薬物定量用電気化学検出 HPLC の 高感度化とその応用

博士 学 位論 文
薬物定量用電気化学検出 HPLC の
高感度化とその応用
東京薬科大学
2015 年
小谷
智子
略 語 表
AA1
アリストロキア酸Ⅰ
AA2
アリストロキア酸Ⅱ
Ag/AgCl
銀 -塩 化 銀 電 極
AUC
血中濃度－時間曲線下面積
BG
血糖値
CE
キャピラリー電気泳動
DBBQ
3,5-Di-tert-butyl-1,2-benzoquinone
FFA
遊離脂肪酸
GC
ガスクロマトグラフィー
GC-FID
水 素 炎 イ オ ン 化 検 出 器 GC
GC-MS
GC 質 量 分 析 法
HPLC-ECD
電 気 化 学 検 出 HPLC
HPLC-FL
蛍 光 検 出 HPLC
HPLC-UV
吸 光 検 出 HPLC
IS
内標準物質
LC-MS
液体クロマトグラフィー質量分析法
LC-MS/MS
液体クロマトグラフィータンデム質量分析法
ODS
オクタデシルシリル化シリカゲル
PFC
プラスチックフォームドカーボン
PK
薬 物 動 態 （ Pharmacokinetics）
SCE
飽和カロメル電極
SMBG
血糖自己測定
S/N 比
シグナル／ノイズ比
t 1/2
半減期
VPA
バルプロ酸
VP-Na
バルプロ酸ナトリウム
Vd
分布容積
目
次
序論
1
第1章
電 解 還 元 に よ る ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC と
生薬への混入監視の実践
1-1
緒言
1-2
実験材料と実験方法
5
1-2-1
ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC
8
1-2-2
ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 吸 光 検 出 HPLC
9
1-2-3
生 薬 お よ び HPLC 用 検 液 の 調 製 方 法
9
1-3
実験結果
1-3-1
ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC 条 件 の 最 適 化
10
1-3-2
ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC の
12
分析能パラメータ
1-3-3
ボウキ中のアリストロキア酸定量
13
1-3-4
アリストロキア酸含有に注意を要する生薬への混入監視
15
の実践
1-4
考察
17
1-5
小括
19
第 2 章
キノンの還元前置波によるバルプロ酸の電気化学検出
HPLC と 血 中 の 薬 物 動 態 分 析 へ の 応 用
2-1
緒言
20
2-2
キノンの還元前置波に基づく酸測定
21
2-3
実験材料と実験方法
2-3-1
ボルタンメトリー装置
22
2-3-2
バ ル プ ロ 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC
23
2-3-3
遊 離 脂 肪 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC
24
2-3-4
実験動物とバルプロ酸ナトリウム投与
25
2-3-5
血糖値の測定方法
26
2-3-6
血中バルプロ酸及び遊離脂肪酸測定のための血漿試料の
26
前処理方法
2-4
実験結果
2-4-1
バルプロ酸由来のキノンの還元前置波
26
2-4-2
バ ル プ ロ 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC の 最 適 化
28
2-4-3
バ ル プ ロ 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC の 分 析 能 パ ラ メ ー タ
30
2-4-4
ラット血中バルプロ酸定量への応用
30
2-4-5
遊 離 脂 肪 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC の 分 析 能 パ ラ メ ー タ
32
2-4-6
ラット血中遊離脂肪酸定量への応用
32
2-4-7
バルプロ酸と遊離脂肪酸の複合動態解析の実践
34
2-4-8
バルプロ酸の薬物動態パラメータに及ぼす
37
高血糖状態の影響
2-5
考察
39
2-6
小括
42
第3章
トロロックスの酸化前置波によるテオフィリンの電気化学
検 出 HPLC と 血 中 の 薬 物 動 態 分 析 へ の 応 用
3-1
緒言
43
3-2
トロロックスの酸化前置波に基づく塩基測定
45
3-3
実験材料と実験方法
3-3-1
トロロックスのボルタンメトリー
47
3-3-2
テ オ フ ィ リ ン の 電 気 化 学 検 出 HPLC
47
3-3-3
実験動物とテオフィリン投与
48
3-3-4
血漿試料の前処理方法
48
3-4
実験結果
3-4-1
テオフィリン由来のトロロックスの酸化前置波
49
3-4-2
テ オ フ ィ リ ン の 電 気 化 学 検 出 HPLC の 最 適 化
50
3-4-3
テ オ フ ィ リ ン の 電 気 化 学 検 出 HPLC の 分 析 能 パ ラ メ ー タ
53
3-4-4
ラット血中テオフィリンの定量への応用
54
3-4-5
ラットにおけるテオフィリンの薬物動態パラメータ算出
55
3-5
考察
56
3-6
小括
60
総括
62
謝辞
65
引用文献
66
序
論
薬 物 を タ ー ゲ ッ ト と し た 定 量 分 析 は ，創 薬 研 究 ，薬 効・薬 理 研 究 ，安 全 性
試 験 ，薬 物 動 態 研 究 な ど の 基 礎 研 究 か ら 医 薬 品 の 製 造 や 品 質 管 理 な ど の 製 薬
の 現 場 ，ヒ ト を 対 象 と し た 治 験 お よ び 治 療 薬 物 モ ニ タ リ ン グ な ど の 臨 床 研 究
に至る広範な研究領域において重要である．
こ の よ う な 薬 学 領 域 に お け る 定 量 分 析 で は ，生 体 試 料 や 製 剤 の よ う に 様 々
な マ ト リ ッ ク ス を 含 む 試 料 を 対 象 と し て 取 り 扱 う こ と が 多 く ，夾 雑 物 と 測 定
対 象 物 質 を 分 離 す る 必 要 が あ る ．こ の た め ，信 頼 性 に 優 れ た 測 定 デ ー タ を 得
る た め の 定 量 分 析 法 と し て 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （ HPLC） が 汎 用 さ
れ て い る ．特 に ，固 定 相 に オ ク タ デ シ ル シ リ ル 化 シ リ カ ゲ ル（ ODS）カ ラ ム
を 用 い た 吸 光 検 出 HPLC（ HPLC-UV）は 有 機 化 合 物 の 分 離 分 析 に 適 す る こ と
か ら 薬 物 の 定 量 に 適 用 さ れ て お り ，製 薬 企 業 や 医 療 機 関 な ど の 様 々 な 施 設 に
お い て HPLC-UV 装 置 が 多 く 導 入 さ れ て き た ．し か し ，HPLC-UV は ，分 析 対
象 に よ っ て は 感 度 や 特 異 性 が 充 分 で な い こ と が あ り ，薬 物 お よ び そ の 代 謝 物
の 網 羅 的 解 析 を 行 う 薬 物 動 態 研 究 ，あ る い は 薬 物 の 分 解 生 成 物 の 同 定 や そ の
生 成 経 路 を 探 査 す る 安 定 性 試 験 ，複 数 の 薬 物 が 投 与 さ れ て い る 患 者 の 治 療 薬
物 モ ニ タ リ ン グ へ の 適 用 が 困 難 な 場 合 が あ る ．近 年 ，こ れ ら に 対 し て 製 薬 企
業 で は 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー タ ン デ ム 質 量 分 析 法 （ LC-MS/MS） の 導 入 が
行 わ れ て い る ．LC-MS/MS は 選 択 性 が 高 く ，血 液 や 尿 中 の 薬 物 お よ び そ の 代
謝 物 を 分 析 す る 際 に 有 益 な 分 析 法 で あ る が ，装 置 が 大 型 ，初 期 導 入 費 と 維 持
費が高額，高感度かつ高精度分析のためには試料に対して充分なクリーン
ア ッ プ 操 作 が 必 要 ，対 象 薬 物 に よ っ て は 誘 導 体 化 操 作 な ど の 前 処 理 方 法 が 煩
雑 で あ る 等 が 問 題 点 と し て 指 摘 さ れ る 場 合 が あ る ．そ の 他 の 高 感 度 HPLC と
し て ，分 離 分 析 ，感 度 ，特 異 性 の 観 点 か ら 蛍 光 検 出 HPLC（ HPLC-FL），電 気
化 学 検 出 HPLC（ HPLC-ECD）な ど が ，薬 物 の 定 量 分 析 に 有 望 と 考 え ら れ る ．
HPLC-ECD は ，酸 化 還 元 物 質 を 高 感 度 か つ 特 異 的 に 定 量 で き る 分 析 法 で あ
り ，様 々 な 領 域 で 利 用 さ れ て い る ．さ ら に ，HPLC-ECD は ，低 価 格 で あ る う
え に 分 析 装 置 自 体 の 小 型 化 を 図 る こ と が 容 易 で あ り ，広 範 な 研 究 機 関 お よ び
小中規模の医療機関への装置導入を考慮した場合，非常に有利である．
HPLC-ECD の 適 用 例 を Table 1 に 挙 げ た [1-10]．HPLC-ECD に よ る 尿 中 カ
テ コ ー ル ア ミ ン お よ び そ の 代 謝 物 の 定 量 は ，過 去 に 神 経 芽 細 胞 腫 な ど の 診 断
に 適 用 さ れ て い た [11-13]． 現 在 は ， マ イ ク ロ ダ イ ア リ シ ス と 組 み 合 わ せ て
麻酔下あるいは覚醒下動物の血液や脳の組織液中のアドレナリン作動性神
経 伝 達 物 質 の リ ア ル タ イ ム モ ニ タ リ ン グ に 応 用 さ れ て い る [14-17]．
-1-
Table 1
Analytes detected by HPLC with amperometric detection.
Analyte or Analyte Class
Working electrode
Ref.
Aromatic amines
Glassy carbon
1
Aromatic nitro compounds
Glassy carbon
1
Ascorbic acid
Pt
2
Bromide
Ag
3
Catecholamines and other biogenic amines
Glassy carbon
1, 4-7
Cyanide
Ag
3, 8
Hydroquinones
Glassy carbon
1
Iodide
Glassy carbon
1, 9
Phenols
Glassy carbon
1
Sulfide
Ag
3
Sulfite
Pt
10
Uric acid
Glassy carbon
1
ま た ，還 元 型 グ ル タ チ オ ン ，酸 化 型 グ ル タ チ オ ン ，ホ モ シ ス テ イ ン ，ホ モ シ
ス チ ン な ど の 含 硫 ア ミ ノ 酸 の HPLC-ECD は ， pmol レ ベ ル の 高 感 度 分 析 を 可
能 と し ，酸 化 ス ト レ ス の 評 価 の 目 的 で ，血 漿 ，肝 ミ ク ロ ゾ ー ム ，肝 細 胞 な ど
の 生 体 試 料 の 分 析 へ 応 用 さ れ て い る [18-23]．
こ の よ う に HPLC-ECD は ， 電 解 酸 化 あ る い は 電 解 還 元 に よ っ て 酸 化 還 元
能を有する様々な生体成分や薬物の定量に適用可能である．しかし，
HPLC-ECD の 検 出 の 場 で あ る 作 用 電 極 界 面 の 安 定 性 の 確 保 が 不 充 分 な 場 合 ，
あるいは電極表面が生体試料中の夾雑物により汚染を受けた場合，
HPLC-ECD の 感 度 や 精 度 の 顕 著 な 低 下 が 起 こ る ． こ の よ う な 実 情 か ら ，
HPLC-UV や LC-MS/MS に 比 べ て HPLC-ECD は 汎 用 性 に 劣 る と 評 さ れ る 場 合
がある．
本 研 究 で は ，HPLC-ECD の 本 来 の 特 性 を 活 か し ，薬 物 の 定 量 分 析 に お け る
実 用 性 を 向 上 さ せ る こ と を 企 図 し た ．そ の た め に は ，さ ら な る 高 感 度 化 と 高
精 度 化 を 目 指 し た HPLC-ECD 装 置 を 構 築 し ， 実 分 析 へ の 応 用 を 図 る た め に
試 料 の 適 切 な 前 処 理 方 法 を 提 示 し た 上 で ，HPLC-ECD の 薬 物 の 定 量 分 析 へ の
適用性を総合的に明らかにすることが重要と考えた．
また，測定対象物質が酸化還元物質でなく，いわゆる電極不活性な場合，
電 極 活 性 な 官 能 基 を 含 む 化 合 物 へ と 誘 導 体 化 し ，反 応 後 に 電 気 化 学 検 出 を 行
-2-
う 方 法 が 知 ら れ て い る [24]．例 え ば ，第 1 級 ア ミ ノ 基 あ る い は 第 2 級 ア ミ ノ
基 の 誘 導 体 化 試 薬 で あ る o-phtalaldehyde, N-succimidyl-3-ferrocenylpropinate,
isocyanate を 利 用 し た ア ミ ノ 酸 お よ び 脂 肪 族 ア ミ ン の 定 量 や カ ル ボ キ シ ル 基
の 誘 導 体 化 試 薬 で あ る p-aminophenol を 利 用 し た 脂 肪 酸 ， 胆 汁 酸 ， プ ロ ス タ
グ ラ ン ジ ン 類 の 定 量 な ど が あ る ．し か し ，誘 導 体 化 試 薬 の 利 用 に よ っ て ，官
能 基 特 異 的 な 検 出 が 可 能 に な る が ，手 順 が 多 く 前 処 理 操 作 の 煩 雑 さ な ど か ら ，
必ずしも汎用的な方法になっていない．
電 極 不 活 性 物 質 の う ち 酸 物 質 あ る い は 塩 基 物 質 で あ れ ば ，キ ノ ン の 還 元 前
置 波 あ る い は ト ロ ロ ッ ク ス の 酸 化 前 置 波 を 活 用 す る こ と [25,26] に よ っ て ，
こ れ ら を 電 気 化 学 的 に 検 出 す る こ と が 可 能 で あ る ．こ の 電 気 化 学 検 出 法 を 活
用 し た HPLC-ECD で は ， 誘 導 体 化 に よ ら ず 電 極 不 活 性 な 酸 物 質 あ る い は 塩
基物質を定量するので前処理方法を簡易にできる利点があるうえに，
HPLC-ECD の 測 定 対 象 物 質 の 適 用 範 囲 を 拡 張 す る こ と が で き ，薬 物 の 定 量 分
析において有利と考えた．
そ こ で ， 本 研 究 で は ， 薬 学 領 域 に お け る 実 分 析 へ HPLC-ECD の 適 用 を 図
るために，必要試料量の低減，簡便な前処理方法の確立を考慮したうえで，
酸 化 還 元 物 質 ，酸 物 質 ，塩 基 物 質 を 対 象 と し た 様 々 な 検 出 モ ー ド を 活 用 し た
HPLC-ECD を そ れ ぞ れ 確 立 す る こ と と し た ．HPLC-ECD が ，薬 物 の 定 量 分 析
に お い て 感 度 と 特 異 性 に 優 れ た 分 析 法 で あ る こ と を 示 す と と も に ，確 立 し た
HPLC-ECD を 血 中 の 薬 物 動 態 分 析 ，あ る い は 生 薬 に 混 入 し た 有 害 成 分 の 監 視
へ 展 開 し ， 薬 物 の 実 用 的 な 定 量 分 析 法 と し て の HPLC-ECD の 有 用 性 を 明 ら
かにすることとした．
第 1 章 で は ， 電 解 還 元 に よ る ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の HPLC-ECD を 構 築 し ，
アリストロキア酸腎症の原因物質であるアリストロキア酸の生薬への混入
を 監 視 で き る 高 感 度 分 析 法 を 確 立 し た ．中 国 産 の 生 薬 を 試 料 と し た 実 分 析 を
行 い ， 第 16 改 正 日 本 薬 局 方 （ 日 局 ） で 定 め ら れ る ア リ ス ト ロ キ ア 酸 Ⅰ の 分
析 法 に 比 べ て ，確 立 し た 分 析 法 は 感 度 と 特 異 性 に お い て 著 し く 優 れ る こ と を
明らかにした．
第 2 章 で は ，キ ノ ン の 還 元 前 置 波 に よ る バ ル プ ロ 酸（ VPA）の HPLC-ECD
を 構 築 し ，血 中 VPA の 薬 物 動 態 分 析 に 適 用 で き る 高 感 度 分 析 法 を 確 立 し た ．
さ ら に ，キ ノ ン の 還 元 前 置 波 に よ る 遊 離 脂 肪 酸（ FFA）の HPLC-ECD も 構 築
し た ．VPA，FFA の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を 同 時 に 取 得 し ，糖 脂 質 代 謝 調
節 を in vivo で 観 察 で き る 複 合 動 態 解 析 法 へ と 展 開 し た ．
第 3 章 で は ，ト ロ ロ ッ ク ス の 酸 化 前 置 波 に よ る テ オ フ ィ リ ン の HPLC-ECD
を 構 築 し ，血 中 テ オ フ ィ リ ン の 薬 物 動 態 分 析 に 適 用 で き る 高 感 度 分 析 法 を 確
立 し た ．本 分 析 法 は カ フ ェ イ ン や テ オ フ ィ リ ン 代 謝 物 の 影 響 を 受 け ず ，従 来
-3-
の テ オ フ ィ リ ン の HPLC-UV や イ ム ノ ア ッ セ イ に 比 べ て 多 く の 利 点 が あ る こ
と を 明 ら か に し た ．さ ら に ，乳 幼 児 お よ び 高 齢 者 を 対 象 と し た テ オ フ ィ リ ン
の 治 療 薬 物 モ ニ タ リ ン グ へ の 適 用 を 図 る た め に ，分 析 に 必 要 な 血 液 試 料 量 の
低減，簡易な前処理方法の設計について検討を行った．
-4-
第1章
電 解 還 元 に よ る ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC と 生 薬 へ の
混入監視の実践
1-1
緒言
1993 年 に ベ ル ギ ー で ，痩 身 療 法 の た め に 生 薬 製 剤 を 摂 取 し た 多 数 の 女 性 に
急 速 に 進 行 す る 腎 不 全 が 起 こ り ， こ の 疾 患 は Chinese herbs nephropathy と 報
告 さ れ た [27-29]． そ の 後 ， 処 方 さ れ た 生 薬 製 剤 の 分 析 に よ っ て ， 原 因 は 誤
用 さ れ た Radix Aristolochiae Fangchi に 含 ま れ る ア リ ス ト ロ キ ア 酸 で あ る と
報 告 さ れ た [30]．以 来 ，こ の 疾 患 は ア リ ス ト ロ キ ア 酸 腎 症 と 称 さ れ る よ う に
なった．
ア リ ス ト ロ キ ア 酸 は ，フ ェ ナ ン ト レ ン 骨 格 を 持 つ 芳 香 族 カ ル ボ ン 酸 で あ り ，
ウ マ ノ ス ズ ク サ 科 の 植 物 は ， Fig. 1-1 の ア リ ス ト ロ キ ア 酸 Ｉ （ AA1,
8-methoxy-6-nitro-phenanthro-(3,4-d)-1,3-dioxolo-5-carboxylic acid）， ア リ ス ト
ロ キ ア 酸 Ⅱ（ AA2, 6-nitro-phenanthro-(3,4-d)-1,3-dioxolo-5-carboxylic acid）な
ど を 含 有 す る [31,32]． こ れ ら は ， 腎 毒 性 ， 発 が ん 性 ， 変 異 原 性 を 有 す る こ
と が 知 ら れ て い る [33-35]．
動 物 実 験 で は ， 100 mg/kg ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 単 回 経 口 投 与 で 近 位 尿 細 管
壊 死 が [33]， 10 mg/kg ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 35 日 間 （ 週 5 日 ） 皮 下 投 与 で ，
近 位 尿 細 管 の 萎 縮 と 間 質 性 線 維 症 が 惹 起 し た と 報 告 さ れ て い る [36]．ア リ ス
ト ロ キ ア 酸 の LD 50 は ，Wistar 系 ラ ッ ト に お い て 56～ 203 mg/kg（ 経 口 ）で あ
り [37]， そ の 標 的 臓 器 は 腎 臓 と 報 告 さ れ て い る [38]． 実 際 ， 問 題 の 生 薬 製
剤 中 に は ， 0.65±0.56 mg/g の ア リ ス ト ロ キ ア 酸 が 含 有 さ れ て い た [30]．
日本でもアリストロキア酸を含む漢方薬の使用による被害が報告されて
い る ．各 国 で は ，ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 含 む 生 薬 ，生 薬 製 剤 の 流 通 を 禁 止 す る
た め に 厳 し い 規 制 を 設 け て い る が ，渡 航 先 で の 購 入 や イ ン タ ー ネ ッ ト 販 売 に
よ る 個 人 輸 入 な ど が 要 因 と な り ，現 在 で も ア リ ス ト ロ キ ア 酸 腎 症 の 患 者 が 報
告 さ れ て い る [29,39,40]．
Fig. 1-1
Structures of aristolochic acids I (AA1) and II (AA2) .
-5-
ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 含 有 に 注 意 を 要 す る 生 薬 ，中 医 薬 の 名 称 お よ び そ の 基
原 植 物 と 使 用 部 位 を Table 1-1 に 挙 げ た ．本 来 ，ボ ウ イ は 日 本 薬 局 方（ 日 局 ）
に記載の通りオオツヅラフジ
Sinomenium acutum Rehder et Wilson
（ Menispermaceae）の つ る 性 の 茎 お よ び 根 茎 を ，通 例 ，横 切 し た も の で あ る ．
こ の 基 原 植 物 は ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 含 有 し な い ．し か し ，ボ ウ イ（ 防 已 ）と
記 載 さ れ て い て も ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 含 有 す る ボ ウ キ（ 防 己 ）が 用 い ら れ る
こ と が あ る ．名 称 が 類 似 し た 生 薬 で 粉 防 己（ 基 原 植 物 は ツ ヅ ラ フ ジ 科 の シ マ
ハ ス ノ ハ カ ズ ラ Stephania tetrandra S. Moore） が あ る ． こ れ に は ア リ ス ト ロ
キ ア 酸 は 含 有 さ れ な い が ，海 外 で 防 己 と 取 り 違 え た た め に 多 数 の 腎 障 害 の 患
者 が 発 生 し た ．現 在 ，日 局 で は ボ ウ イ は 防 已 と 表 記 さ れ て い る が ，中 国 の 薬
典 で は 防 己 と 表 記 さ れ る ．已 あ る い は 己 ，両 国 の 漢 字 表 記 に お い て わ ず か な
違 い し か な い た め 注 意 を 要 す る [41,42]．
日局に定められた基原植物およびその部位を生薬として使用していれば
ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 混 入 の 可 能 性 は ほ と ん ど な い が ，国 に よ っ て は 異 な る 植
物 を 類 似 し た 生 薬 名 で 呼 称 す る 場 合 も あ り ，ま た ，諸 外 国 に お い て は 日 局 に
適 合 し な い 製 品 が 流 通 し て い る こ と か ら ，生 薬 ，漢 方 薬 の 使 用 に 当 た っ て は ，
ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 含 む 植 物 が 混 入 し な い よ う に 原 料 の 確 認 等 に 留 意 し ，監
視 を 行 う 必 要 が あ る ． こ の 経 緯 で ， 日 局 14 改 正 第 1 追 補 以 降 ， 日 局 サ イ シ
ン の 使 用 部 位 は ，ウ ス バ サ イ シ ン ま た は ケ イ リ ン サ イ シ ン の 根 お よ び 根 茎 で
あり，アリストロキア酸を含む地上部が使用部位より削除された．さらに，
純 度 試 験 に AA1 の 分 析 法 が 定 め ら れ た ．
ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 定 量 に は ， 従 来 ， HPLC-UV [43] ， LC-MS [44-46] ，
HPLC-FL [47] が 利 用 さ れ て い る ． 日 局 で は HPLC-UV を 利 用 し て AA1 の 分
析 を 行 っ て い る が ， HPLC-UV は 特 異 性 に 乏 し い た め ， ア リ ス ト ロ キ ア 酸 に
対 応 す る 保 持 時 間 に ピ ー ク が 認 め ら れ た 場 合 ，条 件 を 変 更 し て 再 度 分 析 し て
こ の ピ ー ク が ア リ ス ト ロ キ ア 酸 で あ る か を 確 認 す る 必 要 が あ る [48]．英 国 や
米 国 の よ う に ，今 後 ，製 剤 を 対 象 に し た 規 制 が 導 入 さ れ る 場 合 ，基 原 植 物 や
生薬に比べて分析対象のアリストロキア酸含量が低値になることが予想さ
れ る ．従 っ て ，よ り 厳 重 な ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 混 入 監 視 を 実 践 し ，ア リ ス ト
ロ キ ア 酸 腎 症 の 発 症 を 防 止 す る た め に は ，感 度 と 特 異 性 に 優 れ た 分 析 法 が 要
求される．
本 研 究 で は ，ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 構 造 中 の ニ ト ロ 基 に 着 目 し ，こ れ を 利 用
し た ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 高 感 度 か つ 特 異 的 な HPLC-ECD の 構 築 を 試 み た ．
ニトロ基は，電解還元によってヒロドキシルアミンへ還元されることから，
ニ ト ロ 基 を 有 す る 化 学 物 質 を 分 析 す る 電 流 計 測 型 の 電 気 化 学 分 析 法 は ，多 く
報 告 さ れ て い る [49-54]．特 に ，2,4-dinitrofluorobenzene な ど の 誘 導 体 化 試 薬
-6-
- 7 -
Aristolochic
acids *
J apanese
Name
Part
(Chinese)
Caulis Akebiae
木通
Akebia quinata Decaisne
Stem
－
(Mu tong)
関木通
Aristolochia manshuriensis Kom
Stem
＋
(Guan mu tong)
Radix Aucklandiae
木香
Saussurea lappa Clarke
Root
－
(Mu xiang)
青木香
Aristolochia debilis Sieb. et Zucc
Root
＋
(Qing mu xiang)
Radix Stephaniae Tetrandrae 防 已
Sinomenium
acutum
Rehder
et Stem,
－
(Fang ji)
Wilson
Rhizome
Radix Aristolochiae Fangchi 広 防 己
Aristolochia fangchi Y.C. Wu
Root
＋
(Guang fang ji)
Radix et Rhizoma Asari
細辛
Asiasarum sieboldii F. Maekawa
Root,
－ **
(Xinxin)
Rhizome
* － , Aristolochi c acid s are not contained in the herbal medicine. ＋ , Aristolochic acid s are cont ai ned in the
herbal medicine.
** Aristolochic acid s are cont ained in aerial part of Asiasarum sieboldii F. Maekawa.
Name
Ori gin
List of herbal m edicines studied and their relat ed medicines.
Herbal medi cine
Table 1-1
[24,55-57] は プ レ カ ラ ム あ る い は ポ ス ト カ ラ ム 方 式 の HPLC に 利 用 さ れ ，ppb
レ ベ ル の ア ミ ノ 酸 の 高 感 度 分 析 に 応 用 さ れ て い る [57]．従 っ て ，ア リ ス ト ロ
キ ア 酸 の 構 造 中 の ニ ト ロ 基 の 電 解 還 元 を 利 用 す れ ば ，感 度 と 特 異 性 に 優 れ た
ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 検 出 が 可 能 で あ り ，す で に ，Sun ら は ，グ ラ フ ァ イ ト 電
極を作用電極としたボルタンメトリーによってアリストロキア酸を検出で
き る こ と を 示 し た [41]． 電 気 化 学 検 出 の 電 解 反 応 と し て ， Fig. 1-2 の よ う な
ニ ト ロ 基 の 還 元 反 応 が 想 定 さ れ る ． し か し な が ら ， Sun ら は AA1 と AA2 の
分 離 定 量 に は 至 っ て お ら ず [41]，AA1 と AA2 の HPLC-ECD を 用 い た 分 析 事
例は，報告されていない．アリストロキア酸の混入監視を目的とする場合，
AA1 と AA2 の 分 離 定 量 を 行 う 必 要 が あ り ， ま た 移 動 相 組 成 は 電 気 化 学 検 出
の支持電解質溶液を兼ねるので，適切な分離系の構築と電解条件の設定が
AA1 と AA2 の 高 感 度 分 離 定 量 を 左 右 す る ．
そ こ で ，本 研 究 で は ，ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 電 解 還 元 を 利 用 し ，ア リ ス ト ロ
キ ア 酸 を 高 感 度 か つ 特 異 的 に 検 出 で き る HPLC-ECD を 構 築 し ， こ れ を 生 薬
へのアリストロキア酸の混入監視へ応用することとした．
Fig. 1-2
1-2
1-2-1
Proposed electrochemical reduction of aristolochic acid II (AA2).
実験材料と実験方法
ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC
ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 電 解 還 元 に 基 づ く HPLC-ECD と し て Fig. 1-3 に 示 す シ
ス テ ム を 構 築 し た ． デ ガ ッ サ ー （ LC-26A, BAS 製 ）， ポ ン プ （ 301M, フ ロ ム
製 ）， サ ン プ ル イ ン ジ ェ ク タ ー （ 7125, レ オ ダ イ ン 製 ）， マ イ ク ロ ボ ア カ ラ ム
（ Capcell Pak C18 UG120, 150 mm x 1.0 mm i.d., 3 m, 資 生 堂 製 ）， カ ラ ム オ
-8-
ー ブ ン （ FT-1, BAS 製 ）， 電 気 化 学 検 出 器 （ LC-4C, BAS 製 ） を 用 い て 構 築 し
た ．フ ロ ー 型 電 解 セ ル（ ラ ジ ア ル フ ロ ー セ ル ，BAS 製 ）の 作 用 電 極 は グ ラ ッ
シ ー カ ー ボ ン（ 円 盤 型：直 径 6 mm），参 照 電 極 は Ag/AgCl，対 極 は ス テ ン レ
ス を 用 い ，作 用 電 極 表 面 に お い て 電 極 還 元 反 応 で 生 じ る 還 元 電 流 を 電 気 化 学
検 出 器 に よ り 測 定 し ，ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 特 異 的 な 検 出 方 法 と し て 構 築 し た ．
移 動 相 は ， メ タ ノ ー ル -水 -リ ン 酸 （ 65:35:0.5, v/v/v）， カ ラ ム 温 度 は 40℃ ，
流 速 は 25 L/min，試 料 注 入 量 は 5 L，印 加 電 位 は -0.7 V vs. Ag/AgCl に 設 定
した．
Fig. 1-3
Block diagram of the HPLC-ECD system.
MP, Mobile phase, methanol-water-phosphoric acid (65:35:0.5, v/v/v); DG,
degasser; P, pump; S, sample injector; column, microbore ODS column (Capcell
Pak UG-120, 150 x 1.0 mm i.d., 3 m); D, electrochemical detector,
electrochemical cell and potentiostat; R, recorder.
1-2-2
ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 吸 光 検 出 HPLC
日 局 16 改 正 の サ イ シ ン の 純 度 試 験（ AA1）に 準 拠 し た HPLC-UV は ，ポ ン
プ（ L-6000, 日 立 製 作 所 製 ），ODS カ ラ ム（ Mightysil ODS, 150×4.6 mm i.d., 3
m, 関 東 化 学 製 ）， UV 検 出 器 （ L-4000, 日 立 製 作 所 製 ） を 用 い て 構 築 し た ．
移 動 相 に は 50 mmol/L NaH 2 PO 4 水 溶 液 － ア セ ト ニ ト リ ル（ 11:9, v/v），流 速 は
1.0 mL/min，試 料 注 入 量 は 20 L，カ ラ ム 温 度 は 25℃ ，測 定 波 長 は 400 nm に
設定した．
1-2-3
生 薬 お よ び HPLC 用 検 液 の 調 製 方 法
実 試 料 と し て 中 国 産 の サ イ シ ン （ Radix et Rhizoma Asari）， ボ ウ キ （ Radix
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Aristolochiae Fangchi ）， モ ク ツ ウ （ Caulis Akebiae ）， モ ッ コ ウ （ Radix
Aucklandiae） を 用 い た ．
本 研 究 で は ，サ イ シ ン の 純 度 試 験（ AA1）に 準 拠 し て HPLC 用 の 検 液 を 調
製 す る こ と と し た ． 日 局 16 改 正 ・ サ イ シ ン の 純 度 試 験 （ AA1） の 方 法 を 以
下に記した．
「純度試験：アリストロキア酸Ⅰ
本 品 の 粉 末 2.0 g を 正 確 に 量 り ， 薄 め た
メ タ ノ ー ル （ 3→ 4） 50 mL を 加 え て 15 分 間 振 り 混 ぜ た 後 ， ろ 過 し ， ろ 液 を
試 料 溶 液 と す る ． 別 に 生 薬 純 度 試 験 用 ア リ ス ト ロ キ ア 酸 Ⅰ 1.0 mg を 正 確 に
量 り ， 薄 め た メ タ ノ ー ル （ 3→ 4） に 溶 か し ， 正 確 に 100 mL と す る ． こ の 液
1 mL を 正 確 に 量 り ， 薄 め た メ タ ノ ー ル （ 3→ 4） を 加 え て 正 確 に 25 mL と し
標 準 溶 液 と す る ．試 料 溶 液 お よ び 標 準 溶 液 20 L ず つ を 正 確 に と り ，次 の 条
件 で 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー <2.01>に よ り 試 験 を 行 う と き ，試 料 溶 液 に は 標
準 溶 液 の ア リ ス ト ロ キ ア 酸 Ⅰ に 対 応 す る 保 持 時 間 に ピ ー ク を 認 め な い ．」
生 薬 中 の ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 定 量 す る 場 合 ，内 標 準 法 が 有 用 と 考 え た ．そ
こ で ， 内 標 準 物 質 （ IS） と し て 3,5-di-tert-buty1-1,2-benzoquinone（ DBBQ）
を 用 い た 場 合 の HPLC 用 検 液 の 調 製 方 法 は ， 次 の 手 順 を 実 施 し た ．
各々の生薬原料は，鋏で切断生薬にした後にミルを用いて生薬末とした．
各 生 薬 末 0.4 g を 精 密 に 量 り ， DBBQ（ IS） を 含 む 75vol%の メ タ ノ ー ル 溶 液
10 mL を 加 え て 15 分 間 振 り 混 ぜ ，試 料 溶 液 と し た ．試 料 溶 液 は ，孔 径 0.45 m
の メ ン ブ レ ン フ ィ ル タ ー （ 13A， ク ラ ボ ウ 製 ） で ろ 過 を し て 検 液 と し た ． マ
イ ク ロ シ リ ン ジ を 用 い て 検 液 5 L を HPLC に 注 入 し ， ク ロ マ ト グ ラ ム を 測
定 し た ． 試 料 溶 液 は ， 必 要 に 応 じ て DBBQ を 含 む メ タ ノ ー ル - 水 - リ ン 酸
（ 65:35:0.5, v/v/v） 混 液 で 適 宜 希 釈 し た ．
1-3
1-3-1
実験結果
ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC 条 件 の 最 適 化
HPLC-ECD の 測 定 条 件 に お い て ， AA1 と AA2 を 特 異 的 か つ 高 感 度 に 検 出
できる印加電位を選定するためにハイドロダイナミックボルタモグラムを
測 定 し た ． 5.0 g/mL の AA1 と AA2 の 標 準 溶 液 を HPLC-ECD に 注 入 し ， 各
電 位 に お け る ク ロ マ ト グ ラ ム を 測 定 し ，得 ら れ た AA1 と AA2 の ピ ー ク 高 さ
を 印 加 電 位 に 対 し て プ ロ ッ ト し た ． Fig. 1-4 の ハ イ ド ロ ダ イ ナ ミ ッ ク ボ ル タ
モ グ ラ ム が 示 す よ う に ，-0.3 V vs. Ag/AgCl よ り 負 電 位 を 印 加 す る と ク ロ マ ト
グ ラ ム 上 に AA1 と AA2 の ピ ー ク が 観 察 さ れ た ．印 加 電 位 を -0.6 V vs. Ag/AgCl
よ り 負 電 位 に 設 定 す る と AA1 の ピ ー ク 高 さ は 大 き く 変 化 し な か っ た が ，AA2
- 10 -
のピーク高さは増加した．しかし，ベースラインノイズレベルも増加した．
よ っ て ，シ グ ナ ル ／ ノ イ ズ 比（ S/N 比 ）が 最 も 良 好 で あ っ た -0.7 V vs. Ag/AgCl
を 印 加 電 位 に 決 定 し た ．p-ニ ト ロ フ ェ ノ ー ル の 電 極 還 元 反 応 の メ カ ニ ズ ム を
考 慮 す る と ， -0.7 V vs. Ag/AgCl 付 近 で は ， 4 電 子 ・ 4 プ ロ ト ン が 関 与 す る 電
極 反 応 （ Fig. 1-2） が 進 行 し た と 考 え ら れ た ．
つ ぎ に ， AA1 と AA2 を 良 好 に 分 離 す る た め に ， 移 動 相 中 の メ タ ノ ー ル と
水 の 組 成 比 お よ び 流 速 を 検 討 し た ．HPLC の 分 離 モ ー ド は ，ODS カ ラ ム を 用
い た 逆 相 分 配 で あ る の で ，移 動 相 中 の メ タ ノ ー ル の 割 合 を 大 き く す る と AA1
と AA2 の 保 持 時 間 が 短 く な り ， 各 々 の ピ ー ク が 近 接 し た ． ま た ， 流 速 を 速
く し た 場 合 も AA1 と AA2 の 保 持 時 間 が 短 く な り ，各 々 の ピ ー ク が 近 接 し た ．
AA1 と AA2 の ピ ー ク の 分 離 と 測 定 時 間 を 考 慮 し た 結 果 ， 移 動 相 は メ タ ノ ー
ル -水 -リ ン 酸 （ 65:35:0.5, v/v/v）， 流 速 は 25 L/min を 選 定 し た ． ま た ， カ ラ
ム 温 度 は 40℃ に 設 定 し た ．
Fig. 1-4
Hydrodynamic voltammograms of aristolochic acids I and II.
HPLC conditions used were: column, microbore ODS column (Capcell Pak
UG-120, 150 x 1.0 mm i.d., 3 m); column temperature, 40℃ ; mobile phase,
methanol-water-phosphoric acid (65:35:0.5, v/v/v); flow rate, 25 L/min.
A
standard mixture (5 L) of aristolochic acids I (AA1) and II (AA2) was injected
into HPLC-ECD at each concentration of 5.0 g/mL.
- 11 -
1-3-2
ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC の 分 析 能 パ ラ メ ー タ
最 適 化 し た HPLC 条 件 下 に お い て ，10.0 g/mL の AA1 と AA2 の 標 準 溶 液
を HPLC-ECD に 注 入 し ，ク ロ マ ト グ ラ ム を 測 定 し た ．Fig. 1-5 に 示 す よ う に
ク ロ マ ト グ ラ ム 上 に は ，AA2, AA1, DBBQ（ IS）の ピ ー ク が ，そ れ ぞ れ 10.6, 13.8,
20.2 min に 観 察 さ れ た ．AA2 と AA1 の ピ ー ク の 分 離 度 は 3.6，AA1 と DBBQ
の ピ ー ク の 分 離 度 は 5.9 で あ り ，各 成 分 由 来 の ピ ー ク を 明 瞭 に 分 離 す る こ と
ができた．
Table 1-2 に は ，本 法 の 分 析 能 パ ラ メ ー タ と し て ，範 囲 ，直 線 性 ，併 行 精 度 ，
検 出 限 界 ， 定 量 限 界 を 示 し た ． AA1 と AA2 の ピ ー ク 高 さ は ， 10 ng/mL～ 50
g/mL の 範 囲 で 相 関 係 数 （ r） 0.997 以 上 の 良 い 直 線 性 を 示 し ， AA1 と AA2
の 検 出 限 界（ S/N = 3）は ，そ れ ぞ れ 3.4 ng/mL（ 17 pg on column）, 3.1 ng/mL
（ 16 pg on column）， で あ っ た ． 5.0 g/mL の AA1 と AA2 の 標 準 溶 液 に つ き
6 回 の 繰 り 返 し 測 定 を 行 っ た と こ ろ ，ピ ー ク 高 さ の RSD（ n = 6）は ，そ れ ぞ
れ 2.2%, 2.3%で あ っ た ．
Fig. 1-5
Chromatograms of standard solution of AA1 and AA2 obtained by
HPLC-ECD.
HPLC conditions used were: column, microbore ODS column (Capcell Pak
UG-120, 150 x 1.0 mm i.d., 3 m); column temperature, 40℃ ; mobile phase,
methanol-water-phosphoric acid (65:35:0.5, v/v/v); flow rate, 25 L/min.
Peaks: AA2, aristolochic acid II; AA1, aristolochic acid I; IS, DBBQ as an internal
standard. A standard mixture (5 L) of AA1 and AA2 was injected into
HPLC-ECD at each concentration of 10 g/mL.
- 12 -
Table 1-2.
Validation characteristics of the present HPLC -ECD for determining
AA1 and AA2.
Analyte
Range
(g/mL)
Linearity
(r )
Repeatability
(% RSD, n = 6)
Quantification
limit
(ng/mL)
Detection
limit
(ng/mL)
AA1
AA2
0.01 - 50
0.01 - 50
0.997
0.999
2.2
2.3
10
10
3.4
3.1
1-3-3
ボウキ中のアリストロキア酸定量
ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 含 有 す る ボ ウ キ を 試 料 と し ，本 法 の 生 薬 分 析 に お け る
有用性と実用性について明らかにすることとした．
第 1 章（ 1-2-3）の 手 順 に 従 っ て ボ ウ キ の HPLC 用 検 液 を 調 製 し ，そ の 5 L
を HPLC-ECD に 注 入 し た と こ ろ ， Fig. 1-6A の ク ロ マ ト グ ラ ム が 得 ら れ た ．
ク ロ マ ト グ ラ ム 上 に AA1 と AA2 の ピ ー ク が 観 察 さ れ ，各 々 の ピ ー ク は ，ク
ロ マ ト グ ラ ム 上 の 他 の Unknown ピ ー ク と 良 好 に 分 離 さ れ て い た ． DBBQ を
IS と し た 内 標 準 法 で ，ボ ウ キ 中 の AA1 と AA2 を 定 量 し た ．Table 1-3 に 示 し
た 定 量 結 果 の 通 り ， ボ ウ キ 中 に は AA1 が 591.6 g/g， AA2 が 1412.2 g/g 含
有 さ れ て い た ．繰 り 返 し 測 定 を 行 っ て 室 内 再 現 精 度（ n = 5）を 評 価 し た と こ
ろ ， RSD は 2.5%以 下 で あ り ， 添 加 回 収 試 験 （ n = 5） を 行 っ て 回 収 率 を 求 め
た と こ ろ ， 98.7%以 上 で あ り ， そ の RSD は 2.0%以 下 と 良 好 な 結 果 を 得 た ．
さ ら に ，ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の HPLC-ECD の 特 異 性 に つ い て ，日 局 16 改 正
の サ イ シ ン の 純 度 試 験 （ AA1） に 準 拠 し た HPLC-UV と の 対 比 に よ っ て 評 価
し た ． ボ ウ キ の HPLC 用 検 液 を HPLC-UV に 注 入 し て 得 た ク ロ マ ト グ ラ ム を
Fig. 1-6B に 示 し た ．Fig. 1-6A の ク ロ マ ト グ ラ ム と 比 較 し て ，AA1 と AA2 の
ピ ー ク の 近 傍 に 多 く の Unknown ピ ー ク が 観 察 さ れ た ． HPLC-ECD の 方 が ，
AA1 と AA2 の 特 異 的 な 検 出 に 有 利 で あ る こ と が 分 か っ た ．
HPLC-UV に よ る AA1 と AA2 の 定 量 結 果 は ， AA1 が 602.6 g/g， AA2 が
1384 g/g で あ っ た ．HPLC-ECD と HPLC-UV の 両 法 よ り 得 た 定 量 結 果 は ，互
い に よ く 一 致 し て い た ．繰 り 返 し 測 定 を 行 っ て 室 内 再 現 精 度（ n = 5）を 評 価
し た と こ ろ ， RSD は 3.0%以 下 で あ り ， 添 加 回 収 試 験 （ n = 5） を 行 っ て 回 収
率 を 求 め た と こ ろ ， 97.7%以 上 で あ り ， そ の RSD は 3.9%以 下 と 良 好 な 結 果
を 得 た ．室 内 再 現 精 度 は HPLC-ECD の 方 が ，HPLC-UV に 比 べ て 優 れ て い た ．
以 上 の 結 果 よ り ，HPLC-ECD は 真 度 と 精 度 に 優 れ ，生 薬 分 析 に 適 用 で き る
ことが示された．
- 13 -
Fig. 1-6
Chromatograms of Radix Aristolochiae Fangchi obtained by (A)
HPLC-ECD and (B) HPLC-UV in the Japanese Pharmacopoeia.
Peaks: AA2, aristolochic acid II; AA1, aristolochic acid I; IS, DBBQ as an internal
standard.
(A) HPLC-ECD conditions were as in Fig. 1-5.
(B) HPLC-UV
conditions used were: column, ODS column (Mightysil ODS, 150 ×4.6 mm i.d., 3
m） ; column temperature, 25℃ ; mobile phase, 50 mmol/L NaH 2 PO 4 -acetonitrile
(11:9, v/v); flow rate, 1.0 mL/min.
Test solution of Radix Aristolochiae
Fangchi (20 L) was injected into HPLC-UV.
Table 1-3
Contents of aristolochic acids I (AA1) and II (AA2) in Radix
Aristolochiae Fangchi studied and recovered from these herbal medicines spiked
with AA1 and AA2 standards.
Content (n = 5)
Method
HPLC-ECD
HPLC-UV
Analyte
Amount
(g/g)
RSD
(%)
Recovery (n = 5)
Added
amount
(g/g)
Recovery
(%)
RSD
(%)
AA1
591.6
2.5
600
98.7
2.0
AA2
1412.2
2.1
1500
99.1
2.0
AA1
602.6
2.7
600
97.7
3.5
AA2
1384.2
3.0
1400
100.3
3.9
- 14 -
1-3-4
1-3-4-1
アリストロキア酸含有に注意を要する生薬への混入監視の実践
サイシンへのアリストロキア酸の混入監視
日 局 サ イ シ ン （ 細 辛 ） は ， ウ ス バ サ イ シ ン Asiasarum sieboldii F. Maekawa
またはケイリンサイシン
Asiasarum heterotropoides F. Maekawa var.
mandshuricum F. Maekawa（ Aristolochiaceae）の 根 お よ び 根 茎 で あ り ，こ れ に
は ア リ ス ト ロ キ ア 酸 は 含 有 さ れ な い ．し か し ，中 国 な ど で は ，ア リ ス ト ロ キ
ア酸を含有する可能性のある地上部を含めた全草が生薬として流通してい
る [42]．実 試 料 の 中 国 産 サ イ シ ン に お い て ア リ ス ト ロ キ ア 酸 含 有 の 有 無 の 確
認に本法が適用可能か検討した．
第 1 章（ 1-2-3）の 手 順 に 従 っ て サ イ シ ン の HPLC 用 検 液 を 調 製 し ，そ の 5
L を HPLC-ECD に 注 入 し て ク ロ マ ト グ ラ ム を 測 定 し た ． 得 ら れ た ク ロ マ ト
グ ラ ム を Fig. 1-7A に 示 し た ． ク ロ マ ト グ ラ ム 上 に AA1 と AA2 の ピ ー ク が
観 察 さ れ た ．本 法 を サ イ シ ン 中 の AA1 と AA2 の 定 量 へ 応 用 し ，そ の 結 果 を
Table 1-4 に 示 し た ． サ イ シ ン 中 に は AA1 が 22.3 g/g， AA2 が 22.4 g/g 含
有 さ れ て い た ．繰 り 返 し 測 定 を 行 っ て 室 内 再 現 精 度（ n = 5）を 評 価 し た と こ
ろ ， RSD は 2.4%以 下 で あ り ， 添 加 回 収 試 験 （ n = 5） を 行 っ て 回 収 率 を 求 め
た と こ ろ ， 98.3%以 上 で あ り ， そ の RSD は 1.9%以 下 と 良 好 な 結 果 を 得 た ．
Fig. 1-7
Chromatograms of (A) Radix et Rhizoma Asari, (B) Caulis Akebiae,
and (C) Radix Aucklandiae obtained by HPLC-ECD.
HPLC-ECD conditions were as in Fig. 1-5.
Peaks: AA2, aristolochic acid II;
AA1, aristolochic acid I; IS, DBBQ as an internal standard.
- 15 -
Table 1-4
Contents of aristolochic acids I (AA1) and II (AA2) in Radix et
Rhizoma Asari studied and recovered from these herbal medicines spiked with
AA1 and AA2 standards.
Content (n = 5)
Analyte
Recovery (n = 5)
Amount
(g/g)
RSD
(%)
Added amount
(g/g)
Recovery
(%)
RSD
(%)
AA1
22.3
2.0
25
99.5
1.8
AA2
22.4
2.4
25
98.3
1.9
1-3-4-2
モクツウへのアリストロキア酸の混入監視
日 局 モ ク ツ ウ（ 木 通 ）は ，ア ケ ビ Akebia quinata Decaisne ま た は ミ ツ バ ア
ケ ビ Akebia trifoliata Koidzumi（ Lardizabalaceae）の つ る 性 の 茎 を ，横 切 り し
た も の で あ り ，こ の 基 原 植 物 は ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 含 有 し な い ．し か し ，中
国 で は ，木 通 と 記 載 さ れ て い て も 関 木 通 あ る い は 淮 木 通 が 用 い ら れ る こ と が
あ る ． 関 木 通 の 基 原 植 物 は キ ダ チ ウ マ ノ ス ズ ク サ Aristolochia manshuriensis
Kom ， 淮 木 通 の 基 原 植 物 は オ オ バ ウ マ ノ ス ズ ク サ Aristolochia kaempferi
Willd.で あ り ， こ れ ら は ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 含 有 す る [42]．
実試料の中国産モクツウにおいてアリストロキア酸含有の有無の確認に
本 法 が 適 用 可 能 か 検 討 し た ． モ ク ツ ウ の HPLC 用 検 液 を HPLC-ECD に 注 入
し ， 得 ら れ た ク ロ マ ト グ ラ ム を Fig. 1-7B に 示 し た ． ク ロ マ ト グ ラ ム 上 に は
AA1 と AA2 の ピ ー ク は 観 察 さ れ な か っ た ．
1-3-4-3
モッコウへのアリストロキア酸の混入監視
日 局 モ ッ コ ウ は ， Saussurea lappa Clarke（ Compositae） の 根 で あ り ， こ の
基 原 植 物 は ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 含 有 し な い が ，中 国 な ど で は ア リ ス ト ロ キ ア
酸 を 含 有 す る 青 木 香 （ ウ マ ノ ス ズ ク サ Aristolochia debilis Sieb. et Zucc.） が
木 香 と し て 用 い ら れ る こ と が あ る [42]．
実試料の中国産モッコウにおいてアリストロキア酸含有の有無の確認に
本 法 が 適 用 可 能 か 検 討 し た ． モ ッ コ ウ の HPLC 用 検 液 を HPLC-ECD に 注 入
し ， 得 ら れ た ク ロ マ ト グ ラ ム を Fig. 1-7C に 示 し た ． ク ロ マ ト グ ラ ム 上 に は
AA1 と AA2 の ピ ー ク は 観 察 さ れ な か っ た ．
- 16 -
1-4
考察
電 解 還 元 に よ っ て ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 検 出 す る 電 気 化 学 検 出 HPLC の 感 度
を 評 価 す る た め に ，本 法 と 既 報 の ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の HPLC お よ び キ ャ ピ ラ
リ ー 電 気 泳 動 （ CE ） [43-47,58] に つ い て 検 出 限 界 を 指 標 に し て 対 比 し た
（ Table 1-5）． 本 法 は ， LC-MS/MS を 除 く 既 報 の 分 析 法 に 比 べ て 高 感 度 で あ
ることが分かった．
今 回 ， マ イ ク ロ ボ ア カ ラ ム を 使 用 し た ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の HPLC-UV お よ
び HPLC-FL の 報 告 が な い た め ，内 径 4.6 mm の コ ン ベ ン シ ョ ナ ル カ ラ ム を 使
用 し た HPLC-UV お よ び HPLC-FL を Table 1-5 に 挙 げ て 対 比 し た ． 一 般 に ，
HPLC-UV お よ び HPLC-FL に お い て コ ン ベ ン シ ョ ナ ル カ ラ ム（ 内 径 3.0～ 6.0
mm）か ら マ イ ク ロ ボ ア カ ラ ム（ 内 径 1.0～ 2.1 mm）へ 替 え る 場 合 ，カ ラ ム に
対 す る 試 料 負 荷 量 を 低 減 す る た め に 試 料 注 入 量 を 低 減 す る 必 要 が あ る（ 例 え
ば ，20 L か ら 5 L へ 低 減 ）．こ れ に よ っ て HPLC-UV [59-61] お よ び HPLC-FL
[62-63] で は ，注 入 し た 物 質 量 換 算 の 検 出 限 界 を 約 10 倍 向 上 で き る [59]．仮
に ， 既 報 の HPLC-UV お よ び HPLC-FL に お い て 内 径 1.0 mm の マ イ ク ロ ボ ア
カ ラ ム を 使 用 し た 場 合 ， 上 述 の 理 由 か ら 検 出 限 界 は 約 10 倍 程 度 向 上 す る と
予 想 さ れ る ．従 っ て ，カ ラ ム 内 径 の ダ ウ ン サ イ ズ イ ン グ を 加 味 し た 場 合 ，本
法 の 検 出 感 度 は HPLC-UV よ り 優 れ ， HPLC-FL と は 同 程 度 と 予 想 さ れ る ．
HPLC-ECD を 用 い た 本 法 は ， LC-MS や LC-MS/MS と 同 等 の 感 度 を 確 保 で き
る こ と が 分 か っ た ． HPLC-ECD は ， LC-MS や LC-MS/MS と 比 べ て 装 置 お よ
び そ の 維 持 費 は 極 め て 安 価 で あ り ，分 析 装 置 自 体 の 小 型 化 も 容 易 で あ る こ と
から，装置導入において利点があると考えられる．
本 法 の 特 異 性 を 評 価 す る た め に ， 本 法 と 日 局 の 純 度 試 験 （ AA1 ） 用
HPLC-UV よ り 得 た ボ ウ キ の ク ロ マ ト グ ラ ム を 対 比 し た ． HPLC-UV に 比 べ ，
本法より得たクロマトグラム上のピークの数は顕著に少なかった．さらに，
AA1 と AA2 の ピ ー ク の 近 傍 に Unknown ピ ー ク は 観 察 さ れ な か っ た ．日 局 の
サ イ シ ン の 純 度 試 験 （ AA1） の 適 否 の 判 定 は ， 以 下 の よ う に 行 わ れ る ．
「アリストロキア酸Ⅰに対応する保持時間にピークを認めた場合は条件を
変 更 し て 分 析 し ，こ の ピ ー ク が ア リ ス ト ロ キ ア 酸 Ⅰ で な い こ と を 確 認 す る ．」
本 法 は ，電 解 還 元 に よ っ て ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 特 異 的 な 検 出 が 可 能 で あ る
こ と か ら ，適 否 の 判 定 に 要 す る 分 析 時 間 も 短 縮 で き ，グ リ ー ン ケ ミ ス ト リ ー
の観点からも多くの利点が見出せると考えられる．
- 17 -
Table 1-5
Method
Detection limit of AA1 by various methods.
Column
(size, length x inter diameter)
Injection
volume (L)
The
present ODS (150 mm x 1.0 mm)
HPLC-ECD
HPLC-UV
LC-MS
LC-MS
LC-MS/MS
ODS
ODS
ODS
ODS
(250 mm x 4.6 mm)
(250 mm x 4.6 mm)
(150 mm x 2.1 mm)
(50 mm x 2.1 mm)
Detection
limit
Ref.
5
17 pg
－
20
10
1
0.5
4.0 ng
1.1 ng
20 pg
5.0 pg
[43]
[44]
[45]
[46]
HPLC-FL
CE-ECD
ODS (250 mm x 4.6 mm)
20
220 pg
[47]
a
Fused silica uncoated capillary
－
13 ng/mL [58]
(400 mm x 25 m)
a Because the injection volume was not described in the literature, the detection
limit of AA1 was shown as unit of concentration.
アリストロキア酸の含有に注意を要する生薬への混入監視における本法
の 有 用 性 を 示 す た め に ，中 国 産 の サ イ シ ン ，モ ク ツ ウ ，モ ッ コ ウ を 用 い て 実
分 析 を 実 施 し た ．日 局 適 合 品 の サ イ シ ン な ら ば ，AA1 は 検 出 さ れ な い ．し か
し ，今 回 得 た ク ロ マ ト グ ラ ム 上 に は AA1 と AA2 の ピ ー ク が 観 察 さ れ た ．よ
っ て ，本 研 究 で 分 析 し た サ イ シ ン に は ，ウ ス バ サ イ シ ン ま た は ケ イ リ ン サ イ
シンの地上部が混入している可能性が高いことが示唆された．
モ ク ツ ウ と モ ッ コ ウ に つ い て は ， AA1 と AA2 の ピ ー ク が 観 察 さ れ な か っ
た ．そ こ で ，HPLC-ECD に お け る AA1 と AA2 の 検 出 限 度 値 に つ い て ，日 局
サ イ シ ン の 純 度 試 験 （ AA1） に 用 い る HPLC-UV の シ ス テ ム 適 合 性 試 験 （ 検
出 の 確 認 ）を 基 に し て 考 察 し た ．日 局 サ イ シ ン の 純 度 試 験（ AA1）に 用 い る
HPLC-UV の シ ス テ ム 適 合 性 試 験 （ 検 出 の 確 認 ） は 次 の よ う に 定 め ら れ ，
HPLC-UV に お け る AA1 の 検 出 限 界 に つ い て 試 験 す る ．
「システム適合性
検 出 の 確 認 ： 標 準 溶 液 1 mL を 正 確 に 量 り ， 薄 め た メ タ
ノ ー ル （ 3→ 4） を 加 え て 正 確 に 10 mL と す る ． こ の 液 20 L を 正 確 に と り ，
上記の条件で操作するとき，アリストロキア酸Ⅰのシグナル S とノイズ N
と の 比 （ S/N 比 ） は 3 以 上 で あ る （ 以 下 略 ）．」
本 試 験 で 用 い る 標 準 溶 液 中 の AA1 の 濃 度 は 400 ng/mL で あ る の で ， 純 度
試 験 で は AA1 の 検 出 限 界 が 40 ng/mL の HPLC-UV の 使 用 が 定 め ら れ て い る
こ と に な る ． 従 っ て ， 純 度 試 験 の 手 順 と AA1 の 検 出 限 界 を 考 慮 す る と 純 度
- 18 -
試 験（ AA1）で は ，サ イ シ ン 中 の AA1 が 1.0 g/g 以 下 で あ る こ と を 確 認 し て
いることとなる．この値は，次式より算出した．
HPLC-ECD の AA1 の 検 出 限 界 は 3.4 ng/mL で あ っ た ．従 っ て ，日 局 に 準 拠
し た AA1 の 純 度 試 験 を 実 施 し た 場 合 ， 生 薬 中 の AA1 含 量 が 85 ng/g 以 下 か
否 か が 確 認 可 能 で あ る ．ま た ，AA2 の 検 出 限 界 は 3.1 ng/mL で あ る の で ，生
薬 中 の AA2 含 量 が 78 ng/g 以 下 か 否 か が 確 認 可 能 で あ る ．従 っ て ，モ ク ツ ウ
お よ び モ ッ コ ウ 中 の AA1 含 量 は 85 ng/g 以 下 ， AA2 含 量 は 78 ng/g 以 下 で あ
る こ と が 分 か っ た ． こ れ ら の 検 出 限 度 値 は ， 日 局 の HPLC-UV と 比 較 し て 約
10 倍 高 感 度 で あ り ，従 来 の 純 度 試 験（ AA1）と 比 較 し て ，よ り 厳 重 な 混 入 監
視が可能であると考えられる．
1-5
小括
本 章 で は ， 電 解 還 元 に 基 づ く HPLC-ECD を 用 い た ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 定
量法を開発し，本法を中国産の生薬を試料とした実分析へ応用することで，
アリストロキア酸の混入の監視に適用できることを明らかにした．
本 法 は ， 既 に 報 告 さ れ て い る ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の HPLC-UV [43], LC-MS
[44,45], HPLC-FL [47]に 比 べ て 高 感 度 で あ り ， ま た ， ボ ウ キ と サ イ シ ン 中 の
AA1 と AA2 の 定 量 分 析 に お い て 真 度 と 精 度 に 優 れ る こ と を 示 し た ．さ ら に ，
本 法 は ， 日 局 の 純 度 試 験 用 HPLC-UV に 比 べ ， ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の 特 異 的 な
検出に有利であることを示した．
本 法 の AA1 の 検 出 限 界 は 3.4 ng/mL，AA2 の 検 出 限 界 は 3.1 ng/mL で あ り ，
日 局 の HPLC-UV と 比 較 し て 高 感 度 で あ っ た ． 従 来 の 純 度 試 験 （ AA1） と 比
較して，より厳重な混入監視が可能であることが分かった．
本 法 は ，電 解 還 元 に よ っ て ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 高 感 度 ，特 異 的 ，高 精 度 に
定 量 で き る の で ，基 原 植 物 や 生 薬 に 比 べ て ア リ ス ト ロ キ ア 酸 含 量 が 低 値 に な
る こ と が 予 想 さ れ る 漢 方 製 剤 ，生 薬 製 剤 ，サ プ リ メ ン ト ，健 康 食 品 等 に 対 す
る AA1 と AA2 の 混 入 監 視 に も 適 用 可 能 と 考 え ら れ る ．
- 19 -
第2章
キ ノ ン の 還 元 前 置 波 に よ る バ ル プ ロ 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC と 血 中
の薬物動態分析への応用
2-1
緒言
我 が 国 で は バ ル プ ロ 酸 （ VPA, valproic acid,
Fig. 2-1） は ， 各 種 て ん か ん （ 小 発 作 ， 焦 点 発
作，精神運動発作，混合発作）および躁病，
躁うつ病における躁状態の治療などの精神科
薬 物 療 法 に 幅 広 く 用 い ら れ る [64]． FDA で は ，
Fig. 2-1
Structure of valproic acid.
単 純 欠 神 発 作 ，複 雑 欠 神 発 作 ，双 極 性 障 害 Ⅰ 型（ BP-I）
（ 躁 状 態 ，成 人 の み ），
片 頭 痛 の 予 防 （ 成 人 の み ）， 双 極 性 障 害 Ⅱ 型 （ BP-II） お よ び 特 定 不 能 の 双 極
性 障 害 （ BP-NOS） に お け る 急 性 期 の 治 療 に 使 用 さ れ ， 成 人 ， 小 児 科 と も に
BP-I, BP-II お よ び BP-NOS の 維 持 期 に も 使 用 さ れ る [65]． VPA に よ る 治 療
中 は ， 視 床 下 部 の 機 能 低 下 [66]， 肝 臓 で の イ ン ス リ ン 代 謝 の 阻 害 [67]， 膵
β 細 胞 の イ ン ス リ ン 分 泌 機 能 不 全 [68,69]，ま た 血 中 遊 離 脂 肪 酸（ FFA）の 上
昇 [70-72] が 生 じ る こ と が 報 告 さ れ て い る ．ま た ，VPA に 起 因 す る と 考 え ら
れ て い る 体 重 増 加 お よ び 血 中 イ ン ス リ ン の 上 昇 が 起 こ る こ と か ら ，VPA を 用
い る 薬 物 療 法 は ，代 謝 お よ び 内 分 泌 障 害 を 伴 い ，肥 満 に な り や す い 傾 向 が あ
る [73-76]．
VPA の 副 作 用 の 機 序 ，代 謝 に つ い て は 様 々 な 報 告 が あ り ，見 解 が 異 な る 場
合 が あ る ． 例 え ば ， 糖 摂 取 時 の 血 中 VPA 濃 度 は 空 腹 時 VPA 濃 度 よ り 低 下 す
る と い う 報 告 [77] と ， 血 中 濃 度 は 食 事 に よ り 影 響 を 受 け な い と い う 報 告 が
あ る [78]． 代 謝 に つ い て も 同 様 で あ る ． VPA は い わ ゆ る 分 岐 脂 肪 酸 で あ る
の で ，β 酸 化 を 受 け て 代 謝 さ れ る ．そ の 際 ，血 中 FFA の β 酸 化 を 阻 害 す る と
い う 報 告 [79-81] と こ れ と は 逆 に 促 進 す る と い う 報 告 が あ る [82]． し か し ，
糖 尿 病 患 者 に お け る VPA と FFA の 相 互 作 用 に 関 す る 報 告 は な い ．
こ れ ら の 報 告 を 考 慮 す る と ，VPA を 用 い る 薬 物 療 法 は ，糖 脂 質 代 謝 に 直 接
的 な 影 響 を 及 ぼ す 可 能 性 が あ る ．従 っ て ，VPA と 糖 脂 質 代 謝 の 相 互 作 用 に つ
い て の 見 解 を 明 確 に す る た め に は ，血 中 VPA，FFA に 対 し て ，同 時 か つ 詳 細
な体内動態が把握できる分析法が必要である．
血 中 VPA 測 定 の 従 来 法 と し て ，HPLC-UV [83]，HPLC-FL [84]， LC-MS [85]，
ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー（ GC）[86,87] が あ る ．し か し ，VPA は 吸 光 特 性 を
持 た な い た め HPLC-UV お よ び HPLC-FL で 高 感 度 検 出 を す る た め に は プ レ カ
ラ ム あ る い は ポ ス ト カ ラ ム 方 式 の 誘 導 体 化 操 作 が 必 要 で あ る ．ま た ，VPA は
揮 発 し に く い た め GC-FID に よ る 分 析 で は ，ト リ メ チ ル シ リ ル 化 剤 を 用 い た
誘 導 体 化 を 行 い ， VPA を メ チ ル エ ス テ ル 体 に し て か ら 分 析 す る 必 要 が あ る ．
- 20 -
さ ら に ，血 液 な ど の 生 体 試 料 分 析 の 際 に は ，分 析 装 置 の 汚 染 を 防 ぐ た め に 充
分 な ク リ ー ン ア ッ プ を 行 う 必 要 が あ り ，試 料 の 前 処 理 操 作 が 煩 雑 に な る 場 合
が多い．
電 気 化 学 検 出 法 の 測 定 対 象 は 酸 化 還 元 物 質 で あ り ，分 岐 脂 肪 酸 で あ る VPA
は ，電 極 不 活 性 物 質 で あ る ．従 っ て ，VPA を 直 接 酸 化 ま た は 還 元 し て 電 気 化
学 検 出 す る こ と は 困 難 で あ る ． 一 方 ， カ ル ボ ン 酸 の HPLC-ECD と し て ， 電
極活性部位を有する誘導体化試薬を用いてプレカラム誘導体化の後に検出
す る 方 法 [88,89] や パ ル ス ド ア ン ペ ロ メ ト リ ー 検 出 に よ る 方 法 [90] な ど が
あ る が ，誘 導 体 化 を 含 め た 前 処 理 操 作 や 装 置 構 成 と そ の 取 り 扱 い 等 が 煩 雑 で
あるため，薬物動態分析への適用は困難である．
1968 年 に 高 村 ら は ポ ー ラ ロ グ ラ フ ィ ー に よ っ て ，キ ノ ン の 電 解 還 元 時 に 微
量 の 酸 が 共 存 す る と 還 元 前 置 波 が 生 じ る こ と を 発 見 し [91]， こ れ を 発 端 に ，
1994 年 に 楠 ら は グ ラ ッ シ ー カ ー ボ ン 電 極 を 用 い た ボ ル タ ン メ ト リ ー に よ る
脂 肪 酸 の 電 気 化 学 的 定 量 法 を 開 発 し た [25,92]． キ ノ ン の 還 元 前 置 波 に 基 づ
く電気化学検出法は，酸への特異性が高く，高感度検出が可能である．
そ こ で 本 研 究 で は ，Fig. 2-1 に 示 す よ う に カ ル ボ キ シ ル 基 を 有 す る VPA に
つ い て も ，キ ノ ン の 還 元 前 置 波 を 利 用 し た 電 気 化 学 検 出 に よ る 酸 測 定 が で き
る と 考 え ，生 体 試 料 分 析 の た め に 簡 便 な 前 処 理 方 法 と 特 異 性 の 高 い 方 法 の 確
立 を 意 図 し て ， VPA の 高 感 度 HPLC-ECD を 構 築 す る こ と と し た ．
さ ら に ， 本 研 究 で は VPA の HPLC-ECD に よ る 薬 物 動 態 分 析 と と も に ， 血
中 FFA の 動 態 分 析 も で き れ ば ， 糖 脂 質 代 謝 調 節 を in vivo で 観 察 で き る 複 合
動 態 解 析 法 と し て 展 開 で き る と 考 え た ．そ こ で ，キ ノ ン の 還 元 前 置 波 に 基 づ
く FFA の HPLC-ECD も 構 築 し た ．本 法 が ，血 中 VPA と FFA の 時 間 － 濃 度 プ
ロ フ ァ イ ル の 取 得 ， VPA の 薬 物 動 態 （ PK） パ ラ メ ー タ の 算 出 に 適 用 で き る
ことを明らかにすることとした．
2-2
キノンの還元前置波に基づく酸測定
キ ノ ン 化 合 物 は ，ポ ー ラ ロ グ ラ フ ィ ー の 分 野 で 早 く か ら 研 究 さ れ て き た 物
質 で あ り ，キ ノ ン － ハ イ ド ロ キ ノ ン 型 の 可 逆 的 電 極 反 応 に お け る 様 々 な 電 気
化 学 的 挙 動 が 明 ら か に さ れ て い る [93-95]． キ ノ ン 化 合 物 の ポ ー ラ ロ グ ラ ム
を 種 々 の 溶 媒 中 で 測 定 す る と き ，一 般 に 明 瞭 な 還 元 波 が 観 察 さ れ ，波 形 ，波
高 な ど は キ ノ ン の 種 類 ，溶 媒 ，共 存 物 質 に よ り 変 化 す る こ と が 知 ら れ て い る
[96]．
一 方 ，プ ラ ス チ ッ ク フ ォ ー ム ド カ ー ボ ン（ PFC, plastic formed carbon）電 極
のような炭素電極を作用電極に用いたボルタンメトリーにおいてもキノン
- 21 -
化 合 物（ Q）を 非 緩 衝 な プ ロ ト ン 性 溶 媒 中（ HB，水 ，エ タ ノ ー ル な ど ）で 電
解 還 元 す る と き ， 式 （ 1） の 電 極 反 応 が 進 行 し ， ボ ル タ モ グ ラ ム 上 に 1 段 の
還 元 波 が 生 じ る （ Fig. 2-2， 曲 線 a）．
Q
＋
HB
＋
e－
QH
＋
B－
（ 1）
こ の 溶 液 の 電 解 還 元 を 微 量 の 酸（ HA）の 共 存 下 で 行 う と ，式（ 2）の 電 極
反 応 が 進 行 し ，キ ノ ン の 還 元 波 よ り も 正 電 位 側 に 新 た な 還 元 波（ 還 元 前 置 波 ）
が 現 れ る （ Fig. 2-2, 曲 線 b）．
Q
＋
HA
＋
e－
QH
＋
A－
（ 2）
還 元 前 置 波 の 出 現 は ， 溶 媒 よ り プ ロ ト ン 供 与 性 の 高 い 酸 （ Fig. 2-2 で は 塩
酸 ）か ら キ ノ ン へ の プ ロ ト ン 供 与 が 起 こ り ，溶 媒 の み の 時 よ り 低 エ ネ ル ギ ー
側 ，す な わ ち 正 電 位 側 で 電 解 還 元 が 進 行 し た た め と 考 え て い る ．還 元 前 置 波
の 波 高 は（ Fig. 2-2, i H ），酸 の 濃 度 に 比 例 す る ．従 っ て ，還 元 前 置 波 の 波 高 の
計 測 に よ っ て 酸 の 定 量 が 可 能 と な る ．さ ら に ，還 元 前 置 波 の 出 現 電 位 は ，酸
の 強 弱 と 関 係 が あ る ． す な わ ち ， pK a が 小 さ い 酸 由 来 の 還 元 前 置 波 ほ ど ， よ
り正電位に出現する．
酸 の 測 定 に 用 い る こ と が で き る キ ノ ン 化 合 物 に は ，還 元 波 と 還 元 前 置 波 が
明 確 に 区 別 で き る こ と ，常 温 で 安 定 で あ る こ と ，有 機 溶 媒 と 水 の 混 液 へ 比 較
的 溶 解 し や す い こ と 等 の 条 件 に 満 た す も の を 選 定 す る 必 要 が あ る ．本 研 究 に
は ， 3,5-di-tert-buty1-1,2-benzoquinone（ DBBQ） を 用 い た ．
2-3
2-3-1
実験材料と実験方法
ボルタンメトリー装置
ボ ル タ ン メ ト リ ー 装 置 に は ，ポ テ ン シ ョ ス タ ッ ト ／ フ ァ ン ク シ ョ ン ジ ェ ネ
レ ー タ ー （ HAB-151， 北 斗 電 工 製 ）， 記 録 計 （ 3036， 横 河 電 機 製 ） を 使 用 し
た ．電 解 セ ル は ，50 mL の 容 量 の ビ ー カ ー 型 ガ ラ ス 製 容 器 と ，PFC を 作 用 電
極 ，Ag/AgCl を 参 照 電 極 ，白 金 線 を 対 極 と す る 3 電 極 を 使 用 し た ．キ ノ ン を
含 む 支 持 電 解 質 溶 液 （ キ ノ ン 試 薬 溶 液 ） に は ， 3 mmol/L DBBQ と 50 mmol/L
過 塩 素 酸 リ チ ウ ム を 含 む エ タ ノ ー ル － 水（ 80:20, v/v）を 用 い た ．キ ノ ン 試 薬
溶 液 に VPA を 溶 解 し て 試 料 溶 液 を 調 製 し ， そ の 20 mL を 電 解 セ ル に 加 え て
ボ ル タ モ グ ラ ム を 測 定 し た ． 走 査 速 度 は ， 20 mV/s に 設 定 し た ．
- 22 -
Fig. 2-2
Voltammograms of 4.0 mmol/L DBBQ in the (a) absence and (b)
presence of 2.0 mmol/L hydrochloric acid in ethanol -water (50:50, v/v)
containing 50 mmol/L NaCl.
PFC, Ag/AgCl, and Pt were used as
working, reference, and counter electrodes, respectively.
Scan rate
was set at 10 mV/s.
2-3-2
バ ル プ ロ 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC
キ ノ ン の 還 元 前 置 波 を 活 用 し た 酸 測 定 を フ ロ ー 型 の 検 出 部 と し て HPLC に
組 み 込 む に は ，移 動 相 と カ ラ ム か ら な る 分 離 系 に キ ノ ン 試 薬 溶 液 を ポ ス ト カ
ラ ム 方 式 で 合 流 さ せ る 2 流 路 系 の シ ス テ ム が 有 用 と 考 え た ．そ こ で ，Fig. 2-3
に 示 す よ う に ， デ ガ ッ サ ー （ DG-980-50, 日 本 分 光 製 ）， ポ ン プ （ 301 M， フ
ロ ム 製 ）， サ ン プ ル イ ン ジ ェ ク タ ー （ 7725, レ オ ダ イ ン 製 ）， マ イ ク ロ ボ ア カ
ラ ム （ Develosil C30-UG-3, 250 mm×1.0 mm i.d., 3m, 野 村 化 学 製 ）， カ ラ ム
オ ー ブ ン （ CTO-10ASvp, 島 津 製 作 所 製 ）， 電 気 化 学 検 出 器 （ LC-4C, BAS 製 ）
を用いて構築した．
フ ロ ー 型 電 解 セ ル（ ラ ジ ア ル フ ロ ー セ ル ，BAS 製 ）の 作 用 電 極 は グ ラ ッ シ ー
カ ー ボ ン（ 円 盤 型：直 径 6 mm），参 照 電 極 は Ag/AgCl，対 極 は ス テ ン レ ス を
用いた．
- 23 -
移 動 相 は ア セ ト ニ ト リ ル － 水 （ 70:30, v/v）， キ ノ ン 試 薬 溶 液 は 6 mmol/L
DBBQ と 20 mmol/L LiClO 4 を 含 む ア セ ト ニ ト リ ル － 水（ 70:30, v/v）を 使 用 し
た ． カ ラ ム 温 度 は 30℃ ， 移 動 相 の 流 速 は 30 L/min， キ ノ ン 試 薬 溶 液 の 流 速
は 60 L/min， 印 加 電 位 は -0.15 V vs. Ag/AgCl， 試 料 注 入 量 は 5 L と し た ．
Fig. 2-3 Block diagram of the HPLC-ECD system.
MP, Mobile phase; QS, quinone solution; DG, degasser; P 1 and P 2 , pumps; S,
sample injector; column, reversed-phase C 30 column (Develosil C30-UG-3, 250
mm x 1.0 mm i.d., 3 m); D, electrochemical detector, electrochemical cell and
potentiostat; R, recorder. For the determination of VPA, an acetonitrile -water
(70:30, v/v) mixture and one containing 6 mmol/L DBBQ and 20 mmol/L LiClO 4
served as a MP and QS, respectively.
For the determination of FFA,
acetonitrile-ethanol (90:10, v/v) mixture and one containing 6 mmol/L DBBQ
and100 mmol/L LiClO 4 served as a MP and QS, respectively.
2-3-3
遊 離 脂 肪 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC
FFA の 場 合 も ，移 動 相 と カ ラ ム か ら な る 分 離 系 に キ ノ ン 試 薬 溶 液 を ポ ス ト
カラム方式で合流させる 2 流路系のシステムを構築した．
Fig. 2-3 と 同 様 に ，デ ガ ッ サ ー（ DG-980-50, 日 本 分 光 製 ），ポ ン プ（ 301 M，
フ ロ ム 製 ）， サ ン プ ル イ ン ジ ェ ク タ ー （ 7725, レ オ ダ イ ン 製 ）， マ イ ク ロ ボ ア
カ ラ ム （ Develosil C30-UG-3, 250 mm×1.0 mm i.d., 3m, 野 村 化 学 製 ）， カ ラ
ム オ ー ブ ン （ CTO-10ASvp, 島 津 製 作 所 製 ）， 電 気 化 学 検 出 器 （ LC-4C, BAS
- 24 -
製）を用いて構築した．
フ ロ ー 型 電 解 セ ル（ ラ ジ ア ル フ ロ ー セ ル ，BAS 製 ）の 作 用 電 極 は グ ラ ッ シ ー
カ ー ボ ン（ 円 盤 型：直 径 6 mm），参 照 電 極 は Ag/AgCl，対 極 は ス テ ン レ ス を
用いた．
移 動 相 は ア セ ト ニ ト リ ル － エ タ ノ ー ル （ 90:10, v/v）， キ ノ ン 試 薬 溶 液 は 6
mmol/L DBBQ と 100 mmol/L LiClO 4 を 含 む ア セ ト ニ ト リ ル － エ タ ノ ー ル
（ 90:10, v/v） を 使 用 し た ． カ ラ ム 温 度 は 30℃ ， 移 動 相 の 流 速 は 30 L/min，
キ ノ ン 試 薬 溶 液 の 流 速 は 60 L/min，印 加 電 位 は -0.09 V vs. Ag/AgCl，試 料 注
入 量 は 5 L と し た ．
2-3-4
実験動物とバルプロ酸ナトリウム投与
本 法 の 血 中 VPA 定 量 へ の 適 用 と ， BG の 変 化 に 伴 う VPA と FFA の 複 合 動
態 解 析 へ の 適 用 を 検 討 す る た め に ，健 常 ラ ッ ト ，マ ル ト ー ス を 一 定 時 間 毎 に
複 数 回 投 与 し た 健 常 ラ ッ ト （ マ ル ト ー ス 負 荷 ラ ッ ト ）， ア ロ キ サ ン を 投 与 し
て 作 成 し た 1 型 糖 尿 病 モ デ ル ラ ッ ト（ 糖 尿 病 ラ ッ ト ）の 各 々 の ラ ッ ト に バ ル
プ ロ 酸 ナ ト リ ウ ム（ VP-Na）を 経 口 投 与 し た ．第 2 章 の す べ て の 動 物 実 験 は ，
東 京 薬 科 大 学「 実 験 動 物 ガ イ ド ラ イ ン 」に 基 づ い て 充 分 な 倫 理 的 な 配 慮 の 下
で実施した．
2-3-4-1
健常ラット
16 時 間 絶 食 し た Wistar 系 雄 性 ラ ッ ト （ 8 週 齢 ） に ， 水 に 溶 か し た VP-Na
（ 150 mg/kg） を 経 口 投 与 し ， 経 時 的 に 約 50 L の 血 液 を 尾 静 脈 よ り 採 血 し
た．
2-3-4-2
マルトース負荷ラット
16 時 間 絶 食 し た Wistar 系 雄 性 ラ ッ ト（ 8 週 齢 ）に ，マ ル ト ー ス（ 1.8 g/kg）
と 水 に 溶 か し た VP-Na（ 150 mg/kg） を 経 口 投 与 し ， 経 時 的 に 約 50 L の 血
液 を 尾 静 脈 よ り 採 血 し た ． マ ル ト ー ス （ 1.8 g/kg） は ， １ 時 間 ご と に 複 数 回
投与した．
2-3-4-3
糖尿病モデルラット
1 型糖尿病モデルラットとしてアロキサン糖尿病ラットを作成した．
Wistar 系 雄 性 ラ ッ ト （ 8 週 齢 ） に ， ア ロ キ サ ン を 含 む 生 理 食 塩 水 を 1 日 1 回
（ 2 日 間 ）， 腹 腔 内 投 与 （ 200 mg/kg） し て 作 成 し た ． 16 時 間 絶 食 し た 糖 尿 病
ラ ッ ト に ，水 に 溶 か し た VP-Na の 水 溶 液 を 経 口 投 与 し（ 150 mg/kg），経 時 的
に 約 50 L の 血 液 を 尾 静 脈 よ り 採 血 し た ．
- 25 -
2-3-5
血糖値の測定方法
血 液 約 50 L の う ち ，5 L の 血 液 は ，血 糖 自 己 測 定（ SMBG）用 の 血 糖 測
定 器（ グ ル コ カ ー ド GT-1641, ア ー ク レ イ 製 ）に よ る BG の 測 定 に 利 用 し た ．
2-3-6
血中バルプロ酸および遊離脂肪酸測定のための血漿試料の前処理方
法
各 種 ラ ッ ト か ら 採 取 し た 血 液 は ヘ パ リ ン で 処 理 を し ，遠 心 分 離（ 3000 r.p.m.,
10 min） し て 血 漿 を 調 製 し た ．
血 中 VPA の 測 定 に は ，10 L の 血 漿 を 使 用 し た ． 血 漿 10 L に ， n-ノ ナ ン
酸 （ IS） を 含 む ア セ ト ニ ト リ ル 0.1 mL を 加 え て 除 タ ン パ ク を 行 い ， 超 音 波
処 理 （ 1 min） と 遠 心 分 離 （ 1500 g, 10 min） を 行 っ た ． 得 ら れ た 上 清 を 孔 径
0.45 m の メ ン ブ レ ン フ ィ ル タ ー （ Ultrafree-MC, Bedford 製 ） で ろ 過 を し て
検 液 と し た ．マ イ ク ロ シ リ ン ジ を 用 い て 検 液 5 L を VPA の HPLC に 注 入 し ，
クロマトグラムを測定した．
血 中 FFA の 測 定 に は ，別 の 10 L の 血 漿 を 使 用 し た ．血 漿 10 L に ，マ ル
ガ リ ン 酸（ IS）を 含 む ア セ ト ニ ト リ ル － エ タ ノ ー ル 混 液 ，エ ー テ ル を 加 え て ，
FFA を エ ー テ ル 層 に 抽 出 し た ．エ ー テ ル に よ る 抽 出 操 作 は 3 回 繰 り 返 し 行 っ
た．エーテル層を分取し，エバポレートした残渣にアセトニトリル－エタ
ノ ー ル（ 90:10, v/v）混 液 40 L を 加 え ，FFA を 溶 解 さ せ た ．こ れ を 孔 径 0.45
m の メ ン ブ レ ン フ ィ ル タ ー（ Ultrafree-MC, Bedford 製 ）で ろ 過 を し て 検 液 と
し た ． マ イ ク ロ シ リ ン ジ を 用 い て 検 液 5 L を FFA の HPLC に 注 入 し ， ク ロ
マトグラムを測定した．
2-4
2-4-1
実験結果
バルプロ酸由来のキノンの還元前置波
VPA の HPLC-ECD の 構 築 に 先 立 っ て ，キ ノ ン の 還 元 前 置 波 に よ る VPA の
検出が可能かボルタンメトリーで検討した．
VPA を 含 む キ ノ ン 試 薬 溶 液 を 電 解 セ ル に 添 加 し て ，還 元 前 置 波 の 出 現 の 有
無 を 検 討 し た と こ ろ ， Fig. 2-4 の 曲 線 b～ e の よ う に -0.15 V vs. Ag/AgCl 付 近
に 一 段 の 明 瞭 な 還 元 前 置 波 を 観 測 で き た ．還 元 前 置 波 の ピ ー ク 電 流 値 と VPA
の 濃 度 の 相 関 を 調 べ た と こ ろ ，0.025～ 4.12 mmol/L の 範 囲 で 良 好 な 直 線 性（ r
- 26 -
= 0.998） を 示 し た ． こ の よ う な 電 解 液 の 組 成 に お け る DBBQ の 還 元 前 置 波
測 定 に よ っ て ， VPA の 定 量 が 可 能 で あ る こ と を 明 ら か に し た ．
HPLC-ECD の 検 出 部 と し て キ ノ ン の 還 元 前 置 波 測 定 を 活 用 す る 場 合 ，還 元
前 置 波 の 現 れ る 電 位 に 印 加 電 位 を 設 定 し て ク ロ マ ト グ ラ ム を 測 定 し ，還 元 電
流を計測することで酸の定量が可能となる．
Fig. 2-4
Voltammograms of 3 mmol/L DBBQ with (a) 0 mol/L (b) 50 mol/L
(c) 75 mol/L (d) 100 mol/L (e) 150 mol/L valproic acid in ethanol-water
(80:20, v/v) containing 50 mmol/L LiClO 4 .
PFC, Ag/AgCl, and Pt were used as
working, reference, and counter electrodes, respectively.
20 mV/s.
- 27 -
Scan rate was set at
2-4-2
2-4-2-1
バ ル プ ロ 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC の 最 適 化
分離条件の選定
キ ノ ン の 還 元 前 置 波 を 利 用 し た FFA の HPLC-ECD で は [97]， 固 定 相 に
ODS カ ラ ム ， 移 動 相 に ア セ ト ニ ト リ ル ― エ タ ノ ー ル 混 液 を 用 い て 炭 素 数 16
～ 20 の FFA の 分 離 定 量 を 達 成 し て い る ． VPA の 炭 素 数 は 8 で あ り ， カ ラ ム
内 に 保 持 さ せ る た め に は ，固 定 相 の 疎 水 性 を 高 く し ，移 動 相 の 極 性 を 高 く す
る 必 要 が あ る ． そ こ で ， 固 定 相 に ト リ ア コ ン チ ル 基 （ C30） を 修 飾 し た シ リ
カ系カラムを採用した．
移 動 相 に 用 い る 溶 媒 は ， 溶 媒 の 極 性 の 指 標 と な る Hildebrand の 溶 解 パ ラ
メ ー タ（ δ ）に 基 づ き ，ア セ ト ニ ト リ ル お よ び エ タ ノ ー ル に 比 べ て δ 値 が 大
き い 水 を 利 用 す る こ と と し た ．移 動 相 と し て エ タ ノ ー ル － 水 混 液 系 を 用 い た
と こ ろ ，VPA は カ ラ ム に 保 持 さ れ ず ，移 動 相 の 極 性 が 充 分 に 高 く な い こ と が
分 か っ た ．そ こ で ，ア セ ト ニ ト リ ル ― 水 混 液 系 を 用 い た と こ ろ ，VPA は カ ラ
ム に 保 持 さ れ た ．VPA の 分 離 定 量 に 最 適 な ア セ ト ニ ト リ ル － 水 の 溶 媒 組 成 に
つ き ，保 持 時 間 と ピ ー ク 高 さ を 考 慮 し て 検 討 し た と こ ろ ，ア セ ト ニ ト リ ル －
水 （ 70:30, v/v） 混 液 を 選 定 し た ．
カ ラ ム 温 度 ，移 動 相 の 流 速 に つ い て も ，保 持 時 間 と ピ ー ク 高 さ を 考 慮 し て
検 討 し た と こ ろ ，カ ラ ム 温 度 は 30℃ ，移 動 相 の 流 速 は 30 L/min に 設 定 し た ．
2-4-2-2
検出条件の選定
キ ノ ン 試 薬 溶 液 の 溶 媒 に は ，移 動 相 と 同 じ ア セ ト ニ ト リ ル － 水（ 70:30, v/v）
混液とすれば，ポストカラム方式で移動相にキノン試薬溶液を混合する際，
混 合 に よ る 脈 流 ノ イ ズ の 影 響 が 少 な く な る ． ま た ， ア セ ト ニ ト リ ル （ 25℃ ）
に お け る DBBQ の モ ル 溶 解 度 は 約 60 mmol/L で あ っ た ．DBBQ が 流 路 に 析 出
し な い よ う に 考 慮 し て ， DBBQ の 濃 度 は 6 mmol/L と し た ．
キ ノ ン 試 薬 溶 液 に は 支 持 電 解 質 も 溶 解 さ せ ，導 電 性 を 確 保 す る こ と と し た ．
有 機 溶 媒 の 割 合 が 多 い 移 動 相 と キ ノ ン 試 薬 溶 液 を 使 用 す る こ と か ら ，支 持 電
解 質 と し て 過 塩 素 酸 リ チ ウ ム を 選 ん だ ．ま た ，そ の 濃 度 は 溶 液 抵 抗 を 考 慮 し
て 決 定 し た ．過 塩 素 酸 リ チ ウ ム の 濃 度 が 薄 す ぎ る と バ ッ ク グ ラ ウ ン ド ノ イ ズ
が 大 き く な る 傾 向 が あ り ，一 方 ，濃 す ぎ る と 流 路 や フ ロ ー 電 解 セ ル 内 で 塩 が
析 出 す る 可 能 性 が あ る ． 以 上 よ り ， キ ノ ン 試 薬 溶 液 と し て 6 mmol/L DBBQ
と 20 mmol/L 過 塩 素 酸 リ チ ウ ム を 含 む ア セ ト ニ ト リ ル － 水 （ 70:30, v/v） 溶
液を選定した．
次 に ， 還 元 前 置 波 に よ る VPA 検 出 の 印 加 電 位 を 選 定 す る た め に ハ イ ド ロ
ダ イ ナ ミ ッ ク ボ ル タ モ グ ラ ム を 測 定 し た ． Fig. 2-5 の ハ イ ド ロ ダ イ ナ ミ ッ ク
ボ ル タ モ グ ラ ム が 示 す よ う に ， +0.3 V vs. Ag/AgCl よ り 負 電 位 を 印 加 す る と
- 28 -
ク ロ マ ト グ ラ ム 上 に VPA の ピ ー ク が 観 察 さ れ た ．-0.15 V vs. Ag/AgCl の と き
に 最 大 の ピ ー ク 電 流 値 が 得 ら れ た ．印 加 電 位 を よ り 負 電 位 に す る と ピ ー ク 電
流 値 が 低 下 し た ． 従 っ て ， S/N 比 が 最 大 と な っ た -0.15 V vs. Ag/AgCl を VPA
のクロマトグラム測定における印加電位として決定した．
キ ノ ン 試 薬 溶 液 の 流 速 に つ き ，保 持 時 間 と ピ ー ク 高 さ を 考 慮 し て 検 討 し た
と こ ろ ， ピ ー ク 高 さ が 最 大 と な っ た 60 L/min を キ ノ ン 試 薬 溶 液 の 流 速 と し
て設定した．
Fig. 2-5
Hydrodynamic voltammogram of valproic acid.
HPLC conditions used were: column, Develosil C30 -UG-3 (250 mm×1.0 mm i.d.,
3m); column temperature, 30℃ ; mobile phase, acetonitrile-water (70:30, v/v);
quinone solution, acetonitrile-water (70:30, v/v) containing 6.0 mmol/L DBBQ
and 20 mmol/L LiClO 4 ; flow rate of mobile phase, 30 L/min; flow rate of
quinone solution, 60 L/min.
A standard mixture (5 L) of valproic acid was
injected into HPLC-ECD at concentration of 14.4 g/mL.
- 29 -
2-4-3
バ ル プ ロ 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC の 分 析 能 パ ラ メ ー タ
最 適 化 し た 条 件 下 で 測 定 し た VPA の ク ロ マ ト グ ラ ム を Fig. 2-6A に 示 し た ．
ク ロ マ ト グ ラ ム 上 に VPA と IS で あ る n-ノ ナ ン 酸 の ピ ー ク を そ れ ぞ れ 8.7 min
と 11.0 min に 観 察 で き た ． VPA と n-ノ ナ ン 酸 の 分 離 度 は 2.84 で あ り ， 良 好
に分離することができた．
直 線 性 を 評 価 す る た め に ， 0.14, 0.36, 0.72, 1.08, 1.44, 3.60, 7.20, 10.8, 14.4,
18.0 g/mL VPA と 7.91 g/mL n-ノ ナ ン 酸 を 含 む 標 準 溶 液 を そ れ ぞ れ 調 製 し ，
ク ロ マ ト グ ラ ム を 測 定 し た ．横 軸 に 標 準 溶 液 中 の VPA 濃 度 ，縦 軸 に IS の ピ ー
ク 高 さ に 対 す る VPA の ピ ー ク 高 さ の 比 を プ ロ ッ ト し ， 検 量 線 を 作 成 し た ．
0.36～ 14.4 g/mL の 範 囲 で 相 関 係 数 （ r ） が 0.999 の 良 好 な 直 線 性 が 得 ら れ
た ．ま た ，3.60 g/mL の VPA 標 準 溶 液 に つ い て ，10 回 の 繰 り 返 し 測 定 を 行 っ
た と こ ろ ， IS の ピ ー ク 高 さ に 対 す る VPA の ピ ー ク 高 さ の 比 の RSD は 2.0％
で あ っ た ． 検 出 限 界 （ S/N = 3） は ， 0.11 g/mL（ 0.53 ng on column） で あ っ
た ． 本 法 は ， VPA の 血 中 濃 度 測 定 を 行 う 上 で ， 充 分 な 感 度 ， 範 囲 ， 直 線 性 ，
精度を有することが分かった．
2-4-4
ラット血中バルプロ酸定量への応用
本 法 が ，血 中 薬 物 濃 度 測 定 に 適 用 で き る こ と を 示 す た め に ，VP-Na 投 与 後
のラット血漿を試料とした実分析を行った．
Fig. 2-6B の ク ロ マ ト グ ラ ム が 得 ら れ ， 内 標 準 法 に よ り 血 中 VPA を 定 量 し
た 結 果 を Table 2-1 に 示 し た ．投 与 1 時 間 後 の ラ ッ ト 血 中 VPA の 濃 度 は ，63.6
g/mL で あ っ た ．繰 り 返 し 測 定 を 行 い ，室 内 再 現 精 度 を 求 め た と こ ろ ， RSD
（ n = 5）は 0.69%で あ っ た ．ま た ，添 加 回 収 試 験 を 行 っ た と こ ろ ，回 収 率 は
90.8%で あ り ， そ の RSD（ n = 5） は 1.7%で あ っ た ． 以 上 の よ う に ， 本 法 は ，
血 中 VPA を 比 較 的 簡 便 な 前 処 理 方 法 で 定 量 す る こ と が 可 能 で あ り ， 真 度 と
精 度 に 優 れ る 血 中 VPA の 分 析 法 で あ る こ と が 分 か っ た ．
- 30 -
Fig. 2-6
Chromatogram of (A) a standard VPA (7.2 g/mL) and (B) a normal rat
plasma at 1 hr after VPA-Na administration subsequent to 16 hr fasting.
HPLC conditions used were: column, microbore C30 column (Develosil C30 -UG-3
(250 mm × 1.0 mm i.d., 3m); column temperature, 30 ℃ ; mobile phase,
acetonitrile-water (70:30, v/v); quinone solution, acetonitrile -water (70:30, v/v)
containing 6.0 mmol/L DBBQ and 20 mmol/L LiClO 4 ; flow rate of mobile phase,
30 L/min; flow rate of quinone solution, 60 L/min; applied potential, -0.15 V vs.
Ag/AgCl. Peaks: VPA, valproic acid; IS, n-nonanoic acid.
Table 2-1
Concentration of valproic acid in rat plasma after oral administration
of 150 mg/kg sodium valproate to normal rat and recovery from the plasma spiked
with valproic acid standard.
Repeatability (n = 5)
Concentration (g/mL)
63.6
Recovery (n = 5)
RSD (%)
Spiked (g/mL)
0.69
64.9
- 31 -
Recovery (%)
RSD (%)
90.8
1.7
2-4-5
遊 離 脂 肪 酸 の 電 気 化 学 検 出 HPLC の 分 析 能 パ ラ メ ー タ
2-3-3 に 記 載 し た HPLC 条 件 下 で 測 定 し た FFA の ク ロ マ ト グ ラ ム を Fig.
2-7A に 示 し た ． ク ロ マ ト グ ラ ム 上 に ア ラ キ ド ン 酸 （ C20:4 ）， リ ノ ー ル 酸
（ C18:2），オ レ イ ン 酸（ C18:1），パ ル ミ チ ン 酸（ C16:0），マ ル ガ リ ン 酸（ C17:0，
IS），ス テ ア リ ン 酸（ C18:0）の ピ ー ク は そ れ ぞ れ ，10.3, 11.9, 14.9, 15.8, 19.0,
23.3 min に 観 察 さ れ ，そ れ ぞ れ の ピ ー ク は 良 好 に 分 離 し て い る こ と を 確 認 し
た ． FFA の 溶 出 挙 動 に つ い て ， 次 の よ う な こ と が 分 か っ た ． 飽 和 脂 肪 酸 は
C16:0，C17:0，C18:0 の 順 に 溶 出 し ，炭 素 数 が 小 さ い 脂 肪 酸 が 早 く 溶 出 し た ．
ま た ， C18:2， C18:1， C18:0 の 順 に 溶 出 し ， 炭 素 数 が 同 じ 場 合 ， 構 造 中 の 二
重 結 合 が 多 い 脂 肪 酸 が 早 く 溶 出 し た ．C18:1 の 方 が C16:0 よ り 先 に 溶 出 し た ．
こ れ ら の 結 果 よ り ，こ の HPLC 条 件 に お け る FFA の 溶 出 挙 動 は ，脂 肪 酸 の 炭
素数と構造中の二重結合の数が関係していると考えられた．
ピ ー ク 高 さ は FFA 濃 度 と 比 例 関 係 を 示 し ，0.75～ 160 mol/L の 範 囲 で 相 関
係 数 （ r ） が 0.999 の 良 好 な 直 線 性 が 得 ら れ た ． ま た ， 30 mol/L の FFA 標
準 溶 液 に つ い て ，10 回 の 繰 り 返 し 測 定 を 行 っ た と こ ろ ，FFA の ピ ー ク 高 さ の
RSD は 2.0%以 下 で あ っ た ． ア ラ キ ド ン 酸 ， リ ノ ー ル 酸 ， オ レ イ ン 酸 ， パ ル
ミ チ ン 酸 ，ス テ ア リ ン 酸 の 検 出 限 界（ S/N = 3）は ，そ れ ぞ れ 0.23, 0.21, 0.18,
0.19, 0.22 mol/L（ そ れ ぞ れ 1.15, 1.05, 0.90, 0.95, 1.10 pmol on column ）で あ っ
た ．本 法 は ，血 中 FFA を 定 量 す る 上 で ，充 分 な 感 度 ，範 囲 ，直 線 性 ，精 度 を
有することが分かった．
2-4-6
ラット血中遊離脂肪酸定量への応用
本 法 が ， 血 中 FFA 測 定 に 適 用 で き る こ と を 示 す た め に ， 16 時 間 絶 食 後 の
ラ ッ ト 血 漿 を 試 料 と し た 実 分 析 を 行 っ た ．Fig. 2-7B の ク ロ マ ト グ ラ ム が 得 ら
れ ， 内 標 準 法 に よ り 血 中 FFA を 定 量 し た 結 果 を Table 2-2 に 示 し た ． 繰 り 返
し 測 定 を 行 い ， 室 内 再 現 精 度 を 求 め た と こ ろ ， RSD（ n = 5） は 2.9%以 下 で
あ っ た ．ま た ，添 加 回 収 試 験 を 行 っ た と こ ろ ，回 収 率 は 93.1～ 100％ で あ り ，
そ の RSD（ n = 5） は 2.1％ 以 下 で あ っ た ．
以 上 の よ う に ，本 法 は ，血 中 FFA を 比 較 的 簡 便 な 前 処 理 方 法 で 定 量 す る こ
と が 可 能 で あ り ，真 度 と 精 度 に 優 れ る 血 中 FFA の 分 析 法 で あ る こ と が 分 か っ
た．
- 32 -
Fig. 2-7
Chromatogram of (A) a standard FFA mixture of 30 mol/L of each
FFA and (B) normal rat plasma after 16 hr fasting.
HPLC conditions used were: column, Develosil C30 -UG-3 (250 mm×1.0 mm i.d.,
3m); column temperature, 30℃ ; mobile phase, acetonitrile-ethanol (90:10, v/v);
quinone solution, acetonitrile-ethanol (90:10, v/v) containing 6.0 mmol/L DBBQ
and 100 mmol/L LiClO 4 ; flow rate of mobile phase, 30 L/min; flow rate of
quinone solution, 60 L/min; applied potential, -0.09 V vs. Ag/AgCl. Peaks: a,
arachidonic acid; b, linoleic acid; c, oleic acid; d, palmitic acid; e, margaric acid
(IS); f, stearic acid.
Table 2-2
Concentrations of FFAs in rat plasma and recoveries from th e plasma
spiked with FFA standards.
Repeatability (n = 5)
FFA
Arachidonic
acid
Linoleic acid
Oleic acid
Palmitic acid
Stearic acid
Recovery (n = 5)
Concentration
RSD
Spiked
Recovery
RSD
(mol/L)
(%)
(mol/L)
(%)
(%)
10.7
2.9
10
93.1
2.0
138.5
2.3
140
95.8
0.99
77.7
0.47
80
122.0
1.9
120
96.8
2.1
55.3
2.6
60
96.4
0.58
Plasma sample obtained from normal rat after 16 -hr fasting.
- 33 -
100
2.1
2-4-7
2-4-7-1
バルプロ酸と遊離脂肪酸の複合動態解析の実践
健常ラットの血中バルプロ酸と遊離脂肪酸の動態分析
高 血 糖 状 態 に お け る 血 中 VPA の 体 内 動 態 を 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル と し
て 捉 え る に 先 立 ち ， ま ず は 健 常 ラ ッ ト に つ き ， VP-Na 投 与 後 の 血 中 VPA お
よ び 血 中 FFA の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を 解 析 す る こ と と し た ．
健 常 ラ ッ ト に お け る BG， 血 中 VPA， 血 中 総 FFAs， 血 中 FFA 分 画 の 時 間
－ 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を Fig. 2-8（ A-D）に 示 し た ．こ こ で ，総 FFAs は 今 回 測
定 対 象 と し た FFA（ ア ラ キ ド ン 酸 ，リ ノ ー ル 酸 ，オ レ イ ン 酸 ，パ ル ミ チ ン 酸 ，
ステアリン酸）の総濃度とする．
BG は ，Fig. 2-8A の よ う に 5 時 間 に わ た っ て 約 50 mg/dL を 維 持 し て い た ．
血 中 VPA は ， Fig. 2-8B の よ う に ， 投 与 0.5 時 間 後 で 最 大 と な り ， そ の 後
は 減 少 し た ． 2 時 間 後 に は 約 30 g/mL を 維 持 し て い た ．
血 中 総 FFAs は ， Fig. 2-8C の よ う に ， 投 与 1～ 2 時 間 後 に わ ず か に 増 加 し
た が ， そ の 後 徐 々 に 減 少 し ， 約 400 mol/L を 維 持 し て し た ．
血 中 FFA 分 画 の う ち リ ノ ー ル 酸 ，オ レ イ ン 酸 ，パ ル ミ チ ン 酸 ，ス テ ア リ ン
酸 の 濃 度 は ， Fig. 2-8D の よ う に ， 投 与 1～ 2 時 間 後 に わ ず か に 増 加 し ， そ の
後 徐 々 に 減 少 し た ．し か し ，ア ラ キ ド ン 酸 の 濃 度 は 投 与 前 後 に お い て ，ほ と
んど変化しなかった．
2-4-7-2
マルトース負荷ラットの血中バルプロ酸と遊離脂肪酸の動態分析
健 常 時 の 高 血 糖 状 態 に お け る VPA の 薬 物 動 態 を 明 ら か に す る た め に ， マ
ル ト ー ス を 一 定 時 間 毎 に 複 数 回 投 与 し た 健 常 ラ ッ ト に つ き ，VP-Na 投 与 後 の
VPA お よ び FFA の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を 解 析 す る こ と と し た ． 二 糖 類
で あ る マ ル ト ー ス は ，小 腸 か ら 血 液 へ 移 行 す る 際 に 腸 内 の α グ ル コ シ ダ ー ゼ
に よ り 加 水 分 解 を 受 け て グ ル コ ー ス に 代 謝 さ れ て 吸 収 さ れ る ．よ っ て ，グ ル
コ ー ス に 比 べ て 最 大 BG に 達 す る ま で の 時 間 が 若 干 遅 く ，食 餌 摂 取 の 模 倣 お
よび高血糖状態の維持のためのモデル作成に適していると考えた．
マ ル ト ー ス 負 荷 ラ ッ ト に お け る BG， 血 中 VPA， 血 中 総 FFAs， 血 中 FFA
分 画 の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を Fig. 2-8（ E-H） に 示 し た ．
BG は ， Fig. 2-8E の よ う に マ ル ト ー ス 投 与 0.5 時 間 後 に 140 mg/dL に 達 し
た ．そ の 後 ，1 時 間 ご と の マ ル ト ー ス の 複 数 回 投 与 に よ り ，BG は 約 170 mg/dL
を維持していた．
血 中 VPA は ， Fig. 2-8F の よ う に ， 投 与 0.5 時 間 後 で 最 大 と な っ た が ， 最
大 血 中 濃 度 （ C max ） は ， 健 常 ラ ッ ト と 比 較 し て 低 下 し た ． 1.5 時 間 以 降 は 約
10 g/mL を 維 持 し て い た ．
血 中 総 FFAs は ，Fig. 2-8G の よ う に ，投 与 前 ～ 投 与 後 に お い て ほ と ん ど 変
- 34 -
化しなかった．
血 中 FFA 分 画 の う ち リ ノ ー ル 酸 ，オ レ イ ン 酸 ，パ ル ミ チ ン 酸 ，ス テ ア リ ン
酸 の 濃 度 は ， Fig. 2-8H の よ う に ， 投 与 2 時 間 後 に 若 干 の 低 下 が 観 察 さ れ た
が，アラキドン酸の濃度は投与前後において，あまり変化しなかった．
VP-Na を 投 与 せ ず に ， マ ル ト ー ス の み を 単 回 投 与 し た ラ ッ ト の BG， 血 中
総 FFAs，血 中 FFA 分 画 の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を Fig. 2-9（ A-C）に 示 し
た ．Fig. 2-9A の マ ル ト ー ス 投 与 に よ る BG の 上 昇 に 伴 い ，Fig. 2-9B, Fig. 2-9C
の 血 中 総 FFAs お よ び ア ラ キ ド ン 酸 を 除 く 血 中 FFA 分 画 は 低 下 し た ．そ の 後 ，
BG が 低 下 し 定 常 状 態 に 回 復 す る に 伴 っ て ，血 中 総 FFAs お よ び ア ラ キ ド ン 酸
を 除 く 血 中 FFA 分 画 は 増 加 し た ．こ の よ う に ，VP-Na を 投 与 し な け れ ば ，糖
脂 質 代 謝 調 節 に よ っ て ， BG と 血 中 FFA の 負 の 相 関 が 観 察 さ れ た ．
2-4-7-3
糖尿病ラットの血中バルプロ酸と遊離脂肪酸の動態分析
糖 尿 病 に 起 因 す る 高 血 糖 状 態 に お け る VPA の 薬 物 動 態 を 明 ら か に す る た
め に ， 1 型 糖 尿 病 モ デ ル の ア ロ キ サ ン 糖 尿 病 ラ ッ ト に つ き ， VP-Na 投 与 後 の
血 中 VPA お よ び 血 中 FFA の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を 解 析 す る こ と と し た ．
糖 尿 病 ラ ッ ト に お け る BG， 血 中 VPA， 血 中 総 FFAs， 血 中 FFA 分 画 の 時
間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を Fig. 2-8（ I-L） に 示 し た ．
BG は ，Fig. 2-8I の よ う に 5 時 間 に わ た っ て 約 450 mg/dL を 維 持 し て い た ．
健 常 ラ ッ ト の BG と 比 較 し て ， 約 9 倍 に 増 加 し て い た ．
血 中 VPA は ，Fig. 2-8J の よ う に ，投 与 0.5 時 間 後 で 最 大 と な っ た が ，C max
は ，健 常 ラ ッ ト お よ び マ ル ト ー ス 負 荷 ラ ッ ト と 比 較 し て 低 下 し た ．投 与 2 時
間 後 以 降 は 約 30 g/mL を 維 持 し て い た ．
血 中 総 FFAs は ，Fig. 2-8K の よ う に ，5 時 間 に わ た っ て 約 500 mol/L を 維
持し，ほとんど変化は観察されなかった．
血 中 FFA 分 画 の う ち リ ノ ー ル 酸 ，オ レ イ ン 酸 ，パ ル ミ チ ン 酸 ，ス テ ア リ ン
酸 の 濃 度 は ，Fig. 2-8L の よ う に ，健 常 ラ ッ ト お よ び マ ル ト ー ス 負 荷 ラ ッ ト の
場 合 と 比 較 し て 約 1.3～ 1.5 倍 増 加 し て い た が ，VP-Na 投 与 後 の 時 間 経 過 に 伴
う 変 化 は 観 察 さ れ な か っ た ．ア ラ キ ド ン 酸 の 濃 度 は ，健 常 ラ ッ ト お よ び マ ル
トース負荷ラットの場合とほとんど同じであった．
- 35 -
Fig. 2-8 Time-concentration profiles of mean (±SE) (A, E, I) BG, (B, F, J) VPA,
(C, G, K) total FFAs and (D, H, L) FFA in (A -D) normal rats, (E-H) 1.8 g/kg
maltose ingested normal rats, and (I-L) diabetic rats, respectively,(n = 5 each),
after oral administration of 150 mg/kg of VP -Na under fasting.
(C, G, K) Total FFAs means the sum of arachidonic, linoleic, oleic, palmitic, and
stearic acids concentrations.
(D, H, L) FFAs: ■ , arachidonic acid; ◇ , linoleic acid; ◆ , oleic acid; □ ,
palmitic acid; △ , stearic acid. (E-H) Maltose (1.8 g/kg) was orally ingested by
a normal rat every 1 hr after 16 hr fasting.
- 36 -
Fig. 2-9 Time-concentration profiles of mean (±SE) (A) BG, (B) total FFAs,
and (C) FFA in normal rats (n = 5 each) after oral administration of maltose (1.8
g/kg).
(B) Total FFAs means the sum of arachidonic, linoleic, oleic, palmitic, and stearic
acids concentrations.
(C) FFAs: ■ , arachidonic acid; ◇ , linoleic acid; ◆ , oleic acid; □ , palmitic
acid; △ , stearic acid.
2-4-8
バルプロ酸の薬物動態パラメータに及ぼす高血糖状態の影響
健 常 ラ ッ ト ， マ ル ト ー ス 負 荷 ラ ッ ト ， 糖 尿 病 ラ ッ ト に お け る VPA の 時 間
－ 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル よ り ， PK パ ラ メ ー タ を 算 出 し た ． VPA の 添 付 文 書 の 記
載 に 従 い ，VPA の 薬 物 動 態 は 1－ コ ン パ ー ト メ ン ト モ デ ル と し て 解 析 す る こ
と と し た ．す な わ ち ，VPA は 投 与 後 に 全 身 体 循 環 に 入 る と 瞬 間 的 に 体 全 体 に
均 等 に 分 布 す る と 仮 定 し た ．解 析 し た 結 果 ，Table 2-3 に 示 す 7 種 の PK パ ラ
メータを算出できた．
- 37 -
各 ラ ッ ト 群 の PK パ ラ メ ー タ に 対 し ，Scheffe 法 に 基 づ い て 多 重 比 較 検 定 を
行 っ た ． 健 常 ラ ッ ト と 比 較 し て 有 意 差 の あ っ た PK パ ラ メ ー タ に つ い て Fig.
2-10 に 示 し た ．
血 中 濃 度 － 時 間 曲 線 下 面 積（ AUC）は ，健 常 ラ ッ ト と 比 較 し て ，マ ル ト ー
ス 負 荷 ラ ッ ト お よ び 糖 尿 病 ラ ッ ト で は ，有 意 に 低 下 し た（ Fig. 2-10A）．半 減
期（ t 1/2 ）は ，健 常 ラ ッ ト と 比 較 し て ，糖 尿 病 ラ ッ ト で は ，有 意 に 増 加 し て い
た（ Fig. 2-10B）．分 布 容 積（ Vd）は ，健 常 ラ ッ ト と 比 較 し て ，糖 尿 病 ラ ッ ト
は 有 意 に 増 加 し た （ Fig. 2-10C）．
今 回 構 築 し た VPA の HPLC-ECD が ，PK パ ラ メ ー タ の 算 出 に 適 用 で き る こ
と を 示 し た ．VPA の 有 効 治 療 血 中 濃 度 は 50～ 100 g/mL で あ り ，比 較 的 狭 い ．
ま た ，消 失 半 減 期 が 短 く ，併 用 薬 ，剤 形 ，血 中 タ ン パ ク 結 合 率 の 変 化 に よ り
血中濃度が顕著に変動することから治療薬物モニタリングの対象となって
い る ．特 異 性 と 感 度 に 優 れ る 本 法 は ，治 療 薬 物 モ ニ タ リ ン グ を 実 施 す る た め
の分析法としても充分適用可能であることが分かった．
Table 2-3
Pharmacokinetic parameters of VPA after oral administration of 150
mg/kg VPA-Na to (N) normal, (M) maltose ingested normal, and (D) diabetic rats,
respectively (n = 5 each).
Parameter
a
C max （ g/mL）
t max （ hr）
AUC（ mg･hr/mL）
k el （ hr -1 ）
t 1/2 （ hr）
Vd（ mL）
Cl（ mL/hr）
N
130.8
0.5
186.1
0.82
0.91
259.1
200.0
M
±4.1
±0
±4.1
±0.2
±0.2
±45.8
±3.4
98.5
0.5
90.3
1.40
0.52
356.4
446.4
b
±34.3
±0
±28.6
±0.2
±0.1
±120
±102
D
58.1
0.5
80.9
0.40
1.72
1229
487.8
±8.5
±0
±10.4
±0
±0.1
±219
±69.4
Values are mean ± standard error (SE).
a
C max , maximum drug concentration; t max , maximum drug concentration time;
AUC, area under the concentration-time curve for 5 hr; k el , elimination rate
constant; t 1/2 , half-life period; Vd, distribution volume; Cl, clearance
b
Multiple doses of maltose were given to normal rats with a single dos e of VP-Na.
- 38 -
Fig. 2-10
Effect of hyperglycemia on (A) AUC, (B) t 1/2 , and (C) Vd (±SE) of
VPA in (N) normal, (M) maltose ingested normal, and (D) diabetic rats,
respectively (n = 5 each).
Significant differences (* p < 0.05, ** p < 0.01) were determined by using
one-way analysis of variance (ANOVA), followed by the Scheffe’s method.
Maltose (1.8 g/kg) was orally ingested by a normal rat every 1 hr after 16 hr
fasting.
2-5
考察
キ ノ ン の 還 元 前 置 波 を 利 用 し た VPA の HPLC-ECD の 感 度 を 評 価 す る た め
に ， 本 法 の 検 出 限 界 を 既 報 の HPLC-UV [83], HPLC-FL [84], LC-MS [85],
GC-FID [86] と 対 比 し た （ Table 2-4）． 本 法 は ， 他 の 分 析 法 と 比 較 し て 高 感
度 に VPA を 定 量 で き る こ と を 明 ら か に し た ． ま た ， HPLC-UV, HPLC-FL は
VPA の 検 出 の た め に 誘 導 体 化 操 作 が 必 要 で あ る 上 に ，前 処 理 操 作 が 煩 雑 で あ
る ．ま た ，LC-MS は 装 置 が 高 価 で あ り ，生 体 試 料 分 析 に お い て 精 度 に 優 れ た
方 法 と す る に は ，試 料 の ク リ ー ン ア ッ プ 操 作 等 に 高 い 分 析 技 術 が 要 求 さ れ る
場 合 が あ る ． 以 上 の こ と か ら ， 本 HPLC-ECD は ， 感 度 と 特 異 性 に 優 れ る 分
析 法 で あ る こ と を 示 し た ．ま た ，分 析 装 置 導 入 に お け る 価 格 面 を 考 慮 し た 場
合 ， 他 の VPA の 分 析 法 と 比 較 し て 有 利 で あ る と 考 え ら れ る ．
さ ら に ，FFA の HPLC-ECD に つ い て も 検 出 限 界 を 指 標 に ，既 報 の HPLC-UV
[98], GC-FID [99] と 対 比 し た と こ ろ ，い ず れ も 本 法 の 方 が 検 出 感 度 に 優 れ て
い た ．し か し ，HPLC-FL [100] と 比 較 し た 場 合 ，本 法 の 検 出 限 界 は 劣 っ て い
た ． HPLC-FL で は ， FFA の 高 感 度 検 出 の た め 4-(5,6-dimethoxy-2phthalimidinyl) phenylsulfonyl semipiperazide に よ る プ レ カ ラ ム 誘 導 体 化 を
- 39 -
行 っ て い る ．こ れ に 対 し て ，本 法 は ，検 出 の た め の 誘 導 体 化 が 不 要 で あ る た
め，生体試料分析が比較的簡易であると考えられる．さらに，本研究では，
FFA の HPLC-ECD の 分 析 カ ラ ム に 内 径 1.0 mm の マ イ ク ロ ボ ア カ ラ ム を 活 用
し た ．キ ノ ン 試 薬 と し て ビ タ ミ ン K 3 を 用 い ，内 径 4.0 mm の コ ン ベ ン シ ョ ナ
ル カ ラ ム を 用 い た FFA の HPLC-ECD の 検 出 限 界 は ， 50 pmol on column で あ
り [97]， 本 法 は 約 50 倍 の 高 感 度 化 を 達 成 で き た ．
以 上 の よ う に ， キ ノ ン の 還 元 前 置 波 に 基 づ く 酸 測 定 を 利 用 し た VPA お よ
び FFA の HPLC-ECD は ， 感 度 と 特 異 性 に 優 れ る 分 析 法 で あ る こ と が 分 か っ
た．
Table 2-4
Method
Detection limit of valproic acid by various methods.
Column
(size, length x inter diameter)
Injection
volume
(L)
Detection Ref.
limit (ng)
The present C30 (150 mm x 1.0 mm)
HPLC-ECD
5
0.53
－
HPLC-UV
HPLC-FL
ODS (250 mm x 4.6 mm)
ODS (250 mm x 4.0 mm)
50
10
5.0
0.87
[83]
[84]
LC-MS
GC-FID
ODS (100 mm x 4.6 mm)
Cyanopropylphenyldimethylsilo
xanefused silica capillary
(25 m x 0.22 mm)
5
2
1.5
1.6
[85]
[86]
本 法 は ， VP-Na 投 与 後 の ラ ッ ト 血 中 VPA の 薬 物 動 態 分 析 に 適 用 で き る こ
と を 示 し た ．健 常 ラ ッ ト ，マ ル ト ー ス 負 荷 ラ ッ ト ，糖 尿 病 ラ ッ ト の 血 中 VPA
の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を 取 得 し ， VPA の PK パ ラ メ ー タ を 算 出 で き た ．
マ ル ト ー ス 負 荷 ラ ッ ト お よ び 糖 尿 病 ラ ッ ト の AUC は 健 常 ラ ッ ト と 比 較 し て
有 意 に 減 少 し （ Fig. 2-10A）， 糖 尿 病 ラ ッ ト の Vd は 健 常 ラ ッ ト と 比 較 し て 有
意 に 増 加 し て い た （ Fig. 2-10C）． こ れ ら の PK パ ラ メ ー タ の 変 化 よ り ， ラ ッ
ト で は BG の 上 昇 に 伴 っ て VPA の 代 謝 と 排 泄 が 促 進 さ れ て い る と 考 察 で き た ．
AUC は 体 循 環 に 流 入 し た 薬 物 の 総 量 で あ り ， Vd は 血 漿 中 タ ン パ ク 結 合 率
の 低 下 お よ び 組 織 結 合 率 の 上 昇 な ど ，血 中 濃 度 を 低 下 さ せ る 要 因 に よ っ て 増
大 す る ．VPA と ア ル ブ ミ ン 間 の タ ン パ ク 結 合 に 関 し て ，次 の よ う な 報 告 が あ
- 40 -
る ． 健 常 人 と 比 較 し て ， 糖 尿 病 患 者 に お け る VPA の タ ン パ ク 結 合 率 は 低 下
し [101]， 血 中 VPA の 遊 離 型 の 割 合 は 増 加 す る [102]． ま た ， FFA と ア ル ブ
ミ ン 間 の タ ン パ ク 結 合 に 関 し て ，次 の よ う な 報 告 が あ る ．健 常 人 と 比 較 し て ，
糖 尿 病 患 者 に お け る タ ン パ ク 結 合 型 の FFA は 増 加 す る [103,104]． ア ル ブ ミ
ン の 結 合 部 位 に お い て VPA と FFA は 競 合 す る [105]． さ ら に ， 高 血 糖 状 態
お よ び 糖 尿 病 時 に お け る 血 中 ア ル ブ ミ ン の 糖 化 に よ っ て [106]， ア ル ブ ミ ン
と 結 合 す る 薬 物 は ，そ の タ ン パ ク 結 合 が 阻 害 さ れ る [105]．VPA も ア ル ブ ミ
ン と 結 合 す る 薬 物 の ひ と つ で あ る ．従 っ て ，高 血 糖 状 態 で は こ れ ら の メ カ ニ
ズ ム の 寄 与 に よ っ て 遊 離 型 VPA が 増 加 し ， VPA の 代 謝 と 排 泄 が 促 進 さ れ る
と 考 え ら れ て い る ．本 研 究 で は ，こ れ ら の 報 告 を 支 持 す る 結 果 を 高 血 糖 状 態
に お け る VPA の PK パ ラ メ ー タ の 変 化 と し て 捉 え る こ と が で き た と 思 わ れ る ．
さ ら に ， 本 研 究 で 実 践 し た VPA と FFA の 複 合 動 態 解 析 で は ， マ ル ト ー ス
負 荷 ラ ッ ト に お い て VP-Na の 投 与 に よ り FFA の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル が
大 き く 異 な る こ と が 観 察 さ れ た ．す な わ ち ，VP-Na 未 投 与 で あ れ ば マ ル ト ー
ス を 投 与 後 ， BG の 上 昇 に よ り 血 中 FFA が 低 下 し た が （ Fig. 2-9B）， VP-Na
を 投 与 し た 場 合 ， マ ル ト ー ス の 投 与 前 後 に お い て 血 中 総 FFAs は ほ と ん ど 変
化 し な か っ た （ Fig. 2-8G）．
VPA と FFA の 相 互 作 用 に 関 し て ， 次 の よ う な 報 告 が あ る ． 血 中 VPA は ，
FFA の β 酸 化 に 関 わ る 酵 素 に 対 し て 競 合 的 に 作 用 [77]， あ る い は FFA の β
酸 化 を 阻 害 す る [79-81]．ア ル ブ ミ ン に 結 合 し て い る VPA は ，血 中 FFA に よ っ
て タ ン パ ク 結 合 部 位 か ら 置 換 さ れ る [107,108]．遊 離 型 の VPA は ，速 や か に
β 酸 化 を 介 し て 代 謝 さ れ る [77]．従 っ て ，VP-Na を 投 与 し た マ ル ト ー ス 負 荷
ラ ッ ト の BG 上 昇 に 伴 い 血 中 FFA が 変 化 し な か っ た の は ，VPA 共 存 に よ っ て
FFA の β 酸 化 が 阻 害 を 受 け ， そ の 結 果 VPA が FFA に 比 べ て 優 先 的 に 代 謝 さ
れ た た め と 考 え ら れ る ． 本 研 究 で 得 ら れ た 血 中 VPA， 血 中 FFA の 時 間 － 濃
度 プ ロ フ ァ イ ル は ，こ れ ら の 報 告 を 支 持 す る 結 果 で あ り ，血 中 FFA に 比 べ て
VPA が 優 先 的 に 代 謝 さ れ る こ と を 裏 付 け る も の と 思 わ れ る ．
以 上 の よ う な 複 合 動 態 解 析 に よ っ て ， VPA， FFA， BG を 計 測 で き ， VPA
投 与 後 5 時 間 に わ た っ て VPA， FFA， BG の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を 得 ら
れることを示した．
キ ノ ン の 還 元 前 置 波 を 利 用 し た HPLC-ECD で は ， 微 少 量 の 血 漿 試 料 で 血
中 VPA と FFA を 測 定 で き た ．従 っ て ，同 一 個 体 に つ い て の VPA と FFA の 動
態 分 析 が 可 能 で あ り ，正 確 な PK パ ラ メ ー タ を 算 出 す る 上 で 有 利 と 思 わ れ る ．
本 法 は ， 糖 脂 質 代 謝 調 節 を in vivo で 観 察 す る た め の 複 合 動 態 解 析 へ 展 開 も
可能と考えられた．
- 41 -
2-6
小括
本 章 で は ， キ ノ ン の 還 元 前 置 波 に 基 づ く 酸 測 定 法 に よ り VPA を 電 気 化 学
的に検出できることをボルタンメトリーで明らかにした．本検出モードを
HPLC の フ ロ ー 型 検 出 部 に 組 み 込 む た め に ， 移 動 相 と カ ラ ム か ら な る 分 離 系
に キ ノ ン 試 薬 溶 液 を ポ ス ト カ ラ ム 方 式 で 合 流 さ せ る 2 流 路 系 の HPLC-ECD
を 構 築 し ， VPA の 分 離 分 析 法 と し て 確 立 し た ．
固 定 相 に は ト リ ア コ ン チ ル 基 （ C30） を 修 飾 し た シ リ カ 系 カ ラ ム を 用 い ，
VPA と IS を 15 min 以 内 に 検 出 す る こ と が で き た ． 本 法 の 定 量 範 囲 は ， 0.36
～ 14.4 g/mL で あ り ， 直 線 性 も 良 好 で あ っ た （ r = 0.999）． 血 中 VPA 測 定 を
行 う 上 で ，充 分 な 定 量 範 囲 と 感 度 を 有 す る こ と が 分 か っ た ．本 法 は ，HPLC-UV，
HPLC-FL，LC-MS な ど の 他 法 と 比 較 し て ，誘 導 体 化 操 作 ，煩 雑 な 前 処 理 方 法
お よ び ク リ ー ン ア ッ プ 操 作 が 不 要 で あ り ，VPA を 特 異 的 に 検 出 で き る 利 点 が
あることを明らかにした．
さ ら に ， 本 法 に よ る VP-Na 投 与 後 の ラ ッ ト 血 中 VPA の 薬 物 動 態 分 析 と 同
時 に 血 中 FFA と BG も 計 測 す る 複 合 動 態 解 析 へ の 適 用 を 検 討 し た ． そ こ で ，
キ ノ ン の 還 元 前 置 波 に 基 づ く 酸 測 定 法 に よ る FFA の HPLC-ECD も 構 築 し た ．
ア ラ キ ド ン 酸 ，リ ノ ー ル 酸 ，オ レ イ ン 酸 ，パ ル ミ チ ン 酸 ，ス テ ア リ ン 酸 と IS
を 30 min 以 内 に 検 出 す る こ と が で き た ．本 法 の 定 量 範 囲 は ，0.75～ 160 mol/L
で あ り ， 直 線 性 も 良 好 で あ っ た （ r = 0.999）． 血 中 FFA 測 定 を 行 う 上 で ， 充
分な定量範囲と感度を有することが分かった．
VPA お よ び FFA の HPLC-ECD お よ び SMBG 用 の 血 糖 測 定 器 を 用 い て ，健
常 ラ ッ ト ，マ ル ト ー ス 負 荷 ラ ッ ト ，糖 尿 病 ラ ッ ト に つ い て ，血 中 VPA，血 中
総 FFAs，血 中 FFA 分 画 ，BG の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を 取 得 し ，複 合 動 態
解 析 を 実 践 し た ．ラ ッ ト の 尾 静 脈 よ り 経 時 的 に 採 血 し た 約 50 L の 血 液 で 血
中 VPA， 血 中 FFA， BG を 計 測 で き ， VP-Na 投 与 後 5 時 間 に わ た っ て 詳 細 な
時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を 取 得 す る こ と が で き た ． 得 ら れ た VPA の 時 間 －
濃 度 プ ロ フ ァ イ ル よ り ， PK パ ラ メ ー タ を 算 出 で き た ．
本 法 は ，VPA の 作 用 機 序 の 詳 細 や ，VPA と FFA の 相 互 作 用 ，あ る い は VPA
と血中アルブミン間のタンパク結合に関する詳細を解明するための分析法
と し て 有 用 で あ り ， 糖 脂 質 代 謝 調 節 を in vivo で 観 察 す る た め の 分 析 法 と し
て 適 用 可 能 と 考 え ら れ る ． 今 後 ， よ り 適 切 に VPA の 薬 物 療 法 を 実 施 す る た
めに有益な手法となると思われる．
- 42 -
第 3 章
トロロックスの酸化前置波によるテオフィリンの電気化学検出
HPLC と 血 中 の 薬 物 動 態 分 析 へ の 応 用
3-1
緒言
テ オ フ ィ リ ン は 気 管 支 拡 張 作 用 を 有 し ，気 管 支 喘 息 や 慢 性 気 管 支 炎 な ど の
治 療 に 臨 床 適 応 さ れ る ． テ オ フ ィ リ ン の 有 効 血 中 濃 度 範 囲 は 狭 く [成 人 ：
56-111 mol/L（ 10-20 g/mL），幼 児：28-72 mol/L（ 5-13 g/mL）] [109,110] ，
ま た ， 血 中 濃 度 が 111 mol/L を 超 え た 場 合 ， 様 々 な 副 作 用 が 現 れ る
[110-112]．特 に 重 大 な 副 作 用 と し て ，痙 攣 ，意 識 障 害 ，急 性 脳 症 ，横 紋 筋 融
解 症 な ど が あ り ， い ず れ も 重 積 症 に な る 傾 向 が あ る [113]． 特 に 乳 幼 児 に お
い て は 痙 攣 に よ る 後 遺 症 あ る い は 死 亡 に 至 る 場 合 が あ る ．こ れ ら 副 作 用 が 起
こ っ て い る 間 ，テ オ フ ィ リ ン の 血 中 濃 度 は 中 毒 域 に 達 し て い な い 場 合 も あ り
[114]，テ オ フ ィ リ ン の 血 中 濃 度 と 副 作 用 発 生 の メ カ ニ ズ ム に つ い て の 因 果 関
係 は 不 明 な 点 が 多 い ．さ ら に ，テ オ フ ィ リ ン の 代 謝 速 度 は ，個 々 の 患 者 ご と
に 異 な る [115,116]． 従 っ て ， 臨 床 で は テ オ フ ィ リ ン の 治 療 薬 物 モ ニ タ リ ン
グを実施し，個々の患者に適した投与設計で薬物療法を実施している．
従 来 ，血 中 テ オ フ ィ リ ン の 分 析 法 と し て GC-MS [117], HPLC-UV [118-122],
LC-MS [123-125]，CE [126]，蛍 光 偏 光 イ ム ノ ア ッ セ イ（ FPIA） [127-131] 等
が あ る ． 特 に HPLC-UV は 多 く の 病 院 や 試 験 室 が 保 有 す る 分 析 装 置 で あ る た
め ，血 中 テ オ フ ィ リ ン の 分 析 法 と し て 利 用 頻 度 が 高 い が ，低 濃 度 領 域 に お け
る 血 中 テ オ フ ィ リ ン の 分 析 に お い て は 感 度 が 不 足 し て い る ．さ ら に ，カ フ ェ
イ ン ，テ オ フ ィ リ ン 代 謝 物 ，キ サ ン チ ン 誘 導 体 等 も 検 出 さ れ る の で ，特 異 性
が 乏 し い こ と が 指 摘 さ れ て い る ．テ オ フ ィ リ ン の 分 析 の 対 象 が 新 生 児 や 乳 幼
児 ，あ る い は 高 齢 者 の 場 合 ，採 血 で き る 血 液 量 が 少 量 で あ る た め ，分 析 に 要
す る 血 液 量 が 少 な い 方 法 が 望 ま れ る ．従 っ て ，新 生 児 ，乳 幼 児 ，高 齢 者 に 対
し て ， 血 中 テ オ フ ィ リ ン の 複 数 回 測 定 を 行 っ て テ オ フ ィ リ ン の PK パ ラ メ ー
タ を 算 出 す る こ と は 極 め て 困 難 で あ る ．こ の よ う に ，テ オ フ ィ リ ン の 治 療 薬
物 モ ニ タ リ ン グ や 薬 物 動 態 分 析 を 実 践 す る 場 合 ，使 用 す る 分 析 法 が 高 感 度 か
つ特異的であるうえに微少の試料量で測定可能である分析法が熱望されて
いる．
こ の 要 望 に 応 え る 分 析 法 と し て ，HPLC-ECD を 活 用 す る こ と と し た ．テ オ
フ ィ リ ン は ， Fig. 3-1 に 示 す よ う な 1 電 子 1 プ ロ ト ン が 関 与 す る 電 極 酸 化 反
応 に よ っ て 生 成 す る ラ ジ カ ル を 経 て ，テ オ フ ィ リ ン の 二 量 体 あ る い は 後 続 の
1 電 子 が 関 与 す る 電 極 酸 化 反 応 に よ っ て 1,3-ジ メ チ ル 尿 酸 が 生 成 す る こ と が
知 ら れ て お り [132]， テ オ フ ィ リ ン を 電 解 酸 化 で 検 出 す る 方 法 と し て グ ラ フ
ァ イ ト 電 極 ，グ ラ ッ シ ー カ ー ボ ン 電 極 お よ び ボ ロ ン ド ー プ ダ イ ヤ モ ン ド 電 極
- 43 -
を 作 用 電 極 に 用 い た ボ ル タ ン メ ト リ ー [133,134] あ る い は HPLC-ECD
[135-138] が 報 告 さ れ て い る ． し か し ， テ オ フ ィ リ ン の 電 解 酸 化 に は 作 用 電
極 の 電 位 窓 の 範 囲 で 比 較 的 高 い 電 位 を 印 加 す る 必 要 が あ る た め ，テ オ フ ィ リ
ンの代謝物であるキサンチン誘導体や他の生体成分も電解酸化で検出され
る 上 に ，反 応 の 場 で あ る 作 用 電 極 表 面 の 劣 化 が 危 惧 さ れ る ．テ オ フ ィ リ ン を
選 択 的 に 検 出 す る た め に ，修 飾 電 極 あ る い は 酵 素 電 極 を 利 用 し た 方 法 が 開 発
さ れ て い る [139-148]． 修 飾 電 極 と し て は ， 単 層 ま た は 多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ
ュ ー ブ を 修 飾 し た グ ラ ッ シ ー カ ー ボ ン 電 極 ，あ る い は ポ リ メ チ レ ン グ リ ー ン
をインプリント高分子膜として修飾したグラッシーカーボン電極がある
[140-143]．一 方 ，酵 素 電 極 と し て は ，金 電 極 表 面 に 形 成 さ せ た ア ル キ ル チ オ
ールの自己組織化単分子膜にテオフィリンオキシダーゼを固定した電極が
あ る [144,145]．こ れ ら の 電 極 を 用 い た テ オ フ ィ リ ン の ボ ル タ ン メ ト リ ー は ，
製 剤 分 析 ，食 品 分 析 ，生 体 試 料 分 析 へ 応 用 さ れ て い る ．し か し ，製 剤 分 析 に
は 約 10～ 100 mg の 製 剤 ， 食 品 分 析 で は 約 10 mL の 飲 料 が 試 料 と し て 使 用 さ
れ て お り [140,141,145]，こ れ ら の 方 法 は 血 中 テ オ フ ィ リ ン 定 量 へ の 適 用 は 図
ら れ 難 い ．ま た ，生 体 試 料 分 析 で は 標 準 血 清 や 尿 に テ オ フ ィ リ ン を 添 加 し た
試 料 に つ い て 分 析 す る 事 例 が 多 く [146,147]， 薬 物 動 態 分 析 等 の 実 分 析 へ の
応 用 に は 至 っ て い な い ．ま た ，修 飾 電 極 や 酵 素 電 極 の 多 く は ，測 定 毎 に 実 験
者 が 作 製 し た も の で あ り ，電 極 の 入 手 や 適 正 な 維 持 管 理 の 点 か ら ，汎 用 性 の
点で有益な分析法としての展開は難しいと思われる．
Fig. 3-1
Products and mechanism of the electrochemical oxidation of
theophylline at pyrolytic graphite electrode [132].
- 44 -
トロロックスを含む非緩衝液において微量の塩基物質の存在下でボルタ
ン メ ト リ ー を 行 う と ，ボ ル タ モ グ ラ ム 上 に 塩 基 物 質 の 濃 度 依 存 的 な 酸 化 前 置
波 が 出 現 す る [26]．こ の 検 出 方 式 を 活 用 す れ ば ，塩 基 物 質 が 電 極 活 性 物 質 あ
る い は 電 極 不 活 性 物 質 で あ っ て も ，ト ロ ロ ッ ク ス の 電 解 酸 化 を 介 し て 塩 基 と
し て 検 出 可 能 で あ る ． テ オ フ ィ リ ン の 場 合 ， 酸 化 前 置 波 に よ る 検 出 は ， Fig.
3-1 の テ オ フ ィ リ ン 自 体 の 酸 化 電 位 よ り も 負 電 位 側 で の 電 極 反 応 を 利 用 す る
こととなり，作用電極表面の劣化が起こり難い利点がある．
本 研 究 で は ，テ オ フ ィ リ ン が ト ロ ロ ッ ク ス の 酸 化 前 置 波 の 波 高 測 定 に よ っ
て，電気化学的に定量できることを示すとともに，テオフィリンの
HPLC-ECD を 構 築 し た ．テ オ フ ィ リ ン の 薬 物 動 態 分 析 に お け る 有 用 性 を 示 す
た め に ，血 中 テ オ フ ィ リ ン の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を 取 得 し ，テ オ フ ィ リ
ン の PK パ ラ メ ー タ が 算 出 可 能 か 検 討 し た ． さ ら に ， 本 法 が 治 療 薬 物 モ ニ タ
リ ン グ に 適 用 で き る 分 析 法 と し て の 実 用 性 を 明 ら か に す る た め に ，分 析 に 必
要な血液試料量の低減，簡易な前処理方法の設計について検討を行った．
3-2
トロロックスの酸化前置波に基づく塩基測定
本 節 で は ，塩 基 物 質 の 電 気 化 学 検 出 に 利 用 し た ト ロ ロ ッ ク ス の 酸 化 前 置 波
の概要を述べるとともに塩基物質定量の基本について述べる．
ト ロ ロ ッ ク ス を 含 む 非 緩 衝 液 に つ き ，電 位 を 負 電 位 側 か ら 正 電 位 側 に 走 査
し て ボ ル タ ン メ ト リ ー を 行 う と ，ボ ル タ モ グ ラ ム 上 に 1 段 の 酸 化 波 が 生 じ る
（ Fig. 3-2， 曲 線 a）． Malyszko ら は ， メ タ ノ ー ル 溶 液 お よ び 酢 酸 溶 液 中 に お
け る ト ロ ロ ッ ク ス の 電 極 酸 化 反 応 は ， Fig. 3-3 の よ う に 進 行 す る と 報 告 し て
い る [149,150]． す な わ ち ， ク ロ マ ノ ー ル 骨 格 の 6 位 の ヒ ド ロ キ シ ル 基 か ら
プ ロ ト ン が 解 離 し て 電 解 酸 化 さ れ た 結 果 ，フ ェ ノ キ シ ラ ジ カ ル が 生 成 す る も
のと考えられている．
こ の 溶 液 の 電 解 酸 化 を 微 量 の 塩 基 物 質 （ Fig. 3-2 で は ， テ オ フ ィ リ ン ） の
存 在 下 で 行 う と ボ ル タ モ グ ラ ム 上 に は ト ロ ロ ッ ク ス の 酸 化 波 （ Fig. 3-2， 曲
線 a）よ り も 負 電 位 側 に 新 た な 酸 化 波（ 酸 化 前 置 波 ）が 現 れ る（ Fig. 3-2，曲
線 b）．酸 化 前 置 波 の 出 現 は ，溶 媒 よ り 塩 基 物 質 の 方 が ト ロ ロ ッ ク ス の 6 位 の
ヒ ド ロ キ シ ル 基 か ら プ ロ ト ン の 引 き 抜 き を 容 易 に す る た め ，よ り 低 エ ネ ル ギ
ー 側 ，す な わ ち 負 電 位 側 で 電 解 酸 化 が 進 行 し た た め と 考 え て い る ．酸 化 前 置
波 の 波 高 （ Fig. 3-2, i H ） は ， 塩 基 物 質 の 濃 度 に 比 例 す る ． 従 っ て ， 酸 化 前 置
波 の 波 高 の 計 測 に よ っ て 塩 基 物 質 の 定 量 が 可 能 と な る ．さ ら に ，酸 化 前 置 波
の 出 現 電 位 は ， 塩 基 物 質 の 塩 基 の 強 弱 と 関 係 が あ る ． す な わ ち ， pK b が 小 さ
い塩基物質由来の酸化前置波ほど，より負電位に出現する．
- 45 -
ト ロ ロ ッ ク ス の 酸 化 前 置 波 に よ る 塩 基 の 定 量 を HPLC-ECD へ 適 用 す る 場
合 ，酸 化 前 置 波 の 現 れ る 電 位 に 印 加 電 位 を 設 定 し て ク ロ マ ト グ ラ ム を 測 定 し ，
酸化電流を測定することで塩基の定量が可能となる．
Fig. 3-2
Voltammograms of 1.5 mmol/L trolox in the (a) absence and (b)
presence of 1.0 mmol/L theophylline in acetonitrile containing 20 mmol/L LiClO 4 .
PFC, Ag/AgCl, and Pt were used as working, reference, and counter electrodes,
respectively.
Fig. 3-3
Scan rate was set at 20 mV/s.
Products and mechanism of the electrochemical oxidation of trolox at
glassy carbon electrode [149,150].
- 46 -
3-3
3-3-1
実験材料と実験方法
トロロックスのボルタンメトリー
第 2 章（ 2-3-1）と 同 じ 構 成 の ボ ル タ ン メ ト リ ー 装 置 を 使 用 し た ．ト ロ ロ ッ
ク ス を 含 む 支 持 電 解 質 溶 液 （ ト ロ ロ ッ ク ス 試 薬 溶 液 ） に は ， 0.54 mmol/L ト
ロ ロ ッ ク ス と 13 mmol/L 過 塩 素 酸 リ チ ウ ム を 含 む ア セ ト ニ ト リ ル 溶 液 を 使 用
した．トロロックス試薬溶液にテオフィリンを溶解して測定溶液を調製し，
そ の 20 mL を 電 解 セ ル に 加 え て ボ ル タ モ グ ラ ム を 測 定 し た ．走 査 速 度 は ，20
mV/s に 設 定 し た ．
3-3-2
テ オ フ ィ リ ン の 電 気 化 学 検 出 HPLC
トロロックスの酸化前置波を活用した塩基測定をフロー型の検出部とし
て HPLC に 組 み 込 む た め に ，移 動 相 と カ ラ ム か ら な る 分 離 系 に ト ロ ロ ッ ク ス
試薬溶液をポストカラム方式で合流させる 2 流路系のシステムを構築した．
そ こ で ， Fig. 3-4 に 示 す よ う に ， デ ガ ッ サ ー （ DG-980-50, 日 本 分 光 製 ）， ポ
ン プ （ 301 M, フ ロ ム 製 ）， サ ン プ ル イ ン ジ ェ ク タ ー （ 7725, レ オ ダ イ ン 製 ），
マ イ ク ロ ボ ア カ ラ ム （ Inertsil SIL 100A, 100 mm×1.0 mm i.d., 3 m， GL サ イ
エ ン ス 製 ）， カ ラ ム オ ー ブ ン （ CTO-10ASvp， 島 津 製 作 所 製 ）， 電 気 化 学 検 出
器 （ LC-4C, BAS 製 ） を 用 い て 構 築 し た ．
フ ロ ー 型 電 解 セ ル（ ラ ジ ア ル フ ロ ー セ ル ，BAS 製 ）の 作 用 電 極 は グ ラ ッ シ
ー カ ー ボ ン（ 円 盤 型：直 径 6 mm），参 照 電 極 は Ag/AgCl，対 極 は ス テ ン レ ス
を 用 い た ．作 用 電 極 と セ ル ブ ロ ッ ク 間 に 挟 み 込 む セ ル ス ペ ー サ ー の 厚 さ は 12
m と し た の で ， セ ル 容 量 と し て は 0.33 L と な っ た ．
移 動 相 は ア セ ト ニ ト リ ル ， ト ロ ロ ッ ク ス 試 薬 溶 液 は 1.5 mmol/L ト ロ ロ ッ
ク ス と 20 mmol/L LiClO 4 を 含 む ア セ ト ニ ト リ ル を 使 用 し た ． カ ラ ム 温 度 は
20℃ ，移 動 相 の 流 速 は 50 L/min，ト ロ ロ ッ ク ス 試 薬 溶 液 の 流 速 は 90 L/min，
印 加 電 位 は +1.1 V vs. Ag/AgCl， 試 料 注 入 量 は 5 L と し た ．
- 47 -
Fig. 3-4 Block diagram of the HPLC-ECD system.
MP, Mobile phase; TS, trolox solution; DG, degasser; P 1 and P 2 , pumps; S, sample
injector; column, normal-phase silica gel column (Inertsil SIL 100A, 100 mm x 1.0
mm i.d., 3 m); D, electrochemical detector, electrochemical cell and potentiostat;
R, recorder.
3-3-3
実験動物とテオフィリン投与
16 時 間 絶 食 し た Wistar 系 雄 性 ラ ッ ト（ 8 週 齢 ）に テ オ フ ィ リ ン を 溶 解 し た
水 溶 液 を 10 mg/kg の 薬 物 量 で 経 口 投 与 し た ．投 与 前 ，投 与 0.5, 1, 2, 3, 5, 8, 24
時 間 後 に 尾 静 脈 か ら 採 血 し た ．血 液 は ヘ パ リ ン 処 理 し ，遠 心 分 離（ 3000 r.p.m.,
10 min）し て 血 漿 を 調 製 し た ． 第 3 章 の す べ て の 動 物 実 験 は ，東 京 薬 科 大 学
「実験動物ガイドライン」に基づいて充分な倫理的な配慮の下で実施した．
3-3-4
血漿試料の前処理方法
血 漿 10 L に ，ク ロ ロ ホ ル ム － イ ソ プ ロ パ ノ ー ル（ 50:50, v/v）混 液 0.2 mL
を 加 え ， ボ ル テ ッ ク ス ミ キ サ ー で 30 分 間 混 和 し て ク ロ ロ ホ ル ム 層 中 に テ オ
フ ィ リ ン を 抽 出 し た ．遠 心 分 離（ 3000 g, 10 min）を 行 っ て ク ロ ロ ホ ル ム 層 を
分 取 し た ． ク ロ ロ ホ ル ム 層 は 70℃ で 蒸 発 乾 固 し ， 得 ら れ た 残 渣 に 0.1 mL の
ア セ ト ニ ト リ ル － ク ロ ロ ホ ル ム（ 90:10, v/v）混 液 を 加 え ，テ オ フ ィ リ ン を 溶
解 さ せ た ． こ れ を 孔 径 0.45 m の メ ン ブ レ ン フ ィ ル タ ー （ Ultrafree-MC,
Bedford 製 ） で ろ 過 し て 検 液 と し た ． マ イ ク ロ シ リ ン ジ を 用 い て 検 液 5 L
を HPLC に 注 入 し ク ロ マ ト グ ラ ム を 測 定 し た ．
- 48 -
3-4
3-4-1
実験結果
テオフィリン由来のトロロックスの酸化前置波
ト ロ ロ ッ ク ス の 酸 化 前 置 波 に よ る 塩 基 測 定 で ，テ オ フ ィ リ ン の 検 出 が 可 能
か 検 討 し た ．ト ロ ロ ッ ク ス 試 薬 溶 液 を 電 解 セ ル に 加 え て ボ ル タ ン メ ト リ ー を
行 っ た ．電 位 を +0.05 か ら +1.0 V vs. Ag/AgCl へ 走 査 し た と こ ろ ，Fig. 3-5A（ a）
に 示 す よ う な ボ ル タ モ グ ラ ム が 得 ら れ ， +0.85 V vs. Ag/AgCl に ト ロ ロ ッ ク ス
の 酸 化 波 が 現 わ れ た ．こ の 溶 液 中 に テ オ フ ィ リ ン を 0.14 mmol/L，0.36 mmol/L，
0.54 mmol/L に な る よ う に 添 加 し た と こ ろ ， そ れ ぞ れ Fig. 3-5A（ b, c, d） に
示 す よ う に ，+0.75 V vs. Ag/AgCl に 酸 化 前 置 波 が 得 ら れ た ． こ の 酸 化 前 置 波
の ピ ー ク 電 流 値 と テ オ フ ィ リ ン の 濃 度 の 相 関 を 調 べ た と こ ろ ， 0.01 ～ 0.54
mmol/L の 範 囲 で よ い 直 線 性 （ r = 0.998） を 示 し た （ Fig. 3-5B）． こ の よ う な
電 解 液 の 組 成 に お け る 酸 化 前 置 波 測 定 に よ っ て ，テ オ フ ィ リ ン の 定 量 が 可 能
であることを示した．
ト ロ ロ ッ ク ス の 酸 化 前 置 波 に 基 づ く テ オ フ ィ リ ン の 検 出 に お い て ，構 造 が
類 似 し て い る キ サ ン チ ン 誘 導 体 も 塩 基 と し て 検 出 さ れ る 可 能 性 が あ る ．そ こ
で ，テ オ フ ィ リ ン の 代 謝 物 あ る い は 関 連 の 生 体 成 分 で あ る カ フ ェ イ ン ，テ オ
ブ ロ ミ ン ，尿 酸 ，3-メ チ ル キ サ ン チ ン ，１ -メ チ ル キ サ ン チ ン ，1-メ チ ル 尿 酸 ，
3-メ チ ル 尿 酸 ， 1,3-ジ メ チ ル 尿 酸 に つ い て 検 討 し た ． 本 法 に お い て ， 酸 化 前
置 波 は ，塩 基 物 質 の pK b が 小 さ い ほ ど 負 電 位 に ，大 き い ほ ど 正 電 位 に 出 現 す
る 特 性 が あ る ． 従 っ て ， pK b が 非 常 に 大 き く ， 非 常 に 弱 い 塩 基 物 質 の 場 合 ，
酸 化 前 置 波 が 出 現 せ ず ， 検 出 不 能 と な る ． テ オ フ ィ リ ン の pK b は 実 験 値 で
11.5 [151]，コ ン ピ ュ ー タ ソ フ ト（ Advanced Chemistry Development (ACD/Labs)
Software V8.14） に よ る シ ミ ュ レ ー シ ョ ン で 12.3 で あ っ た ． 上 述 し た キ サ ン
チン誘導体についてコンピュータソフトによるシミュレーションを行った
と こ ろ ，pK b は い ず れ も 13 以 上 で あ っ た ．従 っ て ，こ れ ら の キ サ ン チ ン 誘 導
体 由 来 の 酸 化 前 置 波 が 出 現 す る な ら ば ，テ オ フ ィ リ ン 由 来 の 酸 化 前 置 波 よ り
正 電 位 側 で あ る と 予 想 さ れ ，こ れ ら の キ サ ン チ ン 誘 導 体 を 本 法 で 検 出 す る の
は 困 難 と 考 え ら れ る ．実 際 に ，試 薬 と し て 入 手 可 能 で あ っ た カ フ ェ イ ン ，テ
オ ブ ロ ミ ン ，尿 酸 ，3-メ チ ル キ サ ン チ ン に つ い て ト ロ ロ ッ ク ス の ボ ル タ ン メ
トリーを行ったところ，酸化前置波は観測されなかった．
- 49 -
Fig. 3-5
(A) Linear potential sweep voltammograms of 0.54 mmol/L trolox with
and without theophylline at a PFC disk electrode in acetonitrile containing 13
mmol/L LiClO 4 and (B) calibration curve of theophylline.
(A) Concentration of theophylline: (a) 0, (b) 0.14, (c) 0.36, and (d) 0.54 mmol/L
Sweep rate: 20 mV/s
3-4-2
3-4-2-1
テ オ フ ィ リ ン の 電 気 化 学 検 出 HPLC の 最 適 化
分離モードの検討
テ オ フ ィ リ ン の HPLC-ECD に お い て ， ト ロ ロ ッ ク ス 試 薬 溶 液 の 溶 媒 ， カ
ラム，移動相について検討した．トロロックスをアセトニトリル－水混液
（ 94:6, v/v）に 溶 解 さ せ た と こ ろ ，白 濁 し た ．従 っ て ，本 HPLC-ECD 用 の ト
ロロックス試薬溶液および移動相の調製には水の適用が困難であることが
分 か っ た ． そ こ で ， ト ロ ロ ッ ク ス を 溶 解 す る た め の 溶 媒 と し て ， (1) 誘 電 率
が 大 き く 電 気 伝 導 性 を 確 保 で き る ， (2) 比 較 的 粘 度 が 小 さ く 移 動 相 に も 適 用
で き る ， (3) 溶 媒 の 塩 基 性 が 小 さ く テ オ フ ィ リ ン の 酸 化 前 置 波 を 観 察 で き る
点 を 考 慮 し て 有 機 溶 媒 を 選 定 し た ．Hildebrand の 溶 解 パ ラ メ ー タ（ δ ）を 尺
度 と し ，水 に つ い で δ 値 が 大 き い ア セ ト ニ ト リ ル を ト ロ ロ ッ ク ス 試 薬 溶 液 の
- 50 -
溶 媒 と し て 利 用 を 試 み た ． 固 定 相 に ODS カ ラ ム ， 移 動 相 に ア セ ト ニ ト リ ル
を 用 い て テ オ フ ィ リ ン の ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を 行 っ た と こ ろ ，テ オ フ ィ リ ン
は カ ラ ム に 保 持 さ れ な か っ た ．そ こ で ，固 定 相 の 極 性 を 疎 水 性 か ら 親 水 性 に
改 め た ．す な わ ち ，固 定 相 に シ リ カ ゲ ル カ ラ ム ，移 動 相 に ア セ ト ニ ト リ ル を
用 い て テ オ フ ィ リ ン の ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を 行 っ た と こ ろ ，テ オ フ ィ リ ン は
カ ラ ム に 保 持 さ れ た ．よ っ て ，ト ロ ロ ッ ク ス の 酸 化 前 置 波 で テ オ フ ィ リ ン を
検 出 す る HPLC-ECD で は ， 固 定 相 に シ リ カ ゲ ル ， 移 動 相 に ア セ ト ニ ト リ ル
を用いることとした．
3-4-2-2
印加電位の選定
テオフィリンを検出するための印加電位を選定するためにハイドロダイ
ナ ミ ッ ク ボ ル タ モ グ ラ ム を 測 定 し た ． Fig. 3-6 の ハ イ ド ロ ダ イ ナ ミ ッ ク ボ ル
タ モ グ ラ ム が 示 す よ う に ， +0.4 V vs. Ag/AgCl よ り 正 電 位 を 印 加 す る と ク ロ
マ ト グ ラ ム 上 に テ オ フ ィ リ ン の ピ ー ク が 観 察 さ れ た ． +1.0 V vs. Ag/AgCl の
と き に 最 大 の ピ ー ク 電 流 値 を 与 え た ．し か し ，印 加 電 位 を +1.1 V vs. Ag/AgCl
に 設 定 し た 場 合 の 方 が ， +1.0 V vs. Ag/AgCl の 場 合 に 比 べ て テ オ フ ィ リ ン の
ピ ー ク 高 さ の 直 線 性 が 良 好 で あ っ た ． よ っ て ， +1.1 V vs. Ag/AgCl を テ オ フ
ィリンのクロマトグラム測定における印加電位として決定した．
3-4-2-3
移動相およびトロロックス試薬溶液の流速の選定
移 動 相 と ト ロ ロ ッ ク ス 試 薬 溶 液 の 流 速 を 検 討 し た ．ま ず ，ト ロ ロ ッ ク ス 試
薬 溶 液 の 流 速 を 90 L/min に 固 定 し ， 移 動 相 の 流 速 を 検 討 し た ． 流 速 を 速 く
す る と 保 持 時 間 は 短 く な っ た （ Fig. 3-7A）． 感 度 に つ い て 比 較 し た と こ ろ ，
流 速 を 60 L/min 以 上 に す る と テ オ フ ィ リ ン の ピ ー ク 高 さ が 低 下 し て テ オ フ
ィ リ ン の 検 出 限 界 が 大 き く な り ， 感 度 は 低 下 し た （ Fig. 3-7B）． 検 討 し た 条
件 の 中 で ， テ オ フ ィ リ ン の 検 出 限 界 が 良 好 で あ っ た 50 L/min を 選 択 し た ．
次 に ， 移 動 相 の 流 速 を 50 L/min に 固 定 し ， ト ロ ロ ッ ク ス 試 薬 溶 液 の 流 速
を 検 討 し た ．ト ロ ロ ッ ク ス 試 薬 溶 液 の 流 速 は 保 持 時 間 に 与 え る 影 響 は ほ と ん
ど な か っ た （ Fig. 3-7C）． 移 動 相 同 様 ， 感 度 に つ い て 比 較 し た ． 流 速 を 30
L/min よ り 速 く す る と テ オ フ ィ リ ン の ピ ー ク が 低 下 し た が ， そ れ 以 上 に ノ
イ ズ が 低 下 し た ． そ の 結 果 ， 検 出 限 界 が 小 さ く な り ， 感 度 が 向 上 し た （ Fig.
3-7D）． し か し ， 流 速 を 110 L/min に 設 定 し た 場 合 ， ピ ー ク 高 さ が 顕 著 に 小
さ く な り ，感 度 が 低 下 し た ．よ っ て ，ト ロ ロ ッ ク ス 試 薬 溶 液 の 流 速 は ，検 出
限 界 が 良 好 で あ っ た 90 L/min を 選 択 し た ．
- 51 -
Fig. 3-6
Hydrodynamic voltammogram of theophylline.
HPLC conditions used were: column, Inertsil SIL 100A (100 mm x 1.0 mm i.d., 3
m); column temperature, 20 ℃ ; mobile phase, acetonitrile; trolox solution,
acetonitrile containing 1.5 mmol/L trolox and 20 mmol/L LiClO 4 ; flow rate of
mobile phase, 50 L/min; flow rate of Trolox solution, 90 L/min.
A standard
mixture (5 L) of theophylline was injected into HPLC -ECD at concentration of
20 mol/L.
- 52 -
Fig. 3-7
Retention time and detection limit of theophylline as functions of flow
rate of (A,B) mobile phase and (C,D) trolox solution.
(A,B) Flow rate of trolox
solution was fixed at 90 L/min.
(C,D) Flow rate of mobile phase was fixed at
50 L/min.
3-4-3
テ オ フ ィ リ ン の 電 気 化 学 検 出 HPLC の 分 析 能 パ ラ メ ー タ
最 適 化 し た HPLC 条 件 下 で 測 定 し た テ オ フ ィ リ ン の ク ロ マ ト グ ラ ム を Fig.
3-8A に 示 し た ．ク ロ マ ト グ ラ ム 上 に テ オ フ ィ リ ン の ピ ー ク を 6.7 min に 観 察
で き た ． テ オ フ ィ リ ン の ピ ー ク 高 さ は 2.0～ 100 mol/L（ 10～ 500 pmol on
column） の 範 囲 で 相 関 係 数 （ r） が 0.999 の 良 好 な 直 線 性 が 得 ら れ た ． ま た ，
20 mol/L の テ オ フ ィ リ ン 標 準 溶 液 に つ い て ， 6 回 の 繰 り 返 し 測 定 を 行 っ た
と こ ろ ，ピ ー ク 高 さ の RSD は 0.81％ で あ っ た ．検 出 限 界（ S/N = 3）は ，0.55
mol/L（ 2.75 pmol on column） で あ っ た ． 本 法 は ， テ オ フ ィ リ ン の 血 中 濃 度
測 定 を 行 う 上 で ，充 分 な 感 度 ，範 囲 ，直 線 性 ，精 度 を 有 す る こ と が 分 か っ た ．
さ ら に ，0.1 mmol/L カ フ ェ イ ン ，テ オ ブ ロ ミ ン ，尿 酸 ，3-メ チ ル キ サ ン チ
ン の ア セ ト ニ ト リ ル 溶 液 を HPLC-ECD に 注 入 し ， 本 法 の 特 異 性 に つ い て 確
認した．これらの化合物に由来するピークはクロマトグラム上に出現せず，
本 法 は ，カ フ ェ イ ン お よ び テ オ フ ィ リ ン の 代 謝 物 の 妨 害 を 受 け な い こ と が 分
かった．
- 53 -
Fig. 3-8
Chromatograms of theophylline obtained from (A) standard solution
(20 mol/L), (B) rat plasma 2 hr later from oral administration of theophylline.
HPLC conditions used were: column, Inertsil SIL 100A (100 mm x 1.0 mm i.d., 3
m); column temperature, 20 ℃ ; mobile phase, acetonitrile; trolox solution,
acetonitrile containing 1.5 mmol/L trolox and 20 mmol/L LiClO 4 ; flow rate of
mobile phase, 50 L/min; flow rate of trolox solution, 90 L/min.
Arrows
indicate the peak of theophylline.
3-4-4
ラット血中テオフィリンの定量への応用
クロロホルム－イソプロパノール混液を用いて血漿中テオフィリンを抽
出 す る 前 処 理 方 法 に つ い て ，回 収 率 を 確 認 し た ．テ オ フ ィ リ ン 投 与 前 の ラ ッ
ト 血 漿 を ブ ラ ン ク 試 料 と し ， 血 漿 中 の テ オ フ ィ リ ン の 終 濃 度 が 200, 50, 20
mol/L に な る よ う に 標 準 溶 液 を 添 加 し た ． テ オ フ ィ リ ン の 定 量 は ， 絶 対 検
量 線 法 に 基 づ い て 行 っ た ． Table 3-1 に 示 す 通 り ， 200, 50, 20 mol/L テ オ フ
ィ リ ン を 含 む 血 漿 を 分 析 し た 結 果 ， 定 量 値 は そ れ ぞ れ 178.4, 43.7, 19.0
mol/L と な り ， 回 収 率 は そ れ ぞ れ 89.3, 87.5, 95.3%で あ っ た ． 本 研 究 で 確 立
し た 前 処 理 方 法 に よ り ，真 度 と 精 度 に 優 れ た 血 中 テ オ フ ィ リ ン の 定 量 分 析 を
行うことができた．
- 54 -
Table 3-1 Repeatability of the present method for determining theophylline in
rat plasma.
Concentration added
Concentration found
(mol/L)
(mol/L)
a, b
RSD b
Recovery
(%)
(%)
a, b
200.0
178.4 ± 1.75
1.7
89.3 ± 0.9
50.0
43.7 ± 1.11
4.4
87.5 ± 2.3
20.0
19.0 ± 0.16
1.5
95.3 ± 0.8
a. mean±standard error (SE)
b. n = 3
3-4-5
ラットにおけるテオフィリンの薬物動態パラメータ算出
本法がテオフィリンの薬物動態分析および治療薬物モニタリングに有用
な 分 析 法 で あ る こ と を 示 す た め に ，ラ ッ ト 血 中 テ オ フ ィ リ ン の 時 間 － 濃 度 プ
ロ フ ァ イ ル を 取 得 し て PK パ ラ メ ー タ の 算 出 へ 応 用 し た ．
16 時 間 絶 食 し た ラ ッ ト に ， テ オ フ ィ リ ン の 水 溶 液 を 10 mg/kg の 薬 物 量 で
経 口 投 与 し た ．Fig. 3-8B に は ，テ オ フ ィ リ ン 投 与 2 時 間 後 の 血 漿 の ク ロ マ ト
グ ラ ム を 示 し た ． 投 与 2 時 間 後 の 血 中 テ オ フ ィ リ ン 濃 度 は 40 mol/L で あ っ
た ． Fig. 3-9 に は ， テ オ フ ィ リ ン の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を 示 し た ． 血 中
テ オ フ ィ リ ン 濃 度 は ，投 与 2 時 間 後 に C max に 達 し た ．そ の 他 の PK パ ラ メ ー
タ を Table 3-2 に 示 し た ．
Fig. 3-9.
Time-concentration profile of mean (±SE) theophylline in rat (n = 5
each) plasma after oral administration of theophylline (10 mg /kg).
- 55 -
Table 3-2 Pharmacokinetic parameters of theophylline after oral administration
of 10 mg/kg theophylline to rat (n = 5 each).
Parameter
a
Mean ± SE
b
C max (mol/L)
t max (hr)
AUC 24h (mol･hr/L)
k el (1/hr)
t 1/2 (hr)
Vd (mL)
Cl (mL/hr)
b
41.9
2.00
472.1
0.11
6.19
269.21
30.15
±
±
±
±
±
±
±
2.66
0.37
42.2
0.01
0.47
8.13
2.31
a
C max , maximum drug concentration; t max , maximum drug concentration time;
AUC 24h , area under the concentration-time curve for 24 hr; k el , elimination rate
constant; t 1/2 , half-life period; Vd, distribution volume; Cl, clearance
b
C max and AUC 24h were 7.55 ± 0.48 g/mL and 85.06 ± 7.61 g ･ hr/mL,
respectively, when a mass concentration was used as a unit.
3-5
考察
ト ロ ロ ッ ク ス の 酸 化 前 置 波 を 利 用 し ，テ オ フ ィ リ ン を 塩 基 と し て 検 出 す る
新 規 電 気 化 学 検 出 法 の 有 用 性 を 評 価 す る た め に ，本 法 と 既 報 の テ オ フ ィ リ ン
の ボ ル タ ン メ ト リ ー [134,139-142] に つ い て 作 用 電 極 ，支 持 電 解 質 溶 液 ，測
定 電 位 ， 直 線 範 囲 を 指 標 に し て 対 比 し た （ Table 3-3）．
本 法 に お い て テ オ フ ィ リ ン の 検 出 に 利 用 す る 酸 化 前 置 波 の 出 現 電 位 は ，電
解酸化でテオフィリンを検出する他の方法の測定電位に比べて低電位であ
っ た ．様 々 な マ ト リ ッ ク ス が 存 在 す る 生 体 試 料 分 析 に お い て ，電 気 化 学 検 出
の 測 定 電 位 を 比 較 的 低 電 位 に 設 定 で き る こ と は ，分 析 法 の 特 異 性 お よ び 再 現
性 の 向 上 を 図 る 上 で 有 利 で あ る ．Table 3-3 に は 修 飾 電 極 を 用 い る こ と で ，電
解 還 元 で テ オ フ ィ リ ン を 検 出 す る 方 法 も あ る が ，直 線 範 囲 が １ 桁 程 度 で あ っ
た [142]．本 法 の 直 線 範 囲 は 0.01～ 0.54 mmol/L で あ る が ，こ れ は ト ロ ロ ッ ク
ス 試 薬 溶 液 中 の ト ロ ロ ッ ク ス 濃 度 が 0.54 mmol/L の た め で あ る ． も し も 測 定
対 象 物 の 濃 度 が よ り 高 濃 度 の 場 合 ，本 法 の 検 出 原 理 を 考 慮 す る と ト ロ ロ ッ ク
ス の 濃 度 を 大 き く す れ ば ，さ ら に 高 濃 度 側 の テ オ フ ィ リ ン を 定 量 で き ，検 量
線 の 範 囲 を 拡 げ る こ と が 可 能 で あ る ．ま た ，テ オ フ ィ リ ン を 電 解 酸 化 で 検 出
- 56 -
- 57 13 mmol/L LiClO4
AN containing 0.54 mmol/L TrOH and
0.1 mol/L Na2SO4
+0.75 V vs. Ag/AgCl
-0.55 V vs. SCE
+1.05 V vs. SCE
+1.1 V vs. SCE
+0.95 V vs. SCE
+1.3 V vs. SCE
Potential of oxidation peak
1.0 x 10-5 - 5.4 x 10-4
2.0 x 10-5 - 7.5 x 10-5
3.0 x 10-7 - 1.0 x 10-5
1.0 x 10-8 - 1.0 x 10-5
4.0 x 10-7 - 1.0 x 10-4
1.0 x 10-6 - 4.0 x 10-4
(mol L )
-1
Linear range
d
Abbreviation: AN, acetonitrile; Ag/AgCl, silver-silver chloride electrode; SCE, saturated calomel electrode.
d. The range would be wider at a higher concentration of TrOH.
c. Multi-wall carbon nanotubes modified glassy carbon electrode
142
141
140
139
134
method
Present
Ref.
b. Platinum nanoparticles decorated multi-wall carbon nanotubes - 1-octyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate composite material film coated glassy carbon electrode
a. Nanosized cobalt phthalocyanine particles modified carbon paste electrode
Plastic formed carbon
Using prepeak of TrOH
molecularly imprinted polymer matrix
Poly(methylene green) employed as
(pH 5.8)
0.1 mol/L Phosphate buffer saline
0.1 mol/L Phosphate buffer (pH 3.0)
MWCNTs-Ptnano –[omim][PF6] / GCE b
MWCNT / GCE c
25 mmol/L Phosphate buffer (pH 7.4)
Britton-Robinson buffer (pH 1.8)
Nano-CoPc-CPE a
Using a modified electrode:
boron-doped diamond electrodes
Supporting electrolyte
Voltammetry for theophylline determination.
Oxidation at a bare electrode using
Electrode
Table 3-3
す る 場 合 ，構 造 が 類 似 し て い る キ サ ン チ ン 誘 導 体 も 検 出 さ れ る 可 能 性 が あ る ．
し か し ，本 法 で は ，非 常 に 弱 い 塩 基 物 質 で あ る カ フ ェ イ ン や キ サ ン チ ン 誘 導
体 は 検 出 不 能 で あ り ，テ オ フ ィ リ ン の 電 気 化 学 検 出 に お い て 有 利 で あ る こ と
を 示 し た ．以 上 の よ う に ，本 法 は ，既 法 の テ オ フ ィ リ ン の ボ ル タ ン メ ト リ ー
と 比 較 し て ，比 較 的 低 電 位 側 で 検 出 可 能 で あ り ，直 線 範 囲 は 2 桁 程 度 ，さ ら
にテオフィリンを特異的に検出できる方法であることを明らかにした．
さ ら に ， ト ロ ロ ッ ク ス の 酸 化 前 置 波 に 基 づ く HPLC-ECD の 有 用 性 を 評 価
す る た め に ， 本 法 と 既 報 の テ オ フ ィ リ ン [120-124,136,137] の HPLC に つ い
て測定条件，分析時間，直線範囲，1 回の分析に必要な血漿試料量を指標に
し て 対 比 し た （ Table 3-4）． 分 析 時 間 は ， オ ク チ ル 基 （ C8） を 修 飾 し た 長 さ
50 mm の シ リ カ 系 カ ラ ム を 使 用 し た LC-MS が 最 も 短 時 間 で あ っ た [123]．
直 線 範 囲 で は ， 本 法 は HPLC-UV， LC-MS， HPLC-ECD と 比 較 し て ほ と ん ど
同 程 度 で あ っ た ． 分 析 に 必 要 な 血 漿 試 料 量 で は ， 本 法 を 含 め た HPLC-ECD
が 他 の 方 法 に 比 べ て 少 量 で あ っ た ． HPLC-UV で は ， カ フ ェ イ ン や 様 々 な テ
オフィリン代謝物も検出されるためこれらを分離するための分析条件の設
定 が 困 難 な 場 合 が あ る ．こ れ に 対 し て ，HPLC-ECD は ，電 解 酸 化 で は カ フ ェ
イ ン が 検 出 さ れ な い の で 特 異 性 の 観 点 か ら 有 利 で あ る ．し か し ，作 用 電 極 の
電 位 窓 の 範 囲 で 比 較 的 大 き な 正 電 位 を 設 定 し た 場 合 ，特 に 生 体 試 料 分 析 に お
い て 試 料 中 の 様 々 な 生 体 成 分 が 酸 化 さ れ ，ク ロ マ ト グ ラ ム 上 に ピ ー ク と し て
観 察 さ れ る ． 実 際 ， Table 3-4 で 挙 げ た HPLC-ECD で は ， グ ラ ッ シ ー カ ー ボ
ン 電 極 に +1.0 V vs. Ag/AgCl を 印 加 し て い る [135-138]．そ の た め ，ク ロ マ ト
グ ラ ム 上 に は 多 く の Unknown ピ ー ク が 出 現 し て い る ． ま た ， こ れ ら の
HPLC-ECD は ， 分 離 に は ODS カ ラ ム を 用 い て 移 動 相 に は 中 性 あ る い は 弱 塩
基 性 の 緩 衝 液 と 有 機 溶 媒 の 混 液 を 使 用 し て い る ．ODS の オ ク タ デ シ ル シ リ ル
基 は 中 性 あ る い は 塩 基 性 条 件 下 で は 脱 離 し や す く ，中 性 あ る い は 塩 基 性 の 移
動 相 を 用 い る 分 析 で は ，ODS カ ラ ム の 耐 久 性 が 危 惧 さ れ る 場 合 が 多 い ．ま た ，
弱 酸 性 条 件 下 で の 分 離 条 件 を 選 定 し た 場 合 ，テ オ フ ィ リ ン の 酸 化 還 元 電 位 が
さ ら に 正 電 位 に シ フ ト す る こ と が 予 想 さ れ る た め ，印 加 電 位 を さ ら に 正 電 位
に す る 必 要 が あ る ．こ れ に よ っ て ，ベ ー ス ラ イ ン ノ イ ズ の 増 大 ，さ ら に 多 く
の Unknown ピ ー ク が 出 現 す る も の と 思 わ れ る ．
本 法 で は ，移 動 相 に ア セ ト ニ ト リ ル を 用 い て 中 性 条 件 下 で 分 離 を 行 っ て い
る が ，固 定 相 に シ リ カ ゲ ル カ ラ ム を 用 い て い る た め カ ラ ム の 耐 久 性 に は 問 題
が 少 な い ．実 際 に ，3 ヶ 月 間（ 注 入 回 数 2000 回 ）の 連 続 使 用 を 行 っ た が ，ピ
ークのテーリングなどのカラムの分離能の低下は観察されなかった．また，
本 法 で は ，グ ラ ッ シ ー カ ー ボ ン 電 極 に +1.1 V vs. Ag/AgCl を 印 加 し て い る が ，
電 解 酸 化 に よ る HPLC-ECD に 比 べ て Unknown ピ ー ク の 出 現 が ほ と ん ど な か
った．
- 58 -
- 59 -
(30:70, v/v)
Buffer (pH 4.8): AN : MeOH
(150 x 4.6 mm i.d., 5 m)
TSK gel ODS-80TM
(60:40, v/v)
Buffer (pH 6.0) : AN : MeOH
(50 x 2.0 mm i.d., 3 m)
Novapak C-18
(93:7, v/v)
(150 x 4.6 mm i.d., 5 m)
d
Protein removal by AN
precolumn
Online extraction using a
Protein removal by AN
precolumn
CHCl3-IPA mixture
Ag/AgCl
b
ECD, +1.0 V vs. Protein removal by AN
Ag/AgCl
b
ECD, +1.0 V vs. Solvent extraction by a
181→124 m/z
MS/MS
MS, 181 m/z d
UV, 275 nm
c
Online extraction using a
CH2Cl2
Solvent extraction by a
CHCl3-IPA mixture
20
13
1
2
30
8
10
8
(min)
Time
0.56 – 2.2 nmol
348 – 2775 pmol
5.5 -1110 pmol
1.4 – 16.7 nmol
8.5 – 550 pmol
0.14 - 5.5 nmol
0.055 – 5.5 nmol
10 – 500 pmol
Linear range
20
10
100
400
100
50
500
10
10
25
10
50
5
50
100
137
136
123
124
121
122
120
method
5 Present
L)
of plasma
L)
volume
Injection Ref.
volume
Sample
a. Abbreviation: AN, acetonitrile; MeOH, methanol; IPA, isopropanol; UV, ultraviolet detection; ECD, electrochemical detection; MS, mass spectrometry
b, c, and d. Applied potential, wave length, and mass-to-charge ratio for monitoring theophylline in each HPLC were shown, respectively.
Buffer (pH 7.3) : AN
Cosmosil 5C18
(900:25:90, v/v/v)
AN : 0.5% formic acid
Hypersil C8
0.1% formic acid (80:20, v/v)
Performance AN : Water containing
(100 x 4.6 mm i.d.)
RP-18e
Chromolith
(900:35:65, v/v/v)
MeOH : Buffer (pH 3.5)
TSK gel ODS-80TM
UV, 275 nm
(86:7:7, v/v/v)
(150 x 4.6 mm i.d., 5 m)
c
UV, 272 nm c
Buffer : MeOH : AN
b
Inertsil C18
(250 x 4.6 mm i.d., 5 m)
Sample preparation
ECD, +1.1V vs. Solvent extraction by a
Ag/AgCl
AN
Inertsil SIL
Detection
(100 x 1.0 mm i.d., 3 m)
Mobile phase
HPLC methods for the determination of theophylline in plasma sample a.
Analytical column
Table 3-4
さ ら に ，微 量 の 血 漿 で 血 中 テ オ フ ィ リ ン を 測 定 で き る 方 法 と し て イ ム ノ ア
ッ セ イ が あ り ，こ れ を 実 践 す る た め に 体 外 用 診 断 医 薬 品 と し て キ ッ ト 化 さ れ
て い る ． 例 え ば ， CEDIA（ Cloned enzyme donor immunoassay） 法 を 利 用 し た
体 外 用 診 断 医 薬 品 の 定 量 範 囲 は ， 7.2～ 183 mol/L で あ り ， 室 内 再 現 精 度 は
RSD と し て 5.4% 以 下 で あ る [130] ． ま た ， EMIT （ Enzyme multiplied
immunoassay technique） 法 を 利 用 し た 体 外 用 診 断 医 薬 品 の 定 量 範 囲 は 11～
222 mol/L で あ り ，室 内 再 現 精 度 は RSD と し て 10%以 下 で あ る [131]．こ れ
ら の イ ム ノ ア ッ セ イ で 使 用 さ れ る 抗 テ オ フ ィ リ ン 抗 体 の 1,3-ジ メ チ ル 尿 酸 ，
カ フ ェ イ ン ，3-メ チ ル キ サ ン チ ン に 対 す る 交 差 反 応 性 は ，そ れ ぞ れ 10%, 3%,
1%で あ る ． 本 法 は イ ム ノ ア ッ セ イ と 比 較 し て 精 度 と 特 異 性 に 優 れ る と 考 え
られる．
3-6
小括
本 章 で は ，ト ロ ロ ッ ク ス の 酸 化 前 置 波 に 基 づ く 塩 基 測 定 法 の 活 用 に よ っ て
テ オ フ ィ リ ン を 電 気 化 学 的 に 検 出 で き る こ と を 明 ら か に し た ．従 来 ，炭 素 系
作用電極に比較的高い正電位を印加して電解酸化によってテオフィリンを
検 出 す る 方 法 は 知 ら れ て い る が ，ト ロ ロ ッ ク ス の 酸 化 前 置 波 を 利 用 し た 本 法
は ，比 較 的 低 い 正 電 位 で の 電 解 で 検 出 で き る こ と を 示 し た ．低 電 位 側 で の 検
出は，妨害物質のピークを減らして特異性の向上を図る上で有利である．
本 検 出 モ ー ド を HPLC の フ ロ ー 型 検 出 部 に 組 み 込 む た め に ，移 動 相 と カ ラ
ムからなる分離系にトロロックス試薬溶液をポストカラム方式で合流させ
る 2 流 路 系 の HPLC-ECD を 構 築 し ， テ オ フ ィ リ ン の 分 離 分 析 法 と し て 確 立
し た ． 分 離 カ ラ ム に シ リ カ ゲ ル カ ラ ム を 用 い ， テ オ フ ィ リ ン を 10 min 以 内
に 検 出 す る こ と が で き た ． 本 法 の 定 量 範 囲 は ， 2.0～ 100 mol/L で あ り ， 直
線 性 も 良 好 で あ っ た （ r = 0.999）． 血 中 薬 物 濃 度 測 定 を 行 う 上 で ， 充 分 な 定
量 範 囲 と 感 度 を 有 す る こ と が 分 か っ た ． HPLC-UV を 用 い た 血 中 テ オ フ ィ リ
ン 分 析 は ，カ フ ェ イ ン や テ オ フ ィ リ ン 代 謝 物 等 も 検 出 さ れ る た め ，特 異 性 が
乏 し く ，分 離 条 件 の 選 定 が 困 難 で あ っ た が ，本 法 は こ れ ら の 化 合 物 の 影 響 を
受 け な い こ と が 分 か っ た ．ま た ，LC-MS な ど と 比 較 し て ，簡 便 な 前 処 理 方 法
お よ び ク リ ー ン ア ッ プ 操 作 に よ り 分 析 で き た ．さ ら に ，本 法 に お け る 血 漿 中
テ オ フ ィ リ ン の 前 処 理 方 法 は ，ク ロ ロ ホ ル ム － イ ソ プ ロ パ ノ ー ル 混 液 に よ る
溶媒抽出といった比較的簡易なものであった．
本 法 を 活 用 し ，テ オ フ ィ リ ン 投 与 後 の ラ ッ ト 血 中 テ オ フ ィ リ ン の 薬 物 動 態
分 析 を 実 施 し た ．ラ ッ ト の 尾 静 脈 よ り 経 時 的 に 採 血 し て 得 た 10 L の 血 漿 を
試 料 と し て 血 中 テ オ フ ィ リ ン を 計 測 で き ， テ オ フ ィ リ ン 投 与 後 24 時 間 に わ
- 60 -
た っ て 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル を 取 得 す る こ と が で き た ．得 ら れ た テ オ フ ィ
リ ン の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル よ り ， PK パ ラ メ ー タ を 算 出 で き た ．
本 研 究 で は ， ト ロ ロ ッ ク ス の 酸 化 前 置 波 を 活 用 し た HPLC-ECD が 血 中 テ
オ フ ィ リ ン の 分 析 に お い て 感 度 と 特 異 性 に 優 れ ， 10 L の 血 漿 で 分 析 可 能 で
あ る こ と を 示 し た ．本 法 は ，テ オ フ ィ リ ン に よ る 副 作 用 の 発 症 メ カ ニ ズ ム を
解 明 す る た め の 分 析 法 や ，テ オ フ ィ リ ン の 治 療 薬 物 モ ニ タ リ ン グ 用 の 分 析 法
として有用と思われる．
- 61 -
総
括
薬 学 領 域 で 活 用 さ れ る 定 量 分 析 法 に は ，分 析 対 象 が 生 体 試 料 や 製 剤 の よ う
な マ ト リ ッ ク ス の 構 成 が 複 雑 な も の で あ っ て も ，感 度 ，真 度 ，特 異 性 ，精 度
に 優 れ ，信 頼 で き る 分 析 結 果 を 提 供 で き る こ と が 要 求 さ れ る ．さ ら に ，前 処
理操作を含む実験手順が簡便であること，微少量の試料で分析できること ，
実分析の実践によって定量分析法の実用性と有用性が的確に示されている
ことも重要である．
HPLC-ECD は ，酸 化 還 元 物 質 を 高 感 度 か つ 特 異 的 に 定 量 で き る 分 析 法 で あ
る ．本 研 究 で は ，薬 物 の 定 量 分 析 に お い て 実 用 性 に 優 れ た 高 感 度 HPLC-ECD
の確立を行った．ニトロ基を有するアリストロキア酸は電解還元に基づく
HPLC-ECD に よ っ て 高 感 度 に 定 量 で き た ．さ ら に ，キ ノ ン の 還 元 前 置 波 に よ
る 酸 物 質 の 検 出 法 ，お よ び ト ロ ロ ッ ク ス の 酸 化 前 置 波 に よ る 塩 基 物 質 の 検 出
法 を HPLC-ECD の 検 出 部 に 組 み 込 ん だ ポ ス ト カ ラ ム 方 式 の 2 流 路 系 の
HPLC-ECD シ ス テ ム を そ れ ぞ れ 構 築 し ，抗 て ん か ん 薬 VPA，抗 喘 息 薬 テ オ フ
ィリンの血中濃度測定へ応用できた．
本論文の第 1 章から第 3 章で述べた結果を以下に総括する．
第1章
電 解 還 元 に よ る ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の HPLC-ECD を 構 築 し ， ア リ ス ト ロ キ
ア酸の生薬への混入を監視できる高感度分析法として 確立できた．本法は，
既 に 報 告 さ れ て い る ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の HPLC-UV, HPLC-FL, LC-MS と 比 較
し て 感 度 に 優 れ て い た ． さ ら に ， 本 法 と 日 局 の サ イ シ ン の 純 度 試 験 （ AA1）
で 定 め ら れ て い る HPLC-UV に つ い て 特 異 性 と 感 度 を 比 較 検 討 し た ． サ イ シ
ン の 純 度 試 験 （ AA1） 用 の HPLC-UV で 測 定 し た ボ ウ キ の ク ロ マ ト グ ラ ム で
は ， ア リ ス ト ロ キ ア 酸 の ピ ー ク 周 辺 に Unknown ピ ー ク が 観 察 さ れ た が ， 本
法 で は 観 察 さ れ な か っ た ．日 局 で は ，AA1 に 対 応 す る 保 持 時 間 に ピ ー ク が 観
察 さ れ た 場 合 に は ，測 定 条 件 を 変 更 し て 再 度 ク ロ マ ト グ ラ ム を 測 定 し ，ア リ
ス ト ロ キ ア 酸 で な い こ と を 確 認 す る 必 要 が あ る ．従 っ て ，本 法 は ，適 否 の 判
定に要するクロマトグラムの測定回数の低減が可能と考えられ た．さらに，
本 法 の AA1 の 検 出 限 界 は 3.4 ng/mL で あ り ，日 局 の 純 度 試 験（ AA1）と 同 じ
前 処 理 方 法 を 実 施 し た 場 合 ，生 薬 中 の AA1 含 量 が 85 ng/g 以 下 で あ る こ と を
確 認 可 能 で あ る ．こ の 検 出 限 度 値 は ，日 局 の 方 法 と 比 較 し て 高 感 度 で あ っ た ．
従 っ て ，本 法 は 日 局 の 方 法 と 比 較 し て 特 異 性 と 感 度 に 優 れ ，よ り 厳 重 な 混 入
監視が可能であることが分かった．
- 62 -
第2章
キ ノ ン の 還 元 前 置 波 に よ る VPA の HPLC-ECD を 構 築 し ，血 中 VPA の 薬 物
動 態 分 析 に 適 用 で き る 高 感 度 分 析 法 を 確 立 し た ．ま ず ，VPA が キ ノ ン の 還 元
前 置 波 に よ り 検 出 で き る こ と を ボ ル タ ン メ ト リ ー で 明 ら か に し た ． VPA の
HPLC-ECD と し て ，移 動 相 と カ ラ ム か ら な る 分 離 系 に キ ノ ン 試 薬 溶 液 を ポ ス
ト カ ラ ム 方 式 で 合 流 さ せ る 2 流 路 系 の シ ス テ ム を 構 築 し ，VPA の 分 離 分 析 法
と し て 確 立 し た ．本 法 は ，VPA と IS を 15 min 以 内 に 検 出 で き ，定 量 範 囲 は
0.36～ 14.4 g/mL（ r = 0.999） で あ っ た ． 血 中 VPA の 薬 物 動 態 分 析 を 実 践 す
る 上 で ，充 分 な 定 量 範 囲 と 感 度 を 有 し て い た ．本 法 は ，VPA を 特 異 的 に 検 出
で き ， 血 漿 試 料 の 前 処 理 方 法 も 比 較 的 簡 便 で あ る こ と か ら ， 既 報 の VPA の
分析法と比較して多くの利点があることを明らかにした．
さ ら に ， VPA と FFA の 複 合 動 態 解 析 へ の 適 用 を 図 る た め に ， キ ノ ン の 還
元 前 置 波 に よ る FFA の HPLC-ECD を 構 築 し た ． 本 研 究 で は ， 健 常 ラ ッ ト ，
マ ル ト ー ス 負 荷 ラ ッ ト ，糖 尿 病 ラ ッ ト の 尾 静 脈 よ り 経 時 的 に 採 血 し た 微 少 量
の 血 液 （ 約 50 L） を 用 い て 同 一 個 体 に お け る VPA と FFA の 血 中 の 動 態 分
析 を 行 い ， VP-Na 投 与 後 5 時 間 に わ た っ て VPA， FFA， BG の 時 間 － 濃 度 プ
ロ フ ァ イ ル を 取 得 で き た ． VPA の 時 間 － 濃 度 プ ロ フ ァ イ ル よ り ， VPA の PK
パ ラ メ ー タ を 算 出 で き ， 健 常 ラ ッ ト に 比 べ て 糖 尿 病 ラ ッ ト で は ， AUC が 優
位 に 低 下 ， Vd は 有 意 に 増 加 す る こ と が 分 か っ た ． 同 一 個 体 に お け る VPA と
FFA の 血 中 動 態 を 追 跡 で き る 本 法 は ， 正 確 な PK パ ラ メ ー タ を 算 出 す る 上 で
有 利 で あ り ， 糖 脂 質 代 謝 調 節 を in vivo で モ ニ タ で き る 複 合 動 態 解 析 へ 展 開
可能であった．
第3章
ト ロ ロ ッ ク ス の 酸 化 前 置 波 に よ る テ オ フ ィ リ ン の HPLC-ECD を 構 築 し ，
微 少 の 血 液 量 か つ 簡 便 な 前 処 理 方 法 で ，血 中 テ オ フ ィ リ ン の 薬 物 動 態 分 析 に
適 用 で き る 高 感 度 分 析 法 を 確 立 し た ．ま ず ，テ オ フ ィ リ ン が ト ロ ロ ッ ク ス の
酸 化 前 置 波 に よ り 検 出 で き る こ と を ボ ル タ ン メ ト リ ー で 明 ら か に し た ．テ オ
フ ィ リ ン の HPLC-ECD と し て ， 移 動 相 と カ ラ ム か ら な る 分 離 系 に ト ロ ロ ッ
クス試薬溶液をポストカラム方式で合流させる 2 流路系のシステムを構築し，
テ オ フ ィ リ ン の 分 離 分 析 法 と し て 確 立 し た ．本 法 は ，テ オ フ ィ リ ン を 10 min
以 内 に 検 出 で き ，定 量 範 囲 は 2.0～ 100 mol/L（ r = 0.999）で あ っ た ．血 中 テ
オ フ ィ リ ン の 薬 物 動 態 分 析 を 実 践 す る 上 で ，充 分 な 定 量 範 囲 と 感 度 を 有 し て
い た ． 本 法 は ， HPLC-UV と 比 較 し て カ フ ェ イ ン や テ オ フ ィ リ ン 代 謝 物 の 影
響 を 受 け ず ，LC-MS な ど と 比 較 し て ，簡 便 な 前 処 理 方 法 お よ び ク リ ー ン ア ッ
プ操作により分析できた．
本 法 を 活 用 し ，テ オ フ ィ リ ン 投 与 後 の ラ ッ ト 血 中 テ オ フ ィ リ ン の 薬 物 動 態
- 63 -
分 析 を 行 っ た ．ラ ッ ト の 尾 静 脈 よ り 経 時 的 に 採 血 し て 得 た 10 L の 血 漿 を 試
料 と し て 分 析 し た 結 果 ， テ オ フ ィ リ ン の PK パ ラ メ ー タ を 算 出 で き た ． 本 法
は ，テ オ フ ィ リ ン に よ る 副 作 用 の 発 症 メ カ ニ ズ ム の 解 明 や 治 療 薬 物 モ ニ タ リ
ングに適用可能であると考えられた．
本 研 究 で は ，ア リ ス ト ロ キ ア 酸 を 酸 化 還 元 物 質 ，VPA を 酸 物 質 ，テ オ フ ィ
リ ン を 塩 基 物 質 と し て 高 感 度 か つ 特 異 的 に 定 量 で き る HPLC-ECD を 確 立 す
る こ と が で き た ．さ ら に ，本 法 を 生 薬 に 混 入 し た 有 害 成 分 の 監 視 ，あ る い は
PK パ ラ メ ー タ の 算 出 等 の 実 分 析 へ 応 用 し ， 薬 物 の 実 用 的 な 定 量 分 析 法 と し
て の HPLC-ECD の 有 用 性 を 明 ら か に し た ．
以 上 の よ う に ，HPLC-ECD は 測 定 対 象 物 質 ご と に 適 切 な 検 出 モ ー ド を 選 定
することで，高感度かつ特異的な分析法として確立することが可能である．
さ ら に ， LC-MS や LC-MS/MS と 比 較 す る と 装 置 と 維 持 費 は 極 め て 安 価 で あ
り ，分 析 装 置 自 体 の 小 型 化 を 図 る こ と も 可 能 で あ る ．従 っ て ，広 範 な 研 究 機
関 お よ び 小 中 規 模 の 医 療 機 関 へ の 装 置 導 入 に お い て HPLC-ECD は 有 利 で あ
る ．HPLC-ECD は ，そ の 感 度 と 特 異 性 を 活 か す こ と で ，薬 学 領 域 の 基 礎 研 究
および応用研究の発展のために有益な分析法として貢献できるものである．
- 64 -
謝
辞
本研究をまとめるにあたり，ご懇切なるご指導を賜わりました 東京薬科
大学分析化学教室
袴田 秀樹 教授に心から感謝いたします．
本研究への適切なご助言，ご協力を賜わりました東京薬科大学
楠 文代
名誉教授に深く感謝いたします．
本 研 究 へ の 有 益 な ご 助 言 ，ご 協 力 を 頂 き ま し た 東 京 薬 科 大 学 分 析 化 学 教 室
小谷 明 講師に感謝いたします．
東 京 薬 科 大 学 分 析 化 学 教 室 で の 実 験 遂 行 に お い て ご 支 援 ，ご 協 力 頂 い た 分
析化学教室の職員，院生，研究生，卒論生の皆様に感謝いたします．
医療法人緑雲会 多摩病院在職中，東京薬科大学客員研究員として研究の
機会を下さいました医療法人緑雲会 多摩病院
申し上げます．
- 65 -
持田 政彦 院長に厚く御礼
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