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甘味タンパク質の構造機能相関
【解説】 甘味タンパク質の構造機能相関 ソーマチンから見えてきたこと 桝田哲哉 甘 味 は 基 本 5 味 の な か で， 最 も 親 し み の あ る 魅 力 的 な 味 で あ る． 甘 味 を 呈 す る 食 品 は 好 ん で 食 べ ら れ，「甘 い も の は 別 腹」という現象も多くの人が経験している．しかしながら糖 質の過剰摂取が生活習慣病や齲歯の一因と考えられているた め，低カロリー甘味料の開発や，摂取後に血糖値の上昇を伴 わ な い 甘 味 料 の 開 発 が 注 目 さ れ て い る． 新 規 甘 味 料 の 開 発 その立体構造が明らかになっているが，甘味タンパク質 間に共通して存在するアミノ酸配列や構造の特徴などは 見いだされていない（図 1） ．甘味タンパク質の多くは， 卵白リゾチームを除き，熱帯雨林に自生する植物に由来 する．甘味強度についてはショ糖との相対比（モル比， は，甘味物質の構造活性相関を土台にして，行われてきた背 重量比）や，ヒト官能検査による閾値法により同定され 景がある．本稿では甘味タンパク質ソーマチンの甘味発現部 ており，ソーマチンやモネリンはショ糖に比べモル比で 位，構造活性相関を中心にほかの甘味タンパク質の知見を交 え近年のトピックスについて概説する． 10 万倍，重量比で 3 千倍と非常に強い甘味を呈する．こ れら甘味タンパク質はいずれも天然甘味料（Natural Sweeteners）である．天然の甘味料としてはほかに の葉に含まれるステビオシドやレバウデ 甘味を呈するタンパク質 オシド A，ブドウやメロンに含まれるエリスリトール， 精製されたタンパク質は一般的に無味，無臭である 甘草の根に含まれるグリチルリチンなどがあるがいずれ が，例外的に甘味を呈するタンパク質が存在する．これ も低分子物質である（4, 5）（表 1）．一方，合成甘味料とし までに 6 種類のタンパク質（ソーマチン，モネリン，ネ ては，サッカリン，アスパルテーム，アセスルファム オクリン（クルクリン） ，マビンリン，ブラゼイン，卵 K，スクラロースが挙げられるが，いずれも強い甘味を （1∼5） 白リゾチーム）が甘味を呈すると報告されている （表 1）．これら 6 種類のタンパク質については，すでに 呈することから「高甘味度甘味料」とも呼ばれ，食品， 飲料に広く用いられている． Structure‒Activity Relationships on the Sweet-Tasting Protein : Studies on the Sweet-Tasting Protein, Thaumatin Tetsuya MASUDA, 京都大学大学院農学研究科 化学と生物 Vol. 52, No. 1, 2014 23 表 1 ■ 甘味タンパク質，甘味物質の特性 分子量 甘味タンパク質 ソーマチン モネリン ブラゼイン マビンリン II ネオクリン リゾチーム 1 22,000 11,100（二量体） 6,500 12,400（二量体） 25,000（二量体） 14,500 等電点 12 9.3 5.0 11.3 7.5‒9.5 11 甘味度 1 1,600‒3,000 3,000 2,000 110 550 20 （100,000） （100,000） （40,000） （4,000） （20,000） （700） 天然甘味料 ステビオシド レバウデオシド A エリスリトール グリチルリチン 318.45 967.01 122.12 822.94 210 242 0.7 93‒170 高甘味度甘味料 サッカリン アスパルテーム アセスルファム K スクラロース ネオテーム シクラメート 183.19 294.30 201.24 397.64 378.47 201.22 400‒700 200 200 600 6,000‒10,000 30‒50 構造 2 到達分解能（Å） β-sandwich ; 11 β-strands in 2 sheets α and β ; α‒β（× 4） β-hairpin and 2 adjacent disulfides all α ; 4 helix β-prism II ; 4-stranded sheets（× 3） α and β ; α＋β motif 0.94（2vhk） 1.15（2o9u ; MNEI） NMR（2brz） 1.7（2ds2） 2.76（2d04） 0.65（2vb1） 甘味度はショ糖に比べ重量比で示す．括弧内はモル比．2 到達分解能，括弧内は PDB 番号を示す． Benth の果実から単離される．陽イオン交換 クロマトグラフィーの溶出パターンから少なくとも 5 つ の バ リ ア ン ト（ソ ー マ チ ン a, b, c, I, II） が 存 在 し， ソーマチン I，ソーマチン II が構成成分の大半を占める． ソーマチンはヒスチジン以外の 19 種のアミノ酸を構成 成分とする 207 アミノ酸残基からなる一本鎖タンパク質 であり，分子量 22,000，等電点が 12，分子内に 8 つのジ スルフィド結合をもつ．ソーマチンの微生物生産が長年 困難であったのは，このジスルフィド結合の多さに一因 があるかもしれない．ソーマチン I および II のアミノ酸 配列を比較すると，4 カ所のアミノ酸残基の相違が見ら れる．46 番目，63 番目，67 番目，76 番目のアミノ酸残 基が異なるが，ソーマチン I ではこの順でアスパラギ ン，セリン，リジン，アルギニンであり，ソーマチン II ではリジン，アルギニン，アルギニン，グルタミンであ る．このようにソーマチン II のほうが全体として塩基性 度が高い． 図 1 ■ 甘味タンパク質の構造 上段左から，ソーマチン（3al7）, モネリン（3mon）, ブラゼイン （2brz）, 中段左からネオクリン（2d04）, マビンリン II（2ds2）, 下段 左から，鶏卵リゾチーム（2vb1）, ガチョウリゾチーム（153l）. 括 弧内は PDB 番号．α-へリックスを赤色，β-ストランドを黄色で示 す．図は pymol で作成した． ソーマチンは甘味料のみならず，タンパク質結晶化の モデルタンパク質としても広く利用されており，現在ま でプロテインデータバンク（PDB）には 40 種類ほどの構 造が登録されている．それら構造の多くは，ソーマチン I と II の混合物や，精製ソーマチン I であり，分解能が 1 Åを切る高分解能のソーマチン I の構造解析も行われて 甘味タンパク質ソーマチンの特徴 ソーマチンは西アフリカ原産の植物 24 いる．近年，筆者らも大型放射光施設 SPring-8 におい て分解能が 0.9Å前後の構造解析に成功し，また初めて ソーマチン II の構造を明らかにした．ソーマチンは 3 つ 化学と生物 Vol. 52, No. 1, 2014 のドメインからなり，コアドメインであるドメイン I は おける高分解能構造データの比較により，pH 変化に伴 典型的な 11 個の β-ストランドで構成されている（アミ うタンパク質の揺らぎ，構造変化をも追跡することも可 ノ酸残基 1 ∼ 53, 85 ∼ 127, 178 ∼ 207） ．残りの 2 つのド 能となっている（7）． メインはジスルフィド結合に富むドメイン III（アミノ 酸 残 基 54 ∼ 84） と ド メ イ ン II（ア ミ ノ 酸 残 基 128 ∼ ソーマチン発現系の構築，ソーマチンプレ配列が発 177）を含んでいる（図 2） ．SCOP（Structural Classifi- 現効率に与える影響 成熟型のソーマチンは 207 アミノ酸残基からなるが， cation of Proteins）においてソーマチン様タンパク質 （thaumatin-like protein）スーパーファミリーに分類さ 前駆体として N 末端に 22 アミノ酸残基からなるプレ配 れている．高分解能構造解析を行うことにより，異方性 列と C 末端に 6 アミノ酸残基からなるプロ配列を有する 温度因子（anisotropic temperature factors）を考慮した （図 3） ．これらプレ，プロ配列は植物においては成熟過 構造の精密化が可能となり，多くのアミノ酸残基におい （6） て，水素原子の存在も確認できた ．また異なる pH に 程で除去される．また，酵母 においても プレ，プロ配列を含む植物由来のソーマチン遺伝子を用 い て 発 現 を 行 う と プ レ 配 列 が 除 去 さ れ る． 近 年， の発現系において，プレ配列ならびにプロ配列 の影響について検討が行われ，プレ配列を用いると N 末 端が正しくプロセスされ，かつ発現量が大幅に増加する 結果となった．一方，プロ配列は除去されず，植物とは 違う機構で発現されることが示唆された．培養条件の検 討，マルチコピー株が作製され，発現量も 1 L あたり 100 mg と大きく改善されている．麹菌での発現では， 甘味を呈する組換え体ソーマチンの大量取得に成功して いるが，N 末端が正しくプロセスされず配列の異なる複 数のタンパク質が発現されている．またトランスジェ ニック植物による発現も試みられており，ジャガイモ， トマトなどでの発現が行われている． 甘味タンパク質の構造活性相関 図 2 ■ ソーマチンの構造 上段左，ソーマチンの cartoon モデル．ドメイン I, II, III, をそれ ぞれ赤色，緑色，青色で示す．黄色は変異体の結果から甘味発現 に重要であると指摘された，Lys67, Lys137, Tyr169 を stick model で示している．上段右，ソーマチンとモネリン双方に反応する 抗 体 の エ ピ ト ー プ． 認 識 部 位 を 赤 色 で 示 し，Asp21, Phe80 を stick model で示す．Arg82 を青色で示す．下段，甘味に影響を与 え た 残 基 2 オ ー ダ ー 以 上 の 甘 味 低 下 が 見 ら れ た 残 基 Lys67, Arg82 を赤色で，1 オーダー程度の甘味低下が見られた残基を青 色で示す．下段右図は左図（クレフト中心）を垂直軸に対し − 90 度回転させクレフト面を側面から描く． 1. ソーマチンの甘味発現部位の探索，構造活性相関 ソーマチンの甘味発現部位の同定はアミノ酸残基側鎖 の化学修飾により古くから検討されてきた．初期の知見 では，アルギニン残基ではなくリジン残基の正電荷が甘 味にかかわり，チロシン残基も甘味にかかわっていると 考えられていた（8）．しかしこれら化学修飾の解析では修 飾残基の同定，構造変化の有無についての検討は十分な されず，後年リジン残基をピリドキサール 5 リン酸で化 図 3 ■ ソーマチンの核酸配列 ソーマチン I の核酸配列，プレ配列 （22 アミノ酸残基）を橙色，プロ配列 をピンク色で示す．4 カ所の実線赤色 はソーマチン I と II で配列が異なる箇 所を示し，破線赤色は 113 番目の残 基を示す．植物ではプレ配列，プロ 配列双方除去されるが，酵母におい てはプレ配列のみ除去される． 化学と生物 Vol. 52, No. 1, 2014 25 学修飾した 1 残基修飾体の分離，同定が行われ，5 つの ノ酸であるアルギニンに注目すると，Lys106 から 10 ∼ リジン残基（Lys78, Lys97, Lys106, Lys137, Lys187）の 11Å離れたところに Arg82 と Arg79 の側鎖が位置して （9） 重要性が指摘された ．またこれら修飾体の負電荷をア おり，それら変異体について検討がなされた．その結果 ルカリフォスファターゼで除去すると，Lys106 以外は R79A 変異体では，3.8 倍，R82A 変異体では，24.4 倍甘 未修飾と同様の甘味閾値に戻ったが，クレフト内部に存 味が低下し，これまでアルギニン残基がソーマチンの甘 在する Lys106 については，負電荷を除去しても甘味が 味に寄与しないという化学修飾の報告と大きく結果を異 減少したままであり，その側鎖構造が甘味発現に重要で とするものとなった．R82A 変異体の結果からそのほか あるとの結果が得られた．それぞれの修飾体の CD スペ のアミノ酸置換体について検討がなされ，R82K 変異体 クトルによる解析では，未修飾ソーマチンと顕著な構造 で 5.3 倍，R82Q 変異体で 22.4 倍甘味が低下し，負電荷を の違いが見受けられず，クレフト構造を含む面に広く存 導入した R82E 変異体ではおよそ 200 倍甘味が低下する 在するリジン残基の正電荷が，受容体と multi-point in- 結果となった（図 2） ．R82E 変異体の甘味低下は後述す teraction しているとの報告がなされた．化学修飾法で るほかの甘味タンパク質の変異による甘味の低下に比べ は，意図したアミノ酸残基のみの修飾や，修飾体を単離 極めて著しい低下であった．R82Q 変異体と R82E 変異 するのに多くの労力がかかるのが欠点である． 体の甘味強度の違いも興味深い点であり，Arg82 の側鎖 部位特異的変異体によるソーマチンの甘味発現部位の はソーマチンの強い甘味を決定づける要因であると考え 解析は，変異を行う部位としてまずソーマチン I と II と られる．これまでのソーマチン I, II の高分解能構造解 で配列が異なる箇所に検討がなされた（9）．その結果によ 析より，甘味発現に重要な 2 残基である，67 番目と 82 ると Ser63 と Arg76 の変異は甘味に影響を与えなかった 番目のアミノ酸残基の側鎖のフレキシビリティーが高い が Lys67 の変異により甘味が減少した．K67E の場合， ことが明らかとなっており，この揺らぎが甘味受容体と 植物ソーマチン I と比べ ∼ 50%, K67A の場合 20% 以下 の相互作用に重要な役割を果たしていると考えられる． であった．そのほか Lys137, Asp113, Tyr169 の変異に 部位特異的変異体を用いた研究以前にはモノクローナ より甘味が減少したとの報告がある．これら残基はいず ル抗体を用いた甘味発現部位の探索もなされていた． れもドメイン II とドメイン III が寄り合った位置に存在 ソーマチンに対して作成された抗体が，モネリンとも交 している（図 2） ．次に，ピリドキサール 5 リン酸による 差して反応し，その逆の現象（モネリン抗体もソーマチ 化学修飾の結果をもとに，酵母 を発現系と ンと交差する）も確認されていた（12, 13）．つまり抗体が して検討がなされた（10, 11）．まず重要性が指摘されてい 認識する部位が甘味発現部位であるとの発想から，双方 たクレフト構造を含む面に存在する塩基性アミノ酸残基 のエピトープの探索がなされた．その結果，この交差抗 に焦点が絞られ，変異体が作製された．リジン残基変異 体はソーマチンの 19-KGDAALDAGGR-29 と 77-CKRF- 体では特に K67A の甘味が 19.3 倍，K67E では 33.3 倍低 GRPP-84 を認識していた（図 2） ．このエピトープのな 下 し た（図 2） ． そ の ほ か の 変 異 体（K19A, K49A, かには，アスパルテーム様の構造（Asp21-Phe80）が見 K106A, K163A）では 1.6 倍から 4 倍程度の甘味の低下で いだされており，興味深いことに，ソーマチンの強い甘 あった．化学修飾の結果から重要性が示唆されていた 味を決定づける残基である Arg82 もこのペプチドのな Lys106 の変異体 K106A では 3.1 倍の甘味低下に留まり， かに含まれている．受容体と甘味タンパク質との相互作 先のピリドキサール 5 リン酸の化学修飾の結果（5.8 倍） 用には分子表面に存在する（ソーマチンの場合はクレフ と少し結果を異とした．ピリドキサール 5 リン酸を用い トが含まれる面）複数のアミノ酸残基が寄与していると た化学修飾の場合，かさ高い芳香環がリジンの ε-アミ 考えられるので，抗体が認識する抗原決定基（エピトー ノ基側鎖に導入されるため，リジンをアラニンに置換し プ）とオーバーラップしていたのは，ごく自然な結果と た部位特異的変異体と比べ，ほかのアミノ酸残基側鎖な も捉えることもできる． どに局所的な影響を与えることも考えられ，化学修飾と 部位特異的変異との実験結果について注意を払う必要が 2. モネリンの特徴，甘味構造活性相関 あると考えられる．Lys106 の近傍に存在する塩基性ア ソーマチンが一本鎖タンパク質であるのに対しモネリ ミノ酸残基について立体構造上で検討すると，9Å離れ ンは 44 アミノ酸からなる A 鎖と 50 アミノ酸からなる B たところに Lys49 の ε-アミノ基が位置している．しかし 鎖が非共有結合したヘテロ二量体タンパク質である（図 ながら K49A 変異体では 3.1 倍程度の甘味低下であった 4）．モネリンは非共有結合したヘテロ二量体であるため ためほかの残基の関与が推測された．そこで塩基性アミ 加熱に対して極めて不安定である．モネリンは比較的小 26 化学と生物 Vol. 52, No. 1, 2014 R70E（ArgA20）変異体では 100 倍から 25 倍甘味が低下 す る 結 果 と な り，Asp72（AspA22） を 含 む Arg86, Arg70 で形成される領域が重要な役割を果たすことが 明らかとなった（17）（図 4）．またモネリンの C 末端には Pro-Val-Pro-Pro-Pro という連続したプロリン残基が分子 表面に存在する．これら Pro 残基を順次欠損させた変異 体を作製しその甘味強度を検討したところ，Pro 残基が 図 4 ■ モネリンの構造 モネリンは 44 アミノ酸からなる A 鎖と 50 アミノ酸からなる B 鎖が 非共有結合したタンパク質である．A 鎖を赤色，B 鎖を青色で示 してある．一本鎖モネリンは B 鎖の C 末端と A 鎖の N 末端を直接 結合させた SCM と B 鎖と A 鎖の間にグリシンとフェニルアラニン の配列を挿入した MNEI が知られている．右図，モネリンの甘味 発現にかかわる残基 2 オーダー以上の甘味低下が見られた残基 （B 鎖：Ile6, Asp7, Ile8, Arg39, A 鎖：Arg36） を 赤 色 で，1 オ ー ダー程度の甘味低下が見られた残基を青色で示す．C 末端の Pro‒ Pro-Pro 配列を水色で，変異により甘味が強まった残基 Tyr65（A 鎖 Y13）を黄色で示してある． 減少するにつれ甘味も減少することがわかった．この時 点では preliminary な CD 解析が行われ，わずかな 2 次構 造変化が見られたという報告であったが，近年，MNEI 変異体の X 線構造解析の結果から，この C 末端の Pro 残 基が甘味に与える影響についても議論されている（18）． また，SCM の変異体の解析より，Glu2（GluB2） , Asp7 （AspB7）, Arg39（ArgB39）の 3 残基が甘味にかかわり， なかでも Asp7 と Arg39 の 2 残基に変異が導入されると モネリンの 2 次構造および 3 次構造の安定性と甘味に影 さいタンパク質であるので，A 鎖，B 鎖のそれぞれのポ 響を与えると報告されている（19）． リペプチド鎖をペプチド固相化学合成し，両者を混合す ることで再構成させたモネリンアナログを用いた解析が 3. ブラゼインの甘味構造活性相関 行われている点がほかの甘味タンパク質と大きく異な ソーマチン，モネリンなど甘味タンパク質の多くは塩 る（14）．アスパラギン酸残基をアスパラギンに置換した 基性タンパク質であるが，ブラゼインは等電点が 5 の酸 アナログが作製され，甘味に与える影響が検討された結 性タンパク質である．甘味強度はショ糖に比べモル比で 果，B 鎖の 7 番目に存在する Asp を Asn に置換したアナ 4 万倍，重量比で 500 から 2,000 倍と報告されている．果 ログが甘味を消失した．このアナログは CD スペクトル 実中にはアミノ酸残基 54 残基と 53 残基の 2 種類のブラ で天然モネリンと同様の波形を示した．AspB7 近傍の ゼインが存在している．前者は 80% を占め，N 末端がピ アミノ酸残基についても検討がなされ，IleB6, IleB8, ログルタミン酸化されている．後者はピログルタミン酸 GlyB9 の重要性も指摘された（図 4）．興味深いことに， が欠如している．54 アミノ酸残基中，約 50% のアミノ このモネリン B 鎖の甘味発現部位，Ile-Asp-Ile 配列は， 酸残基が極性アミノ酸残基である（Asp 5 残基，Arg 2 ソーマチンの配列 100 番目から 102 番目（Ile-Asp-Ile）に 残基，Glu 4 残基，His 1 残基，Lys 7 残基，Tyr 6 残基， も存在している．ソーマチンの場合これら残基は分子内 Ser 2 残基）．ブラゼインは甘味タンパク質のなかでは最 部に存在する β-ストランドに位置しており，直接甘味 も小さく（分子量約 6,500） ，分子内に 4 つのジスルフィ 受容体との相互作用には関与しないと思われるが，甘味 ド結合を有し，80 度，4 時間の加熱でも安定である（20）． 発現に必須な立体構造保持に重要な役割を果たしている ブラゼインの構造は NMR で決定され，3 つの逆並行 β- 可能性も挙げられる．この点については今後の検討課題 ストランドと一つの α-へリックスから構成されること であると言えよう． がわかった（図 1） ．また近年，分解能 1.8Åの X 線結晶 部位特異的変異体を用いた甘味発現部位の同定では， 構造解析もなされ，NMR で得られた構造との相違点も 2 つのペプチド鎖を遺伝子工学的手法により結合させた 指摘されている（21）．ブラゼインの発現は staphylococcal 一本鎖モネリンが用いられている．立体構造上 A 鎖の N nuclease を N 末端に融合させた大腸菌発現系や酵母発 末端と B 鎖の C 末端が近傍に位置しているため，A 鎖の 現系を用いて行われている．ブラゼインの甘味‒構造活 N 末端（Arg1）と B 鎖の C 末端（Glu50）を直接結合させ 性相関の研究においても多くの変異体が作製され，N 末 （15） た 94 アミノ酸残基からなる SCM と A 鎖と B 鎖の間 端と C 末端を含む領域と，Arg43 を含むフレキシブルな にグリシンとフェニルアラニン 2 残基のスペーサを導入 ループがブラゼインの甘味発現にかかわることが報告さ した 96 残基からなる MNEI の 2 種類の一本鎖モネリン れた（22）．後年さらに 25 種類の変異体を用いた解析によ が作製された（16）（図 4）．固相ペプチドによる構造活性 り，C 末 端 領 域 と，Asp29-Arg33, Glu36, Tyr39-Arg43 相 関 の 結 果 を 基 に 検 討 が な さ れ，R86E（ArgA36）, が甘味に大きく影響することが示された（23）（図 5）．ま 化学と生物 Vol. 52, No. 1, 2014 27 ことがわかった．また，これらそれぞれの残基の甘味に 対する貢献度について検討がなされ，Lys13 と Arg14 は いずれかの残基があれば甘味を保持できるが，そのほか の残基は相加的な役割を果たしているとの知見が得られ ている（27）． 甘味受容体 1999 年 cDNA サブトラクション法により，味覚組織 図 5 ■ ブラゼインの構造 に特異的に高発現している味覚関連遺伝子のスクリーニ ブラゼインは 54 アミノ酸残基からなる．N 末端がピログルタミン 酸化されたバリアントが 80% を占める．甘味発現にかかわる残 基，Lys6, Lys30, Arg33, Glu36, Arg43, Tyr54 を赤色，Lys5, Tyr8, Lys15, His31, Asp50 を青色で示す．部位特異的変異により甘味が 強くなった部位については黄色で示す． ングが行われ，新規の 7 回膜貫通型の G タンパク質共役 型受容体（GPCR）遺伝子（T1R1, T1R2）がクローニン グされた（28）．その後，ヒトゲノムデータベースからヒ ト第 1 染色体 1p36 領域にあたる BAC クローンの塩基配 列がスクリーニングされ，新規な遺伝子（T1R3）がク た Lys18 と Ala19 間にジペプチド Arg-Ile を挿入すると， ローニングされた（29∼32）．T1Rs は GPCR ファミリーの 甘味が消失することが示され．ジペプチドの挿入で サブグループ C に属するが，このグループの特徴として Cys16-Cys37 のジスルフィド結合が変化し，間接的に 細胞外の N 末端部分が大きなドメインを形成している Glu36 の構造に影響を与えていることが明らかとなって ことが挙げられる（図 6） ．T1Rs はおよそ 500 アミノ酸 いる．近年，His31, Glu36, Glu41 をそれぞれ Arg, Asp, 残基からなる細胞外ドメイン（NTD）, その下流に 50 ア Ala に置換した 2 残基変異体（H31R-E36D, H31R-E41A, ミノ酸残基ほどのシステインリッチ領域（CRD）を有 E36D-E41A） , 3 残基変異体（H31R-E36D-E41A）が作製 し，さらに 300 アミノ酸残基からなる C 末側膜貫通領域 され，いずれも wild-type に比べ甘くなると報告されて （TMD）を有する（図 6） ．その後の研究により，T1R1- いる（24）．また高分解能 NMR により，甘味に寄与する T1R3 のヘテロ二量体はうま味受容体を T1R2-T1R3 のヘ Tyr11 の温度依存的な構造変化を追跡した興味深い報告 テロ二量体は甘味受容体を形成することがわかっ （25） もある た（33, 34）．甘味受容体 T1R2-T1R3 は，糖類，アミノ酸， ． ペプチド，合成甘味料，甘味タンパク質を認識する．以 ほかの甘味タンパク質の構造活性相関 4. これまで，ソーマチン，モネリン，ブラゼインについ 下に主な甘味物質について受容体上での結合，応答に係 る部位について概説する． て甘味構造活性相関について紹介してきたが，そのほか にマビンリン，ネオクリン，リゾチームが甘味を呈す る．マビンリンについては 2008 年に立体構造が決定さ 低分子甘味物質の受容体結合部位の探索 れ，ほかの甘味タンパク質とは異なり，β-ストランドを 甘味物質は糖類から合成甘味料，甘味タンパク質にい 含まず α-へリックスのみから構成されることがわかっ たるまで構造特性は大きく異なる．これまでの実験結果 た（図 1）．しかしながら，変異体作製による甘味部位 から甘味物質に対する応答は生物種によって異なること の同定，構造活性相関の観点からの研究はまだ十分な結 が知られている．代表例としてマウスやラットなどの 果を得られていない．ネオクリンについては，それ自身 げっ歯類は，ヒトが甘味を感じることのできる甘味タン 甘味を呈するが，酸味を呈する物質を味わうと甘味に変 パク質（ソーマチン，モネリン，ネオクリン，ブラゼイ える「味覚修飾タンパク質」であり，すでにその観点か ン）や合成甘味料のアスパルテーム，ネオテーム，シク ら多くの変異体の検討がなされており，これらについて ラメートなどを認識しない．一方でシュクロースやグル （26） は，総説を参照されたい ．リゾチームについても， コースなどはヒトを含めげっ歯類も感知することができ 多くの化学修飾体，部位特異的変異体が作製され，溶菌 る．そこでこの種間の甘味物質に対する感受性の違いを 活性に重要な残基 Glu35 と Asp52 が存在する面とは反対 利用して，ヒト由来甘味受容体やマウス由来甘味受容体 の面に散在している 5 つの塩基性アミノ酸残基（Lys13, を HEK293 細胞などの培養細胞で強制発現させ，甘味物 Lys96, Arg14, Arg21, Arg73）が甘味発現に重要である 質にどのような応答性を示すのかを調べることにより， 28 化学と生物 Vol. 52, No. 1, 2014 図 6 ■ 甘味受容体 上図：甘味受容体のサブユニットは およそ 500 アミノ酸残基からなる細 胞外ドメイン（NTD）, その下流に 50 アミノ酸残基ほどのシステインリッ チ領域（CRD）を有し，さらに 300 ア ミノ酸残基からなる C 末側膜貫通領 域（TMD） を 有 す る．Cartoon 図 は グルタミン酸受容体（2e4u）アドレ ナリン受容体（3p0g）の構造をもと に，modeller（9.10）を用いて作製し た．下図：Wedge model．ドメイン の 配 置 が「Open」 型（左） と 「Closed」型（右）の平衡状態にあり， リガンド存在下では活性状態を示す 「closed-open/A」 の 構 造（右 側） に なる．低分子甘味物質の場合，結合 部位に結合し活性型となるが，甘味 タンパク質の場合，低分子甘味物質 の 結 合 部 位 で は な く， 受 容 体 に 楔 （wedge）を打ち込むような様式で活 性状態になる． 受容体のどの領域が甘味物質の結合や応答に関与してい る の か 検 討 さ れ た． ヒ ト 型 T1R2-T1R3 は， ラ ッ ト 型 T1R2-T1R3 で 応 答 性 が 見 ら れ な い ア ス パ ル テ ー ム や ソーマチン，モネリンなどの甘味タンパク質に対して応 答が見られた．次にヒト型 T1R2 とマウス型 T1R3 を組 合せた受容体（hT1R2-mT1R3）を作製し，応答性を検 討したところ，マウス型 T1R2-T1R3 に対して応答が見 られなかったアスパルテームに対し応答が見られたこと から，アスパルテームの応答はヒト型 T1R2 が必要であ ることが示唆された（35）．この結果については T1R2 遺伝 子をノックアウトしたマウスに，ヒト型の T1R2 遺伝子 を導入すると，本来マウスが感じえない甘味物質（モネ リン，ソーマチン，アスパルテーム，アセスルファム K，グリチルリチン）に対して反応を示した 図 7 ■ 甘味受容体と甘味物質の相互作用部位 で ス）との応答に関する受容体のアミノ酸残基が詳細に特 の実験によっても検証されている（36）．次に受容体内の 定されており，アミノ酸誘導体，スルファミン酸類，糖 応答に係わる領域をさらに特定するため，ヒトとラット アナログの 3 種の構造が異なる甘味物質がどのような選 の T1R2，T1R3 遺 伝 子 か ら N 末 端 側 細 胞 外 ド メ イ ン 択性で受容体の応答に寄与しているか精緻に検討が行わ （NTD）と C 末端膜貫通ドメイン（TMD）を置換したキ れている（38）．一方シクラメートはヒト型 T1R3 の TMD メラレセプターを作製し，検討したところ，アスパル が関与していることが同様の実験で示されている．以上 テームとネオテームの応答にはヒト型 T1R2 の NTD が のことから，甘味受容体 T1R2-T1R3 には多くの甘味物 （37） 必要であることが示された （図 7） ．さらに，ヒト由 質に対するリガンド結合部位が存在し，さまざまな構造 来 T1Rs の ア ミ ノ 酸 配 列 と マ ウ ス お よ び ラ ッ ト 由 来 をもつ甘味物質に対して幅広く対応していると考えられ T1Rs のアミノ酸配列とを比較し，ヒトのアミノ酸配列 る． を基に受容体の点変異体を作製し検討がなされた．その 結果アスパルテーム，ネオテームに対する応答には，ヒ ト T1R2 の Ser144 および Glu302 が重要であることが示 甘味タンパク質の甘味受容体応答部位の探索 された．さらに近年，T1R2-T1R3 の甘味受容体モデル 先述の種間の甘味物質に対する感受性の違いを利用 を用い，低分子甘味物質（アスパルテーム，D-トリプト し，モネリンの応答には T1R2 が，一方ブラゼインは ファン，サッカリン，アセスルファム K，スクラロー T1R3 が関与していることが見いだされた（39）．さらにブ 化学と生物 Vol. 52, No. 1, 2014 29 ラ ゼ イ ン の 認 識 に は ヒ ト T1R3 の CRD に 存 在 す る Asp68 に着目し変異体を作製した．その結果，グルタミ Ala537 と Phe540 が関与していることが明らかとなっ ン酸に置換した変異体（M42E, Y63E, Y65E）や D68R 変 た．また，この部位における変異体が，わずかではある 異体はいずれも甘味が減少した．一方，アルギニンに置 が低分子甘味料（ショ糖，D-トリプトファン，サッカリ 換した変異体（M42R, Y63R）も甘味が減少したが，正 ン，アスパルテーム）やモネリンに対する受容体活性に 電荷を増加させる置換よりも負電荷を増加させる置換の 影響を与えていたことから，T1R3 の CRD が甘味受容体 ほうが甘味に与える影響が強い傾向があった．一方， として機能するうえで重要な役割を担っていると示唆さ Y65R 変異体では wild-type より 1.6 倍ほど甘味が強くな れている．また，ネオクリンの応答にはヒト T1R3 の る結果となった．このように受容体とのドッキングモデ NTD が（40），ソーマチンの応答にはヒト T1R3 の CRD が ルを用いることで，さらに甘いタンパク質をデザインす かかわっていると示唆され，近年 CRD 中の 5 つのアミ ることも可能であると期待される．しかしながら相当数 ノ酸残基が応答に重要な役割を担うとの結果が得られて の変異体タンパク質やアナログの構造活性相関の結果を （41, 42） いる （図 7）． もとに受容体のモデル構造の有用性が導き出されている のも現況である． 甘味受容体モデルを用いた甘味タンパク質とのドッ キングシミュレーション こ の wedge model と は 別 に， ブ ラ ゼ イ ン 変 異 体 の データを参照にして受容体とのドッキングシミュレー T1Rs は現時点でそれらの立体構造は決定されていな ションが行われ，ブラゼインは T1R2 の NTD にも結合 いが，甘味受容体と同じファミリーに属する代謝型グル しうることが示された（44）．さらに「より甘い」ブラゼ タミン酸受容体（mGluR）については構造が決定されて イン変異体の作製も試みられている（44）．甘味が強く いる．グルタミン酸受容体はホモ二量体からなり，N 末 なった変異体（E41A, D50K, D29A/E41K, D29N/E41K, 端側にある LB1 と LB2 ドメインの間にグルタミン酸を D29K/E41K）ではそれらアミノ酸残基の側鎖は受容体 結合する．通常リガンド物質非存在下では，ドメインの モデル上では酸性アミノ酸と相互作用すると考えられる 配置が「Open」型と「Closed」型の平衡状態にあり，リ ため，電荷の反発を減少させる変異により甘味が強くな ガンド存在下では活性状態を示す「closed-open/A」の る．また Y54W の変異により甘味が強くなるのは，54 構造に，アンタゴニスト存在下では非活性状態である 番目の側鎖が受容体の疎水ポケットと相互作用する環境 「open-open/R」に柔軟に構造を変化させる（図 6）．こ 下にあり，より疎水性が増加する変異が甘味増加に適し の構造を鋳型として T1R2-T1R3 のモデルが構築され， ていると考えている．しかしながら，D40A や D40K の 甘味物質との応答や活性化モデルが提唱されている（43）． 変異体では，結果として甘味が増加したが，この残基は こ の モ デ ル で は， 甘 味 タ ン パ ク 質 の 正 電 荷 部 位 と， 受容体と直接相互作用しているとは考えられておらず， T1R3 細胞外ドメイン中央部の負電荷部位とが静電的相 変異を行うことでブラゼイン自身の局所構造を安定化さ 互作用することによって，T1R2-T1R3 の活性化状態を せることにより甘味が増加したとの見解をしている．近 安定化している．甘味タンパク質間には配列相同性や構 年，ブラゼイン変異体と甘味受容体との相互作用につい 造類似性はないが，その表面上にくさび（wedge）の様 ては，ブラゼイン，受容体双方の部位特異的変異体によ な構造的特徴をもち，T1R3 中央部に大きくはまり込む る解析も試みられており，甘味タンパク質のなかでは最 ことができる．この甘味タンパク質‒甘味受容体の結合 も 構 造 活 性 相 関 の 情 報 が 多 い タ ン パ ク 質 で あ る（45）． モデルは“wedge model”と呼ばれている（図 6） ．甘味 ソーマチンの場合も，同様にドッキングシミュレーショ タンパク質の研究において，甘味発現に関与しているア ンがなされたが，モネリン，ブラゼインに比べ変異体の ミノ酸残基は，甘味タンパク質分子表面上の比較的広い 情報がまだ少なく，精度高い相互作用解析は困難な状況 範囲に存在していることが明らかになっており，甘味受 下にある（46）．多くの甘味物質は T1R2 の NTD 領域と相 容体との相互作用には分子表面の広い範囲が関与すると 互作用する一方で，ソーマチン，ブラゼインの応答には いう wedge model を間接的に支持するものとなって ヒト T1R3 の CRD 領域，ネオクリンは T1R3 の NTD 領 いる．モネリンの甘味発現について受容体とのドッキン 域が重要であると報告されており（図 7），T1R3 は新規 グシミュレーションに基づき検討がなされた（18）．受容 甘味料創出のターゲットとなり得る可能性を秘めてい 体と相互作用すると予測される面の縁に存在する る． Met42（Met42B） , Tyr63（TyrA11）と，中央に位置し 受容体モデルから予想される結果と受容体発現細胞を て い る Tyr65（TyrA13） , 甘味に寄与する酸性残基 用いた応答実験の結果との間には，検討を要する点が 30 化学と生物 Vol. 52, No. 1, 2014 多々ある．たとえば分子量の大きいタンパク質が，本当 に細胞膜に近い CRD 領域と相互作用しているのか，単 に情報伝達過程に影響を与え応答性を変化させているの ではないかという点である．また，受容体モデルで用い られる mGluR がホモ二量体であるのに対して，甘味受 容体がヘテロ二量体であり，かつそれらの配列の相同性 が 26% 程度であることを鑑みると，現行のモデルが実 際の構造を厳密に反映しているかという点である．いず れにせよ甘味受容体の構造が明らかになり，各甘味物質 に対する受容認識機構が明らかになることが待たれる． おわりに 本稿では甘味タンパク質ソーマチンを中心に甘味タン パク質の構造，甘味活性相関を中心に述べてきた．ソー マチンは単に甘味を呈するだけでなく，苦味や渋味を抑 制する作用や，風味を増強する作用をもつことも知ら れ，非常に興味深いタンパク質であり，これら多彩な機 能についても筆者らは研究を開始している．甘味受容体 の発見以降，甘味物質がどのように受容体を活性化し， 「甘い」という情報を伝達しているかについて多くの研 究がなされているが，甘味受容体をはじめとする味覚受 容体が舌上だけでなく，消化管などにも発現しており， 消化管ホルモンの分泌制御，トランスポーターの発現に も深く関与していると報告されている（47∼49）．今後甘味 タンパク質の詳細な構造情報をもとに受容体の活性化機 構を精査することで，新規な甘味料のデザインも可能に なるかもしれない．さらにタンパク質は糖類に比べ低カ ロリーであり，ショ糖代替甘味料の可能性をも有してい る．しかしながら，ショ糖特有の味質や物性をもつ甘味 料は，再現されておらず，今後新規な甘味料をデザイン するうえで重要な検討課題であると言えよう． 謝辞：本総説で紹介したソーマチンの構造解析の一部は大型放射光施設 SPring-8（BL26B1, BL38B1） で 行 わ れ た（課 題 番 号：2009A1096, 2009B1379, 2010B1064, 2011B1073, 2012A1048, 2012B1067）. 文献 1） 2） 3） 4） Y. 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