欠落した５’末端が得られた（データ非掲載）。 相補体もしくは断片。 単一の２，２５６ｂｐＯＲＦを含み、推定分子量８２． （２１）（２０）に記載の単離された核酸分子を含む遺 伝子構築物またはベクター。 ６ｋＤａおよびｐＩ７．０であるタンパク質をコードす 40 る、２，４３０ｂｐのＨｖＣｓｌＨ１ ｃＤＮＡ断片を （２２）（２０）に記載の単離された核酸分子または（ ＰＣＲ増幅した（図６Ａ）。ＡＲＡＭＥＭＮＯＮを用い ２１）に記載の遺伝子構築物を含む細胞。 たこの配列の概念上の翻訳の分析により、５つから９つ （２３）植物細胞である、（２２）に記載の細胞。 の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）が見出され、さまざまなプ （２４）単子葉植物細胞である、（２３）に記載の細胞 ログラムの間のコンセンサスは、２つのＮＨ２ 末端およ 。 び４つのＣＯＯＨ末端のＴＭＤ（図６Ｂ）であり、成熟 （２５）穀類植物細胞である、（２３）または（２４） タンパク質の両末端は、細胞質性であることが予測され に記載の細胞。 る。このトポロジーもまた、細胞質内にＤ，Ｄ，Ｄ，Ｑ （２６）（２２）∼（２５）のいずれか１に記載の１以 ＦＫＲＷモチーフを含む大型の中心ドメインを配置して 上の細胞を含む多細胞構造物。 いる（図６Ｃ）。ヌクレオチドレベルでは、ＨｖＣｓｌ （２７）植物全体、植物組織、植物器官、植物部分、植 50 Ｈ１は、３種のコメＣＳＬＨ遺伝子と、６８∼７４％の ( 28 ) JP 55 5759176 B2 2015.8.5 56 同一性（６２∼６９％のアミノ酸同一性）を有している の断片を増幅することに成功した。Ｈ１Ｒ１０プライマ （実施例６を参照されたい）（Hazen et al., Plant Ph ー、すなわち１．３ｋｂ断片の５’末端近くにアニーリ ysiol 128: 336-340, 2002）。系統発生学的再構成は、 ングするために設計されたアンチセンスプライマーを用 ＨｖＣｓｌＨ１が、おそらくＯｓＣＳＬＨ１のオオムギ いたＢＡＣ オーソログであることを示している（図７）。Ｓｌｏｏ プンリーディングフレームの残り＋配列の上流の７４８ ｐ×Ｈａｌｃｙｏｎの倍加半数体集団を使用するＨｖＣ ｂｐの同定を可能にした。先に得られた結果から予測さ ｓｌＨ１の遺伝子マッピング（Read et al., Aust J Ag れたように、ＢＡＣ r Res 54: 1145-1153, 2003）は、ＨｖＣｓｌＨ１は染 ＢＡＣ 色体２Ｈの短腕上にあり、Ｂｕｒｔｏｎらにより報告さ ＣＳＬＨ遺伝子が１種だけ存在することが確認された。 れた（Plant Physiol 146: 1821-1833, 2008）４種のＨ 10 【表２】 クラスターからおよそ１．５ｃＭであり、非発芽オオム ギ穀粒中のβ−グルカン含有量を調節する主要ＱＴＬ内 にあった（Han et al., Theor Appl Genet 91: 921-927 , 1995；図８）ことを示している。 【０１９８】 支援情報 ＢＡＣライブラリのスクリーニングを用い、全長ＨｖＣ ｓｌＨファミリーメンバーの完全なセットを得た。オオ ムギゲノム（品種モレックス）の６．５等価体を含むＢ 20 ＡＣフィルターをスクリーニングし、３種の明らかに陽 性のクローンを同定した（データ非掲載）。ＨｉｎｄＩ ＩＩを用いて消化したこれらのクローン由来のＢＡＣ ＤＮＡのブロットを検出した場合、同じ３種のクローン である３−５−１０、３−７−３および３−７−８が陽 ３−５−１０および３ −７−８の消化パターンは同一であると思われ、多くの バンドはＢＡＣ ３−７−３と共通であり、このことは 、３種のＢＡＣはすべて、オオムギゲノムの同一の領域 または非常に類似した領域を含むことを示している。ゲ 30 ノムＤＮＡのブロットを同じプローブとハイブリダイズ させた場合、単一のバンドが、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩまたはＥｃｏＲＶを用いて消化したレーンに観察さ れ、ＢＡＣ消化の結果を裏付けた。すべてのＨｖＣｓｌ Ｈ ＥＳＴもまた単一の遺伝子に由来するので（表２） 、これらのデータは、オオムギゲノム中にはＣＳＬＨ遺 伝子が１種だけ存在することを強く示唆している。 【０１９９】 アダプタープライマーＰＣＲ法（Siebert et al., Nucl Acids Res 23: 1087-1088, 1995）を使用して、ＨｖＣ 40 ｓｌＨ１の５’末端を同定した。ＤＮＡを、ＢＡＣ３− ５−１０および３−７−３から単離し、アダプターが連 結された平滑末端ＤＮＡ断片を作製するさまざまな制限 酵素を用いて消化した。次いで、遺伝子の５’末端を含 有する断片を増幅するために、アダプター特異的プライ マーおよびＨｖＣｓｌＨ１特異的プライマー（表３）を 用いて、ネステッドＰＣＲを実施した。プライマーＡＰ ２およびＨ１Ｒ６を使用する、ＮｒｕＩにより消化され たＢＡＣ ３−７−３ ＤＮＡの増幅により、Ｎ末端配 列の約２０個のアミノ酸以外をすべて含む１．３ｋｂｐ 50 【０２００】 【表３】 ３−５−１０から得られた配列は ３−７−３と同一であり、オオムギゲノム内に ｖＣＳＬＦ遺伝子（ＨｖＣＳＬＦ３、４、８、１０）の 性であると検証された。ＢＡＣ ３−７−３ＤＮＡの直接配列決定は、オー ( 29 ) JP 57 5759176 B2 2015.8.5 58 ト）を、プールされた３週齢のカナマイシン耐性Ｔ２ 実 生から調製した。抗ＨＡ抗体を用いたウェスタンブロッ ティングは、ＨｖＣｓｌＨ１転写産物を含有する２８の 系統のうちわずか４系統だけが予想サイズ（約９０ｋＤ ａ）のポリペプチドを蓄積したことを示した（図１Ｃ） 。分子量がより大きいタンパク質およびより小さいタン パク質が検出されることもあった（例えば、レーン１１ ）。９０ｋＤａのタンパク質は、総タンパク質抽出物（ データ非掲載）または非形質転換シロイヌナズナ植物か 10 ら調製された混合膜分画（図１Ｃ、Ｃｏｌ−０レーン） 中には観察されなかった。ＨＡタグ付加ＨｖＣｓｌＨ１ が、ＨｖＣｓｌＨ１ ｍＲＮＡを発現する植物系統の一 部だけに蓄積する理由、あるいは、ＨｖＣｓｌＨ１のタ ンパク質レベルと、ＨｖＣｓｌＨ１の転写産物のレベル （図１ＢおよびＣを比較されたい）または植物中に存在 するＨｖＣｓｌＨ１トランスジーンの数（データ非掲載 ）のいずれかとの間に相関がない理由は知られていない が、このことは以前から観察されていた（Burton et al ., Science 311: 1940-1742, 2006）。ＨＡタグ付加Ｈ 20 ｖＣｓｌＨ１を発現する８、１１、１６および２４系統 と検出可能なレベルのタンパク質を発現しない６系統（ 対照）を、次の実験のために選択した。 【０２０１】 【０２０３】 免疫ＥＭを使用して、トランスジェニックシロイヌナズ ナ植物の細胞壁が検出可能なレベルのβ−グルカンを蓄 積するかどうかを決定した。８、１１、１６、２４およ び６系統の自家受粉子孫（Ｔ２ 世代）由来の成葉片の切 片を、β−グルカンに特異的なモノクローナル抗体で検 出し（Meikle et al., Plant J 5: 1-9, 1994）、その 30 後１８ｎｍの金粒子と結合した二次抗体を使用して検出 【実施例２】 した。金粒子は、ＨＡタグ付加ＨｖＣｓｌＨ１陽性の８ 【０２０２】 、１１および１６系統（それぞれ、図２Ａ、Ｃ、Ｂ）の シロイヌナズナにおけるＨｖＣｓｌＨ１の発現は、（１ 細胞壁中に明らかであるが、ＨｖＣｓｌＨ１を発現した ，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンの堆積をもたらす （データ非掲載）２４系統または検出可能なＨｖＣｓｌ シロイヌナズナにおける異種発現のために、ＨｖＣｓｌ Ｈ１タンパク質を有さなかった６系統（図２Ｅ）のいず Ｈ１ ＯＲＦを、Ｇａｔｅｗａｙを可能にするバイナリ れにおいても細胞壁中に明らかではなかった。各陽性ト ーベクターのｐＧＷＢ１５にクローニングし（Nakagawa ランスジェニック系統は、組織標識の異なるパターンを et al.,J Biosci Bioeng 104: 34-41, 2007；図１５） 示した。８系統において、表皮細胞壁、時として木部壁 、ＨｖＣｓｌＨ１をＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制 にまばらな標識が観察されるが（図２Ａ）、一方１１系 御下に置き、３×ＨＡエピトープタグをコードされるタ 40 統では、表皮壁および維管束組織壁はわずかに標識され ンパク質のＮＨ２ 末端に付加した（図１Ａ）。形質転換 ただけであるが、より強い（よりまばらではあるが）標 シロイヌナズナ種子の初期選択により、ＰＣＲでＨｖＣ 識が葉肉壁において観察された（図２Ｃ）。広範囲に分 ｓｌＨ１の含有が確認されたいくつかの推定トランスジ 布する明るい標識が、１６系統の成葉の細胞壁すべてに ェニック実生を同定した。これらのＴ１ 植物のＲＮＡブ 存在した（図２Ｂ）。「構成的に」発現される３５Ｓプ ロット分析により、ロゼット葉中におよそ９０％のＨｖ ロモーターにより駆動される遺伝子を発現するトランス ＣｓｌＨ１転写産物が蓄積したことが示された（図１Ｂ ジェニックシロイヌナズナ系統による異所性多糖類産生 ）。抗ＨＡタグ抗体を使用するウェスタンブロッティン の不規則かつ非一貫性のパターンは、以前から観察され グを使用して、これらの系統におけるＨｖＣｓｌＨ１タ ている（Burton et al., 2006,上記）。非形質転換シロ ンパク質を検出した（図１Ｃ）。混合したミクロソーム イヌナズナの葉の切片においては、標識は見られなかっ 膜の分画（５０，０００∼１００，０００×ｇのペレッ 50 た（図２Ｄ）。標識レベルの低下は、このβ−グルカン ( 30 ) JP 59 5759176 B2 2015.8.5 60 を特異的に加水分解する枯草菌（Bacillus subtilis） ｅｘ３ およびＨｅｘ４ の存在を示した（図９Ｂ）。１６ のエンドヒドロラーゼとともにプレインキュベートを行 −１および１６−２系統におけるβ−グルカンの量は、 ったトランスジェニック植物の葉切片に見られた（Burt Ｇ４Ｇ３ＧＲ のピーク面積から推定されるように、それ on et al., 2006,上記、データ非掲載）。 ぞれ、総細胞壁の０．００５％および０．００３％（ｗ 【０２０４】 ／ｗ）であった。 トランスジェニックシロイヌナズナの細胞壁にβ−グル 【実施例３】 カンが存在することの生化学的確認の提供、および新生 【０２０５】 β−グルカンの微細構造の調査のために、葉および／ま ＨｖＣｓｌＨ１は、ＨｖＣｓｌＨ１を発現するトランス たは茎材料を、植物８、１１および１６系統に由来する ジェニックシロイヌナズナ植物の、ＥＲ関連小胞および 系統の自家受粉のＴ３ およびＴ４ の子孫からプールした 10 ゴルジ関連小胞内に位置するが、細胞膜には位置しない 。これらの系統は、ＨｖＣｓｌＨ１トランスジーンにつ １１系統由来の高圧凍結葉の切片を、金標識抗ＨＡ抗体 いてホモ接合性であった。β−グルカンは、植物の年齢 とともにインキュベートし、ＨｖＣｓｌＨ１の細胞内位 とともに蓄積されることが見出されたので、試料は植物 置を決定した。標識は、小胞体およびゴルジ由来小胞に が老齢になった際に採取した。細胞壁を調製し、（１， 見出されたが、細胞膜には見出されなかった（図４Ａ、 ３：１，４）−β−グルカン特異的エンドヒドロラーゼ Ｂ）。同様の結果が、根および実生の標識切片において を用いて消化し、放出されたオリゴ糖をＨＰＡＥＣおよ 観察された（データ非掲載）。 びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによってプロファイルした 【実施例４】 。（１，４）−β−グルコシド結合が（１，３）−β− 【０２０６】 Ｄ−グルコシル残基の還元末端側にある場合、（１，３ オオムギにおいて、成長中の穀粒、花の組織および二次 ；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼは、 20 細胞壁肥厚中の葉の細胞で、ＨｖＣｓｌＨ１は、低レベ これらの結合を特異的に加水分解する。この酵素の作用 ルで転写される により、さまざまな重合度（ＤＰ）の、一連のオリゴ糖 さまざまなオオムギ組織において、ＨｖＣｓｌＨ１転写 が生成される。この一連の診断用オリゴ糖は三糖類のＧ 産物のレベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を使 ４Ｇ３ＧＲ および四糖類のＧ４Ｇ４Ｇ３ＧＲ （式中、Ｇ 用して決定した。遺伝子特異的プライマーを表４に表す は、β−Ｄ−グルコピラノース、３および４は、それぞ 。 れ（１，３）および（１，４）結合を示し、ＧＲ は還元 【表４】 末端残基を指す）。８および１１系統ならびに植物１６ に由来する２種の独立した系統（１６−１および１６− ２系統）由来の葉または葉および茎から調製した細胞壁 を、（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒド 30 ロラーゼを用いて処理した場合、可変量のＧ４Ｇ３ＧＲ およびＧ４Ｇ４Ｇ３ＧＲ が放出された（図３、図９Ａ） 。これらのオリゴ糖は、酵素で処理しなかった対照では 検出されなかった。Ｇ４Ｇ３ＧＲ とＧ４Ｇ４Ｇ３ＧＲ と の比（ＤＰ３：ＤＰ４）は、１６−１系統において３． ５であることが推定され、これは、オオムギ葉試料由来 のβ−グルカンに関して得られたＤＰ３：ＤＰ４比の３ ．６と同様である。グルコース（Ｇ３ＧＲ ）の（１，３ ）−β結合二糖類であるラミナリビオースと同時溶出し たピークが、複数の試料において、８、１１および１６ 40 −２系統においてさまざまなレベルで観察された（図９ 【０２０７】 Ａ、データ非掲載）。この産物はオオムギおよび酵素未 図５（Ａ∼Ｃ）は、一連のオオムギの栄養組織および花 処理の対照試料には存在せず（図９Ａ）、その出現が、 組織のｃＤＮＡにおいて、ＨｖＣｓｌＨ１転写産物が慣 （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラ 用的に１，０００ｓコピー／μｌ ーゼ調製物中の酵素の混入あるいは内在性二糖類または ルで蓄積されたことを示す。この値は、本発明者らが通 シロイヌナズナ内の酵素活性によるものではないことが 常１０，０００ｓから１００，０００ｓコピー／μｌ 検証される。このプロファイルにおけるオリゴ糖の種類 ｃＤＮＡの範囲の値で研究した他のオオムギＣＥＳＡお をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析によってさらに確認し よびＣＳＬの一部より低かった。ＨｖＣｓｌＨ１転写産 、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析は、ＨＰＡＥＣプロフ 物のレベルは、子葉鞘および葉脚を含む、急速に伸長す ァイルにおいて観察された比と同様の比でＨｅｘ２ 、Ｈ 50 ｃＤＮＡ未満のレベ る細胞を含む組織において比較的低く、これらは活発に ( 31 ) JP 61 5759176 B2 2015.8.5 62 β−グルカンを合成する組織である。 hartoideae））は、複数のＣＳＬＨ遺伝子を有すると思 【０２０８】 われる。ＨｖＣｓｌＨ１ ＨｖＣｓｌＨ１転写産物のレベルは葉頂において最も高 加形態を、シロイヌナズナにおいて異種発現させた場合 く、ここでは、細胞はもはや活発に成長せずβ−グルカ 、タンパク質が検出された４つの植物系統の３つが、β ンの蓄積も減っている（図５Ｃ；２、４）。葉における −グルカン特異的モノクローナル抗体により認識された ＨｖＣｓｌＨ１の転写は、１０日齢の実生の葉頂から開 多糖類を、それらの細胞壁に蓄積した。トランスジェニ 始した約１３ｃｍ長の葉内の６か所の範囲から単離され ック系統の単離細胞壁を、特異的（１，３；１，４）− たＲＮＡを使用してさらに特徴を調べた。これらの範囲 β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼを用いて消化した は、完全に成熟した細胞（範囲Ａ）から分裂細胞を含む 場合、特有の三糖類（Ｇ４Ｇ３ＧＲ ）および四糖類（Ｇ 葉脚（範囲Ｆ）を含む。ｉｎ ４Ｇ４Ｇ３ＧＲ ）が、オオムギ胚乳由来のβ−グルカン ｓｉｔｕ ＰＣＲ（実施 10 例５を参照されたい）を使用して、ＨｖＣｓｌＨ１ ｃＤＮＡのエピトープタグ付 ｍ に見出される比と同様の比で検出され、トランスジェニ ＲＮＡを含む葉頂中のそれらの細胞を同定した。この技 ックシロイヌナズナ系統由来の細胞壁が、β−グルカン 術において、遺伝子転写産物が検出された細胞は、紫か を含んだことを実証する。さらに、エピトープタグ付加 ら暗い褐色に染色される（図５Ｄ、１８Ｓ ＲＮＡ陽性 ＨｖＣｓｌＨ１は、トランスジェニック植物細胞の小胞 対照）。転写の起こらなかった細胞は、明るい褐色に染 体およびゴルジ由来小胞において見出された。ＨｖＣｓ 色され、陰性対照として検出される（図５Ｅ）。ＨｖＣ ｌＨ１を発現したトランスジェニックシロイヌナズナ系 ｓｌＨ１は、維管束間の、厚膜組織の繊維細胞および木 統の形態学的表現型は、野生型植物と同一であると思わ 部細胞などの二次細胞壁肥厚にある細胞において大部分 れる。 は転写される（図５Ｆ）。オオムギ葉から採取した切片 【０２１１】 を使用する免疫ＥＭおよびβ−グルカン抗体での検出に 20 （１，３）−および（１，４）−β−グルコシル結合の より、これらの細胞の細胞壁中のβ−グルカンを同定し 全割合ならびに１６−１系統植物に由来する細胞壁の（ た。 １，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラー 【０２０９】 ゼ消化からのＧ４Ｇ３ＧＲ およびＧ４Ｇ４Ｇ３ＧＲ 産物 ＨｖＣｓｌＨ１転写産物のレベルを、さらに、一連の２ の比は、オオムギ組織から単離されたβ−グルカンにお ４日の成長中の胚乳においてより詳細に調査した（図５ いて観察される比と同様であるが、観察された一つの独 Ｂ）。ＨｖＣｓｌＨ１の発現は、成長中のデンプン質胚 特な特徴は、１６−２系統の細胞壁から、（１，３；１ 乳全体で低かった。胚乳細胞壁においてβ−グルカンが ，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼにより放 最初に検出されるおよそ１日前の４ＤＰＡにおいて、最 出される主要なオリゴ糖がラミナリビオースであること 大転写レベルに達した。この転写パターンは、成長中の であった（Ｇ３ＧＲ ；図９Ａ）。可変レベルのＧ３ＧＲ 穀粒においてもまた発現された、いくつかのオオムギＣ 30 の存在はまた、三糖類の四糖類に対するレベルの増加、 ＳＬＦ遺伝子（ＨｖＣＳＬＦ３、４、７、８および１０ したがってＤＰ３：ＤＰ４比の増大に関連した。大部分 ）の転写パターンと同様であるが、ＨｖＣＳＬＦ９およ の植物系統の細胞壁消化物中にＧ３ＧＲ が存在すること び６は、さらにより高い転写産物レベルを示す。 は、交互の（１，３）−β−および（１，４）−β−結 【実施例５】 合のグルコシル残基（−Ｇ３Ｇ４Ｇ３Ｇ４−）の多糖類 【０２１０】 含有切片を示す。これらが個別の多糖類中に存在するか 考察 、またはさらに通常の微細構造の特徴を有するβ−グル 本明細書に提示したデータは、イネ科植物特異的ＣＳＬ カン鎖の一部を構成するかは分かっていない。交互の（ Ｈ遺伝子ファミリーのメンバーであるＨｖＣｓｌＨ１の １，３）−β−Ｄ−グルコシルおよび（１，４）−β− 産物が、シロイヌナズナにおいてβ−グルカンの生合成 Ｄ−グルコシル残基は、オオムギと、他の穀類のβ−グ を仲介することを示している。オオムギは、ＥＳＴデー 40 ルカンにおいて共通ではないが、非開花植物のトクサ属 タベース分析、ゲノムＤＮＡブロット分析およびＢＡＣ （Equisetum）由来のβ−グルカンの重要な成分を表し ライブラリのスクリーニングに基づき、ＣＳＬＨ遺伝子 、さらに担子菌類および子嚢菌類を含む多くの真菌由来 を一つだけ有すると思われる。パンコムギ、イタリアン のβ−グルカン中に検出される。Ｇ３ＧＲ はトランスジ ライグラス（Lolium multiflorum）、トールフェスク（ ェニックシロイヌナズナにおけるβ−グルカンシンター Festuca arundinacae）およびミナトカモジグサ（Brach ゼの誤制御を介して生じる可能性があり、その膜の微小 ypodium distachon）（すべてイチゴツナギ亜科（Pooid 環境が異なるため、またはオオムギにおいて、（１，３ eae））などの他のイネ科植物のＥＳＴ分析は、オオム ）−βグルコシド結合形成を抑制する（または（１，４ ギと同様の１種の同定ＣＳＬＨ遺伝子を有するが、トウ ）−βグルコシド結合形成を促進する）未知の因子が、 モロコシ、ソルガムおよびサトウキビ（すべてキビ亜科 シロイヌナズナに最適以下のレベルで存在するためと思 （Panicoideae））、コメなど（エールハルタ亜科（Ehr 50 われる。植物１６に由来する系統の中でこの因子のレベ ( 32 ) JP 63 5759176 B2 2015.8.5 64 ルがわずかに変化することが、得られた構造の違いの原 く両方の型のβ結合を生成することができることを示し 因であろう。β−グルカンの構造のばらつきに関する別 ている。ＣＳＬＨファミリーは、糖質作用性酵素（Carb の考えられる説明は、組み立て後のプロセシングの微妙 ohydrate Active Enzymes：ＣＡＺｙ）データベースに な差に関すると思われる（さらに、下記の支援情報を参 より、グリコシルトランスフェラーゼファミリー２（Ｇ 照されたい）。 Ｔ２）のメンバーであると分類され（http://www.cazy. 【０２１２】 org; Coutinho et al., J Mol Biol 328: 307-317, 200 オオムギにおいて、ＨｖＣｓｌＨ１は、組織が完全に成 3）、このファミリーは、（１，３）−β−または（１ 熟した細胞を含む葉頂で最も高度に転写された。ＨｖＣ ，４）−β−結合のいずれかの合成を独立して触媒でき ｓｌＨ１および任意のオオムギＣＳＬＦの連携転写（co ordinatetranscription）を示す証拠はなく、それらが る酵素を含み、二機能性酵素、すなわち２種のグリコシ 10 ド結合を合成できる酵素の例でもある。例えば、ヒアル コードする産物が、タンパク質複合体の成分ではないこ ロン酸合成酵素（ＨＡＳ）は、（１，４）−β−グルク とを示唆している。例えば、ＨｖＣｓｌＨ１の転写は、 ロン酸−（１，３）−β−Ｎ−アセチルグルコサミンの オオムギにおいてβ−グルカンが特徴的に蓄積される組 繰り返し二糖単位を合成し、両方のトランスフェラーゼ 織である子葉鞘または成長中の胚乳などの伸長する細胞 活性が、１種のポリペプチドにある。マウスＨＡＳ１に 中では高くない。通常は、細胞増殖の調節、およびおそ おいて、Ｄ，Ｄ，Ｄ，ＱＸＸＲＷモチーフを含む領域は らく暗所においてエネルギー供給源として動員できるグ 、これらの活性の両方に関与する。Ｄ，Ｄ，Ｄ，ＱＸＸ ルコースの一時貯蔵に関係すると思われる栄養組織の一 ＲＷモチーフをさらに含む、ＣＳＬＨの活性部位は、同 次細胞壁に見出されるが、β−グルカンは、木部管状要 様に二機能性であると思われる。別の可能性は、ＣＳＬ 素および厚膜組織繊維の木化細胞壁においてもまた見出 Ｈシンターゼが、単子葉植物および双子葉植物に共通の され、ここでは、β−グルカンに対する抗体を使用する 20 、第２の結合の合成に関与する別のグルコシルトランス 免疫ＥＭにより、中葉領域（一次細胞壁）と膜組織細胞 フェラーゼと、唯一のグルコシド結合を合成することで の二次細胞壁との両方において標識が示される。ｉｎｓ ある。 ｉｔｕ ＰＣＲは、葉中のＨｖＣｓｌＨ１遺伝子の転写 【実施例６】 が、維管束間の厚膜組織の繊維細胞および木部細胞など 【０２１４】 の細胞に限定されていることを示すので、植物中の他の 材料と方法 場所における一次細胞壁のβ−グルカン合成における役 バイナリーベクターの構築および植物の形質転換 割を除外することはできないが、この遺伝子の主要な役 ＨｖＣｓｌＨ１ 割は、二次細胞壁成長の間のβ−グルカン合成にあるこ 成葉頂のｃＤＮＡから、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標 とが示唆される。 ）（Stratagene）を用い、プライマーＨｖＨ１ＴＯＰＯ 【０２１３】 30 ＯＲＦを、オオムギ品種スクーナーの ｆおよびＨｖＨ１ＴＯＰＯｒ（表３）を使用して増幅し β−グルカンの微細構造がどのように生じたかにかかわ 、ＰＣＲ産物を、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Invitrog らず、ＣＳＬＨがシロイヌナズナにおいてβ−グルカン en）にクローニングした。製造業者（Invitrogen）のプ の合成を仲介できることは明らかであり、どのようにこ ロトコルを使用し、ＬＲ反応を使用して、ＮＨ２ 末端に の多糖類が合成されるかという本発明者らの理解に関す ３×ＨＡタグを含むデスティネーションベクターｐＧＷ る暗示を有する研究成果である。β−グルカンの組み立 Ｂ１５にｃＤＮＡをクローニングし（Nakagawa et al., てに関すると考えられる機序は、優勢なセロトリオシル J Biosci Bioeng 104: 34-41,2007）、ＤＮＡ配列決定 およびセロテトラオシル単位の合成、これらの（１，４ により、予測配列を確認した。ＨｖＣｓｌＨｌ：：ｐＧ ）−β−単位と単一の（１，３）−β−結合とのランダ ＢＷ１５構築体を、大腸菌（Escherichia coli）からア ムな結合、そして三糖類単位と四糖類単位のモル比を制 グロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium 御する手段で説明できるはずである。少なくとも２種の 40 tumefaciens）ＡＧＬ１株に、三親接合を介し、ヘルパ グルコシルトランスフェラーゼ活性が共同して作用する ープラスミドｐＲＫ２０１３を使用して移した。シロイ と思われ、一方の活性は、（１，４）−β−結合グルコ ヌナズナＣｏｌ−０植物を、フローラルディップ法を使 ース残基を連続的に付加し、三糖類および四糖類を組み 用して形質転換した（Clough and Bent, Plant J 16: 7 立て、他方の活性は、単一の（１，３）−β−結合を付 35-743, 1998）。 加する。多糖類シンターゼの本発明者らの最近の知見に 【０２１５】 基づき、いくつかの機序は仮定として可能である。最も ＲＮＡブロット分析 簡略な説明は、１種のポリペプチドが両方のグルコシド Ｔ１植物の成熟ロゼット葉からＴＲＩｚｏｌ（登録商標 結合型の合成に関与していることである。本発明者らの ）（Invitrogen）を使用して抽出した、約１０μｇの総 トランスジェニック実験は、ＣＳＬＨタンパク質が独立 ＲＮＡ試料を調製し、１％ｗ／ｖアガロース−ホルムア してβ−グルカンを作ることができ、したがっておそら 50 ルデヒドゲル上で分離した（Farrell, RNA methodologi ( 33 ) JP 65 5759176 B2 2015.8.5 66 es: A laboratory guide for isolation and character 週間後、カナマイシン耐性の実生をプールし、液体窒素 ization, Academic Press, Inc., San Diego, 1993）。 中で凍結し、ホモジナイズ用緩衝液（５０ｍＭ ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄ（商標）Ｎ ｅ Ｉｍａｇｅｓ ＋ 膜に転写し、Ｇｅｎ ＮａＰ Ｏ４ 緩衝液、ｐＨ７．５、０．５Ｍスクロース、２０ｍ ＣＤＰ−Ｓｔａｒ検出モジュール（ Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ Amersham-Biosciences）に概説された方法に従って、プ 、８３μＬ植物プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma、P レハイブリダイズおよびハイブリダイズを行った。プラ 9599））を含む乳鉢および乳棒で４℃において粉砕した イマーＨ１Ｆ２およびＨｖＨ１ＴＯＰＯｒ（表３）を用 。ホモジネートを、５０μＭメッシュのフィルターを通 いて増幅したＨｖＣｓｌＨ１断片を、Ｇｅｎｅ Ｉｍａ してろ過し、Ｓ／Ｎを、６，０００×ｇで１０分間、４ Ｐｒｉｍｅラベリングモジュー ℃において遠心した。Ｓ／Ｎをデカントし、５０，００ ｇｅｓ Ｒａｎｄｏｍ ル（Amersham）を使用し、製造業者のプロトコルに従っ 10 ０×ｇで３０分間、４℃において、４．５ｍｌの超遠心 て標識し、プローブとして使用した。 管（Beckmann）において遠心した。５０，０００×ｇの 【０２１６】 Ｓ／Ｎをデカントし、ペレットを、１０ｍＭ 定量的ＰＣＲ分析 −ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５に、ガラス−テフロンホモ ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成およびＱＰＣＲを、Burton e ジナイザーを使用して再懸濁した。再懸濁したペレット t al.（Plant Physiol 146, 1821-1833, 2008）に記載 を、Ｔｒｉ−ＭＥＳ緩衝液を用いて４．５ｍＬに希釈し された変法を用いて、Burton et al.（Science 311, 19 、１００，０００×ｇで、１時間、４℃において遠心し 40-1942, 2006; Plant Physiol 134, 224-236, 2004） た。ペレットを、上に概説したように、０．２５Ｍスク に記載のように実施した。オオムギ対照遺伝子のプライ ロース、１０ｍＭ マー配列を表４に記載する。 ５に再懸濁した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ 【０２１７】 20 Ｔｒｉｓ Ｔｒｉｓ−ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７． アッセイ試薬（BioRad）を使用して測定し、ウシ血清ア ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ ルブミンを標準として使用した。 ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲを、Koltai & Bird（Plant Phy 【０２１９】 siol 123: 1203-1212, 2000）の方法に従って、下記の ウェスタンブロッティング 変形を加え実施した。組織を切片にした後、ゲノムＤＮ 膜タンパク質（３０μｇ）の試料を、６０℃において２ Ａを、３７℃において６時間、１×ＤＮａｓｅ緩衝液お ０∼６０分間、２００ｍＭジチオスレイトールおよび試 よび４Ｕ 料緩衝液（３７．５ｍＭ ＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅ（Promega）中 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７． で処理することによって取り出した。ｃＤＮＡの合成を ０、１０％グリセロール、３％ドデシル硫酸ナトリウム 、ＲＮａｓｅ Ｈステップを省き、遺伝子特異的プライ （ＳＤＳ）、０．０２５％ブロモフェノールブルー）中 マー（１μｇ、表３）を逆転写に使用したことを除き、 でインキュベートし、ＳＤＳ：タンパク質比を１．５ｍ Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ（Invitrogen） 30 ｇＳＤＳ対３０μｇのタンパク質にして、その後８％Ｓ を使用して実施した。ＰＣＲを、１×ＰＣＲ緩衝液、２ ＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加した。電気泳動後、ゲルをニ ００μｍ トロセルロース（ＯＳＭＯＮＩＣ（商標）Ｎｉｔｒｏｐ ｄＮＴＰ（Promega）、０．２ｎｍｏｌジゴ キシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（Roche）、２ｍＭ Ｍｇ Ｃｌ２ 、２００ｎｇの各プライマーおよび２Ｕ Ｔａｑ ｕｒｅ ２２μｍ）に、０．０５％ＳＤＳを含有するＴ ｏｗｂｉｎ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、１９２ｍ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen）を含む、最終容量 Ｍグリシン、２０％メタノール）中で４℃において１０ ５０μＬ中で実施した。サイクリングパラメーターは、 ０Ｖ、９０分間かけてブロットした。次いで、膜を、３ 下記のとおりである：初期変性９６℃２分、次いで、９ ％ｗ／ｖ粉乳を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢ ４℃３０秒、５９℃３０秒、７２℃１分を４０サイクル Ｓ；２０ｍＭ 。その後切片を洗浄し、１．５Ｕのアルカリホスファタ ーゼ結合抗ジゴキシゲニンＦａｂフラグメント（Roche Ｔｒｉｓ塩基、１５０ｍＭ ＮａＣｌ） において一晩ブロッキングし、その後、１％ＢＳＡを含 40 有するＴＢＳで１：１０００に希釈したラット抗ＨＡポ ）とともにインキュベートし、Koltai & Bird（2000、 上記）により概説されたように、１０∼２０分発色させ リクローナル抗体（Roche）中で室温で１時間インキュ た。陰性対照切片では、逆転写酵素を省き、すべてのＨ するＴＢＳで３回洗浄し、次いで、３％ｗ／ｖ脱脂粉乳 ｖ を含有するＴＢＳで１：１０００に希釈した抗ラットＩ １８Ｓ ベートした。膜を０．０５％ＳＤＳ（ＴＢＳＴ）を含有 ｒＲＮＡプライマーを含み、ゲノムＤＮＡ から任意の増幅があったかどうかを確認した。 ｇＧ 【０２１８】 。膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、その後、シグナルを、Ｓ 混合ミクロソーム膜の調製 ｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ ＨｖＣｓｌＨ１トランスジェニック植物のＴ１種子を回 化学発光基質（Pierce）を用いて検出した。 収し、約１００個の種子を、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン 【０２２０】 （Sigma）を含有する１×ＭＳ寒天培地上に撒いた。３ 50 ＨＲＰ結合抗体（Dako）中でインキュベートした 免疫電子顕微鏡法 Ｐｉｃｏ ( 34 ) JP 67 5759176 B2 2015.8.5 68 シロイヌナズナ組織を固定し、Burton et al.（Science の（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロ 311, 1940-1942, 2006）に従って、抗（１，３；１， ラーゼ（McCleary et al., J Inst Brew 91: 285-295, ４）−β−Ｄ−グルカン特異的抗体（Meikle et al., P 1985）を加えた。混合物を、連続混合しながら、５０℃ lant J 5: 1-9, 1994）を用いて標識した。抗ＨＡ抗体 において２時間インキュベートし、その後Ｓ／Ｎを、（ を用いた標識のために、植物組織を２つの銅のプランチ １，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラー ェットの間に置き、Ｌｅｉｃａ ゼ放出オリゴ糖として回収した。陰性対照および（１， ＥＭ高圧フリーザーに おいて急速に凍結させた（２．７×１０ −１０，０００℃ｓ − １ ５ ｋＰａおよび ３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒドロラーゼ処 の適切な速度に設定する）。 理Ｓ／Ｎを、グラファイト化カーボンカートリッジ上で プランチェットを、−５０℃、７２時間に設定したＬｅ 、Packer et al.（Glycoconj J 15: 737-747, 1998）に ｉｃａ自動凍結置換装置中で１００％エタノールに移し 10 より記載のように脱塩し、乾燥させた。 た。試料を、室温（ＲＴ）で一晩置き、取り出し、ＬＲ 【０２２３】 Ｗｈｉｔｅ樹脂でろ過し、Burton et al.（2006、上 ＨＰＡＥＣ分析 記）に記載のようにゼラチンカプセルに包埋した。包埋 乾燥させた（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエン した葉組織の切片をフォルムバー被覆金グリッド上に回 ドヒドロラーゼ放出オリゴ糖を、１００μＬのＭｉｌｌ 収し、１％ｗ／ｖ ｉ Ｈ２ Ｏに溶解し、２０μＬを、０．２Ｍ ＢＳＡを含有するリン酸緩衝生理食 塩水（ＰＢＳ；１３７ｍＭ ＰＯ４ 、２．７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ 中の５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で１：２０ ｏＰａｃ ＮａＯＨ ＮａＯＡｃを用いて平衡化したＣａｒｂ ＰＡ１カラム（Dionex）に、パルスアンペロ ０に希釈したラット抗ＨＡポリクローナル抗体中で室温 メトリック検出装置（ＰＡＤ）およびオートサンプラー で１時間、次いで４℃で一晩インキュベートした。グリ を搭載したＤｉｏｎｅｘ ッドをＰＢＳで数回洗浄し、次いで、１％ｗ／ｖ システム（Dionex）を使用して注入した。オリゴ糖を、 ＢＳ 20 ＢｉｏＬＣ ＩＣＳ ３００ Ａを含有するＰＢＳで１：２０に希釈した１８ｎｍ金（ ０．２Ｍ Jackson ImmunoResearch）と結合した抗ラット二次抗体 Ｍ ＮａＯＨ中３５０ｍＭまでの線形勾配で、１５分か 中で室温で１時間インキュベートした。次いで、グリッ けて、１ｍＬ／分で溶出した。ラミナリビオース（Seig ドを洗浄し、染色後、Burton et al.（2006、上記）に aku）、マルトースおよびセロビオース（双方ともSigma 記載のようにＴＥＭ下で見た。 ）を、標準として流した。 【０２２１】 【０２２４】 細胞壁材料の調製 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ アルコール不溶性画分（ＡＩＲ）を、植物材料を液体窒 残りの（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカンエンドヒ 素中で、乳鉢と乳棒を使用して粉砕することによって調 ドロラーゼ放出オリゴ糖のアリコート（３０μＬ）を凍 製した。５倍量の８０％エタノールをホモジネートに加 30 結乾燥させ、ＤＭＳＯに溶解し、ＮａＯＨ法（Ciucanu え、その後４℃において１時間回転することによって混 and Kerek, Carb Research 131: 209-217, 1984）を使 合した。３，４００×ｇで５分間遠心後、上清を取り除 用してメチル化した。メチル化オリゴ糖を、ジクロロメ き、残留物を室温で８０％エタノール中で１時間、２回 タン（ＤＣＭ）中に分配し、ＤＣＭ相をＭｉｌｌｉＱ水 還流し、その後５０％エタノール中で１時間、２回還流 で３回洗浄した。ＤＣＭ相を、Ｎ２ 気流下で乾燥させ、 した。エタノール可溶性画分を取り除き、ＡＩＲを１０ その後１０μＬの５０％アセトニトリルに再溶解した。 ０％エタノールで１回洗浄し、その後４０℃において真 １μＬのアリコートを、１μＬの２，５−ジヒドロキシ 空乾燥させた。 安息香酸マトリックス（５０％アセトニトリルに溶解し 【０２２２】 て１０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、１μＬの混合物を、ＭＡ （１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン特異的エンドヒ ドロラーゼ消化 ＬＤＩ 40 ＮａＯＨ中５０ｍＭのＮａＯＡｃから０．２ ＴＯＦ質量分析計（Voyager DSTR, Applied Bi osystems）において分析するために、ＭＡＬＤＩプレー ＡＩＲ（１００ｍｇ、上記のように調製）を、５ｍＬの トにスポットした。 ２０ｍＭ 【０２２５】 ＮａＰＯ４ 緩衝液、ｐＨ６．５中で２時間、 ＭＳ分析 ５０℃において、２００ｒｐｍで振とうしてインキュベ ＥＳＴ分析、コンティグの組み立ておよびバイオインフ ーター中で連続混合しながらインキュベートした。２時 ォマティクス 間後、懸濁液を遠心分離（３，４００×ｇ、５分）にか ＢＬＡＳＴサーチツール（Altschul et al., Nucl Acid け、上清（Ｓ／Ｎ）を取り除いた。別の５ｍＬの緩衝液 s Res 25: 3389-3402, 1997）を使用して、ＣＳＬＨ を加え、インキュベートおよび遠心分離を繰り返した。 ＥＳＴを、現在中止になったＳｔａｎｆｏｒｄ この２次インキュベートで得たＳ／Ｎを、酵素非含有陰 ｌ Ｗａｌｌ 性対照として使用した。ペレット化したＡＩＲを、５ｍ .ncbi.nlm.nih.gov/）、ＨａｒｖＥＳＴ（http://harve ＬのＮａＰＯ４ 緩衝液に再懸濁し、これに、１００μｌ 50 st.ucr.edu/）、ＧｒａｉｎＧｅｎｅｓ（http://wheat. Ｃｅｌ ｗｅｂｓｉｔｅ、ＮＣＢＩ（http://www ( 35 ) JP 69 B2 2015.8.5 70 pw.usda.gov/GG2/index.shtml）、Ｂａｒｌｅｙ ｎｅ 5759176 Ｇｅ とによって変性させ、次いで、中和溶液（１．５Ｍ Ｉｎｄｅｘ（http://compbio.dfci.harvard.edu/ tgi/plant.html）およびＢａｒｌｅｙ ａＣｌ、０．５Ｍ Ｂａｓｅ（www. ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｎ ｐＨ７．２、１ ＥＤＴＡ）に浸したろ紙上に置くことによって中 barleybase.org）を含む、公共のデータベースに照会 和した。次いで、膜を、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで することにより得た。配列を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（商 ３回洗浄し、標準的条件（Sambrook et al., Molecular 標）３．０（GeneCodes）またはＶｅｃｔｏｒ （登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ ＮＴＩ cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbour ９．１．０（Invitrogen Laboratory Press, New York, 1989）を使用してハイ ）のモジュールであるＣｏｎｔｉｇＥｘｐｒｅｓｓのい ブリダイズを行った。 ずれかを使用して、コンティグに組み立てた。ＤＮＡま 【０２２７】 たはタンパク質の配列を、ＣｌｕｓｔａｌＸ（Thompson 10 ＢＡＣ et al., Nucl Acids Res 24: 4876-4882, 1997）を使用 陽性クローンを、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール してアライメントした。系統発生学的分析を、固有近隣 を含有するＬＢブロス中で、３７℃において一晩培養し 結合アルゴリズムを使用して実施し、ツリーのロバスト た。細胞を、遠心分離（１２，０００×ｇ、３分）によ 性は、１０００回のブートストラップ反復を使用して評 ってペレット化し、このペレットを９０μＬのＴＥＳ緩 価した。配列類似性を、ＭａｔＧａｔ 衝液（２５ｍＭ ２．０２（http ＤＮＡの単離 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ ://bitincka.com/ledion/matgat/）（Campanella et al ｍＭ ., BMC Bioinformatics 4: 29, 2003）を使用して計算 た。溶解溶液（０．２Ｍ した。膜貫通ドメインは、ＡＲＡＭＥＭＮＯＮ（http:/ リコート（１８０μＬ）を加え、ゆっくりと混合し、そ /aramemnon.botanik.uni-koeln.de）（Schwacke et al. の後１３５μＬの３Ｍ , Plant Physiol 131: 16-26, 2003）に記載の一連のプ 20 た。染色体ＤＮＡを遠心分離（１２，０００×ｇ、１５ ログラムを使用して予測した。翻訳後修飾を予測するモ 分）によってペレット化した。Ｓ／Ｎを回収し、２μＬ チーフは、Ｔｏｏｌｓメニュー（http://www.expasy.or のＲＮａｓｅ g/tools/#pattern）のＥｘＰａｓｙに記載のプログラム おいて１時間インキュベートした。Ｔｒｉｓ飽和フェノ を使用して同定した。タンパク質パラメーターは、Ｅｘ ール−クロロホルム（比１：１）の４００μＬのアリコ Ｐａｓｙ（http://www.expasy.org/cgi-bin/protparam ートを加え、試料を再度遠心分離にかけた（１２，００ ）のＰｒｏｔＰａｒａｍを使用して計算した。 ０×ｇ、５分）。Ｓ／Ｎを回収し、ＢＡＣ 【０２２６】 ２∼３倍の冷却９５％エタノールを使用して、室温で１ オオムギＢＡＣスクリーニング ０分かけて沈殿させた。ＢＡＣＤＮＡを、遠心分離（１ 非Ｙｄ２ ５，０００×ｇ、１５分）によりペレット化し、７０％ 品種モレックス（Clemson University Genom ics Institute, CUGI）由来のオオムギゲノムの６．５ 30 ＥＤＴＡ、１５％ｗ／ｖスクロース）に再懸濁し ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）のア ＮａＯＡｃ Ａ（１０ｍｇ／ｍＬ）を加え、３７℃に 、４℃において保存した。 イゼーション溶液（０．５３Ｍ 【０２２８】 Ｈ７．２、７．５％ｗ／ｖ ＳＤＳ、１ｍＭ ｐ ＥＤＴＡ ＤＮＡを、 エタノールで洗浄し、２０∼５０μＬのＴＥに再懸濁し 等価体を含有するＢＡＣフィルターを、プレハイブリダ ＮａＰＯ４緩衝液 ｐＨ４．６を加え ゲノムウォーキング 、１１μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）中で、６５℃におい Siebert et al.（Nucl Acids Res 23: 1087-1088, 1995 て６時間ブロッキングした。プライマーＨ１Ｆ１および ）のアダプターライゲーション法を使用して、公知のＣ Ｈ１Ｒ１またはＨ１Ｒ５（表３）を用いて増幅した、放 ＳＬＨ 射性標識ｃＤＮＡおよびｇＤＮＡ断片を加え、６５℃に た。オオムギゲノムＤＮＡを消化するために使用した制 おいて、２４時間インキュベートした。フィルターを、 限酵素は、ＥｃｏＲＶ、ＮｒｕＩ、ＰｖｕＩＩ、Ｓｃａ ２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、室温で３回洗浄した。 ＩまたはＳｓｐＩであった。一次ＰＣＲ反応を、２μＬ 最終の洗浄を、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて実 40 のライゲートＤＮＡ（１：１０希釈）、１×ＰＣＲ緩衝 施した。フィルターを、Ｘ線フィルムに２ｄで撮影した 液、２ｍＭ 。陽性ＢＡＣクローンを同定し、ＣＵＧＩウェブサイト およびアンチセンスプライマーＨ１Ｒ７各１００ｎｇ（ （http://www.genome.clemson.edu）に支持されたよう 表３）、０．４ｍＭ に整理した。クローンを、２５μｇ／ｍｌクロラムフェ ポリメラーゼ（Invitrogen）を含有する２５μＬ量で実 ニコールを含有するＬＢ寒天上に画線し、３７℃におい 施した。 て一晩増殖させた。各クローンのコロニーを採取し、２ サイクルパラメーターは、下記のとおりであった：９６ ５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天 ℃２分、次いで９４℃３０秒間、５９℃３０秒間、７２ 上に載せた、グリッドの付いたナイロン膜に置き、３７ ℃１分間を４０サイクル、および最終ステップ７２℃で ℃で一晩インキュベートした。ＤＮＡを、膜上に固定し ７分間。二次ＰＣＲ反応を、１μＬの一次ＰＣＲ産物を 、０．４Ｍ 用いて、アダプタープライマーＡＰ２およびネスティッ ＮａＯＨに浸したろ紙上に２０分間置くこ 50 ＥＳＴ配列の上流のゲノムＤＮＡ断片を増幅し ＭｇＣｌ２ 、アダプタープライマーＡＰ１ ｄＮＴＰならびに１単位のＴａｑ ( 36 ) JP 71 5759176 B2 2015.8.5 72 ドプライマーＨ１Ｒ６各１００ｎｇを使用して実施した えた。プレートを、４℃の低温室に３∼５日置き、同時 。反応組成およびサイクルパラメーターは、アニーリン に発芽させた。次いで、低温湿性処理プレートを、昼と グ温度に６１℃を使用した以外は上記と同じであった。 夜の温度がそれぞれ２３℃および１７℃の環境制御成長 【０２２９】 キャビネット（Thermoline L+MモデルTPG1260 TO-5x400 ＢＡＣの配列決定 、Smithfield、NSW、Australia）に移した。ロゼット葉 配列決定のために、０．５から１μｇの単離ＢＡＣ Ｄ における平均光強度レベルは、１６時間の明サイクルで ＮＡを、５ｐｍｏｌのプライマーおよび１×Ｂｉｇ Ｄ 、三足蛍光灯（Sylvania Standard F30W/133-T8 Cool W ｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１（ＢＤＴ）ミッ hite）により供給された、約７０μＥ − ｍ ２ − Ｓ １ で クス（Applied Biosystems, USA）と、最終容量２０μ あった。ＭＳプレート上で３週間後、個々の苗を、水和 Ｌで混合した。サイクルパラメーターは、下記のとおり 10 させた直径４２ｍｍのＪｉｆｆｙペレットに移した。ト であった：９６℃１５分、次いで９６℃１０秒間、５５ レイに６つのペレットを９列並べ、３つのトレイを個々 ℃１０秒間および６０℃４分間を６５サイクル。ＤＮＡ に２×３．５フィート金網台の棚に置き育てた。相対湿 を、０．１容量の３Ｍ 度を測定し、６０から７０％の間にした。植物に、地下 ＮａＯＡｃ ｐＨ５．２および ２．５容量の９５％エタノールを用いて氷上で１０分間 灌漑によって２∼３日ごとに、Ｐｅｔｅｒ’ｓ 沈殿させ、次いで１２，０００×ｇで３０分回転させる ｆｅｓｓｉｏｎａｌ（商標）ＧｅｎｅｒａｌＰｕｒｐｏ ことによってペレット化した。ペレットを７０％エタノ ｓｅ植物用肥料（Scotts Australia）を補給した水道水 ールですすぎ、乾燥させ、配列決定のためにＡＧＲＦ（ を与えた。 Brisbane, Australia）に送付した。 【０２３２】 【０２３０】 シロイヌナズナトランスジェニック植物のゲノムＤＮＡ ＨｖＣｓｌＨ１のマッピング 20 遺伝子マッピングを、６０系統のＳｌｏｏｐ×Ｈａｌｃ Ｐｒｏ の抽出およびＰＣＲ分析 ＤＮＡを、単一のシロイヌナズナの葉から、Edwards et ｙｏｎの倍加半数体（ＤＨ）マッピング集団を使用して al.（Nucl Acids Res 19: 1349, 1991）に記載の方法 実施した（Read et al., Aust J Agric Res 54: 1145-1 に従って抽出した。ゲノムＤＮＡの１μＬアリコートを 153, 2003）。ＤＮＡブロットハイブリダイゼーション 、プライマーＨ１Ｆ２およびＨｖＣｓｌＨ１ＴＯＰＯｒ （Sambrook et al.,1989、上記）の標準的方法を使用し （表３）を使用する、下記のサイクリング計画：９４℃ て、プライマーＨ１Ｆ１およびＨ１Ｒ５（表３）を使用 ２分、その後９４℃２０秒、５７℃３０秒、７２℃３０ してＰＣＲ増幅したＨｖＣｓｌＨ１プローブを、６種の 秒を３５サイクルで、トランスジェニック植物のＰＣＲ 制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｅｃｏ スクリーニングにおいて鋳型として使用した。 ＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ）の１種を用いて消化 【実施例７】 した、親系統のゲノムＤＮＡを含有する膜とハイブリダ 30 【０２３３】 イズさせた。次いで、二遺伝子ハイブリッド集団を、明 コメおよびオオムギ由来のＣｓｌＨ らかな多型をもたらす酵素（ＤｒａＩ）を用いて消化し ノ酸配列のアライメント た。多型をスコア化し、ＨｖＣｓｌＨ１マップの位置を コメおよびオオムギ双方におけるＣｓｌＨ配列に関する 、ＭａｐＭａｎａｇｅｒ ＱＴバージョン０．３０（Ma ＤＮＡおよびアミノ酸配列のアライメントを実施し、配 nly et al., Mamm genome 12: 930-932, 2001）の「fin 列間の同一性および類似性のパーセントを計算し、その d best location」機能を使用して決定した。マップの 結果を図１０に示す。ＤＮＡおよびタンパク質配列をア 位置は、http://www.barleyworld.org/において利用可 ライメントし、http://bitincka.com/ledion/matgat/か 能な供給源を使用したＱＴＬデータと相関した。 らダウンロードしたＭａｔＧＡＴバージョン２．０２に 【０２３１】 シロイヌナズナの成長条件 ＤＮＡおよびアミ おけるデフォルトパラメーターを使用して比較した。 40 【０２３４】 シロイヌナズナの種子を、滅菌溶液（次亜塩素酸ナトリ マルチプル配列アライメントおよび系統樹作成を、Thom ウム（有効塩素２％）、Ｔｗｅｅｎ−２０数滴）中で１ pson et al.（Nucl Acids Res 25: 4876-4882,1997）に ５分間表面滅菌し、次いで滅菌ＭｉｌｌｉＱ水で４回す より記載されたＣｌｕｓｔａｌＸプログラムを使用して すいだ。 実施した。タンパク質のアライメントおよび結果として 表面滅菌種子を、５０ｍＬの滅菌１×ＭＳ培地（４．３ の系統樹を、それぞれ図１１および１２に示す。 ３ｇ／Ｌ ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇの基礎 【実施例８】 塩類（Phytotechnology Laboratories）、２％ｗ／ｖス 【０２３５】 クロース、１％ｗ／ｖバクトアガー）を含有する８５× ＨｖＣｓｌＨ１およびＯｓＣＳＬＦ２トランスジェニッ ２５ｍｍのペトリ皿に広げた。形質転換体の選択のため クシロイヌナズナ系統の異種交配 に、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン（Sigma）を培地に加 50 タグ付加ＨｖＣｓｌＨ１タンパク質が抗ＨＡ抗体を使用 ( 37 ) JP 73 5759176 B2 2015.8.5 74 して検出された、２種のトランスジェニックシロイヌナ ３３３ｂｐのコンセンサス配列を、図１６に示す。７５ ズナ系統１５−８および１５−１１を、ＯｓＣｓｌＦ２ １アミノ酸（配列番号７０）の単一の長いオープンリー 、Ｈ３７およびＨ１７−４を含む他の２種のトランスジ ディングフレームが存在する。 ェニックシロイヌナズナ系統と、Burton et al.（Scien 【０２４０】 ce 311: 1940-1942, 2006）により記載されたように、 オリゴヌクレオチドプライマーＳＪ９１およびＳＪ８５ 遺伝的に異種交配させるために選択した。ＨｖＣｓｌＨ を、コンセンサス配列の５’および３’末端から設計し １およびＯｓＣＳＬＦ２タンパク質を同じ細胞型の中に 、これらを使用して、図１７においてＨｖＣｓｌＨ１ｇ 発現することによって、単一遺伝子（ＣＳＬＨまたはＣ Ｈｉｍ（配列番号７１）と称するゲノムＤＮＡから３２ ＳＬＦだけ）トランスジェニックシロイヌナズナ植物に ０３ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。 おいて観察されるレベルより高いレベルの（１，３；１ 10 【０２４１】 ，４）−β−Ｄ−グルカンが細胞壁中に堆積される可能 オオムギｃＤＮＡ配列およびゲノム配列のアライメント 性があると考えられた。さらに、このことは、免疫電子 により、ＣｓｌＨ遺伝子が、コンセンサスＧＴ．．ＡＧ 顕微鏡研究および化学的細胞壁分析において、（１，３ スプライスドナー／アクセプター部位に、個々に隣接す ；１，４）−β−Ｄ−グルカン検出の助けになるはずで る８個の小型（およそ１００ｂｐ）のイントロンを有す ある。 ることが示された（図１７）。 【０２３６】 【０２４２】 親系統の４種すべてが、それらの細胞壁に（１，３；１ ＣｓｌＨ１のコムギホモログを、ＴＩＧＲデータベース ，４）−β−Ｄ−グルカンを含有することを、免疫電子 においてＴＣ２５５９２９と同定した。ＥＳＴのＣＪ６ 顕微鏡法により確認した（図１３）。４種の集団それぞ １４３９２、ＣＪ６０９７２９およびＣＪ７２１２０４ れに由来する個体を、雌雄の親として使用した。雌親（ 20 により例示されるように、配列の３つのクラスにより、 例えば、個体Ｈ３７−５）の花はおしべの葯が裂開する この仮想コンセンサスが構成された。ＰＣＲプライマー 前におしべを取り去り、雄親（例えば、個体１５−８− を、ＡＴＧ開始コドンの周囲のオオムギ配列（ＳＪ１６ ３）の裂開したおしべを使用して受粉した。個々の異種 ３）および３’末端における３種のＥＳＴ型すべてのコ 交配した花を標識し、得られた種子の鞘を脱水して回収 ンセンサス配列（ＳＪ１６４）から設計し、コムギ栽培 した。 品種チャイニーズ・スプリング由来の全長ゲノム断片を 【０２３７】 増幅するために使用した。２種の配列型を同定し、Ｔａ 個々の異種交配子孫を土に撒き、鋳型として葉のゲノム ＣｓｌＨ１−１（配列番号７８）およびＴａＣｓｌＨ１ ＤＮＡならびにＨｖＣｓｌＨ１特異的プライマーおよび −２（配列番号７９）と名付けた。 、別の反応において、ＯｓＣｓｌＦ２特異的プライマー 【０２４３】 を使用するＰＣＲによりそれらの遺伝子型を決定した。 30 ＴａＣｓｌＨ１−３（配列番号８０）と称する第３のホ 成葉を固定し、包埋し、切片にし、（１，３；１，４） モログを、材料および方法においてより詳細に記載した −β−Ｄ−グルカンモノクローナル抗体を用いて標識し 、プライマーＳＪ２０４およびＳＪ１６４を使用して単 た。図１４に観察されるように、多くの子孫が、親系統 離した。 より非常に高いレベルの標識を有することが見出された 【０２４４】 。例えば、パネルＤに示す個体の表皮細胞中の標識は、 オオムギ配列との比較により、イントロン−エクソン接 その１５−８−３×Ｈ３７−７の親と比較して非常に多 合部が、３種の遺伝子すべてにおいて保存されているこ い（図１３）。同じ遺伝子型の同胞（図１４、パネルＣ とが示された（図１７）。３種のコムギ遺伝子は、９４ ）は、表皮細胞壁の標識のレベルが一貫して低いことを ．８∼９６．１％同一である。 示した。 【実施例９】 【０２４５】 40 ３種のコムギＣｓｌＨ１遺伝子の推定コード領域の配列 【０２３８】 （配列番号７２、配列番号７３および配列番号７４）は オオムギ栽培品種ヒマラヤおよびコムギ由来のＣｓｌＨ 、それぞれ、７５２アミノ酸のポリペプチド（配列番号 ｃＤＮＡおよびゲノム配列のクローニング ７５、配列番号７６および配列番号７７）をコードする ＣｓｌＨ１遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列を、オオムギ栽培 。 品種ヒマラヤから、オオムギＥＳＴ配列、コメＣｓｌＨ 【０２４６】 １遺伝子配列（ＬＯＣ＿Ｏｓ１０ｇ２００９０）に基づ オオムギおよびコムギのＣＳＬＨ１遺伝子のＤＮＡコー くプライマーを使用するｃＤＮＡからのＰＣＲ、および ド配列およびアミノ酸配列を、ｍｕｓｃｌｅアライメン ５’ＲＡＣＥの組み合わせを使用して単離した。 トプログラムを使用してアライメントし、同一性および 【０２３９】 類似性のパーセントを、ＰＡＭ２５０マトリックスを使 ＨｖＣｓｌＨ１（Ｈｉｍ）（配列番号６９）と称する２ 50 用して計算した。同一性および類似性のパーセントを示 ( 38 ) JP 75 5759176 B2 2015.8.5 76 す表を、図２７に示す。 。ＲＮＡを、開花約１５日後に成長中の穀粒から単離し 【０２４７】 、ｃＤＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ 図２７に示すように、コムギタンパク質は、互いに約９ して調製した。その後、オオムギトランスジーンの発現 ４∼９５．０％の同一性を有し、オオムギタンパク質と を、リアルタイムＰＣＲにより分析した。使用したプラ 約９２．６∼９３．１％の同一性を有する。 イマーは、コムギおよびオオムギの遺伝子双方を増幅す 【実施例１０】 るので、表５は、内在性のコムギＣｓｌＨ遺伝子と比較 【０２４８】 した相対的発現レベルを示す。 オオムギおよびコムギにおけるＣｓｌＨ遺伝子の発現 【表５】 ＩＩＩを使用 ＣｓｌＨ１遺伝子の発現を、半定量的（ＲＴ−ＰＣＲお よびゲル電気泳動）と定量的（リアルタイムＰＣＲ）法 10 により調査した。 【０２４９】 βグルカンのレベルは、子葉鞘の成長に伴い増加し、そ の後成長の停止後に減少するので、子葉鞘は、βグルカ ンの生合成に関する遺伝子の発現を調べるために良好な 組織である。ＣｓｌＨ１遺伝子は、成長の停止後にだけ 最大の発現を示し、最も古い組織（６∼８日齢、図１９ Ａ／Ｂに示すように）において高い。 【０２５４】 【０２５０】 大部分の系統が、対照より数百倍高いレベルでオオムギ 他の組織もまた調べた。成長中の葉において、ＣｓｌＨ 20 ＣｓｌＨ遺伝子を発現し、９、１０、１２および１４系 １遺伝子は、葉の頂点の最も古い組織において示差的お 統は最も高い発現を示した（１０００倍を超えて高い） よび最大発現を示す（図２０）。これらの結果から、Ｃ 。 ｓｌＨ１遺伝子は、分裂および伸長を停止し、したがっ 【０２５５】 て分化する細胞において、選択的に（しかし排他的では 成熟時に、単一穀粒のβグルカン含有量に関して分析し ない）発現すると思われる。成熟胚乳中の細胞は、成長 、結果の要約を表６に示す。 の同様の段階にある、すなわち、細胞分裂が停止し、細 【表６】 胞の拡大が緩慢になり、細胞が特殊化したデンプン保存 柔組織に分化する。 【０２５１】 オオムギ胚乳組織において、ＣｓｌＨ１遺伝子発現は、 30 開花後４日ほどでピークを迎え、その後、後期の間に増 加し、２８日目で最大に達する（図２１）。 【０２５２】 コムギにおいてＣｓｌＨ１遺伝子発現には大きな差があ り、開花後４日目で発現はピークを迎え、その後は非常 に低い。これらの結果をリアルタイムＰＣＲにより確認 し、開花後２８日目において、ＣｓｌＨ遺伝子の発現が 、オオムギにおいてコムギより約１０倍高いことが示さ 【０２５６】 れた（図２２）。 【実施例１１】 ＰＣＲ陰性系統はすべて、平均すると穀粒重量の０．６ 40 ９％の、最も低いβ−グルカン含有量を有し、一方、Ｐ 【０２５３】 ＣＲ陽性系統由来の穀粒は、０．９７％の高い平均β− コムギ穀粒におけるオオムギＣｓｌＨ遺伝子の過剰発現 グルカン含有量を有した。表６の最後の列は、所与の系 トランスジェニックコムギ植物を、バイオリスティック 統由来の任意の単一穀粒の最大β−グルカン含有量を示 形質転換により、発現が胚乳組織においてのみ起こるよ し、最も高いＰＣＲ陰性系統は１．０％（大部分の穀粒 うにグルテニンプロモーターの制御下で全長ゲノムＨｖ はこれより非常に低い）であるが、いくつかのＰＣＲ陽 ＣｓｌＨ１（品種ヒマラヤ）遺伝子により作出させた（ 性系統は有意に高いβ−グルカンレベルの穀粒を有し、 図２３）。系統を、トランスジーンの有無に関して、若 ９系統および１０系統（最も発現が高い）は、最大１． 葉材料のＰＣＲによりスクリーニングした。１２種のＰ ９％のβ−グルカンを含む穀粒を有する。β−グルカン ＣＲ陽性系統および３種のＰＣＲ陰性系統（Ｈ１−２、 のこれらのレベルは、以前はコムギでは見られなかった −７および１１）を、成熟まで温室において成長させた 50 。 ( 39 ) JP 77 5759176 B2 2015.8.5 78 【０２５７】 【０２６１】 これらのＴ０植物の先端は、トランスジーンについて分 ＤＮＡ、ＲＮＡの単離およびｃＤＮＡの合成 離するＴ１種子を含有する。ＤＮＡを単一の遺伝子座に 植物ＤＮＡを、十分に膨張した葉の組織から、ＣＴＡＢ 挿入した場合、３種のトランスジェニック対１種の野生 に基づく方法（Murray and Thompson, Nucleic Acids R 型種子の比が観察されるはずである。図２５は、Ｈ１ト es. 8: 4321-4325, 1980）を使用して単離した。総ＲＮ ランスジェニック１０系統由来の個々のＴ１種子のβ− Ａを、葉および子葉鞘の組織から、Ｑｉａｇｅｎ社のＲ グルカンレベルを示し、これにより、およそ３／４（４ ＮＡｅａｓｙキットを使用して単離した。 ７／６１）が、ＰＣＲ陰性系統の平均（０．７％）より ＲＮＡを、成長中の胚乳からフェノールＳＤＳ法および 高いβ−グルカンレベルを有することを見出すことがで ＬｉＣｌ沈殿（Clarke et al., Functional and Integr きる。最も高いβ−グルカンレベル（１．９％）と平均 10 ative Genomics 8, 211-221, 2007）を使用して単離し ＰＣＲ陰性レベル（０．７％）との比から、β−グルカ た。ＲＮＡは、ＤＮＡｓｅを用いて、Ambion社の「ＤＮ ン含有量の増加は、野生型コムギ穀粒で通常見られる量 Ａフリー」キットを使用して処理し、次いでｃＤＮＡを の２．７倍である。さらに重要な観察結果は、穀粒の多 、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｌＩＩ逆転写酵素を使用して くの割合が、少なくとも１．４％のβグルカンを有する 、製造業者（Clontech）の指示書に従って合成した。 ことである。 【０２６２】 【０２５８】 ＣｓｌＨ遺伝子のクローニング 系統がホモ接合性になり、遺伝子量が増加した場合、こ ＣｓｌＨ遺伝子をクローニングする方法は、ＣｓｌＦ遺 れらの穀粒においてβ−グルカンのさらなる増加が見ら 伝子のクローニングおよび特性決定において記載された れることが予想される。 方法と同様であった（Burton et al., Plant Physiol 1 【実施例１２】 20 46: 1821-1833, 2008）。コメセルロースシンターゼ様 【０２５９】 Ｈ１遺伝子（ＬＯＣ＿Ｏｓ１０ｇ２００９０）のオオム 実施例９から１１までの材料および方法 ギホモログの１．８ｋｂ仮想コンセンサス配列（ＴＣ１ 植物材料 ４０３２７）を、ＴＩＧＲデータベースにおいて同定し オオムギ（Hordeum vulgare）栽培品種ヒマラヤおよび た。ＰＣＲプライマー対（ＳＪ２７−ＳＪ７３およびＳ コムギ（Triticum aestivum）栽培品種チャイニーズ・ Ｊ７２−ＳＪ７５）を、コメＣｓｌＨ１配列に基づいて スプリング、ウェストニア（Westonia）およびボブホワ 設計し、これらを用いてｃＤＮＡ由来の配列を増幅した イト（Bob White26）を、標準的温室条件下で成長させ 。次いで、遺伝子の５’末端を５’ＲＡＣＥにより、Ｓ た。 ＭＡＲＴｃＤＮＡライブラリと、ネステッドＣｓｌＨ１ 【０２６０】 プライマーＳＪ２８およびＳＪ７９を使用して、製造業 プライマー配列 30 者（Clontech）の指示書に従って増幅した。 実施例９から１１まで、および本実施例において参照す 【０２６３】 るプライマー配列を、下記の表７に示す： 全長ゲノムクローンを、プライマーＳＪ９１およびＳＪ 【表７】 ８５ならびにＰｈｕｓｉｏｎ Ｔａｑポリメラーゼ（Fi nnzymes）を用いて、製造業者の推奨するサイクリング 条件（変性９８℃３０秒、その後、９８℃５秒、６３℃ ７秒および７２℃３分を３５サイクル）に従って増幅す ることによって単離し、ｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ ＴＯＰ Ｏクローニングベクター（Invitrogen）にクローニング した。 40 【０２６４】 コムギＣｓｌＨゲノムクローンを、ＰＣＲによって、Ｐ ｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを用いて、栽培品種チャイニ ーズ・スプリングからプライマーＳＪ１６３およびＳＪ １６４を使用して７０℃のアニーリング温度で単離した 。ゲノムウォーキングキットを、製造業者（Clontech） の指示書に従って使用し、さまざまなボブホワイト（デ ータ非掲載）から、３種のコムギＣｓｌＨホモログすべ てのコード領域の上流に伸長する配列を得た。第３のホ モログに特異的なプライマー（ＳＪ２０４）を設計し、 50 ＳＪ１６４とともに使用して第３の全長単離ゲノムクロ ( 40 ) JP 79 5759176 B2 2015.8.5 80 ーンを単離した。予測エクソン／イントロン境界が、配 番号７１）を、プライマーＳＪ９１およびＳＪ８５を使 列決定ｃＤＮＡ断片により正しくスプライシングされ得 用して増幅し、高分子量グルテニンＢｘ１７プロモータ ることを確認した（データ非掲載）。 ーの１．９ｋｂ断片とノパリンシンターゼターミネータ 【０２６５】 ーの間に、ＥｃｏＲＩ断片として挿入した（図２３）。 ＲＴ−ＰＣＲによるコムギおよびオオムギ中のＣｓｌＨ Ｂｘ１７プロモーターは、成長中の胚乳において高レベ 遺伝子の発現分析 ルの発現をもたらす（Reddy and Appels, Theor Appl G 総ＲＮＡを、７日齢の植物の第１葉、さまざまな年齢の enet 85: 616-624, 1993）。 濃い色の成長した子葉鞘および開花後４日（ＤＰＡ）間 【０２６８】 隔をあけて回収した成長中の穀粒の切片から単離し、Ｄ ボブホワイト２６コムギ植物を、バイオリスティック法 ＮＡｓｅ処理し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ （Pellegrineschi et al., Genome 45: 421-430, 2002 ＩＩＩを用 10 いて製造業者（Invitrogen）の指示書に従って逆転写し ）を使用して、５０ｍｇ／Ｌ た。ＰＣＲ反応を、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（Qiagen）を て用い形質転換させた。ＨｖＣｓｌＨ発現ベクター（ｐ 使用して実施した。 ＺＬＢｘ１７ＨｖｇＨ１）とＮＰＴＩＩ選択可能なマー ｃＤＮＡを希釈し、１μｌ当たり１ｎｇの元のＲＮＡと カー（ｐＣＭＳＴＬＳｎｅｏ、図２４）の発現を駆動す 等量のレベルでＰＣＲ反応に使用した。半定量的ＲＴ− るＣａＭＶ ＰＣＲのためにはＣｓｌＨ１プライマーＳＪ７２および ミドとを等モル量で混合し、未熟胚に同時に撃ち込んだ ＳＪ７４、ＣｓｌＦ遺伝子のためのプライマー対は下記 。 のとおりであった；（ＣｓｌＦ６；ＳＪ１０７−ＳＪ８ 【０２６９】 ２）、（ＣｓｌＦ４；ＳＪ９４−ＳＪ９５）、（Ｃｓｌ トランスジェニック植物を、トランスジーンの存在に関 Ｆ９；ＳＪ９７−ＳＪ９３）、（ＣｓｌＦ３；ＳＪ４４ 20 して、若葉組織およびSigma社のＲｅｄＥｘｔｒａｃｔ −ＳＪ３８）、（ＣｓｌＦ８；ＳＪ９６−ＳＪ３７）。 ｎＡｍｐ（商標）キットを使用して、プライマーＳＪ２ アニーリング温度は５９℃を使用した。試験増幅を実施 ４４およびＳＪ７９を用いてスクリーニングした。 して、増幅が飽和（チューブリンの２４サイクルを除き 【０２７０】 、およそ３２∼３５サイクル）でなかったことを確実に 開花（葯の出現および花粉の脱落）において、先端をタ し、産物を、アガロースゲル電気泳動後の臭化エチジウ グ付加し、穀粒をおよそ１５ｄｐａにおいて試料採取可 ム染色によって分析した。リアルタイムＰＣＲを３連の 能にした。先端由来の３種の穀粒をプールし、ＲＮＡを 試料について、Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ６０００装置（Corb 抽出し、逆転写し、トランスジーンの発現レベルを、リ ett Life Sciences, AU）においてＨｏｔＳｔａｒＴａ アルタイムＰＣＲによりプライマーＳＪ１８３およびＳ ｑ（Qiagen）、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎならびにプライマー Ｊ８５を使用して分析した。発現レベルを、α−チュー ＳＪ１８３およびＳＪ１６４ならびにアニーリング温度 30 ブリン（プライマーＴＵＢおよびＴＵＢ２Ｆ）に対して ６０℃を使用して実施した。相対的発現レベルを、コム 正規化し、最終的に最も低い発現体と比較した比で表し ギ０ｄｐａ試料を比較因子（１に設定）として用いて、 た。 装置のソフトウェアを使用して計算した。この試料のＣ 【０２７１】 ｔ値は２５．５サイクルであった。１５ｄｐａにおける 成熟単一穀粒由来の粉を、β−グルカン含有量に関して トランスジェニック穀粒の分析のために、相対的発現値 、リケナーゼ酵素法（AACC Method 32-33, Megazyme as を、チューブリンに対して正規化し、最も低い発現系統 say kit, McCleary and Glennie-Holmes, J. Inst Brew （Ｈ１−１３）と比較した。 ing 91: 285-295, 1985）の小規模バージョンを使用し 【０２６６】 て分析した。β−グルカン含有量を、粉砕全粒粉のパー Ｑ−ＰＣＲによるオオムギ中のＣｓｌＨ遺伝子の発現分 析 Ｇ４１８を選択試薬とし ３５Ｓプロモーターを有する第２のプラス セント（ｗ／ｗ）として表した。 40 【実施例１３】 ＨｖＣｓｌＨ１転写産物を、発芽後０．５から７日の成 【０２７２】 長中の子葉鞘において測定した。ＨｖＣｓｌＨ１転写産 オオムギ品種ゴールデンプロミス（Golden Promise）中 物は、伸長段階の完了および葉の出現後にだけ蓄積され のオオムギＣｓｌＨ遺伝子の過剰発現 ることが示された。発現の最も高いレベルは、子葉鞘が オオムギＣｓｌＨ 老化（ねじれおよび収縮）する７日後に見られた（Gibe ド領域を、２種のＧａｔｅｗａｙ可能なオオムギ形質転 aut et al., Planta 221:729-738, 2005）。 換ベクターに移した。ベクターｐＲＢ４７４は、胚乳特 【０２６７】 異的発現を提供するオートムギグロブリンプロモーター 胚乳においてオオムギＣｓｌＨ遺伝子を過剰発現するト を含有し（Vickers et al., Plant Mol Biol 62: 195-2 ランスジェニックコムギ植物の作製 14, 2006）、ベクターｐＭＤＣ３２（Curtis and Gross 全長オオムギ品種ヒマラヤのゲノムＣｓｌＨ配列（配列 50 niklaus, Plant Physiol. 133: 462-9, 2003）は、すべ ｃＤＮＡ（配列番号１）の全長コー ( 41 ) JP 81 5759176 B2 2015.8.5 82 ての植物組織において構成的発現を駆動する二重３５Ｓ 量を穀粒重量のパーセントとして、下記の表８に示す。 プロモーターを含有する。 【表８】 【０２７３】 オオムギの形質転換 ベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに 移し、オオムギ栽培品種ゴールデンプロミスの未熟胚盤 を、確立されたプロトコルを使用して形質転換し、トラ ンスジェニック植物の２種の集団を作製した。トランス ジーンの挿入は、サザンブロッティングにより確認した 。植物２３６−１から２３６−１８は、オートムギグロ 10 ブリンプロモーターにより駆動されるオオムギＣｓｌＨ 遺伝子を含有する。植物２３７−１および２は、３５Ｓ プロモーターにより駆動されるオオムギＣｓｌＨ遺伝子 を含有する。植物２０８−２、−３、−５および−７は 対照植物であり、オートムギグロブリンプロモーターの みを有する空ベクターｐＲＢ４７４についてトランスジ 【０２７７】 ェニックである。 空ベクター対照系統（２０８）は、およそ４％の（１， 【０２７４】 ３；１，４）−β−Ｄ−グルカン含有量を有し、これは 転写産物の分析 野生型ゴールデンプロミス穀粒では典型的である。Ｔ１ 葉および受粉後７および１４日（ＤＡＰ）の成長中の穀 20 穀粒をバルク化した（したがって、ヌル分離穀粒（null 粒の試料を、２３６種の植物から回収した。総ＲＮＡを -segregant grain）を含有する）にもかかわらず、有意 、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen）を使用して、標準的 な数のトランスジェニック系統（網掛け部分）が対照よ プロトコルに従って抽出し、ｃＤＮＡを、Burton et al り高い総（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン含有量 .（Plant Physiol 146: 1821-1833, 2008）に従って合 を示し、最も高い値は５．９％であった。 成した。定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を、Bu 【０２７８】 rton et al.（2008、上記）に従って実施した。Ｃｓｌ 当業者であれば、本明細書に記述されている本発明が、 Ｈ遺伝子の転写産物レベルを、トランスジェニック穀粒 具体的に記述されているもの以外の変形および変更を許 の胚乳において、一般的に非常に低い野生型胚乳レベル 容することを理解するであろう。本発明はそのような全 と比較した。 ての変形および変更を含むと理解されるべきである。本 【０２７５】 30 発明は同様に、個別的にまたは集合的に、本明細書にお 図２６に示すように、空ベクター対照系統（２０８）は いて述べられ、または示されているステップ、特徴、組 、ＣｓｌＨ転写産物の典型的な野生型のレベルを有する 成物および化合物の全て、ならびに該ステップまたは特 。トランスジェニック系統（２３６）は、７日目（７Ｄ 徴のいずれか２つ以上の任意のおよび全ての組合せを含 ）においてＨｖＣｓｌＨ１ む。 ｍＲＮＡレベルの有意な増 加を示し、受粉後１４日目（１４Ｄ）においてさらに増 【０２７９】 加する。 同様に、本明細書において用いられる単数形の「１つの 【０２７６】 （a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、 β−グルカンの分析 文脈上既に特段の指示がないかぎり、複数の態様を含む トランスジェニック植物由来のＴ１種子を回収した。個 ことに留意しなければならない。すなわち、例えば、「 々の個体植物由来のバルクＴ１穀粒の試料を粉砕して粉 40 トランスジーン（a transgene）」への言及は、単一の にし、存在するβ−グルカンの量を、Ｍｅｇａｚｙｍｅ トランスジーンだけでなく２以上のトランスジーンを含 法（上記）を使用して分析した。個々の植物からのデー み、「植物細胞(aplant cell)」は単一の細胞だけでな タを、２回の再現の平均値として表し、β−グルカンの く２以上の細胞を含むなどである。 ( 42 ) 【図１】 JP 【図３】 【図４】 【図５】 【図２】 5759176 B2 2015.8.5 ( 43 ) 【図６】 JP 【図８】 【図９】 【図７】 【図１０】 5759176 B2 2015.8.5 ( 44 ) 【図１１−１】 JP 【図１２】 【図１１−２】 【図１３】 5759176 B2 2015.8.5 ( 45 ) 【図１４】 JP 【図１６−１】 【図１６−２】 【図１５】 5759176 B2 2015.8.5 ( 46 ) 【図１６−３】 JP 【図１７−２】 【図１７−３】 【図１７−１】 5759176 B2 2015.8.5 ( 47 ) 【図１７−４】 JP 【図１７−６】 【図１８−１】 【図１７−５】 5759176 B2 2015.8.5 ( 48 ) 【図１８−２】 JP 【図２０】 【図２１】 【図２２】 【図１９】 5759176 B2 2015.8.5 ( 49 ) JP 【図２３】 【図２５】 【図２４】 【図２６】 5759176 B2 2015.8.5 ( 50 ) 【図２７】 JP 5759176 B2 2015.8.5 ( 51 ) 【配列表】 0005759176000001.app JP 5759176 B2 2015.8.5 ( 52 ) JP 5759176 B2 2015.8.5 ──────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/10 (2006.01) Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 (2006.01) Ｃ１２Ｐ 21/08 (73)特許権者 508034912 グレインズ (74)代理人 ．オー．ボックス ５３６７ 平木 祐輔 藤田 節 新井 栄一 100111741 田中 夏夫 ダブリン，モニカ，スザンヌ オーストラリア国 (72)発明者 ウッド ラス スミス (56)参考文献 ９ ３０７３ ヴィクトリア，レザーヴァー，ホッブス クレセント １／１５ ３０８４ ヴィクトリア，イーグルモント，モスマン ドライブ ４ ２９１３ ストリート オーストラリアン キャピタル テリトリー，ニコルズ，フリート １８ ５０６６ サウス オーストラリア，ヘーゼルウッド パーク，ハワード テ ４８ バートン，レイチェル，アニータ オーストラリア国 審査官 ストリート フィンチャー，ジェフリー，ブルース オーストラリア国 (72)発明者 ポンズ，ラトローブ ジョブリング，ステファン，アラン オーストラリア国 (72)発明者 ヴィクトリア，ムーニー ベイシック，アントニー オーストラリア国 (72)発明者 ３０３９ ペットリノ，フィロメナ，アンジェラ オーストラリア国 (72)発明者 テリトリー，キングストン，ピー 100122389 弁理士 (72)発明者 コーポレーション キャピタル 100118773 弁理士 (74)代理人 ディベロップメント オーストラリアン 100091096 弁理士 (74)代理人 アンド ２０６４ 弁理士 (74)代理人 リサーチ オーストラリア国 ５０４１ サウス オーストラリア，パノラマ，パノラマ ドライブ ７ 鶴 剛史 米国特許出願公開第２００６／０１４３７２９（ＵＳ，Ａ１） 米国特許出願公開第２００７／０１９２９０７（ＵＳ，Ａ１） HUNTER,C.T. et al.，Analuses of Mu-induced knockout mutations in cell wall biosyntheti c genes of maize identified through reverse genetics.，Plant Biology 2005, Meeting of the American Society of Plant Biologists，２００５年 ７月１６日，Abs # 420，pp.177， ＵＲＬ，http://abstracts.aspb.org/pb2005/public/P49/8025.html LIEPMAN,A.H. et al.，Expression of cellulose synthase-like (Csl) genes in insect cells reveals that CslA family members encode mannan synthases.，Proc. 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