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血 管 内皮 細 胞 は血 管 内表 面 を 被 う単 層 上 皮 細 胞 で あ り, 近 年, 組 織 培 養 法 が確 立 し, 多
方 面 か ら の研 究 が 進 み, 一 躍 脚 光 を 浴 び る よ うに な った 。 こ の細 胞 は線 溶 系 活性 化酵 素 で
あ る プ ラ ス ミノ ゲ ンア クチ ベ ー タ ーを 合 成 し, 血 液 中 に分 泌 す る細 胞 で あ るこ とか ら, 血
栓 症 との関 係 で活 性 化 因子 誘 導 物 質 の研 究 や,
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が 行 なわ れ て きた 。 また 最 近,
1
Key word
合 成 され た ア クチ ベ ー タ ーの 生化 学 的 研 究
ウ ロキ ナ ーゼ と組 織 ア クチベ ー タ ー との比 較 研 究 が 行 な わ
れ, 多 くの知 見 が得 られ て い る。 本 稿 で は, プ ラ ス ミノ ゲ ンア クチベ ー タ ー の 基 礎 知 識 お
よび 内皮 細 胞 と線 溶 系 との関 係 な どを, 筆 者 らの研 究 を含 め ま とめ てみ た。
度 の 日本 人 の 死亡 者 数 お よび 死亡
血 管 内 皮 細 胞 に 関 す る 生 化 学 的研 究 の 発 展 は, 1973
原 因 につ い ての 厚 生 省統 計 情報 部 の 調査 報 告 に よる と,
は じめ に
年, Jaffe ら^<1,2)>に
よる細 胞培 養 法 の 確 立 を嚆 矢 とす る。
死 亡 率 の 第1位 は悪 性新 生物 (malignant
そ の後 の研 究成 果 に つ い て は 立 派 な 成 書 が あ り^<3)>,
それ
23.9%を
1982年
占 め, 第2位
お よび 第3位 に脳 血 管 疾 患
lebrovasculardiseases)
eases)の17.7%と
neoplasms)
の20.7%,
で
(ce
に よる と, (1)内皮 細 胞 の成 長 因 子 な どに よ る成 長 の調 節
心 疾 患 (heart dis
機 構, (2)血 液 凝 固 因 子の 活 性 化 調 節 の場 と して の内 皮 細
続 いて い る。 と ころ で, 第2位 お よ
胞 の役 割, (3)内皮 細 胞 内 で 合 成 され る蛋 白質 に 関 す る基
び 第3位 の疾 患 は い ずれ も血 管 内 で の障 害 に関 連 す る も
礎 的 研 究, (4) 結 合 組 織 形 成 に 関 係 あ る フ ィ ブ ロネ クチ
の で あ り, そ の 死亡 率合 計 は38.4%と
ン, コ ラー ゲ ン, トロ ンボ ス ポ ン ジ ンな ど の細 胞 機 能 と
物-い わ ゆ る癌-の
な り, 悪 性 新 生
それ を は る か に上 回 って い る。
の関 連, (5)血 小 板 と内皮 細 胞 との 相 互 作 用 に か か わ る プ
脳 血 管 疾 患 お よび 心 疾 患 は, 脳 出血 ・脳 血 栓 ・脳 硬
ロス タ グラ ンジ ン誘 導 体, (6) 白血 球, T細 胞 と内 皮 細 胞
塞 ・心 不 全 お よび心 筋 硬 塞 で代 表 され る血 管 系 の疾 病 で
との 関 係, (7) 内皮 細 胞 の病 理 学 的 側 面 と して, 血 管 損 傷
あ り, 現 在 そ の臨 床 医 学 的 研 究 のみ な らず, 基 礎 医 学,
に対 す る 内皮 細 胞 の応 答 につ い て の 研 究, な どが 総 括 さ
生化 学 的 研 究 が 幅 広 く行 なわ れ てい る。 基 礎 的 研 究 を 大
れ て い る。
別 す る と, (1)
血 液 凝 固 因 子 お よび 線 溶 系 因 子 を 含 む
本 稿 で は, 内 皮 細 胞 の有 す る多 くの機 能 の 中 で, と く
血 漿 蛋 白質 の研 究, (2) 血 小 板 の粘 着, 凝 集, 放 出反 応
に 線 溶 系 の亢 進 とい う現 象 に焦 点 を あ て, プ ラス ミノ ゲ
に 関す る研 究,
そ れ に加え近
ン ア ク チベ ー タ ーを 中心 と し, そ の周 辺 を解 説 す る と と
血 管 内 皮 細 胞 に 関 す る 研 究 が著 し く進 歩 して
もに, 筆 者 ら の研 究 室 で 得 られ た 研 究 成 果 を概 説 す る。
年, (3)
が 主 流 とされ て きた が,
きた 。 これ は 止 血 あ るい は 血 栓 形 成 が, 一 連 の血 漿 蛋 白
と くに 興 味 あ る現 象 は, あ る種 の植 物 ス テ ロー ル-シ
質, 血 小 板 お よび 血 管 内 皮 細 胞 の三 者 の 微 妙 な相 互 作用
トステ ロ ール あ るい は フ コ ス テ ロー ル-が
に よって 誘 起 され る現 象 で あ るか らで あ る。
胞 の プ ラ ス ミノ ゲ ン ア クチベ ー タ ー の合 成 お よび細 胞 外
Hiromi
Hagiwara,
ŽR 2-12-1)
152,
Stimulative
Motoyuki
[Laboratory
Shimonaka,
of
Biological
Yuji
Inada,
Chemistry,
東 京工 業大 学 理 学 部 化学 科 生 物 化 学 教 室
Tokyo
Institute
of
Technology,
(〒152
Ookayama,
血 管 内皮 細
東 京 都 目黒 区 大 岡
Meguroku,
Japan]
Production
of
Plasminogen
Activator
in
Endothelial
Cells
with
Various
【プラス ミノ ゲ ン ア クチ ベ ー ター 】 【内皮 細 胞 】 【植 物 ス テ ロー ル 】 【線 溶】
Inducers
including
Phytosterol
Tokyo
2
蛋 白 質
核 酸
酵 素
Vol. 30
No.
1
(1985)
放 出 を誘 起 す る現 象 の発 見 で あ り, こ の現 象 が 各 種 血 栓
症 の 治 療 に 役 立 つ こ とを 夢 み て い る。
1.
血 管内皮細胞
血 管 内皮 細 胞
(vascular
し た よ う に, 血 管 の3層
膜 : tunica
media,
endothelial
cell) は 図1に
の 膜 (外 膜 : tunica
内 膜 : tunica
intima)
externa,
示
中
の うち で血 液
と接 す る 内膜 を 構 成 して い る細 胞 で あ る。 血 管 内皮 細 胞
の 生 理 機 能 と して は 次 の2つ
(1)
血液関門
(blood
が よ く知 られ て い る^<3,4)>。
barrier)-血
液 と組 織 と の
間 の種 々 な物 質 の通 過 を調 節 す る。
(2)
抗血栓 面
板 の血 管 壁
(thromboresistant
(コ ラ ー ゲ ン層)
線 溶 系 の恒 常 性 を保 つ
surface)-血
小
へ の 粘 着 を 防 ぐ。 血 液 凝 固,
(以 上 の は た ら き を 図2に
模式化
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した)。
抗 血 栓 面 の 形 成 に つ い て は,
胞 が 血 液 凝 固,
培 養 細 胞 を用 い て 内皮 細
線 溶 系 お よび血 小 板 な どに重 要 な役 割 を
もつ 物 質 を合 成 分 泌 して い る こ とが判 明 した こ とで 明 ら
か に な っ た 。 内 皮 細 胞 が 合 成 分 泌 して い る 物 質 を あ げ
る と,
血 小 板 凝 集 を 防 止 し,
タ サ イ ク リン
(prostacyclin
血 管 を 拡 張 させ る プ ロス
; プ ロス タ グ ラ ン ジ ン I_2 :
PGI_2)^<5,6)>,血 小 板 粘 着 と 出 血 時 間 に 関 与 す る 血 液 凝 固 第
VII因 子 抗 原
ラ ン ト因 子
(factor
(von
VIII
antigen)^<1,7)>と フ ォ ン ・ビ ル ブ
Willebrand
図1.
ウ シ頸 動 脈 の顕 微 鏡 写 真 (ヘ マ トキ シ リソ-エ オ ジン 染 色)
(a)
(40倍)
A : 内膜, B : 中膜, C : 外 膜
(b)
(400倍)
D : 内 皮 細 胞 (核), E : 基 底 膜,
F : 中 膜 (矢 印 : 平 滑 筋 細 胞 (核))。 こ の染 色
法 で は 細 胞 の 核 が 染 色 さ れ る。
factor)^<8)>や 線 溶 系 を 活 性
化 さ せ る プ ラ ス ミ ノ ゲ ン ア ク チ ベ ー タ ー (plasminogen
固 第VIII因
子, フ ォ ン ・ビル ブ ラ ン ト因 子 に 関 して は, 最
activator)^<9,10)>な ど が あ る 。 プ ロ ス タ サ イ ク リ ン, 血 液 凝
近 のす ぐれ た 総 説 お よび 成 書 が あ る^<11∼15)>。
図2.
2
抗血栓面 としての内皮細胞のはた らき
プラス ミノゲン活性化因子の血管内皮細胞での産生
3
プ ラ ス ミ ノ ゲ ンア ク チ ベ ー タ ー に は 組 織中 に 存 在 す る
組 織 ア クチ ベ ー ター
(tissue
activator)
す る ウ ロ キ ナ ー ゼ (urokinase)
や,
理 的 に重 要 な 血 液 中 の プ ラス ミノゲ ンア クチ ベ ー タ ー
は,
血 管 内 皮 細 胞 が 合 成 し,
分 泌 し た も の で あ る の で,
血 管 内 皮 細 胞 の 培 養 は これ ら の 基 礎 研 究 と し て,
きわ め
ら^<1,2)>に
よ り,
ヒ ト臍 帯 静 脈 内 皮 細 胞
の 培 養 が 行 な わ れ て 以 来,
各 種血 管 内 皮 細胞 が培 養 され
て き た が^<16∼22)>,
そ れ ぞ れ,
そ の培 養 の方 法 が 異 な る。 本
稿 で は そ の 一 例 と し て,
筆 者 ら の 行 な っ た ウ シ頸 動 脈 内
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線 溶 系 は 生 体 が 有 す る 防 御 機 構 の1つ
ラ ス ミ ノ ゲ ン (Plasminogen)
(bovine
carotid
プ ラ ス ミ ノ ゲ ン は 分 子 量93,000,
す る 糖 蛋
artery) は
屠 殺 場 よ り新
ク リー ン ベ ン チ 内 で 血 管 を 切 り開 き,
メ
561
の 結 合 が 切 断 さ れ,
ペ ニ シ リ ン (penicillin),
マ イ シ ン (streptomycin)
minimum
50μg/ml
essential
medium)
る 。95%空
37℃
酸 ガ ス,
培 養 を 行 な う 。 そ の 結 果,
示 す よ う に,
ス ト レプ ト
に 分 散 さ せ,
(9cm^2)
3aに
50
を 含 む イ ー グル 最 小 必 須培 地
ー ニ ン グ プ ラ ス チ ッ ク ペ ト リ皿
気 ・5%炭
serum),
中 で浮 遊
コ
さ せ
の培 養 条件 で初 代
浮 遊 して い た 内皮 細胞 塊 は 図
ペ ト リ皿 に 付 着 し,
胞 の 増 殖 が 始 ま る 。 図3bは
そ こか ら内皮 細
ペ ト リ皿 一 面 に 細 胞 が 増 殖
Arg
Glu-plg
Lys
Glu-Pln
ペ プ チ ドが 遊 離 し, N
は プ ラ ス ミ ン に よ り, ま た Lys-Plg
ノ ゲ ン ア ク チ ベ ー タ ー に よ り,
いずれ も
Glu-Plg
前 者 の 経 路 のほ
によ っ て,
い 。 ま た,
Lys-Pln
は2つ
Glu-Plg→Lys-Plg→Lys-Pln,
Glu-Pln→Lys-Pln
は プ ラス ミ
の 経 路,
う が 後 者 に 比 べ て,
に変 換 され る。
活 性 化 速 度 が大 き
プ ラ ス ミ ノ ゲ ン 分 子 中 に は リ ジ ン お よ び ε-
ア ミノ カ プ ロ ン酸 な ど と結 合 す る部 位
で 継 代 培 養 を 行 な い,
ウシ
多 量 の細 胞 を得 る。
が 存 在 し,
(Lysine-binding
合 す る 。 プ ラ ス ミ ノ ゲ ン 分 子 中 の Lysine-binding
植 え 継 ぎ を 行 な い,
他 は初 代 培 養 と同一 条 件
は 全 部 で5カ
そ の 部 位 を 介 し て フ ィ ブ リ ン分 子 と 結
有 し, 他 の4カ
所 あ り,
(a)
(b)
site
1つ は リ ジ ン に 対 し強 い 親 和 力 を
所 は 弱 い 親 和 力 を 有 す る^<27)>。Lys-Plg は
フ ィ ブ リ ン分 子 上 のE部
図3.
に変
す な
お よ び Glu-Plg→
Lys-Pln
%ト
替 え,
N
の プ ラ ス ミ ノ ゲ ン に 変 換 さ れ る (Lys-Plg)。
換 さ れ る 。 以 上 の よ うに,
わ ち
ま た,
は プ ラ ス ミ ン に よ り限 定 分 解 を 受 け や す く,
site)
リ プ シ ン溶 液 で 分 散 さ せ,
560-
ト リ プ シ ン様 の セ リ ン酵
し た 状 態 を 示 した も の で あ る 。 こ の 状 態 の 細 胞 を0.05
胎 児 血 清 だ け は10%に
を有
素 で あ る プ ラ ス ミ ン に 変 換 さ れ る (Glu-Pln)。
末端
(fetal bovine
端 に Glu
ク チ ベ ー タ ー に よ り プ ラ ス ミ ノ ゲ ン分 子 中 の
末 端 を 構 成 す る 分 子 量 約8,000の
シ胎 児血 清
N末
白 質 で あ る (Glu-Plg)^<26)>。 プ ラ ス ミ ノ ゲ ンア
ス で 内 表 面 か ら 内 皮 細 胞 だ け を 削 り取 る 。 得 ら れ た 内 皮
(Eagle's
プ
を プ ラ ス ミ ン (plasmin)
細 胞 塊 を20%ウ
unit/ml
であ
血 管 の 損 傷 部 な ど に 生 じ た フ ィ ブ リ ン塊 を 溶 解 す る^<25)>。
Val
皮 細 胞 の 培 養 法 に つ い て 述 べ る^<23,24)>。
鮮 な も の を 得,
血 液 凝 固,
に 変 換 さ せ る 酵 素 で あ る 。 生 じた プ ラ ス ミ ン は 選 択 的 に
に Jaffe
ウ シ頸 動 脈
プ ラ ス ミ ノ ゲ ン ・プ ラ ス ミ ン 変 換
り, 本 稿 で 述 べ る プ ラ ス ミ ノ ゲ ン ア ク チ ベ ー タ ー は,
て 重 要 で あ る。
1973年
II.
尿 中 に存 在
な ど が 知 ら れ て い る 。生
位 と 高 い 親 和 力 で,
Glu-Plg
は
ペ トリ皿に付着 した ウシ頸動脈 内皮細胞塊か らの内皮細胞 の増殖 (初代培 養)
継代培養を行 なった血管内皮細胞 の16回 植 え継 ぎを行なったあ との顕微 鏡写真
3
4
蛋
白 質
核 酸
酵 素
Vol. 30 No.
1
(1985)
図4.
線 溶 系 の 主 要 機 構^<27∼29)>
→ : 酵 素 反 応, 【tautomer】
結合を
: 表 わ し, 線 の 太 さ が 親 和 力 の 強 さ を 示 して い る 。
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フ
ィブ リ ン分 子 上 のD部 位 と低 い親 和 力 で そ れ ぞ れ 結 合
る^<34)>。
して お り, 結 合 す る プ ラス ミノ ゲ ンの 数 は フ ィ ブ リン1
プ ラ ス ミノ ゲ ン ア クチ ベ ー ター に 関 す る 研 究 は, ヒ ト
分 子 に対 し, E部 位 お よびD部 位 そ れ ぞ れ2個 の 合 計4
床 か ら得 られ る ウ ロキ ナ ー ゼ たつ い て, さ か ん に 行 な わ
個 で あ る と考 え られ て い る^<28,29)>。
れ た^<35,36)>。
そ れ は, そ の単 離 精 製 が比 較 的 簡 便 で, 均 一
血 液 内 に は, プ ラス ミンに対 して 特 異 的 に 結 合 し, そ
な もの が 大量 に 得 られ るた め で あ る 。 ウ ロキ ナ ーゼ は 分
の酵 素 機 能 を消 失 させ る蛋 白質 が存 在 す る。 そ の阻 害
子 量54,000と31,500の2種
蛋 白 質 と して 現 在 ま で, α_2-プラス ミンイ ン ヒ ビ タ ー
が, 後 者 は 前 者 の 会 解 産物 で あ る と考 え られ て い る。
(α_2-PI), α_2-マク ロ グ ロ ブ リン, ヘ パ リン ・ア ンチ トロ
ンビ ンIII複合 体 な どが報 告 さ れ て い る。 これ らの 阻 害 蛋
白質 の 中 で最 も効 果 的 に プ ラス ミン活 性 を 阻 害 す る もの
類 の もの が知 られ て い る
表1に 各 種 組 織 か ら 単 離 精 製 さ れ た組 織 ア クチ ベ ー
タ ー とそ の 分 子 量 を 示 す^<37∼46)>。
と くに,
ヒ ト メ ラ ノー
マ 細 胞 の組 織 ア ク チベ ー タ ーの 研 究 で は, Pennica
ら^<47)>
は α_2-PIであ り, プ ラス ミン と化 学量 論 的 に 結 合 し阻 害
が メ ラ ノー マ 細 胞 か ら 組 織 ア クチベ ー タ ー に 対 す る
す るだ け で な く, プ ラス ミノ ゲ ンの フ ィ ブ リン
mRNA
の吸着
を得, 遺 伝 子工 学 的 手 法 を 用 い て ア ミノ酸 配 列
な どを 明 らか に した (図5)。
を も 阻害 す る。
メ ラ ノ ーマ 細 胞 の 組織 ア
クチベ ー タ ーは 単 鎖 の糖 蛋 白質 で あ り, 530個 の ア ミノ
III.
酸 残 基 で構 成 きれ て い る。 そ の中 で Arg 3-SeR 4と
プ ラ ス ミ ノゲ ンア ク チ ベ ー タ ー
プラス ミノ ゲ ン ア ク チベ ー タ ーは, 単 一 な も ので は な
い。 組 織 に 存 在 す る組 織 ア クチ ベ ー タ ー, 血 管 壁 か ら分
泌 され る血 管 内皮 ア クチベ ー タ ー (vascular activator),
尿 中 に 存 在 す る ウ ロキ ナ ー ゼな どが あ り, いず れ も蛋 白
分 解 酵 素 で あ る。 また, ス ト レプ トキ ナ ーゼ (streptoki
nase)や
ス タ フ ィ ロキ ナ ーゼ
(staphylokinase)
の よう
に, 微 生 物 が 産 生 す る蛋 白分 解 酵 素 で な い ア クチ ベ ー タ
ー も存 在 す る。 また, 血 漿 中 の血 液 凝 固 第XII因子^<30,31)>と
プ レカ リク レイ ン^<32)>に
依 存 した プ ラ ス ミノゲ ンの活 性 化
機 構 が報 告 さ れ て い る。す な わ ち, 活 性 化 第XII因子 は 直
接 プ ラス ミノ ゲ ンを 活 性化 す る こ とは な い が, プ レ カ リ
ク レイ ンを 活 性型 カ リク レイ ンに 変 換 す る。 この カ リク
レイ ンは プ ラス ミノ ゲ ンア クチ ベ ー ター 活 性 を 有 して お
り^<33)>,
プ ラ ス ミノ ゲ ンを 活 性 化 す る。 さ らに, 高分 子量
キ ニ ノ ゲ ンが 線溶 活 性 化 に 関与 す る こ と も知 ら れ て い
4
表1.
各 種 器 官 の プ ラス ミノ ゲン 活 性 化 因子
Arg
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プラス ミノゲン活性化因子 の血管内皮細胞 での産生
図5.
5
ヒ ト組 織 ア ク チ ベー タ ー の 構 造^<47,48)>
ヒ ト組 織 ア クチ ベ ー ター は ア ミノ酸 残 基 数530で
あ り,
→ の 部 分 が 容 易 に 開 裂 し,
鎖になる。ギザギザの部分には 糖 が結 合す る と考 え られ る 。
278-Ile 279 で 限 定 分 解 が 容 易 に起 こ り, ジ ス ル フ ィ ド
ン親 和 性 が 強 く, フ ィ ブ リノ ゲ ンー フ ィ ブ リ ン変 換 に際
で 結 合 した2本 鎖 に な る こ とが 知 ら れ て い る^<48)>。Rij
して フ ィブ リ ンに 吸着 し, フ ィ ブ リン表 面 で 阻 害 因子 な
ken^<49)>は,
分 子 量72,000,
どか ら の影 響 を受 け ず に 効 果 的 に プ ラ ス ミノ ゲ ンー プ ラ
ジス ル フ ィ ドに よ り結 合 した
2本 鎖 の ア クチ ベ ー タ ーを メラ ノ ー マ細 胞 か ら精 製 し,
ス ミ ン変 換 を行 な い, フ ィブ リン分 解 を 行 な う。 これ に
軽 鎖側 に活 性 部 位 を 構 成 す る セ リ ン残 基 の存 在 を報 告 し
対 して ウ ロキ ナ ー ゼ は, フ ィ ブ リンに 対 す る親 和 性 が 低
ている。
く, フ ィブ リ ンの存 在 に 関 係 な く プ ラ ス ミノ ゲ ンを 活 性
各 種 プ ラス ミノ ゲ ン ア クチベ ー タ ーに 対 す る抗 体 を と
化 す る^<53)>。
組 織 ア クチ ベ ー タ ー の プ ラス ミノ ゲ ン活 性 化
り, 免 疫 学 的 に比 較 検 討 す る と, 子 宮 組 織 や ヒ トメラ ノ
に お い て は, フ ィブ リンが 存在 す る場 合 と存 在 し ない 場
ー マ細 胞 な ど, 組 織 ア クチ ベ ー タ ーに 対 す る抗 体 と ウ ロ
合 とで は, そ の活 性 化 速 度 は著 し く異 な り, ミカ エ リス
キ ナ ー ゼ に対 す る抗 体 の2つ に 分 類 され る。 そ れ ぞ れ の
定 数 で 前 老 は後 者 の100倍
程 度 低 くな る^<51∼53)>。
抗 体 に対 応 して, ア ク チベ ー タ ーは 組 織 ア クチベ ー タ ー
血 管 内 皮 細 胞 か ら血 液 中 に放 出 され る プ ラス ミノ ゲ ン
型 と ウ ロキ ナ ーゼ 型 に 分 類 され る^<50)>。
組 織 ア クチベ ー タ
ア クチ ベ ー タ ー は, 血 栓 溶 解 とい う役 割上, 最 も重 要 と
ー と ウ ロキ ナ ーゼ は どち ら も ジ イ ソプ ロ ピル フ ル オ ロリ
ン酸 (DFP)
で活 性 が阻 害 され る セ リ ン酵 素 で あ るが,
思 わ れ る。 研 究 の初 期 の段 階 にお い て Aoki^<43)>,Binder
ら^<44)>は
ヒ ト下 肢血 管 を 灌 流 す る こ とに よ り, 血 管壁 か ら
両 者 の プ ラ ス ミノ ゲ ンを 活 性 化 す る機 構 は 図6に 示 す よ
浸 み 出 して くる ア クチ ベ ー タ ー を分 離 ・精 製 し, 分 子 量
うに異 な る。 す な わ ち, 組 織 ア クチ ベ ー タ ー は フ ィブ リ
80,000^<43)>あ
る い は67,000∼75,000^<44)>の も の を そ れ ぞ れ
1.
組 織 ア クチ ベ ー タ ー+フ
2.
組 織 ア クチ ベ ー タ ー ・フ ィ ブ リン複 合 体+プ ラス ミノ ゲン
ウ ロキ ナ ー ゼ+プ ラ ス ミ ノゲン → プ ラ ス ミン → 線 溶
図6.
ィブ リン
→ 組 織 ア クチ ベ ー タ ー ・フ ィブ リン複 合 体
→ プ ラス ミン
→線溶
組 織 ア クチ ベ ー タ ー と ウ ロキ ナ ー ゼ の プ ラ ス ミ ノゲン 活 性 化 機 構
5
6
蛋 白 質
核 酸
酵 素
得 た 。 そ の後, 培 養 血 管 内皮 細 胞 か らプ ラス ミノ ゲ ンア
Vol. 30
表2.
No.
1
(1985)
プ ラス ミ ノゲン 活性 化 因子 分 泌 に 影響 す る物 質
クチベ ー タ ーが 培 養 液 に分 泌 され る こ とが 明 ら か に な
り^<54)>,
血 管 内 に お い て は, 内皮 細 胞 が ア クチ ベ ー タ ー を
絶 えず 血 液 中 に分 泌 して い る と考 え られ る よ う に な っ
た 。Levin
60,000の
ら^<59)>は
培 養 ヒ ト臍帯 静 脈 内皮 細 胞 に分 子 量
組 織 ア クヂ ベ ー タ ー を見 い だ して い るが, Bo
oyseら^<46)>はウ ロ キ ナ ー ゼ型 の ア クチ ベ ー タ ー も存 在 し
て い る と報 告 して い るる。
ま た, Levin
ら^<10)>は
培 養 ウ シ大
動脈 内皮 細 胞 か ら分 子 量74,000と100,000の
チ ベー タ ー型 と, 52,000の
組織 ア ク
ウ ロキ ナ ー ゼ型 の ア クチ ベ
ー タ ーが 分 泌 され る と報 告 して い る。 筆者 ら^<55)>も
, 培養
ウシ頸 動 脈 内皮 細 胞 に2つ の 型 の ア クチ ベ ー ター の存 在
を 確 か め た。
血 液 中 に 存 在 す る ウ ロキ ナー ゼ型 の ア クチ ベ ー タ ー
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と, 尿 中か ら単 離 され た ウ ロキ ナ ー ゼ が 同一 の もの で あ
るか 否 か とい う問 題 に 関 して, 最 近 Booyse
ら^<56)>は,
ヒ
ト臍帯 静 脈 内皮 細 胞 か ら得 た ウ ロキ ナ ー ゼ 型 の ア クチ ベ
ー タ ー と ヒ トウ ロキ ナ ー ゼ を 用 い て , SDSゲ
ル 電気 泳
動, ペ プ チ ドマ ッ プな どに よ り検 討 した 結 果, 両 者 の 識
別 が不 可能 で あ る と報 告 して い る。
作 動性 物 質 また は トロ ン ビ ン (thrombin)^<71)>
を 経 口あ る
血 管 内皮 細 胞 は プ ラ ス ミノ ゲ ン ア クチ ベ ー タ ーを 合 成
す る の み な らず, 分 子 量50,000前
後 の 阻 害 因 子 を も合
い は 血 管 内へ 投 与 す る と, 血 管 内 の 線 溶 系 活 性, す な わ
ち プ ラ ス ミノ ゲ ンア クチ ベ ー タ ー量 が 上 昇 す る こ とが 知
成 す る^<17,19,54,57∼62)>。Loskutoff^<61,62)>
の報 告 に よれ ば, 内 皮
られ て い る。た と えば, バ ゾプ レ ッシ ン2∼10μgの
細 胞 で 合 成 され る阻 害 因 子 の量 は 同細 胞 の合 成 す る全 蛋
中 へ の投 与 に よ って, 血 管 内 皮 細 胞 に 貯 わ え られ て い た
白質 の2∼12%に
ア クチベ ー タ ー は放 出 され, 血 中 の線 溶 系 が亢 進 す る。
も達 す る。 さ らに,
こ の阻 害 因 子 は
血液
素 な ど) に対
そ の後, 内皮 細 胞 の培 養 が 可 能 と な っ てか らは, 培 養
し安 定 な 蛋 白質 で あ り, 組 織 ア クチ ベ ー タ ー型 とウ ロキ
液 中 に種 々 の物 質 を溶 か し, 内皮 細 胞 よ り合 成 あ るい は
ナ ーゼ 型 の 両 ア クチ ベ ー タ ー の 機 能 を 阻害 す る。 しか
分 泌 され る プ ラス ミノ ゲ ンア クチベ ー タ ー量 の増 減 を 調
し, こ の阻 害 因 子 の 生理 的役 割 お よび 阻 害機 構 は ま だ 明
べ る研 究 が行 なわ れ る よ うに な った 。 た とえ ば, ス テ ロ
確 で ない 。
イ ドホ ル モ ンの培 養 液 へ の添 加 に よ り, 培 養 内皮 細 胞 か
熱, pH,
変 性 剤 (4Mグ
ア ニ ジ ン, 6M尿
らの ア クチ ベ ー タ ー分 泌 の抑 制 が 報 告 され^<72)>,
また,
IV.
プ ラ ス ミ ノ ゲ ン ア ク チ ベ ー ター 誘 起 物 質
こ
の 現 象 とは反 対 に, ヒ ト培 養 癌 細 胞 で は ス テ ロイ ドホ ル
モ ンの エ ス トラ ジ オ ール な どに よ り, ア クチ ベ ー タ ーの
生 体 内 で の血 液 凝 固, 線 溶 系 の調 節 機 構 の解 明 お よび
分 泌 が 促 進 す る と の報 告 も あ る^<73)>。
そ の他, 培 養 内 皮 細
血 栓 症 の 予 防 と治 療 とい う2つ の 目的 か ら, 血 管 内 皮 細
胞 に エ タ ノ ー ルを 終 濃 度1%程
胞 内 プ ラ ス ミノ ゲ ンア クチ ベ ー タ ー の合 成 あ るい は 細 胞
ー タ ー の分 泌 が亢 進 され る^<74)>。Loskutoff
ら^<70)>は
培養内
度 添 加 す る と, ア クチ ベ
外 へ の分 泌 を亢 進 また は抑 制 させ る物 質 の探 索 が 多 くの
皮 細 胞 に トロ ンビ ンを 加 え る こ とに よ りア クチベ ー タ ー
研 究 者 に よ っ て行 なわ れ て い る。 そ の結 果 は表2に 示 さ
の合 成 と分 泌 が抑 制 され る と報 告 して い るが,
れ てい るが^<63∼77)>,
そ の 他, ス トレス, 運 動, 血 管 の圧 迫
ンの フ ィ ブ リノゲ ンー フ ィブ リ ン変 換 に よ り血 栓 を 形 成
な ど に よる線 溶 系 の亢 進 も プ ラス ミノ ゲ ンア クチ ベ ー タ
す る とい う本来 の 性質 と考 え あわ せ る と, た いへ ん興 味
ーに よる こ とが知 られ て い る。 表2に 示 した よ うに, ス
深 い 。 しか し, 先 に 述 べ た よ うに^<71)>,
トロ ンビン が 血 管
トロ ン ビ
タ ノ ゾ ロー ル^<63)>,
メチ ル ア ン ドロス テ ンジ オ ー ル な ど^<65)> 内 の 線 溶 活 性 を亢 進 させ る とい う報 告 もあ り, 培 養 内皮
の ス テ ロイ ド化 合 物, バ ゾプ レ ッシ ン(vasopressin) とそ
細 胞 とい う単 一 系 を 用 い た場 合 と, 血 管 内 とい う全 体系
の誘 導 体 や ア ドレナ リ ン (adrenaline)
で の場 合 で,
6
な ど^<66∼68)>の
血管
トロ ンビ ンが 同 じ作 用 を す る とは 一 概 に 言
7
プ ラス ミノゲン活性化因子の血管内皮細胞での産生
表3.
え ない こ とが わ か る。 また, これ ら の誘 起 物 質 が ど の よ
うに細 胞 に 作 用 し, ア クチベ ー タ ーを 放 出す るか につ い
ス テ ロ イ ドに よる ウシ 血 管 内皮 細 胞 の プ ラ ス
ミノ ゲン ア ク チ ベ ー ター の 産 生
ては まだ 明確 で ない 。 筆 者 ら は, あ る種 の植 物 ス テ ロー
ル の培 養 内皮 細 胞 へ の添 加 に よっ て, ア クチベ ー タ ー の
合 成 お よび 分 泌 が亢 進 され る現 象 を観 察 した^<24,55)>。
次 に,
これ ら の研 究 につ い て 述 べ る。
V.
シ トス テ ロ ー ル お よ びフ コ ス テ ロ ー ル に
よ るプ ラス ミノゲ ンア ク チ ベ ー ター の 誘 導
実 験 に使 用 した ス テ ロイ ドの構 造 を表3に 示 す 。 この
中 で コ レス テ ロー ル の24位
に エ チ ル基 の 導 入 さ れ た シ
トズ テ ロー ル (sitosterol)^<78∼81)>
は 高等 植 物 の緑 葉 に 含 ま
れ, 同 じ く24位
に エ チ リデ ン基 の導 入 さ れた フ コス テ
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ロ ール (fucosterol)^<82)>
は 褐 藻 に 含 まれ る。これ ら2種 の
ステ ロー ル は, 培 養 内皮 細 胞 の プ ラス ミノゲ ンア クチ ベ
ー タ ーの 合 成 と分 泌 を亢 進 させ た 。
ステ ロー ル の 効果 を み る た め の 実験 方 法 は, 図7に 示
す よ うに,
ま ず 培 養 内 皮 細 胞 (10∼16
回植 え継 ぎ を 行
な った もの) の培 養 液 に ステ ロイ ドを添 加 し, 1世 代 培
養 を 行 な う。 細 胞 が ペ ト リ皿 一 面 に増 殖 した あ と, ステ
ロイ ドを 含 む 培 養 液 を 取 り除 き, 細 胞 を ステ ロイ ドと血
清 を 含 まな い 培 養 液 で 洗 浄 し, さ らに 同 じ培 養 液 を 加 え
て保 温 を 始 め る。 必 要 な 時 間 ご とに 培 養 液 を 抜 き出 し,
細 胞 か ら分 泌 され た プ ラ ス ミノ ゲ ンア クチベ ー タ ー量 を
測 定 す る。一 方, 0.5%
Triton X-100を
含む培養液を用
い て細 胞 の抽 出液 を得, 細 胞 内 に存 在 す る プ ラ ス ミノ ゲ
ンア クチ ベ ー ター量 を測 定 す る。
プ ラス ミノ ゲ ンア クチ ベ ー タ ー量 を測 定す る方 法 に は
合 成 基質 (S-2251な
図7.
ど) を用 い る方 法^<52)>,
フ ィ ブ リン平
板法
(fibrin
plate method)^<83,84)>, ユ ー グ ロ ブ リ ン の 溶 解
時間 を調 べ る方 法
(euglobulin
lysis
time
method)^<84)>,
[^<125>I]フ ィ ブ リ ン を 用 い る 方 法^<54,70)>,お よ び 筆 者 ら の 考
ス テ ロール 処 理 した 細 胞 内 外 の プ ラ ス ミノ ゲン ア ク チ ベ ー タ ー を 含 む 試 料 の調 製 法^<24)>
7
8 蛋 白 質
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図8.
案 した フ ィ ブ リン懸 濁 液 法
核 酸
酵 素
フ ィ ブ リリ懸 濁 液 法 の操 作 法 (a)
Vol. 30
No. 1
と ウ ロキ ナ ーゼ を用 い た 標 準 曲線 (b)^<24)>
(fibrin suspension method)^<85∼87)>
表3は,
な どが あ る。 フ ィブ リ ン懸 濁 液 法 は (図8a),
プ ラス ミンの 天 然 基 質 で あ る フ ィブ リン単 量 体 の会 合 体
を 超 音 波 破 砕 し, 均 一 な フ ィブ リ ン粒 子 の溶 液 を 得 る。
これ を基 質 と して プ ラ ス ミノ ゲ ン存 在 下 で 内皮 細 胞 抽 出
液 または 培 養 液 を 加 え, 37℃ で保 温 し, フ ィブ リ ンの分
解 に よる濁 度 の減 少 を 測 定 す る (図8b)。
プ ラス ミノ ゲ
ンア クチ ベ ー タ ー 量 は, ウ ロキ ナ ーゼ を 用 い, 濁度 が20
%減 少 した 時 間 を ウ ロキ ナ ー ゼ 国 際 単 位 (IU)
ロ ッ トし, 検 量 線 を 作 製 し, ウ ロキ ナ ー ゼIUに
に対 しプ
換算 し
た。
各 種 ス テ ロ イ ドを 終 濃 度25μMに
に 培 養 液 に 添 加 し,
8時 間 保 温 後,
ク チ ベ ー タ ー 量 を 測 定 し,
対 照 の 活 性 を1.00と
な るよ う
細 胞 か ら分 泌 した ア
ス テ ロ イ ドを 添 加 しな か っ た
した 場 合 の相 対 活 性 を 表 わ した も
の で あ る 。 動 物 中 に 存 在 す る ス テ ロ ー ル で あ る コ レス テ
ロー ル
(cholesterol)
は 対 照 と変 わ り な く,
rone)や
や 側 鎖 の長 さ の異 な る ステ ロイ ド
ま た,
テ ス トス テ ロ ン
エ ス ト ラ ジ オ ー ル (estradiol)
(testoste
な ど の性 ステ ロ
イ ドホ ル モ ン で は 抑 制 の 傾 向 さ え 見 ら れ た 。 こ れ に 対 し
て フコ ス テ ロ ー ル と シ トス テ ロ ー ルは,
ア ク チベー
ター
の分 泌 を 飛 躍 的 に促 進 させ た 。
図9と
図9.
(1985)
図10は
シ トス テ ロ ー ル 処 理 を した 細 胞 か ら の
ス テ ロ イ ド処 理 した 細 胞 か ら の ア ク チ ベ ー タ ー
分 泌 の経 時 変 化^<24)>
(●) シ トス テ ロー ル 処 理, (○) 対 照, (▲) コ
レス テ ロ ー ル処 理, (△) アン ドロス テン 処 理 。
ス テ ロイ ドの 終 濃 度 は25μMと
8
した 。
図10.
シ トス テ ロール 各 濃 度 に お け る内 皮 細 胞 の プ ラ
ス ミノ ゲン ア クチ ベ ー タ ー分 泌 量 の変 化^<24)>
プラス ミノゲン活性化因子の血管内皮細胞での産生
ア クチ ベ ー タ ー分 泌 の経 時 的 変 化 と, 添 加 す る シ トス テ
時 間 保 温 の間 に, シ トス テ ロー ル処 理 で は 対照 に 対 して
ロー ル の濃 度 変 化 を, そ れ ぞ れ 観 察 した も の で あ る。 シ
約3倍,
トス テ ロー ル処 理 を した 細 胞 か らは, 時 間 と と もに 指 数
ー活 性 の新 た な 増 加 が 観 察 され た 。 こ れ に対 して, シ ク
的 に ア クチ ベ ー タ ー分 泌 が 高 ま り, 6時 間 後 に は 対 照 に
ロヘ キ シ ミ ド処理 を 行 な うと, どの細 胞 で も新 た な ア ク
比べ て約3∼4倍
も分 泌 量 が 高 ま って い る。 また, シ ト
ステ ロー ル を20∼50μMに
な る よ う培 養 液 に 加 え る と,
細 胞 か らの ア クチ ベ ー タ ーの 分 泌 量 は 増 加 した 。
こ こ ま では 内皮 細 胞 か ら分 泌 され る プ ラ ス ミノ ゲ ンア
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9
フ コ ステ ロ ー ル処 理 で は 約7倍 の ア クチ ベー タ
チ ベ ー ター 活 性 の増 加 は 観 察 され な い。 こ の こ とか ら,
両 ス テ ロー ル は 内皮 細 胞 の 蛋 白質 合 成 を刺 激 して い る と
思 わ れ る。
フ コス テ ロ ール と シ トス テ ロ ー ルそ の も のは, プ ラス
クチ ベ ー タ ー量 の み を 測 定 して きた が, 次 に, 細胞 内 で
ミノゲ ンを 活性 化 す る能 力 を もた ない し, プ ラス ミ ノゲ
の ア クチ ベ ー タ ー量 が フ コ ス テ ロ ール と シ トステ ロー ル
ンア クチ ベ ー ター に 作 用 し活 性 を 高 め る とい う作 用 も保
処 理 で ど の よ うに変 化 す るか に つ い て 述 べ る (表4)。
持 して い な い。
両 ス テ ロ ール で 内皮 細 胞 を処 理 す る と, 細胞 抽 出 液 の
次 に, この 内皮 細 胞 内 で 合 成 され た プ ラス ミノゲ ンア
0時 間 に お い て, す で に対 照 に 比 べ て ア クチ ベ ー ター を
クチ ベ ー ター の 分 子量 を 調 べ る と 同時 に, そ の ア クチ ベ
多 量 に 貯 わ え て お り, さ らに8時 間 保 温後 の 細 胞 抽 出液
ー タ ー が組 織 ア クチ ベ ー タ ー型 か ウ ロキ ナ ー ゼ型 か い ず
中 のア クチベ ー ター量 は0時 間 の 値 とほ ぼ 等 しい もの で
れ の種 類 に 属 す る か 調 べ た 。 分 子 量 は フ ィブ リ ン ・オ ー
あ った が, 培 養 液 中 に は 多量 の ア クチ ベ ー ター が 分 泌 さ
トグ ラ フ ィ ー (fibrin autography)^<10,88)>
に よ り推 定 す る。
れ, 細 胞 内 外 の ア クチ ベ ー タ ーの 総和 は 対 照 と比 べ, は
す な わ ち, Laemmli^<89)>
の 条件 で 試 料 を ス ラ ブ電 気 泳 動 法
るか に 大 きい 。 この事 実 か ら, フ コス テ ロ ール あ る い は
に よ り泳 動 させ た ゲル を, プ ラ ス ミノ ゲ ンを含 む フ ィブ
シ トステ ロ ール で の 内皮 細胞 の処 理 は, ア クチ ベ ー タ ー
リン寒 天 ゲル 上 に重 ね 合 わ せ, 37℃ で保 温 し, フ ィブ リ
の 分 泌 だ け で な く, 合 成 を も亢 進 させ て い る こ とが 示 唆
ンが溶 解 した 位 置 か ら ア クチ ベ ー タ ー の分 子 量 を 測 定 し
され た 。 これ を さ らに 明確 にす る た め に, 蛋 白質合 成 阻
た。 ま た, フ ィブ リン寒 天 ゲ ルに プ ラ ス ミノ ゲ ンだ け で
害 剤 で あ る シ ク ロヘ キ シ ミ ド (cycloheximide)
を細 胞
な く, 組 織 ア クチ ベ ー ター あ るい は ウ ロキ ナ ーゼ の抗 体
に 加 え, ア クチ ベ ー タ ー量 に どの よ うな効 果 を お よぼす
を添 加 す る と, それ ぞ れ 対 応 す る ア クチベ ー タ ーが 抗 体
か 検討 した (表5)。
シ ク ロヘ キ ジ ミ ド処 理 を行 なわ な か った 細胞 で は, 8
表4.
表5.
ス テ ロイ ド処 理 を した 内皮 細 胞 内外 の プ ラ ス
ミノ ゲン ア クチベ ー タ ー 量^<55)>
蛋 白 質 合 成 阻 害 剤 シ ク ロヘ キ シ ミ ドに よ る内 皮 細
胞 の プ ラス ミノゲ ン ア クチ ベ ー タ ー合 成 の 阻 害^<55)>
図11.
フ ィ ブ リン ・オ ー トグ ラ フ ィー に よる細 胞 培 養 液 中
の プ ラス ミノ ゲン ア クチ ベ ー タ ー の 同 定^<55)>
(a)
A
: 対 照 細 胞 の試 料,
細 胞 の 試 料,
(b)
C
B
: シ トス テ ロー ル処 理
: フ コ ス テ ロール 処 理 細 胞 の試
料。
シ トス テ ロール 処 理 細 胞 の 試 料 を 電気 泳 動 し,
そ の ゲルをA
: 対 照 フ ィブ リン 寒 天 ゲ ル, B :
抗 組 織 ア クチ ベ ー タ ー を 添 加 した フ ィブ リン寒
天 ゲル に 載 せ た と き の オ ー トグ ラム。
9
10
蛋 白 質
核 酸
酵 素
に よ って 中和 され, フ ィ ブ リン溶 解 は 観 察 され な い こ と
そ の 結 果, ウ シ頸 動 脈 内 皮 細 胞 で は 図11に
55,000,
No. 1
(1985)
本 稿 を ま とめ る に あた り貴 重 な 助 言 を い た だ い た 東 京 都 老 人
総 合 研 究 所 薬 理 研 究 室, 室 田誠 逸, 森 田 育 男, 昭 和大 学 薬 学 部
生 物 化 学 教 室, 中村 泰 治, 中谷 一泰, 東 京工 業 大学 理 学 部 化学
か ら, ア ク チベー タ ー の種 類 を 確 か めた 。
に, 分 子 量31,000,
Vol. 30
示す よう
科, 池 川信 夫, 九 州大 学 医 学 部病 理 学 教 室, 田 中健 蔵, 居 石克
夫, 諸 先生 方 に 深 謝 い た します 。
81,000と130,000の4つ
の プ ラ ス ミノ ゲ ンア クチ ベ ー タ ーが 観 察 され た 。 図11a
のAは
ス テ ロー ル処 理 を して い な い細 胞, Bは
ロー ル処 理,
文
シ トステ
Cは フ コス テ ロー ル処 理 を した 細 胞 の 培 養
液 を 調 べ た もの で あ るが,
両 ス テ ロ ール 処 理 に よ って
(文献番号を太字に したものは 特に重要な文献である ことを示す)
1)
Jaffe,
各 ア クチ ベ ー タ ー の活 性 が 高 ま って い る こ とが 観 察 され
た 。 図11bのA,
Bは
と
E.
2756
C.
2)
3)
E.
Database Center for Life Science Online Service
55,000の
活 性 の消 失 が観 察 さ れ た^<54)>。
ウシ頸 動 脈 内 皮
細 胞 で は, お もに 分 子 量55,000の
ウ ロキ ナ ー ゼ型 の ア
クチ ベ ー ター が 存 在 した 。ま た, 31,000の
Nossel,
5)
ア
6)
クチ ベ ー タ ーが 分 解 され るた め で あ ろ う^<10)>。
以 上 の よ うに, 植 物 ステロー ル の フ コス テ ロー ル と シ
7)
8)
L.,
W.,
Nachman,
2757-2764
Vogel,
H.
Cell,
G.,
93,
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E.
9)
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841-850
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Mann,
K.
Acad.
K.,
D.
Levin,
J.,
703,
E. G.,
631-636
15)
16)
とす る計 画 が あ る 。 しか しな が ら, 組 織 ア ク チベ ー タ ー
17)
ト由 来 の もの で あ った と して も抗 原 性 の発 現 の危 惧 に よ
18)
19)
る。 そ れ に 対 し, シ トス テ ロー ル あ る い は フ コス テ ロー
20)
ゲ ンア クチベ ー タ ー の合 成 お よび 細 胞 外 へ の分 泌 が亢 進
21)
22)
L.:
Bowie,
USA.,
74,
E.
Collen,
G.,
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Biochim.
113-115
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14)
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医 薬 製 剤 に な る こ とが期 待 され る。
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Weksler,
室 田 誠 逸 : 生 化 学,
され るな らば, 血 栓 の予 防 あ るい は治 療 に対 す る新 しい
New
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13)
ル の血 中 投 与 に よ っ て, も し内皮 細 胞 内 で の プ ラス ミノ
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現 在, 血 栓 症 の治 療 には, お も に ウ ロキ ナ
ま す ます血 栓 溶 解 に対 す る即 効 性 の医 薬 の開 発 が 望 まれ
of
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礎 と 実 験,
12)
待 で きな い 。 そ こで, 今 後
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って, そ の安 全 性 は100%期
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明 らか に な った 。 現 在, これ らス テ ロー ル を動 物 に投 与
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主 で あ るが, 少 量 の組 織 ア クチ ベ ー タ ー型 を 含む こ とが
お わ りに
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す こ と, お よび そ の ア クチベ ー ター は ウ ロキ ナ ー ゼ型 が
い る。
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ゲ ンア クチベ ー タ ー の合 成 を亢 進 させ, そ の 分 泌 を 促
し, 線 溶 系 の亢 進 が起 こる か ど うか とい う問 題 が 残 って
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T hromb.
トス テ ロ ール は ウ シ血 管 内皮 細 胞 に作 用 し, プ ラ ス ミノ
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Thorgeirsson,
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た り現 わ れ な か った りして い るが, これ は55,000の
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活性が現われ
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Endothelial
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含 む も の (B) を 比較 した もの で, 抗 組 織 ア クチベ ー タ
ー抗 体 で81 ,000と130,000の
ア クチベ ー タ ー活 性 が
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Minick,
フ ィブ リン寒 天 に 抗組 織 ア クチ ベ
ー タ ー抗 体 (メ ラ ノ ー マ細 胞) を 含 まな い もの (A)
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