蛋白質核酸酵素

性域への多核NMRの応用三浦 洌・藤井
ラ ビ茂フ
ン酵 素 の 研 究は1932年,
Warburg
で に 半 世 紀 以 上 た って い る 。 以 来,
に よ る 旧 黄 色酵 素 の 発 見 に 始 ま るか ら, す
膨 大 な 数 の フ ラ ビ ン酵 素 が 知 られ る よ うに な ったが,
同 時 に, そ の 分 布 が 生 物 界 に 普 遍 で あ る こ と, 基 質 や 反 応 が き わ め て 広 範 囲 に及 ぶ こ と も
Database Center for Life Science Online Service
わ か って き た 。フ ラ ビ ン とい う1つ の 分 子 種 が これ ほ ど 広 範 囲 の 反 応 を 触 媒 で き る の は 驚
異 で あ る 。 筆 者 らは, この 驚 異 の 中 味 を 探 ろ う と して き た 。 本 稿 で は,
て 多 核NMRを
は じめ に
安 定 同位 体 を 用 い
利 用 した 筆 者 ら の 最 近 の 研 究 を 紹 介 した い。
フ ラ ビン酵 素 群 は 生 物 界 に あ ま ね く 分 布
の 生物 が, 酸 化還 元過 程 に よ っ て エ ネ ル ギ ー を得 て生 命
し, 生 命 を 維 持す るた め の 中枢 的 な 役 割 を担 っ て い る。
を 維 持 して い る こ とを 考 え る と, フ ラ ピン酵 素 群 の 中枢
そ の機 能 は, 非 常 に 広 範 囲 に 及 び, ア ミノ酸, 糖 質, 脂
的 な 役 割 が 理 解 で き る。 ち な み に, フ ラビン とい うの は
質, 核 酸 の代 謝,
図1の
P450に
ミ トコ ン ド リア の 呼 吸鎖 電 子伝 達 系,
つ らな る電 子 伝 達 系, 光 合 成 電 子 伝 達 系 な どに
リボ フ ラ ビン の リビチ ル基 を除 い た縮 合 環 (7, 8-
ジ メチ ル イ ソア ロキ サ ジ ン) を もつ 分 子 の 総 称 名 で あ
る。
関 与 して い る こ とか ら も, 容 易 に そ の 広範 な 役割 を理 解
す る こ とが で き る。 ま た, 生 物発 光
や, 損 傷DNAの
光依存的修復の よ
うな光 に まつ わ る特 異 な 過 程 に ま で
フ ラビ ン酵 素 が か か わ って い る。 い
うま で も な く, フ ラ ビ ン酵 素 は, フ
ラ ビン分 子 種 を 補 酵 素 とす る酵 素 群
であ るが, フ ラ ビ ンに は, 酸 化 型,
還 元 型 が あ っ て (図1),
フ ラ ビン酵
素 は電 子 の授 受 を 伴 う酸 化 還 元 反 応
を触 媒 す る。 上 にあ げ た 反 応 過 程 か
ら判 断 す れ ば, フ ラ ビン 酵 素 群 は 生
体 内 のほ とん どす べ て の 酸 化 還 元 過
程 に, 直 接 的 また は 間 接 的 に 関 与 し
て い る とい って もけ っ して い いす ぎ
図1.
リボ フ ラ ビ ン, FMN,
FADの
構造
FADはAMP部
分 ま で 含 ん だ 全 体 の構 造 。
で は な い 。 高 等 動 物 を 含 め, す べ て
Retsu
Miura,
Shigeru
Fujii,
関西 医科 大 学 化 学 教 窒
The Application of Multinuclear NMR to the
Key【フ
word
ラ ビ ン酵 素 】 【多核NMR】
Active
【安 定 同 位 体】
(〒573
Sites
枚 方 市 宇 山 東 町18-89)
of Flavoenzymes
[Laboratory
of
Chemistry,
Kansai
22
蛋 白 質
核 酸
酵 素
フ ラ ビン酵 素 群 の 広範 な 役 割 の別 の 見方 をす れ ば, フ
5
No. 5
(1990)
て い る^<2,3)>。
ニ ワ ト リの 輸卵 管RNAか
ら 得 られ たc-
ラ ビン酵 素 に よっ て 触 媒 さ れ る酸 化 還 元 反応 の様 式 は,
DNAの
塩 基配 列 も 最 近 明 らか に され て い る^<4)>。
同様 の
基 質 ・反 応 の型 の い ず れ に お い て も他 の どの補 酵 素 よ り
RBPは
妊 娠 中 の哺 乳 動 物 の 血 漿 中 に も 見 い だ さ れ て い
も多 岐 ・多様 に わ た って い る とい うこ とが で き る。 こ の
る^<5)>。
これ ら のRBPの
うち, ニ ワ ト リ卵 白 のRBPは
物
こ とは, フ ラ ビ ン補 酵 素 が 並 は ず れ た潜 在 的 触媒 能 力 を
理 化 学 的 研 究 の も っ とも 進 ん でい る も ので あ る。 卵 白
備 え て い る こ と にほ か な らず, フ ラ ビ ン分 子 は補 酵 素 と
RBPに
お け る リボ フ ラ ビン の 結 合 は 強 く, フ ラビン-蛋
して のす ぐれ た 必 要 条 件 を 満 た して い る。 この 並 はず れ
白 質 相互 作 用 の モ デ ル系 と して しば しば 扱 わ れ て きた 。
た 潜 在 的 触 媒 能 力 は, フ ラ ビ ン分 子 そ の も のの 複 雑 な構
RBPは
造 (図1)
蛋 白 質 と よぶ べ き で あ る。 す なわ ち, RBP中
に 由来 す るわ け であ るが, フ ラ ピ ンに は 図1
に示 す 酸 化 状 態,
2電 子 還 元 状 態 以 外 に, 1電 子 還 元 状
態 (セ ミキ ノン 型 フ ラ ビン) も可 能 であ るた め,
1電 子
酸 化 還 元 過 程 に も 参 加 す る こ と が で き る。 ま た,
型,
1電 子 還 元 型,
い電 荷 移 動 (charge
Database Center for Life Science Online Service
Vol.
酸化
2電 子 還 元 型 の いず れ に も 属 さな
transfer) 状 態 が フ ラ ビ ン酵 素 反 応
フ ラ ビン酵 素 と して の 役 割 を もたず,
フ ラ ビン
のフラビ
ンに は触 媒 活 性 が な く, フ ラビ ンの触 媒 能 力 はす べ て 抑
え られ て い る とい う 意 味 で, RBPは
フ ラビ ン酵 素 の い
わ ば, “対 照” とみ なす こ とも で き る。
8-フ ル オ ロ-8-デ メチ ル リボ フ ラ ビン (8F-リ
ビ ン) は, Kasai
ボ フ ラ
らに よっ て台 成 され た リボ フ ラ ビ ン の
に しぼ しば み られ る。 こ の よ うな複 雑 な酸 化 還 元 系 も フ
フ ッ素 化 誘 導 体 で,
ラ ビン 補 酵 素 の広 範 な潜 在 的 触 媒 能 力 の一 因 とな って い
ッ素 に お きか え た もの で あ る^<6)>。
こ の化 合 物 は,
リボ フ ラ ビン の8位 の メ チ ル基 を フ
る。 個 々 の フ ラ ビ ン酵 素 で は, こ の潜 在 的 触 媒 能 力 が 巧
ン酵 素 (蛋 白質) の 活 性 域 ア ミノ酸 残 基 を検 索 す るた め
フ ラビ
妙 に制 御 され た り, 促 進 され た り して調 節 を受 け, そ れ
の試 薬 と して の 性 質 を も って い るが^<6)>,
こ こ で は, ^<19>F-
ぞ れ の基 質 特 異 性, 反 応 特 異 性 が発 現 され て い る。 筆 者
NMRを
ら は, フ ラビ ン分 子 の潜 在 的 触 媒 能 力 (反応 性) が, フ
した 例^<7)>を
紹 介す る。
ラ ビン 分 子 種 を め ぐる分 子 間 相 互 作 用 を介 して調 節 され
ア ポ卵 白RBP-8F-リ
ボ フ ラ ビ ン複 台 体 に適 応
8F-リ ボ フ ラ ビン-ア ポRBP複
合 体 の^<19>F-NMRで
る と い う観 点 に た っ て, 機 能 を異 にす る い くつ か の フ ラ
は, 8F-リ ボ フ ラビ ン 由来 の信 号 は中 性pHで
ビ ン酵 素 (蛋 白質) につ い て研 究 を進 め て きた 。
もの に 比 べ て 低 磁 場 側 に シ フ トした 幅 広 い ピー ク と して
生 体 内 にお け る フ ラ ビ ン分 子 種 の存 在 様 式 は,
ラ ビ ン, FMN
は遊 離 の
リボ フ
(フ ラ ビン モ ノヌ ク レオ チ ド), FAD
(フ
ラ ビン ア デ ニン ジ ヌ ク レオ チ ド) で あ る (図1)。 この う
ち, 補 酵 素 とな るの はFMN,
FADだ
け であ り, リボ フ
ラ ビン は 補 酵 素 とは な ら な い。 本 稿 で は,
, FMN,
FADを
リボ フ ラビン
そ れ ぞ れ 補 酵 素 (また は補 因子) と
す る, リボ フ ラ ビン結 合 蛋 白質, 旧 黄 色 酵 素, D-ア ミノ
酸 酸 化 酵 素 を と りあ げ, フ ラ ビンを め ぐる分 子 間 相 互 作
用 につ いて, 多 核NMR分
光 法 を 利 用 した 筆 者 ら の最
近 の研 究 を 紹 介 した い。
1.
リボ フ ラ ビ ン結 合 蛋 白 質
リボ フ ラ ビ ン 結 合 蛋 白 質
in ;RBP)
は,
(riboflavin
リ ボ フ ラビン
り, 貯 蔵 した り す る 役 割 を も ち,
白,
卵 黄,
れ ら3種
11ま
826
Prote
を 輸 送 した
ニ ワ ト リRBPは
卵
卵 を 産 む ニ ワ ト リ の 血 漿 中 に み ら れ る^<1)>。
こ
類 のRBPの
血 漿RBPは
一方 ,
binding
(ビ タ ミ ンB_2)
ア ミ ノ酸 配 列 か ら, 卵 白RBPと
同 一 蛋 白 質 で219個
の ア ミ ノ酸 か ら な り,
図2.
卵 黄RBPは
た は13残
卵 白RBPの
カル ボ キ シル 末端 の
基 が 欠落 した蛋 白質 で あ る こ とがわ か っ
8F-リ
(a) 遊 離8F-リ
ラ ビン。
ボ フ ラ ビ ンの^<19>F信号 のpH滴
ボ フ ラ ビン, (b)
RBP結
定 曲 線^<7)>
合8F-リ
ボフ
フラビン酵素活性域へ の多核NMRの
図3.
8F-リ
ボ フ ラ ビン-RBPの
観 測 され る。 こ の信 号 のpH依
結 合 定 数 のpH依
Database Center for Life Science Online Service
こ のPKaは8F-リ
23
存 性^<7)>
存 性 調 べ た と ころ, 図2
に示 す 結 果 が 得 られ た 。 遊 離 の8F-リ
定 曲線 は, 9.6付 近 にpKaを
応用
ボ フ ラビン の 滴
示 す 単 純 な 曲線 で あ る。
ボ フ ラ ビ ンのN
(3)-Hに
よるもの
で あ る が, 8位 の^<19>Fの信号 が, 遠 く離 れ た3位 の イ オ
ン化 状 態 に こ の よ うに敏 感 であ る こ とは注 目に値 す る。
フ ラ ビン の ウ ラ シ ル部 分 は, フ ラ ビ ン酵 素 にお いて, 蛋
白 質,
リガ ン ドと水 素 結 合 を介 して 相 互 作 用 す る部 位 で
あ る。 こ の部 位 の電 子 的 な変 化 が8位
の電 子 的 変 化 と し
て伝 え られ る事 実 は, フ ラ ビン 酵 素 中 の8位 の重 要 性 を
示 唆 して い る。 図2に 明 らか な よ うに, RBP結
図4.
(a)
[2-^<13>C]
コ リ ボ フ ラ ビ ン の^<13>C-NMRス
遊 離
[2-^<13>C] リ ボ フ ラ ビン,
リボ フ ラ ビ ン,
(c)
RBPに
(b)
ペ ク トル^<9)>
RBP結
比 べ て 小 過剰
の
合[2-^<13>C]
[2-^<13>C] リボ フ
ラ ビ ン存 在 下 。
合状態
の 信号 は, 酸 性 域 か ら 中性 域 にか け て緩 や か な変 化 が み
ラ ビンは 文 献 記 載 の方 法^<10)>に
従 って^<13>C標識 出 発 原 料 を
られ るが, N (3)-Hに
用 い て, 化 学 合 成 に よっ て調 製 した 。 これ ら の^<13>C標
識
よ るpKaが
ア ル カ リ側 にず れ て
い る こ とが わ か っ た 。8F-リ ボ フ ラ ビ ンがRBPに
結合
す る と, そ の蛍 光 が完 全 に消 光 され る こ とを利 用 して,
8F-リ ボ フ ラ ビ ン-PBR複
合 体 の結 合 定 数 を求 め る こ と
が で き る。 この 方法 は, リボ フ ラ ビン-RBP結
られ た Nishikimi
ン-RBP複
3),
ら の 方 法 で あ る^<8)>。8F-リ
ボ フラビ
合 体 の結 合 定 数 のpH依
5.5, 9.5付 近 にpKaを
存 性 をみ る と (図
もつ 典型 的 な ベ ル型 曲線
を 示 して い る。 この プ ロ ッ トは, 蛋 白 質
離 状 態 のpKaを
ラ ビ ン のN
合 に用 い
リガ ン ドの遊
反 映 す るの で, pKa9.5は8F-リ
(3)-Hに
ボフ
相 当す る と思 わ れ る。pKa5.5は
蛋 白質 の ア ミノ酸 残 基 に よ る ので あ ろ う。 これ らの 確 認
と, よ り詳 しい 解 析 の た め に, 以 下 に 述 べ る よ う に
^<13>C-NMRを
適 用 した^<9)>
。
測 定 す る方 法 で あ る。^<13>C標
ビン に よ る^<13>C-NMRス
ペ ク トル を 図4に 示 す 。これ ら
て, 標 識^<13>Cの化 学 シフ トのpH依
に, 2-^<13>C信
号 のpH-化
遊 離 型 のpHプ
存 性 を調 べ た (図5
ロフ ィー ル は いず れ も,N (3)-Hの
イ
もつ 単 純 な滴 定 曲線 を与 え
る。 中 で も, N (3) に近 接 した2-, 4-^<13>C信
号 の 滴 定 曲線
は, N (3)-Hの
イオン 化 状 態 に敏 感 で あ る。一 方, RBP
結 合 型 のpHプ
ロ フ ィー ル で は, い ず れ も, N (3)-Hの
pKaが
ア ル カ リ側 に シフ トして い る こ とが わ か り, 8F-
リボ フ ラ ビ ンのpKaの
N (3)-Hの
結 果 が 確 認 で きた 。RBP結
(3)-HのpKa値
合
の 上昇は
近 傍 の環 境 に起 因 す る はず で あ る 。 す な わ
ち,
リガ ン ドとの相 互 作 用 を 考 慮 して, 2, 4, 4a, 10a位
合, ま た は, N (3)-H近
選 んだ (位置 番 号 に つ い て は 図1参 照)。^<13>C標
識 リボフ
合 型 につ い
学 シ フ トプ ロフ ィー ル を示 す)。
オン 化 を 反 映 して, pKa10を
識 位 置 は, フ ラ ビ ン酸 化 還 元部 位, フ ラビ ン と蛋 白 質,
を
合 型 状 態 の^<13>C-NMR
の^<13>C標識 リボ フ ラ ビン の遊 離 型, RBP結
に よ る リ ボ フ ラ ビ ン のN
こ の方 法 は^<13>Cで標 識 した リボ フ ラ ビ ンを ア ポRBP
に結 合 させ, ^<13>C-NMRを
リボ フ ラ ビ ンの遊 離 状 態, RBP結
ス ペ ク トル を測 定 した 。そ れ ら の うち, [2-^<13>C]
リボ フ ラ
可 能 性 と して, N (3)-Hと
蛋 白質 部 分 と の 水 素 結
傍 の 疎 水 的 環 境 に よ るN (3)-ア
ニ オン の不 安 定 化 が 考 え られ る。 そ こで, N (3) 位 の 水
827
24
蛋 白 質
核 酸
酵 素
Vol. 35
No. 5
(1990)
ろ, い ず れ もpH依
存 性 を 示 さな か った。 こ の こ と, お
よび, 3-メ チ ル リボ フ ラ ビン のRBPと
の結 合 が, リボ
フ ラビン の それ と同等 の強 さ であ る (図6)
RBP結
合 に よ るN (3)-HのpKa値
こ とか ら,
の 上 昇 は, 疎 水 性
環 境 に よ るN (3) 位 の プ ロ トン化 型 安 定化 に 起 因す る と
結 論 され た 。
リボ フ ラ ビ ン, 3-メ チ ル リボ フ ラ ビ ン とRBPと
合 定 数 のpH依
ン (図3),
存 性 を み る と (図6),
リボ フ ラ ビン (図6A)
側 のpKaが3-メ
8F-リ
の結
ボフラ ビ
にみ られ る ア ル カ リ
チ ル リボ フ ラビン の場 合 に消 失 して い
る (図6B)。
した が っ て,
れ るpKa10,
8F-リ ボ フ ラ ビ ンの結 合 に み られ るpKa
9.5は,
N (3)-Hに
リボ フ ラビ ン の結 合 にみ ら
由来 す る と結 論 で きた 。 リボ フ ラ ビン
, 3-メ チ ル リボ フラ ビン, 8F-リ ボ フ ラ ビン に は5付
Database Center for Life Science Online Service
近 にpKaを
もつ 解 離 基 は な く, リボ フ ラビン,
3-メ チ
ル リボ フ ラ ビ ン, 8F-リ ボ フ ラ ビン の結 合 定 数-pHプ
ロ
ッ トにみ られ る, pKα 約5の 解離 基 は蛋 白質 側 に 由来 す
る。 この こ とに 基 づ き, 3-メ チ ル リボ フ ラ ビン とRBP
の結 合 は式 (1)
図5.
[2-^<13>C]リボ フ ラ ビン の^<13>C信 号 のpH滴
遊 離 型 (○) お よびRBP結
の 理 論 曲線 。
の平 衡 式 で表 わ され る。
定 曲 線^<9)>
合 型 (●)。 実 線 はpKa9.90
こ こで, PH,
(pKa約5)
Pは
結 合 に関 与 す る蛋 白 質 中 の解 離 基
のそ れ ぞ れ プ ロ トン化, 脱 プロ トン化 状 態
を表 わ し, そ の解 離 の平 衡 定 数 はK_1で
メ チ ル リボ フ ラ ビン, Ka_1, Ka_2は,
とMの
P
結 合 定 数 であ る。
実 測 され る結 合 定数 は 式
Ka_1,
あ る。Mは3-
そ れ ぞ れ, PH,
Ka_2を
(2)
で 与 え ら れ る 。K_1,
パ ラ メ ー タ と し て 図6Bの
観測点を非線型
最 小 二 乗 法 に よ っ て フ ィ ッテ ィン グ す る と, pK_1=5.04,
Ka_1=1.01×10^9M^<-1>と
フ ラ ビン とRBPの
求 め る こ と が で き た 。 ま た,リ
こ こ で,
図6.
リボ フ ラ ビン-RBP結
合 定 数 のpH依
お よ び3-メ チ ル リボ フ ラ ビン-RBP結
pH依
存性
存 性 (A)
合定数 の
(B)^9)
実 線 は い ず れ も 非 線 型 最 小 二 乗 法 の 最 適理 論 曲 線 (本 文 参
照) で あ る。
ン化,
828
合 型 のpH依
存性 を 調べ た と こ
結 合 は式
のFH,
FはN
(3)
の よ うに 表 わ せ る 。
(3) が そ れ ぞ れ プ ロ ト
脱 プ ロ トン 化 した リ ボ フ ラビ ン を 表 わ し,
る 。K_3は,
る。
号 の遊 離 型, RBP結
(4)
そ の 解 離 の 平 衡 定 数,
数,
素 を^<13>C標識 メ チ ル化 し, こ の^<13>C-メ
チ ル のNMR信
式
Ka_3,
RBP結
Ka_4, Ka_5は
PH,
P,
合 型FHの
式
(3)
ボ
K_1は 式
(1)
K_2は
と共 通 で あ
プ ロ トン 解 離 の 平 衡 定
中 に 示 した 結 合 定 数 で あ
フラ ビン酵 素活性域へ の多核NMRの
応用
酸 配 列 やcDNAの
25
配列 は 明 らか に な って い な い。 ア ミ
ノ酸 配 列 に関 して は ご く一 部 が わ か っ て い る に す ぎ な
い^<15)>。
生 理 的 意 義 は ともか く と して, OYEは
種 々 の物
理 化 学 的 研 究 の対 象 に な っ て き た が, それ は, OYEが
フ ェ ノー ル化 合 物 と強 固 な複 合 体 を形 成 し, 可 視部 の 長
波 長 領 域 に 特 徴 的 な 吸 収 帯 を 示 す^<14,16)>こ
とに 注 目さ れ
た か らで あ る。 こ の吸 収 帯 は フ ェ ノー ル 化 合物 と フ ラ ビ
ンの間 の電 荷 移 動 (charge
観 測 さ れ るみか け の 結 合 定 数 は 式 (5)
で与 え られ
る。
さ れ た が^<16)>,
Eweg
transfer) 相互 作用 に よ る と
らに よっ て電 荷 移 動 相 互 作 用 とす る
こ とに 異論 が 提 出 さ れ た^<17)>。
しか し, Kitagawa,
naら
Nishi
に よ る共 鳴 ラマン 分 光 法 に よ る研 究^<18,19)>,
Beinert
らの^<13>C-, ^<15>N-NMR法 に よ る研 究^<20)>,
筆 者 らの^<13>CK_2に
は^<13>C標 識 リ ボ フ ラ ビン のNMR信
滴 定 曲 線 か ら 求 め ら れ たpKa値
Database Center for Life Science Online Service
用 い,
K_1, Ka_3,
Ka_4,
の平 均 値
Ka_5を
NMR法
号 のpH
(9.95)
を
に よ る 研 究^<21)>に
よ っ て,
O YE複
フ ェ ノ ール 化 合 物-
合 体 に は フ ェ ノー ル-フ ラ ビ ン電 荷 移 動 相 互 作 用
が 介 在 す る こ とが 支 持 され て い る。 こ の フ ェノ ー ル化 合
パ ラ メ ー タ と し て 図6A
の 観 測 点 を 非 線 型 最 小 二 乗 法 に よ っ て フ ィ ッテ ィ ン グ す
物-OYE複
る と, PK_1=4.89,
は, フ ラ ビ ン酵 素 反 応 中 に しば しば み られ る こ とか ら,
pK_3=12.15,
Ka_4=1.42×10^9M^<-1>,
た 。 す な わ ち,リ
RBP結
Ka_3=2.31×10^7M^<-1>,
Ka_5=9.01×10^6M^<-1>と
ボ フ ラ ビ ン のN
台 に よ っ て10.0か
確 認 さ れ た 。 ま た,
5付
ら12.2に
ま で 上 が る こ とが
近 にpKaを
リ ボ フ ラ ビ ン はN
う がRBP結
電 荷 移 動 相 互 作 用 の重 要 性 が指 摘 さ れ て い た^<22)>。
以下
に, 筆 者 ら の^<13>C-NMRを
(3)-HのpKaは
も つRBP側
基 の 脱 プ ロ トン 化 状 態 が リ ボ フ ラビン
る こ と,
求 め られ
合 体 の 電 荷 移 動 吸 収 帯 と同 様 の幅 広 い吸 収 帯
の解 離
の結 合 に 有 利 で あ
利 用 したOYEの
研 究^<21)>を
紹
介 す る。
前 節 のRBPの^<13>C-NMRの
したFMNを
アポOYEに
応 用 と同 じ く, ^<13>C標
識
再 構 成 させ, 種 々 の 条 件 下 に
(3) 位 が プ ロ トン 化 状 態 の ほ
合 に有 利 で あ る こ とが 確 認 さ れ た 。
以 上 の よ う に^<19>F標 識 リボ フ ラ ビン, ^<13>C標 識 リ ボ フ
ラ ビ ン を 用 い た^<19>F-NMR, ^<13>C-NMRに
よ っ て, RBP-
リボ フ ラ ビ ン 複 合 体 の フ ラ ビン 域 の 環 境 や,
結 合 にか か
わ る イ オン 化 状 態 の 詳 細 を 知 る こ と が で き た 。
II.
旧 黄 色酵 素
(old
旧 黄
yellow
色 酵 素
enzyme
; OYE)
は, Warburg
ら に よ っ て ビ ー ル 酵 母 か ら 初 め て の フ ラビ ン 酵 素 と し
て 発 見 さ れ^<11)>,
彼 ら は こ の 酵 素 を, “Gelbes
と名 づ け た^<12)>。
彼 ら に よ っ て,
Ferment”
そ れ ま で に 栄 養学 上
のビ タ ミン と し て 知 ら れ て い た ビ タ ミンB_2と
が 初 め て 関 連 づ け ら れ た 。 ま た,
OYEは
酵素
フ ラ ビン 酵
素 と して は 初 め て 結 晶 化 さ れ た 酵 素 で あ る^<13)>。
旧黄 色 酵
素
(old yellow
enzyme)
と い う奇 妙 な 名 称 が 生 き 残 っ て
い る の は こ のOYEの
が,
も う1つ
由緒 あ る 歴 史 と 無 関 係 で は な い
の 理 由 は,
そ の 生 理 的 基 質,
生理的意義 が
今 に至 るま で は っ き りしな いか らで も あ ろ う。
OYEは,
FMNを
分 子 量49,000の
サ ブ ユ ニッ
トあ た り1個
補 酵 素 と し て も っ て い る^<14)>。OYEの
の
全 ア ミノ
図7.
(a)
[4a-^<13>C] FMNの^<13>C-NMRス
遊 離 型,
(b)
OYE結
合 型,
(c)
ペ ク トル^<21)>
OYE-PBP複
合 体 型 。
829
26
蛋
表1. ^<13>C標
白 質
識FMNの^<13>C化
核 酸
酵 素
Vol. 35
No.
5
(1990)
大 き さ と置 換 基 の ハ メ ッ ト σ_p値の関 係 を プ ロ ッ トす る
学 シ フ ト^<21)>
と図8の
よ うに近 似 的 直 線 関 係 が 得 られ た 。
と ころ で, フ ェ ノー ル化 合 物 とOYEの
複 合 体 では フ
ェ ノー ル の 水酸 基 が 脱 プ ロ トン化 した フ ェ ノ ラ ー トイオ
ン 型 に な っ て い るこ とがわ か っ て い る^<16,20)>。p置
換 フェ
ノ ラー トイ オン の ハ メ ッ ト σ_p値は フ ェ ノ ラ ー ト酸 素 に
a)
PBPはp-プ
ロモ フ ェ ノ ール 。
お け る電 子密 度 の指 標 と考 え る こ とが で き る。 した が っ
^<
13>C-NMRス
ペ ク トル を 測 定 し, 標 識^<13>Cの信 号 を観 測
した 。FMNの^<13>C標
識 位 置 は, 前 節 と同 じ く, フ ラ
酸 素 の電 子密 度 が 高 い ほ ど 複 合 体 の4a炭
ビン 部 分 の2,
10a位
フ トが高 い, す なわ ち, 電 子 密 度 が 高 くな って い る こ と
4, 4a,
で あ る。 化 学 合 成 し た
素 の化 学 シ
^<
13>C標 識 リボ フ ラ ビン を オ キ シ塩 化 リンに よ って リン酸
を示 して い る。筆 者 らは, こ の こ とか ら, OYE-フ
化 し, 逆 相HPLCに
ー ル化 合 物 複 合 体 で は, フ ェノ ラ ー ト酸 素 か ら フ ラビ ン
て精 製 して^<13>C標識FMNを
こ とが で き る^<23)>。^<13>C-FMN再
構 成OYEの
p-プ ロモ フ ェ ノ ール (PBP)
NMRを
Database Center for Life Science Online Service
て, 図8の 近 似 的 直 線 性 は, イオン 化 した フ ェ ノ ラー ト
遊 離 状 態,
との 複 合 体 に つ い て^<13>C-
測 定 し, そ れ ぞ れ の^<13>C信
号 を観 測 す る こ とが
で き た 。 図7は
型,
得る
OYE-PBP複
る。表1に,
[4a-^<13>C]FMNの
遊 離 型, OYE結
合 体 型 の^<13>C-NMRス
合
ペ ク トル で あ
結 果 を ま とめ るOYEとOYE-PBP複
合
へ の電 荷 移 動 が起 こ り, そ の結 果, フ ラビン の4a炭
素
の電 子密 度 が高 くな っ て い る と解 釈 して い る。
OYEの^<31>P-NMRス
ペ ク トル に は, FMNの
リン酸
基 に よ る^<31>P信号 が み られ る。 この^<31>P化 学 シ フ トは
pH 8に お い て, 遊離FMNの
そ れ よ り3.4ppm低
シ フ ト して い る。 遊 離FMNの^<31>P信
体 を比 較 す る と, 4a-^<13>Cの化 学 シ フ トが 他 に 比 べ て と
を 示 し, pKa6.5を
くに差 が大 き く, 複 合 体 で3.7ppm高
OYE結
磁 場 シ フ トして
ェノ
合FMNの
磁場
号 はpH依
存性
もつ 単 純 な 滴 定 曲線 を 与 え る が,
そ れ は, pH
5∼9の 範 囲 でpHに
依
い る。sp^2炭 素 の化 学 シ フ トは, 電 子 密 度 に もっ と も敏
存 しな い (図9)^<21)>。
遊 離FMNのpKa6.5は
感 で あ る こ とか ら, PBPと
の モ ノア ニオン ージ ア ニ オン 平 衡 に よる も の で あ る 。 し
ラ ビン の4a炭
複 合 体 を 作 る こ とに よ り, フ
素 の電 子 密 度 が 高 くな って い る こ とが示
た が っ て, OYE結
合 のFMNリン
リン酸 基
酸 基 は 広 いpH領
唆 され た。
フ ェ ノー ル 化 合 物 と フ ラ ビ ン の間 の相 互 作用 を よ り詳
し く知 るた め に, 他 のp置
換 フ ェ ノー ル誘 導 体 とOYE
の 複合 体 につ い て 同様 の測 定 を 行 な い, 4a炭
素 の化 学
シフ トが どれ だ け 変 化す るか を 調 べ た 。用 い た フ ェノ ー
ル誘 導 体 のp置
換 基 は, F, Cl, Br, CHO,
た が, す べ て の誘 導 体 につ い て, 4a炭
NO_2で あ っ
素 の信 号 は複 合
体 形 成 に よっ て 高磁 場 シフ トした 。 この高 磁 場 シ フ トの
図8. p置
換 フ ェ ノー ル-OYE複
合 体 形 成 に よる4a-^<13>C
化 学 シ フ ト変 化 の置 換 基 効 果^<21)>
図9.
遊 離型
FMNの^<31>P信
号 のpH依
(○) お よ びOYE結
存 性^<21)>
合 型 (●)。
域
フラ ビン酵 素活性域へ の多核NMRの
27
応用
にわ た って ジア ニオ ン型 に 固 定 され て い る とい え る。 同
じ よ うなpH非
FMN蛋
依 存 性 と ジア ニオン 型 へ の 固 定 が 他 の
白質 フ ラボ ドキ シ ンに もみ られ る^<24)>。
しか し,
蛋 白質 結 合FMNの^<31>P信
号 が遊 離FMNに
き く低 磁 場 シ フ トして い る のはOYEに
フ ラ ボ ドキ シン の場 合, 0.1ppmシ
あ る^<24)>。
同 じFMN蛋
比 べ て大
特 徴的 で あ る 。
フ トして い るだ け で
白質 であ っ て も両 者 で, リ ン酸 部
分 の結 合 様 式 が大 き く異 な って い る と考 え られ る。 フ ラ
ボ ドキ シ ンのFMNの
リン酸 結 合 部 位 に は 陽 電 荷 を も
つ 残 基 は な い が^<25,26)>,
OYEのFMNの
リン酸 結 合部 位
に は陽 電荷 を もつ 残 基 があ って, そ の静 電 相 互 作 用 のた
め に 低磁 場 シフ トす る こ とが考 え られ る。 こ の よ うな 静
電 相 互 作用 に よ る低 磁 場 シ フ トはNADPH-ア
キ シ ン還 元酵 素 とNADPと
ド レノ ド
の複 合 体 に お け るNADP
Database Center for Life Science Online Service
の2'-リン 酸 基 の^<31>P信号 に も観 察 され て い る^<27)>。
III.
D-ア
ミ ノ酸 酸 化 酵 素
図10.
D-ア
は,
ミノ酸 酸 化酵 素
1935年,
Krebs
(D-amino
acid
oxidase
; DAO)
(a)
DAOお
^<13>C-NMRス
DAO,
FAD-DAO,
に よ っ て 発 見 さ れ^<28,29)>,
Kubo,
よ び^<13>C-FAD再
ペ ク トル^<37)>
(b)
(d)
構 成DAOの
[2-^<13>C] FAD-DAO,
(c)
[4, 10a-^<13>C_2] FAD-DAO。
[4a-^<13>C]
図 中 に は そ
れ ぞれ の信 号 を示 して い る。
Yamano
ら に よ っ て ブ タ 腎 臓 のDAOが
動物 の フ ラ ビ ン
酵 素 と し て 初 め て 結 晶 化 さ れ た^<30,31)>,
歴 史の古い由緒あ
る酵 素 で あ る 。 生 体 に と っ て,
と くに 高 等 動 物 に と っ
てD-ア
ミ ノ酸 は,
DAOは
生 物 界 に 広 く分 布 し, 高 等 動 物 で は,
臓 を は じ め,
DAOの
い わ ば 異 物 で あ る に も か か わ ら ず,
種 々 の 臓 器,
組 織,
Hamilton
息 香 酸, o-, m-, p-ア
ミノ安 息 香 酸 はDAOと
強 く結 合
して 複 合 体 を 作 り, 可 視 吸 収 スペ ク トル^<41)>,
CDス
ペク
腎
トル^<42)>,
共 鳴 ラマン ス ペ ク トル^<43)>な
どの分 光 学 的 方 法 に
細 胞 に見 い だ され る。
よ って これ ら の複 合 体 の性 質 が 調 べ られ て き た 。 安 息 香
肝 臓,
生 理 学 的 意 義 に 関 して は 現 在 の と こ ろ,
た 説 は な い が,
は い くつ か の 拮 抗 阻 害 剤 が 知 られ て い る が, 中 で も, 安
ら に よ っ て,
DAOの
確立 し
生理的基
酸 は, 基 質D-ア
つ が,
ミ ノ酸 と 共 通 して カル ボ キ シル 基 を も
ア ミノ安 息 香 酸 はD-ア
ミノ酸 と 共 通 して カル ボ
シ ス テ ア ミン と グ リ オ キ シ ル 酸 の 環 状 付 加 物 で あ
キ シル 基 とア ミノ基 の両 方 を もつ の で, 安 息香 酸 よ りも
る と い う 仮 説 が 提 出 さ れ て い る が^<32,33)>,
確定 して い な
基 質 に近 い 基 質 類 似 体 であ る。 ま た, ア ミノ安 息 香 酸 の
質 は,
3つ の異 性 体 (o-, m-, p-異
い。
本 節 で 扱 うDAOは
そ の 発 見 以 来,
非 常 に広 い範 囲 の
研 究 の 対 象 と な っ て き た ブ タ 腎 臓 皮 質DAOで
のDAOは
あ る。こ
分 子 量39,000^<34,35)>の サ ブ ユ ニ ッ トあ た り1
分 子 のFADを
識FADで
そ れ ぞ れ の 標 識^<13>C信 号 を 観
測 す る こ と が で き る (図10)^<37)>。 こ の と き の,
^<13>C標 識 位 置 は , 第 工節,
と 同 じ く,
フ ラ ビ ン 環 の2,
^<13>C標 識FADは
4,
のRBP,
4a,
10a炭
FADの
OYEの
揚合
素 で あ る。
, 化 学 合 成 し た^<13>C標 識 リボ フ ラ ビ ン
を Brevibacterium ammoniagenes
よ っ てFADレ
第II節
っ とも基 質 に近 い。
こ の こ とか ら, 上 記 基 質 類 似 体 の う ちo-ア
ミノ安 息
o-ア ミノ安 息 香 酸 よ り も さ ら に 基 質 に 近 い 構 造 の 基
再 構 成 し て, ^<13>C-NMRス
ペ ク ト ル を 測 定 す る と,
性体が も
香 酸 が基 質 に も っ とも近 い構 造 を もっ て い る。 しか し,
も っ て お り, ア ミ ノ酸 配 列^<34)>,
cDNAの
塩 基 配 列^<36)>も
明 らか に さ れ て い る 。
DAOを^<13>C標
性体) の うち, ア ミノ基 と
カ ル ボ キ シ ル基 の互 い の幾 何 学 的 配 置 はo-異
のFAD合
成酵素に
ベ ル に 誘 導 して 得 ら れ る^<38∼40)>。DAOに
質 類 似 体 は α-ア ミノ-β-シ ア ノ ア ク リル 酸 (NC-CH=
C (NH_2) COOH)
であ る。 こ の 化 合 物 はDAOと
ア
ノ-D-ア ラニン
(D-BCNA)
β-シ
の 反応 に よっ て生 成 す
る^<44)>。DAO-o-ア ミノ安 息香 酸 複 合 体 は 可 視 部 長 波 長 領
域 に 幅 広 い 典 型 的 な 電 荷 移 動 吸 収 帯 を示 し, こ の 吸収 帯
はDAO-m-ア
ミノ安 息 香 酸 複 合 体,
DAO-p-ア
ミノ安
息 香 酸 複 合 体 と な る に した が って 小 さ く な る^<41>。
さ ら
に, DAO-α-ア
ミ ノ-β-シア ノ ア ク リル酸 複 合 体 もま た
831
28
蛋 白 質
核 酸
酵 素
Vol. 35
No. 5
(1990)
Database Center for Life Science Online Service
図11.
DAOお
よびDAO拮
抗 阻害 剤 複 合 体 に お け る2, 4, 4a, 10a-^<13>C信号 の 化 学 シ フ トの 相 関 図^<48)>
OAB,
MAB,
PABは
そ れ ぞ れ, o-, m-, p-ア ミノ安 息 香 酸 の略, BZは 安 息 香 酸 の略, DAO-D-BCNAは
DAO-α-ア
ミノ-β-シ ア ノ ア ク リル 酸 複 合 体, DAO-D-ProはDAO-⊿^1-ピ
ロ リ ジ ン-2-カ ル ボン 酸 複 合 体 で あ
る (本 文 参 照)。
長 波 長 部 に 電荷 移 動 吸 収帯 を示 す^<44,45)>。
また, Shiga
は, DAO-ア
ミノ安 息 香 酸 複 合 体 のCDス
ら
ペ ク トル の解
析 か ら, これ らの 電 荷 移 動 は ア ミノ基 か ら フ ラ ビ ンへ と
起 こ る こ とを示 唆 して い る^<42)>。
これ らの こ とを 総合 して, 筆 者 らは, DAO-基
質 複合
体 に お い て, ア ミノ基 か らフ ラ ビン へ の 電 荷 移 動 が 触媒
過 程 で 重 要 な 役 割 を 果 たす と考 え て い る^<46,47)>。^<13>C標
識
FADで
再 構 成 したDAOと
体 の^<13>C-NMRス
上 述 の基 質類 似 体 との 複合
ペ ク トル を 測 定 し, 遊 離 のDAOと
比
図12.
DAO-o-ア
ミノ安 息 香 酸 複 合 体 の モ デ ル
較 した 。結 果 を グ ラ フ に ま と め る (図11)^<48)>。
図中の
DAO-D-BCNAはDAOと
BCNA)
β-シア ノ-D-ア ラ ニ ン (D-
の反 応 に よ って 生 成 す るDAO-α-ア
ミノ-β-シ
ア ノア ク リル酸 複 合体 で あ り^<44)>,
図 中 のDAO-D-Proは
DAOとD-プロ
リン の反 応 でみ られ るDAO-⊿^1-ピ
る。 す な わ ち, カル ボ キ シル基 結 合 部 位 はC
(4)=Oの
水 素 結 合 部 位 と共通 (た とえ ば, リ シン の ε-アミノ基)
(ま た は, 接 近) して お り, こ の位 置 に カ ル ボ キ シ ル基 が
ロリ
結 合す る とC (4)=Oで
の 水 素 結 合 が 切 断 され (また は,
ジン-2-カ ル ボ ン酸 複合 体 で^<41)>,
こ の 場 合 の リガ ン ドは
弱 め られ), そ の た め に4-^<13>C信号 が 高磁 場 シ フ トす る。
生 成 物 の イ ミノ酸 で あ る。 図か ら明 らか な よ うに, 4a-,
ま た,
10a-^<13>Cは 複合 体 形 成 に対 して それ ほ ど敏 感 で は な い
微 小 変 化 の た め に, C (2)=Oで
が, 2-^<13>C,
4-^<13>Cは
敏 感 に 変 化 して い る。興 味深 い の は,
2-^<13>C信
号 が 低 磁 場 シ フ トす る。 一 方, ア ミノ基 は,
2-^<13>C信
号 の 複 合 体 形 成 に よ る 変 化 の しか た が 同 程 度 の
ラビ ンの近 くに位 置 し, ア ミ ノ窒 素 とフ ラ ビン π電 子 系
低 磁 場 シ フ トであ るの に対 し, 4-^<13>C信号 は,
との 間 に電 荷 移 動 相 互 作 用 が可 能 とな る。o-位 が フ ラ ビ
リガン ド
リガ ン ド結 合 に よ るフ ラ ビ ン周 りの蛋 白質 構 造 の
の水 素 結 合 が 強 め られ,
フ
の種 類 に よっ て変 化 の様 相 が異 な っ て い る。 フ ラ ビ ンの
ンの 近 くに 位 置 す る こ と は, DAO-フ
2, 4炭 素 は カ ル ボ ニ ル炭 素 で, こ れ ら の カル ボ ニル 基
(o-, m-, p-異
は, 蛋 白 質 や,
フ ル オ ロ安 息香 酸 の^<19>Fがフ ラ ビ ン に も っ と も近 い こ と
リガ ン ド, 溶 媒 と の 水 素 結 合 部 位 で あ
る。 ま た, これ らの位 置 で の水 素 結 合 は2-^<13>C,4-^<13>Cの
化 学 シ フ トに影 響 を与 え る こ とが Moonen
ら に よっ て
明 らか に され て い る^<40)>。
複 合 体 の活 性部 位 で の配 置 を 図12の
832
性 体) 複 合 体 の^<19>F-NMRに
ミノ安 息 香 酸
よ うに推 定 して い
お い てo-
を示 唆 す る結 果^<50)>か
ら も支 持 され る。
筆 者 らは, 図12の
合 体 と して 図13の
筆 者 らは, 以 上 の こ とか ら, DAO-o-ア
ル オ ロ安 息 香 酸
モ デ ルを 拡 張 して, DAO-基
質複
モ デル を 考 え て い る。 基 質 の カル ボ
キ シ ル基 は フ ラ ビン のC
(4)=Oと
水 素 結 合 して い る残
基 (ま た は, そ れ に接 近 した 残 基) と結 合 す る こ とに よ
フラビン酵素活性域へ のNMR多
核 の応用
29
(た とえば, 総 説54)。
しか し, 筆 者 ら は, DAOの
応 の 解 析^<55,56)>,
基 質 α-プロ トン のpKaに
逆反
付 随 す るエ ネ
ル ギ ー論 な どか ら協 奏 反 応 説 を主 張 して い る^<46,47)。
基 質 か らフ ラ ビ ンへ と電 子 移 動 が 起 こ る と, 基 質 は生
成 物 イ ミノ酸 に な りフ ラ ビ ンは 還 元 型 に な る。 こ の と
き, イ ミノ酸-還 元 型 酵 素 複 合 体 が 生 成 す る。 こ の 複 合
体 は, 最 初, 長 波 長 可 視 領 域 に幅 広 い吸 収 帯 を もつ 紫 色
中 間 体 とよば れ る反 応 中 間 体 と して観 察 され た^<57∼59)>。
こ
図13.
DAO-基
質複合体のモデル
の紫 色 中 間 体 は,
イ ミノ酸-還 元 型 酵 素 複 合 体 で あ る と
され た が^<58,60)>,
共 鳴 ラマ ン法 に よ って, 還 元 型 酵 素 と カ
りC (4)=Oで
の 蛋 白質 との 水 素結 合 が 切 断 さ れ る (ま
Database Center for Life Science Online Service
た は, 弱 め られ る)。一 方, C (2)=Oで
の蛋 白 質 との 水素
チ オン 型 イ ミ ノ酸 との電 荷 移 動 複合 体 で あ る こ とが 証 明
され た^<61∼64)>。^<13>C標
識FADで
再 構 成 したDAOを
て, こ の 紫 色 中 間体 の^<13>C-NMRを
る。 ア ミノ基 は, カチ オン 型 で結 合 し, プ ロ トンが 蛋 白
と比 較 した^<48)>。
そ れ ぞ れ の^<13>C化学 シ フ トを 図14に
質 塩基 に よっ て 引 き抜 か れ, 中 性 型 ア ミノ基 とな って 非
とめ た 。
用い
結 合 は基 質 結 合 に よ る蛋 白 質 の微 小 変 化 に よ り強 め られ
共 有 電 子対 (lone pair) か ら フ ラ ビン へ 電 荷 移 動 相 互 作
用 す る。 こ の 相 互 作 用 に よっ て 基 質 の α-プ ロ トン の
pKa値
は い くぶ ん 低下 す る 。 次 に, こ の α-プ ロ トン 引
還 元 型DAOお
測 定 し, 還 元 型 酵 素
ま
よび, 紫 色 中 間 体 の それ ぞれ の^<13>C化
学 シ フ ト と還 元 型FMN
(中 性型, お よび, N (1)-ア ニ ナ
ン型) の化 学 シ フ ト^<65)>と
の比 較 か ら, 還 元 型DAOお
よ
き抜 き と, ア ミノ基 の 電 子対 の フ ラビ ンへ の電 子移 動 が
び 紫 色 中間 体 の フ ラビ ン部 分 は いず れ も, N (1)-ア ニナ
協 奏 的 に起 こ り, 基 質 の酸 化 が 完 了す る。 この とき, α-
ン型 還 元 型 で あ る こ とが わか っ た 。紫 色 中 間 体 と還 元 型
プロ トン引 き抜 き と電 子 移 動 は 協 奏 的 に進 む の で, α-カ
DAOと
ル ボ ア ニ オン 生 成 は 起 こ らな い と考 え て い る^<46,47>。
して お り, 紫 色 中 間体 で, 4a炭
フ ラ ビン を め ぐる蛋 白質,
リガン ド, 溶 媒 との 水 素 結
合 ネ ッ トワー クは フ ラ ビン の反 応 性 を 制 御 ・調 節 す る重
を比 べ る と, 4a-^<13>C信号 が 顕 著 に 高 磁 場 シ フ ト
素 の電 子 密 度 が高 くな
って い る こ とが 示 唆 され る。 こ の こ と と, 還 元 型 フ ラ ビ
ンの4a炭
素が再酸化過程 で 分子状酸素 と反応す る 部
要 な 因 子 で あ るこ とが分 子 軌 道 計 算 に よ っ て示 され て い
位 であ る こ とを考 慮 す る と, 紫 色 中 間 体 で, 4a炭
る^<51∼53)>。
した が って, 基 質結 合 の結 果, C (2)=O,
C (4)=
酸 素 に対 す る求 核 的 反 応 性 が 高 くな っ て い る とい え る。
Oで の 水 素結 合 が変 動 を受 け る こ と に よ って, フ ラ ビ ン
す なわ ち, 生 成 物 (イ ミノ酸) が 還 元 型 酵 素 の ア ニ オン
部 分 の 反 応 性 が 調節 を受 け, 電 子移 動 が容 易 に な る と推
型 フ ラビン と電 荷 移 動 相 互 作 用す る こ とに よ っ て, 還 元
定 す る こ とが で き る。DAOに
よる基質酸化 に つ い て
型 フ ラ ビ ンの分 子 状 酸 素 に 対 す る反 応 が 促 進 され る。 こ
は, 基 質 の α-プロ トン引 き抜 き とフ ラ ビンへ の 電 子 移
の こ とは, 遊 離 の還 元 型 酵 素 の 酸 素 に 対 す る反 応 性 よ り
動 が段 階 的 に進 み, した が っ て, 電 子 移 動 の前 に, α-カ
も紫 色 中 間 体 の そ れ のほ うが 高 く, DAOの
ル ボ ア ニ オン が 生 成 す る とい う機 構 が 提 唱 さ れ て い る
ル にお いて 分 子 状 酸 素 は生 成 物 イ ミ ノ酸 が 遊 離 す る 前
図14.
紫 色 (D-Ala),
ア ニ オン 型 還 元 型FMN
(FMNH^-),
還 元 型DAO,
2, 4, 4a, 10a-^<13>C信号 の 化 学 シ フ トの相 関 図^<48)>
紫 色 (D-Pro)
は そ れ ぞ れ 基 質 にD-ア
素の
触媒 サイ ク
紫色中間体におけ る
ラ ニ ン, D-プ ロ リン を 用 い た と きの 紫 色 中 間 体 で あ る。
833
30
に,
蛋 白 質
核 酸
酵 素
紫 色 中 間 体 に 反 応 す る とい う 反 応 動 力 学 か らの 結
Vol. 35
No. 5
(1990)
を 目指 して い る。
論^<58,60,66,67)>の
化 学 的 な根 拠 を与 え て い る。
以 上 の よ う に,
DAO,
DAO-基
文
質 類 似 体 複 合 体, 還 元 型
紫 色 中 間体 に^<13>C-NMRを
クル の 各過 程 で, フ ラ ビ ン部 分 の反 応 が どの よ うに調 節
を受 け るか の い くつ か の 重 要 な 知 見 を 得 る こ とが で き
1)
2)
た。
3)
4)
お わ りに
フ ラ ビ ン酵 素 (蛋 白質) へ の多 核NMRの
応 用 につ い て筆 者 らの研 究 を紹 介 した が, ^<13>C, ^<15>N標
識
フ ラ ビン を用 い たNMR法
先 駆 的 研 究^<10,68,69)>,
Muller
につ いて は, Yagi
らによる
5)
らに よ る系 統 的 研 究 (本 文 中
に い くつ か 引 用 した) な どがあ る が, 限 られ た 誌 面 のた
6)
Database Center for Life Science Online Service
め 割 愛 した 。
こ こ で 紹 介 した ブ ラ ビン を 安 定 同位 体 (^<13>C, ^<15>N,
^<19>F) で標 識 してNMRに
7)
利 用す る方 法 は , フ ラ ビ ン酵
素 の 反 応 中 心 そ の も の の情 報 を 純 粋 に取 り出せ る こ と,
NMR信
号 が一 般 に 電 子 状 態 に 敏 感 で あ る こ とな ど か
ら, フ ラ ビ ン酵 素 反 応 機 構 を理 解 す る のに と くに 有 効 で
8)
9)
あ る。 した が って, こ の よ うな 方 法 は 他 の補 酵 素 (ま た
は 補 因 子) を もつ 酵 素 や 蛋 白質 に適 用 され て しか るべ き
10)
で あ るが, 現 在 の ところ, こ の方 法 が 系統 的 に 適 用 さ れ
て い る のは フ ラ ビン 酵 素 だ け で あ る と い って も よ い 。
NMRを
酵 素 や 蛋 白 質 の よ うな 巨 大分 子 に応 用 す る場 合
は, ^1H-NMRで
あ れ, 自然 存 在 比^<13>C-NMRで
あれ,
得 られ る情報 が 多 す ぎて, 活 性 中 心 に 関す る情 報 を 抽 出
す るの は一 般 に 困 難 を きわ め る。 そ の た め, それ ぞれ の
11)
12)
13)
14)
酵 素や 蛋 白 質 の 性 質 を利 用 した巧 妙 な 「
工 夫 」 が な され
る。蛋 白 質 の ア ミノ酸 残 基 を標 識 す る の もひ とつ の 「
工
15)
夫 」 で あ るが, 活 性 部 位 の残 基 の み を特 異 的 に標 識 す る
の は, そ れ ほ ど容 易 で は な い 。本 稿 で紹 介 した方 法 は,
手 法 と して は比 較 的 容 易 で あ り, 少 な く とも信 号 の帰 属
16)
17)
に 関 して は曖 昧 さか ら免 れ る。
補 酵 素 にか ぎ らず, 生 理活 性物 質 が本 来 の生 理 的 機 能
18)
を 発 現 す る の は, 蛋 白 質や 他 の生 体 分 子 種 との相 互 作 用
を 介 して であ る こ とを 考 え る と, こ の方 法 が よ り広 く,
19)
も っ と一 般 的 に応 用 す る こ とが可 能 で, 実 際, いろ い ろ
な 安 定 同位 体 標 識 生 理 活 性分 子 に 多核NMRが
応用 さ
れ て い る。
現 在, 筆 者 らは, 機 能 の異 な る い くつ か の フ ラ ビン酵
素 に本 方 法 を 用 い て, そ れ ぞ れ の酵 素 にお い て, フ ラ ビ
ンの潜 在 的 触 媒 能 力が ど の よ うに調 節 され るか を 調 べ,
こ の観 点 か ら フ ラ ビン酵 素 反 応 を統 一 的 に 理 解 す る こ と
834
献
適 用 して, 触 媒 サ イ
White, H. B., III,
Merril, A. H. Jr.: Annu.
Rev. Nutr., 8, 279-299 (1988)
Hamazume, Y., Mega, T., Ikenaka, T.: J.
Biochem., 95, 1633-1644 (1984)
Norioka, N., Okada, T., Hamazume, Y., Mega,
T., Ikenaka, T.: J. Biochem., 97, 19-28 (1985)
Zheng, D. B., Lim, H. M., Pene, J. J., White, H.
B., III : J. Biol. Chem., 263, 11126-11129
(1988)
Merril, A. H., Jr., Freohlich, J. A., McCormick,D. B.: J. Biol. chem., 25
(1979)
Kasai, S., Sugimoto, K., Miura, R., Yamano,
T., Matsui, K.: J. Biochem., 93, 397-402
(1983)
Miura, R., Kasai, S., Horiike, K., Sugimoto,
K., Matsui, K., Yamano, T.: Biochem. Bio
phys.Res. Commun., 110, 406-411 (1983)
Nishikimi, M., Kyotgoku, Y.. J. Biochem., 73,
1233-1242 (1973)
Miura, R., Tojo, H., Fujii, S., Yamano, T.,
Miyake, Y.: J. Biochem., 96, 197-206 (1984)
Yagi, K., Ohishi, N., Takai, A., Kawano, K.,
Kyogoku, Y.: in Flavins and Flavoproteins
(ed. Singer, T. P.), pp. 775-781, Elsevier Sci
entificPublishing
Co., Amsterdam (1976)
Warburg, O., Christian, W.: Biochem. Z., 254,
438-458 (1932)
Warburg, O., Christian, W.: Biochem. Z., 266, 377-411 (1933)
Theorell, H., Akeson,
A.: Arch. Biochem.
Biophys., 65, 439-448 (1956)
Abramovitz, A. S.,Massey, V.: J. Biol. Chem.,
251, 5321-5326 (1976)
Miura, R., Yamaichi, K., Tagawa, K., Miyake,
Y.: J. Biochem., 102, 1311-1320 (1987)
Abramovitz, A. S., Massey, V.: J. Biol. Chem.,
251, 5327-5336 (1976)
Eweg, J. K., Muller, F., van Berkel, W. J. H.:
Eur. J. Biochem., 129, 303-316 (1982)
Kitagawa, T., Nishina, Y., Shiga, K., Watari,
H., Matsumura, Y., Yamano, T.: J. Am.
Chem. Soc., 101, 3376-3378 (1979)
Nishina, Y., Kitagawa, T., Shiga, K., Watari,
H., Yamano, T.: J. Biochem., 87, 831-839
(1980)
Beinert, W.-D.,
Ruterjans, H., Muller, F.,
Bacher, A.: Eur. J. Biochem., 152, 581-587
(1985)
21) Miura, R., Yamano, T., Miyake, Y.: J. Bio
chem.,99, 907-914 (1986)
22) M
assey, V., Ghisla, S.: Ann. N. Y. Acad.
Sci., 227. 446-465 (1974)
20)
フ ラビン酵 素活性域へ の多核NMRめ
23)
Nielsen,
P.,
Anal.
24)
Moonen,
21,
25)
Rauschenbach,
Biochem.,
C.
T.
408-414
Burnett,
L.:
W.,
R.
M.,
J.
Biol.
Mayhew,
S.
mes(ed.
E.,
29)
Krebs,
A.:
H.
A.:
Academic
H.,
Database Center for Life Science Online Service
Chim.
31)
H.,
Biol.,
32)
42,
33)
11,
Hamilton,
(eds.
1,
York
(1935)
54)
Summer,
pp.
499-535,
M.,
Watari,
J.,
S.,
Ito,
Sawada,
K..
S.,
Bull.
Iwatsubo,
A.:
M.,
Bull.
Watari,
Soc.
56)
Chim.
(1960)
A.,
Buckthal,
D.
J.:
57)
Bioorg.
(1982)
A.:
Adv.
Enzymol.,
57,
58)
59)
85-178
(1985)
34)
Ronchi,
B.,
S.,
sey,V.:
35)
Minchiotti,
Swenson,
R.
J.
Tojo,
Miura,
R.,
Fukui,
Y.:
37)
40)
Nakamura,
N.,
R.,
try,15,
1043-1053
Manstein,
Mas
60)
(1982)
Nishina,
T.:
Y.,
J.
Bio
61)
T.,
3612-3618
Miyake,
(1987)
J.
Biochem.,
Fischer,
D.
101,
62)
Pai,
Watari,
chem.,91,
Chem.
Walsh,
C.:
63)
Biochemis
E.
F.:
J.
Biol.
Chem.,
64)
(1986)
Horiike,
H.:
K.,
Biochem.,
Y.,
Biochemistry,
Isomoto,
80,
Shiga,
H.,
4,
A.,
1101-1108
K.,
Yamano,
Tojo,
T.:
J.
65)
Yamano,
(1976)
H.,
Miura,
R.,
Biochem.,
90,
(1981)
R.,
Yamano,
Miura,
Agr.
(1965)
Nishina,
Miura,
J.,
Ganther,
K.,
J.
J.
(1968)
(1976)
J.,
V.,
Shiga,
M.:
281-287
16169-19173
Massey,
Shiga,
T.:
J.
R.,
H.,
K.,
Nishina,
Miyake,
837-843
Miyake,
Biochem.,
87,
Y.,
Y.,
Shiga,
Yamano,
(1982)
46) ŽO‰Y Ÿ®•EŽO‘î‰Â•_•EŽR–ì•r—Y : •¶‰»Šw, 57
103-116
K.,
Shibata,
Y.:
Tanaka,
42,
1515-1520
45)
26,
Japan,
Watari,
44)
F.,
Spencer,
T.:
43)
Watanabe,
Curti,
Jr.,
8824-8834
Yamano,
(1982)
Miyake,
1161-1173
42)
H.,
(1987)
261,
41)
Shiga,
1741-1752
R.,
Soc.
39)
K.,
Biochemistry,
Miura,
581-589
38)
257,
H.,
M.,
C.
Chem.,
Watari,
K.,
Galliano,
Williams,
Horiike,
chem.,92,
36)
L.,
P.,
Biol.
H.,
55)
Soc.
(1958)
T.,
350-370
G.
Bio
(1951)
Iwatsubo,
Isomoto,
G.
Chem.,
1620-1644
part
431-447
569-582
Hamilton,
J.
53)
29,
II,
Mitani,
40,
T.,
Ac
52)
T.:
Shiraishi,
Yamano,
Shiga,
57-118,
Enzymes
T.,
T.,
Biol.,
Kubo,
H.,
The
New
N.,
Enzy
(1975)
J.,
Yamano,
Kawashima,
pp.
49)
50)
51)
(1974)
The
Yamano,
K.),
Soyama,
S.,
M.
(1985)
Press,
H.,
D.
Ludwig,
in
XII,
S.,
in
L.:
York
Biochem.
Myrback,
Kendall,
G.,
4383-4392
M.
P. D.),
Fujii,
H.
D.,
249,
1263-1271
Kubo,
47)
48)
Biochemistry,
S.
Ludwig,
New
Y.,
J. B.,
30)
G.
Chem.,
G.,
chem.,97,
Krebs,
A.:
(1983)
F.:
Mayhew,
Boyer,
Nonaka,
28)
Muller,
Darling,
M.
ademicPress,
27)
Bacher,
359-368
(1982)
LeQuesne,
26)
P.,
130,
(1985)
Y.,
Watari,
1469-1481
K.,
T.:
H.,
(1980)
Tojo,
J.
66)
67)
68)
H.,
Bio
69)
応用
31
Miura, R., Miyake, Y.: Bioorg.
Chem., 16,
97-110 (1988)
Miura, R., Miyake, Y.: J. Biochem.,
102,
1345-1354 (1987)
Moonen, C. T. W., Vervoort, J., Muller, F.:
Biochemistry,
23, 4859-4867 (1984)
Miura, R.: J. Biochem., 105, 318-322 (1989)
Nishimoto, K., Watanabe, Y., Yagi, K.: Bio
chim.Biophys.
Acta, 526, 34-41 (1978)
Nishimoto, K., Kai, E., Yagi, K.: Biochim.
Biophys. Acta, 802, 321-325 (1984)
Nishimoto, K., Fukunaga, H., Yagai, K.: J.
Biochem., 100, 1647-1653 (1986)
Massey, V., Ghisla, S.: in Colloquium-Mos
bach,Biological
Oxidations
(eds. Sund, H.,
Ulrich, V.),
pp. 114-139,
Springer-Verlag,
Berlin/Heidelberg
(1983)
Miyake, Y., Matsushita, S., Miura, R., Yama
no,T.: in Flavins and Flavoproteins
(eds.
Yagi, K., Yamano, T.), pp. 93-99, Japan Sci
entificSocieties
Press, Tokyo (1980)
Matsushita, S., Miura, R., Miyake, T., Yama
no,T.: J. Biochem., 88, 121-129 (1980)
Kubo, H., Watari, H., Shiga, T.: Bull. Soc.
Chim. Biol., 41, 981-988 (1958)
Massey, V., Gibson, Q. H.: Fed. Proc., 23, 18-29 (1964)
Yagi, K., Okamura, K., Naoi, M., Sugiura, N.,
Kotaki, A.: Biochim.
Biophys.
Acta, 146,
77-90 (1967)
Bright, H. J., Porter, D. J. T.: in The Enzymes
(ed. Boyer, P. D.), XII, pp. 421-505, Acad
emicPress,
New York (1975)
Nishina, Y., Shiga, K., Watari, H., Miura, R.,
Miyake, Y., Tojo, H., Yamano, T.: Biochem.
Biophys. Res. Commun., 106, 818-822 (1982)
Miura, R., Nishina, Y., Ohta, M., Tojo, H.,
Shiga, K., Watari, H., Yamano, T., Miyake,
Y.: Biochem. Biophys. Res. Commun., 111,
588-594 (1983)
Nishina, Y., Shiga, K., Miura, R., Tojo, H.,
Ohta, M., Miyake, Y., Yamano, T., Watari, H.:
J. Biochem., 94, 1979-1990 (1983)
Nishina, Y., Miura, R., Tojo, H., Miyake, Y.,
Watari, H., Shiga, K.: J. Biochem., 99, 329337 (1986)
Vervoort, J., Muller, F., O'Kane, D. J., Lee, J.,
Bacher, A.: Biochemistry,
25,
8067-8075
(1986)
Koster, J. F., Veeger, C.: Biochim. Biophys. Actor, 151, 11-1
Porter, D. J. T., Voet, J. G., Bright, H. J.: J.
Biol. Chem., 252, 4464,-4473 (1977)
Yagi, K., Ohishi, N., Takai, A., Kawano, K,
Kyogoku, Y.: Biochemistry,
15, 2877-2880
(1976)
Kawano, K., Ohishi, N., Suzuki, A. T., Kyo
goku,Y., Yagi, K.: Biochemistry,
17, 38543859 (1978)
385