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アイソ トープ標識DNAを 用いた 抗変性DNA抗 体の測定
ア イ ソ トープ 標 識DNAを 抗 変 性DNA抗 用 いた 体 の測定 第1編 検 出法 の基 礎 的 検討 岡 山大学 第三 内科(主 任:大 藤 更 井 哲 (昭 和56年2月12日 緒 者 の血 清 中 に は 多 彩 な 自 己 抗 体 が み ら れ る が,最 DNA抗 原 の2次 DNAと1本 反 応 す る抗 体, が 高 く,と ii) n-DNA, え て,当 科 に おい て 日 体 価 測 定 時 に 用 い て い る3H・ Actinomycin D・n-DNAを 作 製す る方法 を応用 構 造 の差 し, d-DNAに3H-Actinomycin native(n-) もの も抗 原 と し,硫 安 法, Polyethylene denatured (PEG)法 Dを に て 抗d-DNA抗 種 標 識 抗 原,各 標 識 した 種 測定 法の 特徴 を検討 したの で 疾 患特 異性 対 の 抗 体 価 は 日常 的 に 測 定 さ れ, を 満 た すSLE患 反 応 す る抗 体 に つ い て は 象 ア メ リ カ リ ウ マ チ 協 会 のSLE診 関 連 文 献 も数 多 い2塾 ∼4), 10)∼14), 18). 例,寛 ,従 断 予 備 基 準7) 者 の 急 性 期(active)群 解 期(inactive)群 来 ゲ ル 内 沈 降 反 応4塾,補 体 結 合 反 応5),受 身 的 血 中 心 とす る正 常 人 血 清(NHS)15例,骨 者 血 清6例, Plesciaら に み ら れ る 抗 補 体 作 用,強 た 抗d-DNA抗 体 家 兎 血 清(antid-DNARS)3例, 量 性 等 に つ い て,満 い イオ ン結合 等 の 非 異 性,再 の 方 法 論 に て抗d-DNA抗 近 年Radioimmunoassay(RIA)を ア イ ソ トー プ 標 識n-DNAを 応 用 し, グ ロ ブ リ ン との 直 接 結 合 に よ り抗n-DNA抗 上 の 血 清 に つ い て種 々 体 価 を比 較 検 討 した. 方 抗 原 と して,血 清 γ体 1)ゲ 価 を 求 め る こ とが で き るよ うに な っ たが, d.DNA ル 内2重 法 沈降 反応 リン 酸 緩 衝 液(0.01M, に 対 す る 抗 体 価 測 定 の 場 合 に は 抗 原d-DNAと Cl)に0.6% 血 清 との 間 の 非 特 異 的 な 結 合 が 強 く,実 用 の 段 解 し,厚 階 に 至 っ て い な か っ た. 反 応 は 孔 径6mm,間 165 pH7.2, Agarose(Sigma社 さ約2mmの 髄腫患 の 方 法8)に 準 じて 作 製 し 正 常 家 兎 血 清(NRS)3例,以 現 性,定 足 で き る 方 法 は なか っ た. 血 清9 血 清28例,当 科 医 師 を 球 凝 集 反 応6塾等 に よ り測 定 され て い たが, d-DNA 特 異 的 反 応 に よ り,感 度,特 Glycol 体 価 を 測 定 し,各 報 告 す る. くに ル ー プ ス 腎 炎 の 重 症 度 と 良 い 相 一 方d-DNAと 125I・d-DNA 体 価 の 測 定 法 に 種 々 の 改 良 を加 常 抗n-DNA抗 に 大 別 さ れ る1). 反 応 す る抗 体 はSLEに 関 を示 す た め,そ 度 共 に 優 れ た 抗d-DNA抗 え て 再 検 討 を試 み た.加 双 方 と 反 応 す る 抗 体, iii)d, DNA と反 応 す る抗 体 の3種 n-DNAと る 抗d-DNA抗 鎖(native) 鎖(denatured)DNAの (d-)DNAの も特 徴 反 応 す る 抗 体 は) 異 に よ り異 な っ た 反 応 性 を示 し, i) DNAと 異 性,感 を 抗 原 と し た 硫 安 法 な ら び に フ ィル ター 法 に よ 成 分 の 一 つ で あ るDNAに 構 造 で あ る2本 受 稿) 体 の 測 定 を 目標 と して, 14C・d-DNA, 全 身 性 エ リ テ マ トー デ ス(SLE)患 対 す る抗 体 が あ る. DNAと 夫 今 回,特 言 的 な もの と して,核 真 教授) 0.15MNa製)を 煮沸溶 プ レー ト を作 成 し た.沈 隔2mmの 降 配列 を用 い てお こ 166 更 な っ た. d-DNA抗 原 はWorthington社 ThymusDNAをSSC Sodium (0.15M Citrate)に 井 製Calf- NaCl, て500μg/mlに 哲 夫 ①3H・Actinomycin 調 製, 10分 間 3H・Actinomycin 沸 〓 水 浴 中 で 加 熱 後,氷 水 中 に て 急 冷 した もの 56℃30分 を 用 い た.血 30分 Borate 清 は56℃, 間 非 働 化 して 使 用 イ ソ トー プ 標 識d-DNAの i) 3H・Actinomycin い て500μg/meに 調 製法 D-d-DNA: SSCを 液50mlに3H・Actinomycin sham社 製)250μCiを 加 え, 30分 移 し, 1週 間SSCに を 交 換 し た.透 て 透 析,こ 識 抗 原 液 を 回 収 し た .作 50μgを D・d. DNA液 含 み, Specific Coliよ 用 い2.5A, の 後100℃10分 得 た. fic Activityは37∼42μCi/mgで Commerford9)の を お こ な い, Worthington社 製CalfThy- tate nsonator 20秒 後, 間 反 応,直 0.15M New ち に0.05M NaCl)を ラ ム を 通 過 さ せ,遊 4℃ に て 保 存 し た. ×104∼9×104cpm/μgで 3)抗d-DNA抗 i)半 Sodium 製 標 識 用125I・100μCiを (pH8.3, G50カ し た. 0.5M Buffer(pH5.0)300μl, ℃60分 飽 和硫 安 法 体 の 放 射 能 活 性 を 測 定 し た.抗d-DNA抗 体価 は3H・Actinomycin して D・d-DNA Bindingと Ace 沈 澱 物 のdpm/ Borate 離 の125Iを 56 Buffer ②14C・d-DNAを 抗 原 とした場合 た 後, 4℃18時 間非働 化 間 反 応 させ 4℃ に て 飽 和 させ た 硫 安 溶 液100μ1を 加 20分 間 遠 沈 した.上 清 を 吸 引 除 去 し沈 渣 に 半 飽 和 硫 安 液2meを NCSな 0.2μgを 56℃30分 加 え 混和 の後 20分 間 遠 沈 し て 沈 渣 を得 た.沈 渣 に ら び に トル エ ン シ ン チ レー タ ー の 添 加 を お こ な い,放 射 能 活 性 を測 定 し た.抗d-DNA 抗 体 価 は14C・d-DNA Bindingと して 次 式 よ り 14C・d・DNABinding= 沈 澱 物 のdpm/ 加 え た14C・d-DNA0.2μ9のdpm×100 除 去 した Activityは8 あ っ た. 抗 原50μ9のdpm×100 England 混 和 し, Specific inding= 算 定 した. 用 い てSephadex 体 価 測定 法 D・d -DNAB 加 えた灘 再 度2,000G 間超 音 波処 理 間 沸 〓 水 中 に て加 熱 の 後 急 冷 原 液300μ1, Nuclear社 加 え シ ン チ レー シ ョ ン バ イ ア ル に 移 え 混 和 し, 2,000G の 熱 変 性 を 加 え てCalf-Thymusd-DNAと こ のd-DNA抗 POPOP0.36gr.in/etolu- し た 血 清10μ1を37℃60分, 溶 解 し, 2 ,000μ9/ 用 い て2.5A, 10分 溶 解,ト ル エ ン シ ン チ レー ター(PPO7gr, 含 む 前 述 ホ ウ 酸 緩 衝 液90μ1, Speci 方 法 に準 要 に 応 じ てKUBOTAI l200Mを (Amersham社)1meに 間 solubilizer 超 音 波 処 理 を加 え な い14C・d-DNA あ った. DNAを0.15MNaCl.に Mode 澱 物 を 得 て, NCS 要 に 応 じて 間 加 熱 の 後 急 冷 し て14C-d-DNAを 調 製,必 20分 間 遠 心 分 離,沈 3H・Actinomycin 200Mを 15秒 間 超 音 波 処 理 を お こ な い,そ じ て お こ な っ た. 間 反 応 させ た. よ く振 盪 混 和 後, 2,000G, り抽 出 精 製 し た14c・ Model iii)125I-d-DNA: 4℃18時 飽 和 硫 安 液 を加 え, 培養 液 に よ り 求 め,必 nsonator 0.15M)1meを 次 式 よ り算 定 した. あ っ た. DNAをAmersham社 KUBOTAI にd-DNA Thymine-2-14Cを 加 え て 培 養 し たE. 間, NaCl Activityはd-DNA1μg あ た り6,000∼8,000cpmで ii)l4C・d-DNA: 8.3, , 0.05M し,液 体 シ ン チ レ ー シ ョ ン カ ウ ン ター に て)検 成 し た3H・ は0.1me中 50μ9(100μl) つ い で 等 量(1.2me)の4℃ ene)9meを の 間 頻 回 にSSC 析 液 に 漏 出 す る 遊 離3H・Actino- Actinomycin meに tubeに 放 射 能 活 性 が 消 失 し た こ と を確 認 の の ち,標 mus Buffer(pH 遠 心 分 離,沈 間 攪 拌 す る. 16時 間 さ ら に 反 応 の 後)Visking D・d-DNA 澱 物 を 半 飽 和 硫 安 液 に 再 浮 遊 し, 2,000 G20分 D(Amer 37℃, mycinDの 用 調 製 し た 熱 変 性Calf-Thymus DNA溶 抗 原 とし 間 非 働 化 処 理 し た 血 清100u1, 混 和 し, 37℃60分 し た. 2)ア D・d-DNAを た場 合 0.015M ③125I・d-DNAを 抗 原 とした場 合 超 音 波 処 理 を加 え な い125I・d-DNA1μgを む ホ ウ酸 緩 衝 液450μl,非 し, 37℃60分4℃18時 含 働 化 血 清50μlを 混和 間 反 応 させ た 後,前 述の ア イ ソ トー プ標 識DNAを 反 応 系 と同 様 な 遠 心 処 理 を 加 え,沈 硫 安 液1meに 用 い た 抗 変 性DNA抗 渣 を半飽 和 再 浮遊 し遠沈 処理 を加 え た後 の沈 澱 に 含 ま れ る放 射 能 活 性 を γ シ ンチ レー シ ョ ン カ ウ ン ター に て 測 定 した.抗d-DNA抗 体価 は 125I・d-DNA Bindingと し て次 式 よ り算 定 した . M, 0.4MのNaClを ×100 加 え た125I・d-DNA1μ9のcpm iv) Polyethylene Glycol法 3H・Actinomycin D・d-DNA 液100μe,非 0.15M 間, 4℃18時 ホ ウ酸 緩衝 液 を 間 反 応 の 後,種 Glyco1(PEG)液 させ 同 じ 条 件 で 遠 沈.上 10μeの 非 働 化 血 清 に90μeの 反応 を 20分 間4℃ で 遠 沈 し ら れ た 沈 澱 を最 終 濃 度 のPEGに meのNCSを 抗 原 と した場合 ウ 酸 緩 衝 液 NaCl)1meを 等 容 加 え 充 分 混 和, 2,000G ィル ター 法 ①14C・d-DNAを 50ugを 含 む 抗 原 働 化 血 清100μe,ホ pH8.3, 々 の 濃 度 のPolyethylene た.得 ll)フ 加 え た もの を用 いて 同様 系 と し, 37℃60分 沈澱 物 のcpm/ 167 に 抗 体 価 を測 定 す る こ と に よ り お こ な っ た. (0.05M, 125I・d-DNABinding= 体 の測 定 再浮遊 清 を除 去 し,沈 渣 に1 加 え 溶 解 させ た 後,ト チ レ ー ター10meを 加 え,シ ルエンシン ンチ レー シ ョ ン バ イ 加 え, 15秒 間 超 音 波 処 理 を加 え た0.2μgの14C・ ア ル に 移 した の ち,液 d-DNAを ン ター に て 沈 渣 の 放 射 能 活 性 を 測 定 した.抗 含 む ホ ウ 酸 緩 衝 液100μ 尼 と37℃30分 間 反 応 の 後, た.以 2meの 冷SSCを 加 え て 反 応 を止 め 上 の 反 応 系 を-10mmHgの 陰 性 で,あ らか じめ 湿 らせ たHAWPO2,500ミ ー に 通 過 させ ,次 ル タ ー を 洗 浄 し た.フ ンチ レー シ ョ ン カ ウ ン タ-に て,フ 体 シ ィル ター に 補 捉 さ れ た 放 射 能 活 性 を 測 定 し た.抗d-DNA mを 1) え た 抗 原 のdpmで サ ン プ ル のdp えた抗 原 の 全放 射 果 14C・d-DNAな ら び に125I・d-DNAを と し た 抗d-DNA抗 ① 抗 原 体 価 の 測定 硫 安 法 の基 礎 的検 討 i)抗 原 に 加 え る 超 音 波 処 理 の 程 度 と血 清 の 結 合能 の 比較 14C・d-DNA , 125I・d-DNAの 各 々 を抗 原 と し, 除 し,百 分 率 で 表 現 した. ②125I・d-DNAを 抗 原 と した場合 10μeの 非 働 化 血 清 に90μeの 加 え, 0.5μgの20秒 d-DNAを ホウ酸 緩衝 液 を 間 超 音 波 処 理 を加 え た125I・ 含 む ホ ウ 酸 緩 衝 液100μ 尼 と37℃30分 間 反 応 させ た.フ ィル ター 通 過 は14C・d-DNA の 場 合 と同 様 に お こ な い,洗 浄後 の フ ィル ター は ポ リス チ レ ン チ ュ ー ブ に 移 し, γ・カ ウ ン タ ー を用 い て放 射 能 活 性 を 測 定 し た.抗d-DNA抗 体 価 は,加 え た 抗 原 のcpmで を除 し,百 分 率 で 表 現 し た. 111)硫 安 法,な 緩 衝 液 のpH,イ pHの サ ン プ ル のcpm らびに フ ィル ター 法 にお け る オ ン強 度 につ い ての検 討 検 討 に は0.15M NaClを 7.3, 加 え た0.02M Tris-HCl緩 衝 液 のpH6.7, い てSLE血 清 と正 常 人 血 清 の 抗d-DNA抗 8.3, 9.0に つ 体価 Fig. 1 dings relation を 測 定 し,イ Mホ オ ン強 度 の 検 討 に はpH8.3の0.05 ウ 酸 緩 衝 液 に0.05M, 0.1M, 0.15M, assayed 0.2 体 分 率 で 表 現 した. 結 風 を用 い て 乾 燥 の 後, 10m2の トル エ ン シ ン チ レ ー ター を加 え,液 抗 体 価 は,加 能 活 性 で 除 し,百 純 水 を通 して フ ィ ィル ター を シ ン チ レ ー シ ョ ンバ イ ア ル に 移 し,熱 価 は 沈 渣 の放 射 能 活 性 を,加 リポ ア フ ィル タ い で5meの 体 シ ンチ レ ー シ ョン カ ウ sulfate 14C・d-DNA of SLE to by and time half method. of and 125I・d-DNA normal human sonication saturate binsera in to antigens, dammonium 168 更 井 哲 夫 Fig. 2a Fig. 2 14C・d-DNAand125I・d-DNA Tris-HCl fate 0.05Mホ Fig. 2b 0.1M method NaCl and bindings buffers (b) filter ウ酸 緩 衝 液pH8.3, of various pH 0.15M NaClを 原 に 対 す る超 音 波 処 理 の 程 度 に 応 じ て, SLE血 清 のd-DNA結 1).一 合 能 は著 明 に 方 正 常 人 血 清 のd-DNA 示 す よ うに 様 々 のpHに Tris-HCl, 正 常 人 とSLE血 0.15M 低 値 で あ る一 方, SLE血 つ こ とが で き た.ま い て は, pH 8.3, NaCl緩 っ た(Fig. 清 の結 合能 を高値 に保 た緩 衝 液 の イオ ン強度 につ 0.15MNaClの0.05Mホ ウ酸 者 血清 の結 合 能 常 人血 清 の結 合能 は低値 であ 3a). 血 清 との反 応時間 in 0.02M ammonium sul SLE血 清23検 体 に つ い て 同 一 検 体 を再 検 す る こ と に よ り検 討 し た が, 14C・d-DNAを した 時 に は γ=0.98(P<0.05), 抗原 と 125I・d-DNAを 相関 フ ィ ル ター 法 の 基 礎 的 検 討 i)抗 原 に 加 え る 超 音 波 処 理 の 程 度 と血 清 結 合能 の 比較 d-DNAに 対 し強 い 反 応 性 を有 す る こ と を 沈 降 反 応 で 確 認 し たSLE患 人 血 清 を対 照 と し,様 し たd-DNAと 常 血 清 との 反 応 性 を検 討 した(Fig-5). 用 い た 緩 衝 液 はpH 8.3,イ 酸 緩 衝 液 で あ っ た.未 DNAを 者 血 清 につ い て,正 々 な程 度 の 超 音 波 処 理 を オ ン 強 度0.15の ホ ウ 処 理 抗 原 で は, 14C・d- 抗 原 と した 場 合 に は,正 常 人 血 清 は44% し た 場 合 に は,正 常 人 血 清 は72%の 抗 原 と 非 特 異的 結 合 を示 し て い た. 15秒 な い し20秒 の 超 音 波 処 理 示 す よ うに,混 和 後37℃ で各 時 間に お け る 結 合 能 を検 討 し た 結 果, 37℃60分 18時 間 の 反 応 で 満 足 す る 結 果 を 得 た. 1V)硫 sera の 非 特 異 的 結 合 を示 し, 125I・d-DNAを iii)ア イ ソ トー プ標 識d-DNAと Fig.4aに saturated 衝 液 を用 い, 常 人血 清の 結合 能 は 緩 衝 液 を 用 い た場 合 に, SLE患 は 高 値 を保 ち,正 human (a) half ② 調 製 した 清 の 結 合 能 を検 討 し た. pH 8.3 の 緩 衝 液 を用 い た 時 に,正 normal by 関 係 を示 した. ii)反 応 系 緩 衝 液 の 結 合 能 に 対 す る 影 響 0.02M and 抗 原 と し た 時 に は γ=0.92(P<0.005)の 結 合 能 は 常 に 低 値 を 示 した. Fig. 2aに SLE method. 用 い た 場 合 に,抗 低 下 し た(Fig. of assayed 安 法 の再 現性 間4℃ を加 え る と, 14C・d-DNAの 50%以 場 合SLE血 清 では 上 の 高 い 結 合 能 を 保 ち 得 る 一 方 で,正 人 血 清 で は10%以 ま た1251・d-DNAの 常 下 の 低 い 結 合 能 を示 して い た. 場 合 に も, SLE血 清 ではや ア イ ソ トー プ 標 識DNAを Fig. 3 Fig. fate 体 の測 定 14C・d-DNA buffers method and pH and 169 Fig. 3b Fig. 3a 3 borate 用 い た 抗 変 性DNA抗 8.3 125I-d-DNA bindings of increasing molarity, (b) filter of SLE and normal assayed by (a) half human sera saturated in 0.05M ammonium sul method. Fig.4a Fig.4b Fig.4 Kineticsof DNA-anti DNA interactionsassayed by (a)half saturated ammonium sulfatemethod and (b)filtermethod. は り50%以 上 の 高 い 結 合 能 を保 ち 得 る一 方 で, 正 常 人 血 清 で は15%以 い た.し 下 の低 い結 合能 を示 して か し更 に 長 時 間 超 音 波 処 理 を加 え た 時 に は, 14C・d-DNA, の 場 合 に もSLE血 1251・d-DNAい ず れの 抗原 清 の 結 合 能 は 著 明 に 低 下 した. ii)反 応 系 緩 衝 液 の 結 合 能 に 対 す る影 響 Fig. 2bに 示 す よ う に 種 々 のpHに 0.02M Tris-HCl, 0.15M NaCl緩 調 製 した 衝 液 で検 討 し た 結 果, pH 8.3の 緩 衝 液 を 用 い た 時 に,正 血 清 の 結 合 能 は 低 値 で あ る 一 方, SLE血 常人 清の結 170 更 井 哲 夫 iii)ア イ ソ ト-プ 標 識d-DNAと 血 清 との 反 応時 間 Fig.4bに 示 す よ う に,混 和 後37℃ で 各 時 間 に お け る 結 合 能 を検 討 した 結 果, 37℃30分 間の 反 応 で 満 足 す べ き 結 果 を 得 た. iv)フ ィル ター法 の 再現 性 同 一 条 件 で 超 音 波 処 理 を お こ な っ た抗 原 を 用 い, SLE血 清23検 体 につ い て 同 ー 検 体 を再 検 す る こ と に よ り検 討 し た が, 14C・d-DNAを 抗 原 と し た 場 合 に は γ=0.94(P<0.005)の 極めて 良 い 相 関 関 係 を 示 し た. ③ 測 定 法間 の相 関に つ いて SLE23検 体 に つ い て,抗 原2種,測 に よ る抗 体 価 の 測 定 をお こ な い,測 定 法2種 定 法 間の相 関 を 求 め た. i)同 Fig. 5 14C• d-DNA dings of relation gens, SLE to and time assayed and normal of by 125I•Ed-DNA human sera sonication filter to 一 抗 原 を 用 い た,硫 果 と,フ bin 1251・d-DNAを in 定 結 果 と フ ィ ル ター 法 に よ る 測 定 結 果 の 相 関 は γ=0.86, 合 能 は 高 値 に 保 つ こ とが で き た.ま 酸 緩 衝 液 に0.15MのNaClを SLE患 た緩 衝 液 の 0.05Mの ホウ 加 え た も の が, あ っ た(Fig. d-DNA結 Fig. d-DNA bindings 合 能 の 相 関,ブ 合 能 と125I・ イ ル ター 法 に お け る 合 能 と125I・d-DNA結 6aFig. 合能の相関. 6b between of P<0.001で 6). 14C・d-DNA結 Correlation SLE filter method sera using and (a) half saturated 125I•Ed-DNA and 抗原 ィ ル ター 法 ii)硫 安 法 に お け る14C・d-DNA結 (Fig.3b). 6 あ り, 14C・d-DNAを に よ る 測 定 結 果 の 相 関 は γ=0.84, 人 血清 の 結合 能 を低値 に抑 え るこ と が で き た in P<0.001で と し た硫 安 法 に よ る 測 定 結 果 と,フ 者 血 清 の 結 合 能 を 高 値 に 保 ち,か つ 正 常 Fig. 抗 原 と し た 時 ,硫 安 法 に よ る 測 anti method. イ オ ン 強 度 に つ い て は, pH 8.3, 安 法 に よる測定 結 ィル ター 法 に よ る 測 定 結 果 の 比 較 ammonium (b) 14C•Ed-DNA sulfate method as antigens. ア イ ソ トー プ標 識DNAを 用 い た 抗 変 性DNA抗 体 の測 定 Fig. 7a Fig. 7 Correlation (a) filter method Fig. 7b between and (b) 121I•Ed-DNA half saturated and 14C•Ed-DNA ammonium bindings sulfate 9 dings Fig. 8 3H•EActinomycin of SLE assayed sulfate and normal by half saturated D d-DNA human bin thylene ammonium sera assayed 3H•EActinomycin of SLE in relation sera of SLE by method. Fig. dings 171 glycol and D•Ed-DNA normal human to concentration glycol assayed bin serum of polyethy by polyethylene method. method. 2)3H・Actinomycin 異 な っ た2種 相 関 は γ=0.92, の 抗 原 を 用 い た硫 安 法 に お け る P<0.001,フ け る 相 関 は γ=0.84, P<0.001で ィル ター法 に お あ っ た(Fig. 7). た 抗d-DNA抗 ① D・d-DNAを 抗原 とし 体 価 の 測定 硫 安 法 を用 い た測 定結 果 正 常 人 血 清 の 結 合 能 が 高 値 とな り, SLE血 群 との 間 に 有 意 差 を 認 め な か っ た(Fig. 8). 清 172 更 ②PEG法 哲 夫 を用 い た測定 結果 種 々 の 濃 度 のPEGを 反 応 系 に 加 え,抗 体 に 結 合 し た 標 識 抗 原 と,遊 試 み た 結 果,最 離 の 標 識 抗 原 との 分 離 を 終 濃 度8.5%のPEGを 良 好 な 分 離 を得 た(Fig.9).し mycin 井 D・d-DNA d-DNAを 用 い る時 か し3H・Actino を抗 原 と し たPEG法 と14C・ 抗 原 と した フ ィル タ ー 法 と の 関 連 を み た と こ ろ,γ=0.64, P<0.01で あ っ た(Fig.10). こ の 測 定 系 に お け る γーグ ロプ リ ン量 の 多寡 に よ る 影 響 を み る た め,正 系 にCohn 常 人 血 清 を用 い た 反 応 fraction II(FrII)の を加 え た と こ ろ,加 各種 濃 度 の もの え たFrIIの 量 に 比 例 して, Fig. 12 14C•Ed-DNA sera 結 合 能 の 上 昇 をみ た(Fig.11). assayed 3)超 bindings by filter of several method. 音 波 処 理14C・d-DNAを 抗 原 とした ブ イル ター 法 で 測 定 し た 各 種 疾 患 の 抗d-DNA 抗 体価 SLE active, SLE 腫 患 者 血 清(M. NRSに 12).ま NA家 Fig. 10 Correlation between bindings assayed 3H•EActinomycin ayed by by filter D•Ed-DNA polyethylene 14C•Ed-DNA method bindings glycol and as method. inactive, NHS,多 Myeloma). お け る抗d-DNA抗 体 価 を測 定 した(Fig. ず 本 法 はd-DNAと の み 反 応 す る抗d・D- 兎 血 清 の 抗 体 価 を良 く把 え,正 常家 兎血 清 の 結 合 能 は 極 め て 低 値 で あ っ た.正 常 人血清 に お け る 結 合 能 の95%迄 に 相 当)は8%の を含 み う る範 囲(2SD 結 合 能 迄 で あ り,以 下 こ れ を 正 常 域 と し,こ れ 以 上 の 結 合 能 を 示 す もの を抗 d-DNA抗 体 陽 性 と 決 定 した. SLE 例 陽 性, SLE の う ち2例 inactiveは64%陽 髄 腫 患 者6例 が,こ の 血 清 は 沈 降 反 応 で は 陰 性,加 1957年, 中2例 に 高値 が 認め られた 按 Robbins10), Holman11), ら が 補 体 結 合 反 応, Seligman し た.以 dings tion 3H•EActinomycin of to normal addition D• d-DNA human serum of Cohn fraction II. bin in rela え て14C・ 抗 原 とす る硫 安 法 で も陰 性 で あ っ た. 応, Miescherら14が て,DNAと 全 に 高 い 結 合 能 を 有 す る も の が み られ 考 11 activeは 性 で あ った が そ た.骨 d-DNAを Fig. 発性骨髄 Antid-DNARS, Ceppel1ini12) 13)がゲ ル 内 沈 降 反 受 身赤 血 球 凝 集 反 応 を用 い 反 応 す る 抗 体 が 存 在 す る こ と を報 告 上 の 報 告 者 が 使 用 し たDNAは 純 度 の 高 い も の で あ り,一 は 考 え られ る もの の,大 部1本 比較 的 鎖 部分 の 混入 部 分 は2本 鎖 構 造 を有 ア イ ソ トー プ 標 識DNAを す る もの と考 え ら れ る.変 鎖DNAとSLE血 用 い た 抗 変 性DNA抗 性 処 理 を加 え た1本 体 の測 定 173 を抗 原 と し, pH 7.8のBorate Saline 反 応 系 を 用 い た 反 応 系 で,ま 清 と の 反 応 は, 1960年Barbu Bufferの た1975年Picazo ら15)によ り ゲ ル 内 沈 降 反 応 を 用 い て最 初 に 報 告 ら21塾 は 超 音 波 処 理 を 加 え た125I・d-DNAを さ れ, Levineら5)も と し, pH7.5のTris-HCl, 変 性 させ, SLE血 同 年phageT4DNAを 熱 清 との反 応 性 を 補 体 結 合 反 応 を用 い て 報 告 して い る.2以 来d-DNAと 反 応す 0.15M Bu- fferの 反 応 系 を 用 い た フ ィル ター 法 に よ り, dDNAと 反応 す る抗体 を特 異 的か つ 高感 度 に検 る 抗 体 は 様 々 な 方 法 を 用 い て 検 出 さ れ て い るが, 出 し, RIAを 測 定 方 法 に は 以 下 の 様 な 種 々 の 問 題 点 が あ る. が 可 能 に な っ た こ と を示 した. まず ゲ ル 内 沈 降 反 応 は 最 も簡 便 な 方 法 で あ るが, 抗 原 NaCl 応 用 し て の 抗d-DNA抗 変 性 処 理 を加 え たDNAは,本 体 価測 定 来 の2本 感 度 が 低 く,補 体 結 合 反 応 は 鋭 敏 な 方 法 で あ る 造 が 破 壊 さ れ て い る た め,水 が, SLE血 結 合 に よ っ て 他 の 物 質 と結 合 しや す い.沈 清 に み ら れ る 抗 補 体 作 用 や, 特 に 変 性DNA自 DNA 体 の 補 体 結 合 性 に よ り測 定 不 能 の場 合 が あ っ て 適 当 で は な い.受 集 反 応 で はd-DNAの 身赤 血球 凝 血球 に対す る付着 が不 良 の 条 件 下 でDNAと もpH い る.今 す る も の の,再 討 す べ く,異 く用 7.45, こ う して 従 来 の 抗d-DNA抗 体 検 出法 が 全 て イ ソ トー プ 標 用 の 場 合 に こ う し た 条 件 を検 な っ たpH,イ 法 で の 結 合 率 を求 め た が,緩 現 す る こ とが 試 み られ る よ うに な っ た.し 同 様 なpH,イ n-DNAが か し, 体 価 の 測 定 に つ い て は, イ オ ン結 合等 の 非 特 異 的 結 合 を示 す こ とが 少 な い た め 感 度,特 結 果 が 得 ら れ,一 ー方 ,抗d-DNA抗 異性 につ いて満 足 す る 般 臨 床検 査 に応 用 されて い る 体 価 測 定 に お け るRIAに は 1969年Carrら17)は3H・ActinomycinDに りin vitroで 標 識 し たDNAを 法 を 用 い て 抗n-DNA抗 よ 抗 原 と し,硫 安 体 価 を測 定 し て い るが, 熱 変 性 し たDNAに3H・ActinomycinDで し た抗 原 を 用 い た 抗d-DNA抗 標識 体 価 の 測 定 は, 正 常 人 血 清 で の 非 特 異 的 反 応 性 が み ら れ,不 当 で あ る と し て い る.我 こ の 結 果 を支 持 す る もの で あ っ た.ま Cohenら18)も た1971年 硫 安 法 を 用 い たRIAでd-DNAに 対 す る 抗 体 価 を 測 定 して い る が,や 測 定 法 上 の 問 題 を 記 載 し て い る. ら19)はd-DNAに と し て,新 適 々 が 今 回 示 し た 成 績 も, は り同 様 な 1973年Tan 対 す る抗 体 を も測 定 す る方 法 た にSolidphase RIAを 応 用 し た が, こ の 方 法 も再 現 性 と定 量 性 に 難 点 を 有 して い る. しか し1974年Winfieldら20)は, 14C・d-DNA 衝 液 のpHは8.3, た フ ィル タ ー 法 の 場 合 に も オ ン 強 度 の 条 件 でd-DNAと の 結 合 能 の 測 定 が 可 能 で あ っ た. 次 にRIAを し て,抗 用 い た 抗d-DNA抗 原DNAの に つ い て 検 討 を加 え た.硫 DNAに 体 価 測定 に 際 大 き さ と血 清 結 合 能 の 関 連 安 法 に お い て,標 識 超 音 波 処 理 を加 え る と,正 常 人 血 清 の 結 合 能 は 変 らぬ ま まSLE血 多 くの 問 題 点 が あ っ た. 抗 原 と し た硫 安 イ オ ン 強 度 は0.15で 特 異 的 な 血 清 との 反 応 を 得 る こ とが で き た.ま よ る抗n-DNA抗 オ ン 強度 の 条 件 下 125I・d-DNAを 識 抗 原 と血 清 の 直 接 結 合 能 を 用 い て 抗 体 価 を表 RIAに の 非特 異 的 な反 応 pH 8.6で は消 失 す る こ とを報 告 し て 回RIA応 で14C・d-DNA, を満 足 す る も の で は な い た め,ア 降反 正 常 人血 清 との間 に沈 降 反 応 が み られ る こ と を 認 め,こ 用 しだ 方 法16)は 凝 集 反 応 と して は 高 い 感 度 を有 現 性 に 問 題 が あ る た め,広 素 結合 等 の イオ ン 応 を用 い て の 検 討 は1959年Deicherら4)がpH5.1 で あ る との 報 告6)が あ り,ま た ベ ン トナ イ ト を応 い られ て い な い. 鎖構 ら れ る た め,超 清 での結合能低下 が み 音 波 処 理 を加 え た 抗 原 は 不 適 当 と考 え られ た.ー 方 フ ィ ル タ ー 法 に お い て,従 来d-DNAは そ れ 自体 フ ィ ル タ ー に 結 合 す る 為, 抗d-DNA抗 体 の 測 定 に は 適 さ ぬ と考 え られ, む し ろn-DNAを n-DNA抗 フ ィ ル ター に 通 す こ と に よ り 原 中 に 含 ま れ て い たd-DNA部 分 を除 去 す る 目的 に さ え 用 い られ て い た.今 回 フ ィル ター 法 に お け るd-DNA抗 最 小 限 に 抑 え,抗 め, 125I・d-DNA, 原 の非特 異的 付着 を 体価 測 定 の特 異性 を高 め る た 14C・d-DNAと 理 を加 え 分 子 鎖 を 短 か く した.す もに超 音 波処 な わ ち15秒 な い し20秒 の 超 音 波 処 理 を加 え た 抗 原 と正 常 人 血 清 との 結 合 能 は 低 値 で あ り,同 抗 原 とSLE血 清 と の 結 合 能 は な お 高 値 を保 つ こ とが 可 能 で あ っ た.し か し過 度 の 超 音 波 処 理 抗 原 を 用 い た場 合 174 更 に は, SLE血 井 清 との 結 合 能 も著 明 に 低 下 し,感 哲 夫 との 見 解 が あ る.ま た14C・d-DNAを 単 にKIの ィル み で ヨー ド化 す る と処 理 前 に 比 べ 血 清 との 結 合 タ ー 法 で は 非 特 異 的 な 付 着 を 除 くこ と の で き る 能 が 低 下 す る との 報 告26)が あ り,ヨ ー ド化 標 識 短 時 間 の 超 音 波 処 理 が 必 要 で あ り,硫 安 法 に つ の125I・d-DNAに い て は 超 音 波 処 理 を加 え ぬ 抗 原 が 適 当 で あ る こ え ら れ る.し とが 判 明 し た. よ るd-DNAへ 度 の 低 下 を示 し た.こ 3H・Actinomycin う し た こ と よ り,フ Dを 用 い てDNAを る 事 は 極 め て 容 易 で あ る こ とか ら,我 3H・Actinomycin D・n-DNAを の 標 識 はin-vitroで 法に 容 易 に しか 標 識す も安 価 に 可 能 で あ り,放 射 能 活 性 の 測 定 に は 一 々 は従 来 般 に 普 及 し て い る γ シ ン チ レー シ ョ ン カ ウ ン タ ー を使 用 で き る こ とか ら ,多 数 検 体 に つ い て 抗 抗 原 と し た硫 安 法 に よ り,抗n-DNA抗 体 価 を 測 定 し て き た. 3H・Actinomycin Dはn-DNAの グ ア ニ ン とシ トシ ン の 間 に 水 素 結 合 に よ っ て 特 異 的 に 結 合 す る も の で あ る が)d-DNAに も 反 応 性 の 低 下 が あ ろ う と考 か し何 よ りの 利 点 と し て,本 対 して も強 い結 合 性 d-DNA抗 体 価 を ス ク リー ニ ン グ 的 に 求 め る 際 に は 適 し た も め と考 え られ る. 抗 体 に 結 合 した 標 識 抗 原 と遊 離 標 識 抗 原 を分 離 す る方 法 と して,硫 安 法, Solid-Phase法,フ を 示 し,安 定 し た 標 識 抗 原 と し て 用 い る こ とが ィ ル ター 法 等 が あ る.今 で き る22).し か し, 3H・Actinomycin の 原 理 に よ りWoldら に よ っ て 紹 介 さ れ,ア ソ トー プ 標 識DNAと 抗 体 との 反 応 を 結 合 率 で を抗 原 と し た 硫 安 法 で は, SLE血 清 と正 常 人 と の 間 に 結 合 能 の 差 が 認 め ら れ ず,測 っ た.そ 定不 能 であ こ で 抗 体 結 合 抗 原 と遊 離 抗 原 と を 明 確 に 分 離 す る こ とが 可 能 なPEG法 しPEG法 D・d-DNA で は 血 清 蛋 白 量,特 を試 み た.し か に γ グ ロプ リン 回 用 い た 硫 安 法 はFarr 表 現 す る も の で あ り,半 飽 和 硫 安 の 条 件 下 で 遠 沈 す る と,遊 離 抗 原 は 上 清 に,グ 利 用 し た も の で あ る.こ の 硫 安 法 は 抗d-DNA 抗 体 価 測 定 の 場 合,反 体 価 の 測 定 に は 不 適 当 で あ る と考 え られ た.な 選 ぶ こ と に よ り高 い 感 度,特 おActinomycin す る.し そ れ 自体 フ ィル ター に 結 合 す る為23), Actinomycin. Dを 用 い て 標 識 し た 抗 原 は フ ィル ター 法 に も不 適 当 で あ る. 14C・d-DNAは , 14C・Thymidine,をE. と り こ ませ た 後 に 抽 出 精 製 し た14C・n-DNAを の 抗 原 は,反 応 系 のpH,イ ン 強 度 を適 当 な も の とす る 限 り,フ 異 性,再 オン強度 を 現 性 を有 で の 遠 沈 操 作 を繰 返 す 煩 項 な 手 技 が 必 要 で あ り,さ らに 分 画 し た 血 清 の 抗 体 定 の グロブ リン分画 の 沈 渣 を必 要 と す る た め,反 応 系に正 常 人血清 を 加 え る 必 要 が あ る 点 で 不 利 で あ る. 必 要 に 応 じて 超 音 波 処 理 し,熱 変 性 を 加 え て 得 た もの で あ る.こ か し4℃ 応 系 のpH,イ 価 を 測 定 す る 際 に は,一 coliに ロ プ リン 分 画 の抗体 に結合 した抗 原は 沈渣 に移行 す るこ とを 量 の影 響 を受 け る こ とが 判 明 し,抗d-DNA抗 Dは イ オ ィル ター 法 フ ィ ル タ ー 法 は,遊 離 標 識 抗 原 は フ ィル タ ー を通 過 す る も の の,抗 体 に 結 合 した 標 識 抗 原 は フ ィル ター に 捕 捉 さ れ る こ と を応 用 し)フ ィル に 適 し た 抗 原 で あ り,超 音 波 処 理 を加 え な け れ ター の 放 射 能 活 性 を 測 定 す る こ とに よ り抗 体 価 ば 硫 安 法 に も適 した 抗 原 で あ る.特 を表 現 す る も の で あ る.従 来 本 法 は 抗n-DNA抗 抗 体 と抗n-DNA抗 体 の2者 に 抗d-DNA を 同時 に 測 定 し,両 者 の 関 係 を検 討 す る 目的 に は14C・DNAは 最 も 適 し た もの と考 え られ る. 1972年Rosenberg24)が 準 じ て 作 製 した.本 DNAに 報 告 した方法 に 法 は 精 製 し たCalf-Thymus 熱 変 性 を加 え, d-DNAのCytosineを 体 価 の測 体 フ ィ ル タ ー に 付 着 す る為 非 た23)し か し, 1975年Picazoら21)は DNAに 超 音 波 処 理 を加 え,抗 原 の フ ィ ル ター へ の 非 特 異 的 付 着 を解 決 し,本 DNA抗 酸 化 剤 と と もに ヨー ド化 し125Iで 標 識 した もの で あ る. 1973年Keiser25)は 定 に はd-DNA自 特 異 的 結 合 が 多 く,不 適 当 で あ る と さ れ て.い ま た 今 回 用 い た125I・d-DNAは1971年Commer fordg), 体 価 の 測 定 に 用 い られ,抗d-DNA抗 本 法 を用 いてn-DNA 標 識d- 法 を 用 い て の 抗d- 体 価 測 定 を可 能 と し て い る.フ ィル タ ー法 は用 い る血 清 の増 量 や骨 髄 腫 タンパ クによ っ て は 非 特 異 的 結 合 を 示 す こ とが あ る が,同 に も1251標 識 が 可 能 と報 告 し て い る が,ヨ ー ド 条 件 で 作 製 し た 抗 原 を 用 い,フ 化 に よ る 変 性 部 分 の 混 在 は さ け ら れ ず,不 適 当 速 度 を 一 定 とす る な らば,高 一 ィル ター の 通 過 い 感 度,特 異 性, ア イ ソ トー プ 標 識DNAを 再 現 性 を 示 し,短 用 い た 抗 変 性DNA抗 時 間 の 測 定 で 多数 検 体 を 処 理 し,各 種 血 清 分 画,細 胞 培 養 上 清,組 3)硫 織 溶 出物 に 結 坑d-DNA抗 4) 論 125I・d-DNA, DNAの3種 両 抗 体 価 を測 定 し比 較 す る 際 に は 最 も適 し た 抗 原 と考 え られ る . 125I・d-DNAはin-vitroで 標 識 可 能 で あ1), 容 易 に 大 量 の 作 製 が 可 能 な こ とか ら,多 に つ い て 抗d-DNA抗 体 価 を ア イ ソ トー プ 標 識d-DNA と血 清 との 結 合 率 を用 い て 表 現 す る 際, DNA, 175 安 法 な ら び に フ ィル ター 法 で抗d-DNA, 抗n-DNAの 14C・DNAが お け る抗 体 価 の 決 定 に も 有 力 な 手 段 とい え よ う. 体 の 測定 3H・Actinomycin 14C・d- 適 して い る. D・d- 5) の 抗 原 を用 い,抗 体 と結 合 し た 標 識 14C・d-DNA, 125I・d.DNAそ 原 と し た 硫 安 法,フ 良 い 相 関 関 係 を示 し,抗d・DNA抗 フ ィル ター 法 を 応 用 し,以 下 の 結 果 を得 た. る上 で 特 異 性,感 1)14C・d-DNA, l25I・d-DNAの 各 々 を抗原 ィ ル タ ー 法 に お い て,用 緩 衝 液 のpHは8.3,イ 体 を検 出 す 現性 に優 れ た方法 であ 6) 3H・Actinomycin D・d-DNAを た 硫 安 法, 8・5%Polyethy1ene オ ン 強 度 は0.15が 適 当 で 抗 原 とし G1yco1法 は と も に 特 異 性 の 点 で 不 適 当 と考 え ら れ た. ィル ター 法 に お い て は 標 識d-DNAに 15∼20秒 の 超 音 波 処 理 を加 え る こ と が 必 要 で あ っ た.し 度,再 る と考 え る. いる あ っ た. 2)フ れ ぞ れ を抗 ィル ター法 の 結果 は互 いに 抗 原 を 遊 離 抗 原 よ り分 離 す る 方 法 と し て硫 安 法, と し た硫 安 法,フ 数 検体 体 を測定 す る際 の抗 原 に か し硫 安 法 で は 標 識d-DNAを 処 理 す る とSLE血 本 稿 の 要 旨 は 昭和53年5月 超 音波 第22回 日本 リウマ チ 学 会 総 会,昭 和54年10月 第29回 日本 ア レル ギー 学 会総 清 の 結 合 能 が 低 下 す る こ とか 会 にお い て 発 表 した. 稿 を終 るに 当 り,終 始 御 指 導 な らび に 御 高 閲 を頂 ら,同 処 理 は 不 必 要 と考 え ら れ た. い た恩 師 大 藤 真教 授 に深 謝 致 し ます. 文 献 1. Arana, R. and Seligman, M.: Antibodies to native and denatured deoxyribonucleic Clin. Invest. 46, 1867-1882, 2. Tan, E. M., Schur, P. H., Carr, R.I. and Kunkel, H. 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S LE in and Medicine, 1261•Ed-DNA 3H•EActinomycin (SLE) sulfate most by 177 SARAI radioimmunoassay d-DNA. with Internal , 1125I•Ed-DNA for the and hematosus of -)DNA antigens Coli I-DNA of DNA 体 の 測定 half saturated 125I•Ed-DNA method d-DNA. the of were half saturated antibody ammonium as the reproducible, antigen. to ammonium d-DNA. sulfate The quantitative, method half satu sen