Saccharomyces cerevisiae 由来カルボキシ

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Title
Saccharomyces cerevisiae 由来カルボキシペプチダーゼYのV字ヘリ
ックスに関する研究
Author(s)
牧野, 舞
Citation
奈良女子大学博士論文、博士（生活環境学）、博課 甲第557号、
平成26年3月24日学位授与
Issue Date
2014-03-24
Description
URL
http://hdl.handle.net/10935/3603
Textversion
ETD
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http://nwudir.lib.nara-w.ac.jp/dspace
博士論文
Saccharomyces cerevisiae 由来
カルボキシペプチダーゼ Y の V 字ヘリックス
に関する研究
2014
奈良女子大学大学院 人間文化研究科 博士後期課程
共生自然科学専攻 食物栄養科学講座
牧野
舞
目次
第1章
序論 ...................................................................................................... 5
1.1. CPY の成熟化 ........................................................................................... 5
1.2. CPY の立体構造 ........................................................................................ 6
1.3. CPY の触媒作用及び基質認識 ................................................................... 7
1.4. V 字ヘリックス ......................................................................................... 8
1.5. 本研究の目的 ........................................................................................... 8
第2章
カルボキシペプチダーゼ Y(CPY)の発現系の構築 ................................ 13
2.1. 緒論 ....................................................................................................... 13
2.2. 実験材料及び実験方法............................................................................ 14
2.2.1. 実験材料 .......................................................................................... 14
2.2.2. 実験方法 .......................................................................................... 15
2.2.2.1. 全長型 CPY の遺伝子の増幅.............................................................. 15
2.2.2.2. 大腸菌発現用ベクターの作製 ............................................................ 15
2.2.2.3. 大腸菌を用いた組換え体 CPY の発現・精製 .................................... 16
2.2.2.4. 酵母発現用ベクターの作製 ................................................................ 17
2.2.2.5. 酵母を用いた組換え体 CPY の発現・精製 ........................................ 18
2.2.2.6. 様々なシグナルペプチドにスワッピングした CPY の酵母発現ベクタ
ーの作製 .......................................................................................................... 19
1
2.2.2.7. 様々なシグナルペプチドにスワッピングさせた CPY の酵母を用いた
発現 ................................................................................................................. 20
2.2.2.8. タンパク質定量 ................................................................................. 21
2.2.2.9. SDS-PAGE 及び Western blotting .................................................... 21
2.2.2.10. アニリダーゼ活性測定 ..................................................................... 22
2.3. 結果 ....................................................................................................... 23
2.3.1. 大腸菌を宿主とした組換え体 CPY の発現・精製 ............................. 23
2.3.2. 酵母を宿主とした組換え体 CPY の発現・精製 ................................. 23
2.3.3. 様々なシグナルペプチドにスワッピングさせた CPY の酵母を用いた発
現 ............................................................................................................... 24
2.4. 考察 ....................................................................................................... 26
第3章
ジスルフィド結合の破壊が CPY の構造安定性及び酵素活性に及ぼす影響
......................................................................................................................... 40
3.1. 緒論 ....................................................................................................... 40
3.2. 実験材料及び実験方法............................................................................ 41
3.2.1. 実験材料 .......................................................................................... 41
3.2.2. 実験方法 .......................................................................................... 42
3.2.2.1. 変異体 CPY (C193A，C207A，C262A，C268A)の作製 .................. 42
3.2.2.2. タンパク質定量 ................................................................................. 43
3.2.2.3. SDS-PAGE 及び Western blotting .................................................... 43
2
3.2.2.4. 酵素活性測定 ..................................................................................... 43
3.2.2.5. 分子モデリングソフトウェアを用いた構造安定性の評価 ................. 44
3.3. 結果 ....................................................................................................... 46
3.3.1. 蝶番様ジスルフィド結合を形成する Cys の Ala 置換体の発現・精製 46
3.3.2. C262A 及び C268A の酵素活性 ........................................................ 46
3.3.3. 各変異体の構造安定性 ..................................................................... 47
3.4. 考察 ....................................................................................................... 48
第4章
V 字ヘリックスの先端付近のアミノ酸置換が立体構造及び基質特異性に
及ぼす影響 ........................................................................................................ 54
4.1. 緒論 ....................................................................................................... 54
4.2. 実験材料及び実験方法............................................................................ 56
4.2.1. 実験材料 .......................................................................................... 56
4.2.2. 実験方法 .......................................................................................... 57
4.2.2.1. 分子モデリングソフトウェアを用いた変異導入箇所の検討 ............. 57
4.2.2.2. Cys 置換体の作製 ............................................................................... 57
4.2.2.3. Tyr225 及び Pro315 の置換体の作製 ................................................. 58
4.2.2.4. タンパク質定量 ................................................................................. 59
4.2.2.5. SDS-PAGE 及び Western blotting .................................................... 59
4.2.2.6. 酵素活性の測定 ................................................................................. 59
4.2.2.7. P315G に対する酵素反応速度論的解析 ............................................. 60
3
4.3. 結果 ....................................................................................................... 61
4.3.1. 分子モデリングソフトウェアを用いた変異導入箇所の検討 .............. 61
4.3.2. Cys 置換体の発現・精製及び酵素活性 .............................................. 61
4.3.3. Q228C 及び K314C の酵素活性 ........................................................ 62
4.3.4. Tyr225 及び Pro315 のアミノ酸置換の影響 ...................................... 62
4.3.5. P315S 及び P315G の酵素活性 ......................................................... 63
4.3.6. P315G の酵素反応速度論的解析 ....................................................... 63
4.4. 考察 ....................................................................................................... 65
第5章
総括 .................................................................................................... 75
参考文献 ........................................................................................................... 76
研究業績 ........................................................................................................... 85
謝辞 .................................................................................................................. 89
4
第 1 章
序論
カ ル ボ キ シ ペ プ チ ダ ー ゼ Y ( C P Y ) は ， 酵 母 S a c ch a ro m y ce s ce r e vi e ia e の
液 胞 に 局 在 す る セ リ ン プ ロ テ ア ー ゼ で あ り ，ペ プ チ ド や タ ン パ ク 質 の C 末
端 か ら す べ て の L-ア ミ ノ 酸 を 遊 離 さ せ る エ キ ソ ペ プ チ ダ ー ゼ で あ る (1)．
1960 年 代 に Hayashi ら に よ っ て 発 見 さ れ て 以 来 ， モ デ ル タ ン パ ク 質 と し
て多岐にわたり研究対象となっている．
1 .1 . C P Y の 成 熟 化
C P Y は 不 活 性 型 の p r e -p r o - 前 駆 体 と し て 合 成 さ れ ，小 胞 体 か ら ゴ ル ジ 体
を 経 由 し 液 胞 へ 輸 送 さ れ て 活 性 化 さ れ る ( F i g . 1 - 1 ) ． P rc 1 配 列 に よ り コ ー
ド さ れ る 全 長 型 CPY の 一 次 構 造 は ， N 末 端 か ら 順 に ， ア ミ ノ 酸 20 残 基 か
ら 成 る シ グ ナ ル ペ プ チ ド 領 域 ，9 1 残 基 か ら 成 る プ ロ ペ プ チ ド 領 域 ，そ し て
421 残 基 か ら 成 る 成 熟 領 域 で 構 成 さ れ て い る ． リ ボ ソ ー ム で 合 成 さ れ た 全
長 型 C P Y は ，ま ず 小 胞 体 へ 輸 送 さ れ ，シ グ ナ ル ペ プ チ ダ ー ゼ に よ る シ グ ナ
ルペプチドのプロセシング，フォールディング，そしてコアグリコシル化
が 起 こ り ， 6 7 k D a の p 1 -C P Y と 呼 ば れ る 前 駆 体 と な る ( 2 - 4 ) ． 細 胞 質 中 が
還元的であるのに対し，小胞体内腔は酸化的な環境であるため，ジスルフ
ィド結合はここで形成され，正しいフォールディングが行われると思われ
る ． I n v i t ro 及 び i n vi v o の 研 究 か ら ， プ ロ ペ プ チ ド を 欠 い た 変 異 体 C P Y
は小胞体に蓄積されるものの正確にフォールディングされ，プロペプチド
領 域 の C 末 端 部 位 が in v i vo で の フ ォ ー ル デ ィ ン グ に 必 須 で あ る こ と が 判
明 し た ( 5 ) ．ま た ，変 性 状 態 か ら の リ フ ォ ー ル デ ィ ン グ を 検 討 し た 研 究 で は ，
5
前 駆 体 CPY か ら は 50%が 5 分 以 内 に リ フ ォ ー ル デ ィ ン グ さ れ た の に 対 し ，
成熟領域のみからでは再生されないことが示され，プロペプチド領域が分
子 内 シ ャ ペ ロ ン と し て 機 能 す る こ と が 示 唆 さ れ た ( 6 ) ．次 に ゴ ル ジ 体 内 に お
い て ，さ ら に グ リ コ シ ル 化 さ れ ，6 9 k D a の p 2 -C P Y と な り ，最 終 的 に 液 胞
へ 輸 送 さ れ る (7)． こ の 液 胞 へ の 輸 送 に お い て ， プ ロ ペ プ チ ド 領 域 の N 末
端 付 近 に 位 置 す る ア ミ ノ 酸 配 列 ( G l n 2 4 -A r g - P r o -L e u 2 7 ) が s o r ti n g s i gn a l
と し て 機 能 す る ( 8 , 9 ) ． 液 胞 内 の p H は ， v ma 遺 伝 子 に コ ー ド さ れ る
H + - AT P a s e に よ っ て 6 . 2 に 維 持 さ れ て い る が ( 1 0 ) ， こ の 酸 性 環 境 に よ り
p r o te i n a s e A (P r A ) や p r o t e i n a s e B (P rB ) な ど の 液 胞 プ ロ テ ア ー ゼ は 活 性 を
示 す よ う に な る ． 活 性 化 し た こ れ ら の 液 胞 プ ロ テ ア ー ゼ に よ り p2-CPY の
プ ロ ペ プ チ ド 領 域 が 切 断 除 去 さ れ ， CPY は 61 kDa の 活 性 型 で あ る 成 熟 体
と な る ( 11 ) ．
1 .2 . C P Y の 立 体 構 造
成 熟 体 CPY の 立 体 構 造 は 1994 年 に X 線 結 晶 構 造 解 析 に よ り 決 定 さ れ た
(F i g . 1 -2 ) ( 1 2 ) ． 二 次 構 造 は α ヘ リ ッ ク ス を 3 4 % ， β シ ー ト を 1 5 % 含 み ， フ
ォ ー ル デ ィ ン グ パ タ ー ン は α / β h yd r o l a s e グ ル ー プ に 分 類 さ れ る ．こ の f o l d
f a m i l y に は ， 小 麦 由 来 セ リ ン カ ル ボ キ シ ペ プ チ ダ ー ゼ I I (C P W I I ) や
G eo t r ic hu m c and id um 由 来 リ パ ー ゼ な ど 幅 広 い 加 水 分 解 酵 素 が 含 ま れ る
(13-15)．
CPY は 糖 タ ン パ ク 質 で あ り ， 4 箇 所 (Asn13， Asn87， Asn168， Asn368)
で N-結 合 型 糖 鎖 修 飾 を 受 け る ． CPY の 細 胞 内 輸 送 に 糖 鎖 が 関 与 す る こ と
が 示 唆 さ れ て い る ほ か ，ス ト レ ス 環 境 下 で の 立 体 構 造 維 持 の 役 割 を 担 う が ，
6
糖 鎖 の 有 無 は 酵 素 活 性 に 影 響 し な い も の と 思 わ れ る (9,16,17)．
1 .3 . C P Y の 触 媒 作 用 及 び 基 質 認 識
C P Y は ペ プ チ ド や タ ン パ ク 質 以 外 に も ，エ ス テ ル や ア ミ ド ，ア ニ リ ド に
対 し て も 触 媒 活 性 を 示 す (1,18-20)． DFP， PMSF， ZPCK な ど の 典 型 的 な
セ リ ン プ ロ テ ア ー ゼ 阻 害 剤 に よ り 活 性 が 阻 害 さ れ ，一 方 で E D TA の 影 響 は
受 け な い ( 2 1 ) ．活 性 中 心 ポ ケ ッ ト の 内 部 に ca t a l y t i c tr i a d ( Se r 1 4 6 ，H i s 3 9 7 ，
A s p 3 3 8 ) を も ち ( 1 2 , 2 2 -2 4 ) ， S e r1 4 6 に よ る 基 質 へ の 求 核 攻 撃 に 始 ま る ア シ
ル化及び中間体の加水分解による脱アシル化の二段階の反応により基質の
ペプチド結合を切断する．
ま た ，活 性 中 心 ポ ケ ッ ト の 近 傍 に お い て ，基 質 の C 末 端 カ ル ボ キ シ ル 基
を 認 識 す る h yd r o ge n b o n d n e t w o rk 及 び 基 質 結 合 部 位 S 1 ’ ， S 1 サ ブ サ イ ト
が 同 定 さ れ て い る ( 1 2 ) ． H yd r o g e n b o n d n e t w o rk は S 1 ’ サ ブ サ イ ト の 底 部
に 位 置 し て お り ， 基 質 の カ ル ボ キ シ ル 基 が G l y5 2 の 主 鎖 の ア ミ ド 基 及 び
Asn51 と Glu145 の 側 鎖 と 水 素 結 合 を 形 成 す る こ と に よ り 基 質 の C 末 端 を
認 識 す る (25)． S1’及 び S1 サ ブ サ イ ト は そ れ ぞ れ 基 質 の ア ミ ノ 酸 の P1’及
び P 1 部 位 の 側 鎖 を 認 識 す る ． S 1 ’ サ ブ サ イ ト は 主 に 疎 水 性 残 基 (T h r6 0 ，
P h e 6 4 ， Ty r 2 5 6 ， Ty r 2 6 9 ， L e u 2 7 2 ， Me t 3 9 8 ) で 構 成 さ れ て お り ， こ の サ ブ
サイトは親水性・疎水性アミノ酸に加え，アルコール，アミド，アニリド
な ど を 認 識 し 広 い 基 質 選 択 性 を 示 す (26)． 一 方 ， S1 サ ブ サ イ ト は 主 に 親 水
性 残 基 ( Ty r 1 4 7 ， L e u 1 7 8 ， Tyr 1 8 5 ， Ty r 1 8 8 ， Trp 3 1 2 ， I l e 3 4 0 ， C y s 3 4 1 )
か ら 成 り ， 基 質 の P1 部 位 の 選 択 性 を 決 定 づ け て い る (27-30)． 構 成 成 分 で
あ る C ys 3 4 1 は 分 子 内 で 唯 一 ジ ス ル フ ィ ド 結 合 を 形 成 し な い C ys 残 基 で あ
7
るが，酵素活性には必須ではないが触媒効率に大きな影響を及ぼすことが
化 学 修 飾 な ど の 研 究 か ら 明 ら か と な っ て い る (27,31-33)． 基 質 結 合 部 位 に
つ い て は ， 酵 素 反 応 速 度 論 的 解 析 な ど か ら さ ら に S2~S5 サ ブ サ イ ト が 推 定
さ れ て い る (34-36)．
1 .4 . V 字 ヘ リ ッ ク ス
C P Y 分 子 に は ， S e r 2 0 4 ~T h r 2 5 1 に 及 ぶ 2 本 の α ヘ リ ッ ク ス か ら な る 特
徴 的 な 構 造 が あ る ( 1 2 ) ．本 研 究 で は こ の 構 造 を V 字 ヘ リ ッ ク ス と 命 名 し た ．
V 字 ヘ リ ッ ク ス は C P Y と 同 じ f o l d f a mi l y に 属 す る C P WI I や ヒ ト 保 護 タ
ン パ ク 質 ／ カ テ プ シ ン A ( P P C A ) に お い て も 同 様 の 構 造 が み ら れ る が ，C P Y
の V 字 ヘ リ ッ ク ス は よ り 巨 大 な ヘ リ ッ ク ス 構 造 か ら 成 る ( F i g . 1 -3 ) ( 1 3 , 3 7 ) ．
V 字 ヘ リ ッ ク ス は 活 性 中 心 ポ ケ ッ ト の 上 部 に 位 置 し て お り ，C P Y の 分 子 内
で形成されている 5 つのジスルフィド結合のうち 4 つが V 字ヘリックスに
関 係 し て い る ．こ の こ と か ら ，V 字 ヘ リ ッ ク ス が C P Y に お い て 意 味 の あ る
部位であることが予想される．
1 .5 . 本 研 究 の 目 的
本 研 究 で は ，CPY の 触 媒 活 性 や 立 体 構 造 維 持 ，基 質 認 識 な ど に お い て V
字ヘリックスがどのような関わりをしているのかを解明することを目的と
し た ． 第 2 章 で は ， さ ま ざ ま な 宿 主 を 用 い た 組 換 え 体 CPY の 発 現 系 の 検
討 及 び シ グ ナ ル ペ プ チ ド の ス ワ ッ ピ ン グ に よ る CPY の 発 現 様 式 の 検 討 に
つ い て ，第 3 章 で は V 字 ヘ リ ッ ク ス の 上 流 及 び 下 流 で 形 成 さ れ て い る 蝶 番
様 ジ ス ル フ ィ ド 結 合 の 破 壊 に よ る CPY の 構 造 安 定 性 及 び 酵 素 活 性 へ の 影
8
響 に つ い て ，そ し て 第 4 章 で は V 字 ヘ リ ッ ク ス の 挙 動 を 調 べ る た め の V 字
構造の先端付近のアミノ酸置換が立体構造及び基質特異性にどのような影
響を及ぼすのかについて述べる．
9
F i g . 1 - 1 S c h e m a t i c d i a g r a m o f m a tu r a ti o n s te p s o f C P Y i n y e a s t
10
F i g . 1 - 2 T h r e e d i m e n s i o n a l s t r u c t u re o f m a tu r e C P Y d e t e r m i n e d b y
X -r a y c r ys t a l l o g r a p h y ( P DB I D : 1 Y SC ) ( 1 2 )
V- s h a p e h e l i x ( S e r 2 0 4 ~T h r 2 5 1 ) i s c o l o r e d i n gr e e n .
T h e ca t a l y t i c tr i a d
( S e r1 4 6 , H i s 3 9 7 , a n d A s p 3 3 8 ) a r e s h o w n i n re d s t i c k .
a r e s h o wn i n o r a n g e t h i c k s t i ck .
11
D i s u l fi d e b ond s
(A)
(B)
CPY
(C)
PPCA
CPWII
F i g . 1 - 3 C o m p a r i s o n o f t h r e e s e ri n e ca r b o x yp e p ti d a s e s w h i c h b e l o n g t o t h e α / β h y d r o l a s e f o l d f a m i l y
E a ch s t r u c tu r e w a s t a k e n f r o m P ro t e i n D a ta B a n k ( P DB ) .
co l o r e d b a s e d o n s e c o n d a r y s tr u c t u re .
P ro t e i n s a r e d i s p l a y e d i n s c h e m a ti c f l a t r i b b o n
V- s h a p e h e l i x r e gi o n i s c i r cl e d i n g r e e n .
larger two helices than the other proteins.
C P Y ’s V- s h a p e h e l i x c o n s i s ts o f
V- s h a p e h e l i c e s o f P P C A a n d C P W I I a r e p o s i t i o n e d u p w a r d , wh i l e
th a t o f C P Y h a n g d o wn .
(A ) C P Y (1 Y SC ; ( 1 2 ) ) , ( B ) P P C A ( 1 I V Y ; ( 3 7 ) ) , ( C ) C P WI I ( 3 S C 2 ; ( 1 3 ) )
12
第 2 章
カ ル ボ キ シ ペ プ チ ダ ー ゼ Y ( CP Y) の 発 現 系 の 構 築
2 .1 . 緒 論
様 々 な 変 異 体 C P Y を 作 製 す る た め に ，ま ず ，組 換 え 体 の 発 現 系 の 構 築 を
試 み た ．CPY が 微 生 物 由 来 の タ ン パ ク 質 で あ る こ と ，ま た ，宿 主 の 培 養 の
簡 便 さ か ら ， 大 腸 菌 E sc he r ic hi a c ol i 及 び 酵 母 S a c c ha r om y c es c e re v is ia e
を宿主に用いることとした．大腸菌の発現系については，宿主由来のタン
パク質の発現を抑え目的タンパク質を高発現させるため，及び精製を簡便
に 行 う た め に ，コ ー ル ド シ ョ ッ ク 発 現 ベ ク タ ー p C o l d I を プ ラ ス ミ ド ベ ク タ
ー に 用 い た ． 酵 母 の 発 現 系 に つ い て は ， C P Y ， P r A ， P rB を コ ー ド す る 遺
伝 子 が 欠 損 し た B J 2 1 6 8 株 及 び C P Y 遺 伝 子 の み が 欠 損 し た B Y 4 7 4 1 p r c1 Δ
株 を 宿 主 と し ， 新 規 酵 母 低 温 誘 導 発 現 ベ ク タ ー p LTe x3 2 1 s V 5 H を プ ラ ス ミ
ド ベ ク タ ー に 用 い た ． Sahara ら に よ る マ イ ク ロ ア レ イ を 用 い た 酵 母 の 低
温ストレス応答の解析から，低温で強く転写が上方制御される遺伝子が新
た に 多 数 同 定 さ れ た ( 3 8 ) ．本 ベ ク タ ー は そ の う ち の 一 つ で あ る H SP 1 2 遺 伝
子のプロモーターが組み込まれており，目的タンパク質を低温で誘導発現
さ せ る ． さ ら に ， p LTe x 3 2 1 s V 5 H ベ ク タ ー に 酵 母 由 来 の 様 々 な 分 泌 性 タ ン
パ ク 質 ( Ta b l e 2 - 1 ) が も つ シ グ ナ ル ペ プ チ ド 配 列 が 挿 入 さ れ た 発 現 ベ ク タ ー
p LTe x3 2 1 s α 2 V 5 H ， p LTe x3 2 1 s C P R 5 V 5 H ， p LTe x 3 2 1 s C WP 2 V 5 H ，
p LTe x3 2 1 s E U G 1 V 5 H ，p LTe x3 2 1 s P H O 8 9 V 5 H に 全 長 型 C P Y の シ グ ナ ル ペ
プ チ ド を 除 い た 配 列 を 挿 入 し ，シ グ ナ ル ペ プ チ ド の 違 い に よ る C P Y の 可 溶
画分内の発現を検討した．
13
2 .2 . 実 験 材 料 及 び 実 験 方 法
2 .2 . 1 . 実 験 材 料
E . c ol i J M 1 0 9 株 及 び B L 2 1 ( D E 3 ) 株 そ れ ぞ れ タ カ ラ バ イ オ 社 及 び
N o va g e n 社 か ら 購 入 し ， S . c e r e vi si a e B Y 4 7 4 3 株 及 び B Y 4 7 4 1 p rc 1 Δ 株 は
T h e r m o F i s h e r S c i e n t i fi c 社 か ら 購 入 し ， B J 2 1 6 8 株 は 文 部 科 学 省 N B R P
「 酵 母 」か ら 購 入 し た ．そ れ ぞ れ の 菌 体 の 遺 伝 子 型 は Ta b l e 2 -2 に 示 し た ．
ク ロ ー ニ ン グ ベ ク タ ー p GE M - T E a s y Ve c t o r は P ro m e ga 社 か ら 購 入 し ，大
腸 菌 発 現 用 ベ ク タ ー p C o l d I は タ カ ラ バ イ オ 社 か ら 購 入 し た ． Qu i kC h a n g e
S i te - D i r e c t e d M u t a g e n e s i s K i t は A g i l e n t Te c h n o l o gi e s 社 か ら 購 入 し た ．
B l e n d Ta q 及 び Ta q DN A P o l ym e ra s e は そ れ ぞ れ 東 洋 紡 社 及 び N e w
England Biolabs 社 か ら 購 入 し た ． T4 DNA ligase は タ カ ラ バ イ オ 社 製 を
使 用 し ，各 種 制 限 酵 素 は Roche 社 ，タ カ ラ バ イ オ 社 ，東 洋 紡 社 製 の も の を
使 用 し た ． ア フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に 使 用 し た TA L O N M e ta l
Affinity Resin は タ カ ラ バ イ オ 社 か ら ， 疎 水 性 相 互 作 用 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ
ー に 使 用 し た T O Y O P E A R L B u t yl - 6 5 0 M は 東 ソ ー 社 か ら 購 入 し た ． Q u i c k
S t a r t B r a d f o r d P r o t e i n A s s a y K i t は B i o -R a d 社 か ら 購 入 し た ． 合 成 基 質
で あ る N - b e n zo y l -L - t y r o s i n e p - n i t r o a n i l i d e (B T p N A ) は Si g m a -A l d ri ch 社
製を使用した．本実験で使用したオリゴヌクレオチドプライマーは日本バ
イオサービス社及びオペロンバイオテクノロジー社に合成を依頼した．各
プ ラ イ マ ー の 配 列 は Ta b l e 2 - 3 に 示 し た ． そ の 他 の 試 薬 に お い て は ， 特 に
記載のない限り和光純薬社及びナカライテスク社の特級試薬を用いた．
14
2 .2 . 2 . 実 験 方 法
2 .2 . 2 . 1 . 全 長 型 C P Y の 遺 伝 子 の 増 幅
CPY の 遺 伝 子 及 び ア ミ ノ 酸 配 列 情 報 は
S a c ch a r om y ce s G e n o me
D a ta b a s e ( h t tp : / / w w w. y e a s t g e n o m e . o r g / ) か ら 得 た ． 酢 酸 カ リ ウ ム 法 に よ
り S . c e r e vi si ae の 実 験 野 生 株 か ら ゲ ノ ム DN A を 調 製 し た ( 3 9 ) ． こ の ゲ ノ
ム D N A を テ ン プ レ ー ト と し ，P C R 法 に よ り 全 長 型 C P Y を コ ー ド す る p r c1
遺 伝 子 領 域 を 増 幅 さ せ た ．こ の P C R で は ，DN A ポ リ メ ラ ー ゼ は B l e n d Ta q
を 用 い ， オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド プ ラ イ マ ー は p r c 1 -L e f t - 2 及 び p r c1 - R i gh t - 3
を 用 い た (Ta b l e 2 - 3 ) ． 増 幅 さ れ た D N A 断 片 を ク ロ ー ニ ン グ ベ ク タ ー
p GE M -T E a s y Ve c to r へ 導 入 し ，プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー p GC WT を 作 製 し た ．
Qu i kC h a n g e S i t e - Di r e c t e d M u ta g e n e s i s K i t を 用 い た 部 位 特 異 的 変 異 導
入 法 に よ り ，p rc 1 配 列 の 3 ’ 末 端 の 終 止 コ ド ン の 直 前 に H i s -Ta g を コ ー ド す
る 塩 基 配 列 を 挿 入 し ， プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー p GC HWT を 作 製 し た ． D N A シ
ー ク エ ン ス 解 析 を フ ァ ス マ ッ ク 社 に 依 頼 し ， p GC HWT の イ ン サ ー ト 部 位
の DN A 配 列 を 確 認 し た ．
2 .2 . 2 . 2 . 大 腸 菌 発 現 用 ベ ク タ ー の 作 製
Pr c1 + H i s t a g 配 列 を 大 腸 菌 コ ー ル ド シ ョ ッ ク 発 現 用 ベ ク タ ー p C o l d I へ
導 入 す る た め に ，2 . 2 . 2 .1 . で 作 製 し た p G C H WT を テ ン プ レ ー ト と し て P C R
法 を 用 い て p rc 1 配 列 の 上 流 に S a c I 配 列 ， 終 止 コ ド ン の 下 流 に Hi n d I I I 配
列 を 挿 入 し た ． オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド プ ラ イ マ ー は S a c I -p r c1 - F 及 び
p r c1 - H i n d I I I - R を 用 い た ( Ta b l e 2 - 3 ) ． P C R 産 物 は ク ロ ー ニ ン グ ベ ク タ ー
15
p GE M -T E a s y Ve c t o r に 導 入 し ， p GC HW T 2 を 作 製 し た ． p GC H WT 2 を 制
限 酵 素 S a c I 及 び H i nd I I I で 切 断 し た の ち ， ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 に て
p r c1 + H i s t a g 配 列 を 含 む イ ン サ ー ト 部 分 を 分 離 し ， ゲ ル を 切 り 出 し
U l t ra f r e e - D A (M i l l i p o r e 社 製 ) で D N A 断 片 を 精 製 し た ．同 様 に 制 限 酵 素 で
処 理 し 精 製 し た p C o l d I と イ ン サ ー ト 断 片 を T 4 DN A L i g a s e で ラ イ ゲ ー シ
ョ ン し ， 大 腸 菌 発 現 用 プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー p C o l d C H WT を 作 製 し た ( F i g .
2 -1 ) ．
2 .2 . 2 . 3 . 大 腸 菌 を 用 い た 組 換 え 体 C P Y の 発 現 ・ 精 製
2 . 2 . 2 . 2 . で 作 製 し た p C o l d C H WT を 用 い て ， 塩 化 カ ル シ ウ ム 法 に よ っ て
コ ン ピ テ ン ト セ ル 化 さ れ た E . c o li B L 2 1 ( DE 3 ) 株 を 形 質 転 換 し た ． 1 0 0
μg/ml ア ン ピ シ リ ン を 含 む LB プ レ ー ト 培 地 (1% polypeptone， 0.5% yeast
e x tr a c t ， 1 % N a C l ， 2 % a g a r ) 上 に 形 成 さ れ た コ ロ ニ ー を ラ ン ダ ム に 選 び ，
コ ロ ニ ー ダ イ レ ク ト PCR に て プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー を 所 有 す る 形 質 転 換 体
(B L C H W T と 命 名 ) を ス ク リ ー ニ ン グ し た ．得 ら れ た B L C H W T を 2 0 0 μ g / ml
ア ン ピ シ リ ン を 含 む
LB 液 体 培 地 内 で
3 7 °C で 振 と う 培 養 し ，
OD600=0.4~0.6 と な っ た と こ ろ で 0.5 mM IPTG を 添 加 し ， 15 °C で 14 時
間培養し，目的タンパク質を誘導発現させた．菌体を回収し，等量の破砕
用 buffer (50 mM sodium phosphate buffer ， 300 mM NaCl， pH 7.0)に 懸
濁 さ せ た の ち Bioruptor (コ ス モ ・ バ イ オ 製 )を 用 い て 超 音 波 破 砕 (破 砕 30
秒 ， 休 止 60 秒 を 1 サ イ ク ル と し て 10 サ イ ク ル )を 行 っ た ． 遠 心 分 離 に よ
り 可 溶 画 分 及 び 不 溶 画 分 を そ れ ぞ れ 回 収 し ，不 溶 画 分 を 0 . 5 % Tri t o n X -1 0 0
を 含 む 破 砕 用 b u f f e r 及 び ミ リ Q 水 で 洗 浄 し た ．破 砕 用 b u f f e r に 8 M u r e a
16
及 び 1 0 m M β - m e r c a p to e t h a n o l を 添 加 し た 可 溶 化 b u f f e r を 不 溶 画 分 の 9
倍量加え，室温で 1 時間インキュベートし不溶画分を溶解させた．遠心分
離 後 回 収 し た 可 溶 化 溶 液 を ， TA L ON Me t a l A f f i n i t y R e s i n を 用 い た
Hi s - ta g ア フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に 供 し た ． 1 m l の レ ジ ン に 対
し て 1 0 倍 量 の 平 衡 化 ／ 洗 浄 b u f fe r ( 5 0 mM s o d i u m p h o s p h a t e b u f fe r, 3 0 0
mM N a C l , 8 M u r e a , 1 0 mM β - m e r ca p to e th a n o l , p H 7 . 0 ) で レ ジ ン を 平 衡
化 し た の ち ，同 b u f f e r で 5 倍 に 希 釈 し た 可 溶 化 溶 液 を 通 し た ．洗 浄 し ，平
衡 化 ／ 洗 浄 b u f f e r に 3 0 m M i m i d a zo l e を 添 加 し た 溶 出 b u f f e r を レ ジ ン の
5 倍量流して溶出液を回収した．
2 .2 . 2 . 4 . 酵 母 発 現 用 ベ ク タ ー の 作 製
2 . 2 . 2 . 2 . で 作 製 し た p C o l d C HWT を テ ン プ レ ー ト と し て ， P C R 法 を 用 い
て p r c1 配 列 の 開 始 コ ド ン の 直 前 に S m a I サ イ ト ，終 止 コ ド ン の 直 前 に X ho I
サ イ ト が 挿 入 さ れ た DN A 断 片 を 増 幅 さ せ た ． オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド プ ラ イ
マ ー は S m a I -p r c 1 - F 及 び p r c 1 - X h o I -R を 用 い ，各 配 列 は Ta b l e 2 - 2 に 示 し
た ． P C R 産 物 は ク ロ ー ニ ン グ ベ ク タ ー p G E M -T E a s y Ve c t o r に 導 入 し ，
p GC H WT 3 を 作 製 し た ． p GC H WT 3 を 制 限 酵 素 S m a I 及 び X ho I で 切 断 し
た の ち ， ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 に て p r c1 配 列 を 含 む イ ン サ ー ト 部 分 を
分 離 し ，ゲ ル を 切 り 出 し U l t r a f re e - DA で DN A 断 片 を 精 製 し た ．同 様 に 制
限 酵 素 で 処 理 し 精 製 し た 酵 母 低 温 誘 導 発 現 ベ ク タ ー p LTe x 3 2 1 s V 5 H と イ ン
サ ー ト 断 片 を T 4 DN A L i ga s e で ラ イ ゲ ー シ ョ ン し ，酵 母 発 現 用 プ ラ ス ミ ド
ベ ク タ ー p LT C V 5 H G WT を 作 製 し た ( F i g . 2 - 2 ) ．
17
2 .2 . 2 . 5 . 酵 母 を 用 い た 組 換 え 体 C P Y の 発 現 ・ 精 製
2 . 2 . 2 . 4 . で 作 製 し た p LT C V 5 H G WT を 用 い て ， 酵 母 B J 2 1 6 8 株 及 び
B Y 4 7 4 1 p r c1 Δ 株 を 酢 酸 リ チ ウ ム 法 で 形 質 転 換 し た ( 4 0 ) ．S D ( - u ra ) プ レ ー ト
培 地 ( 0 . 6 7 % Ye a s t N i t r o g e n B a s e w i t h o u t A m i n o A c i d s ， 2 % g l u c o s e ， 2 %
a ga r ， 3 0 μ g / m l L - l e u c i n e ， 2 0 μ g / m l h i s ti d i n e m o n o h y d r o c h l o ri d e
mo n o h yd r a t e ， 3 0 μ g / m l a d e n i n e h e m i s u l f a te d e h yd r a te ， 2 0 μ g / m l
L - m e th i o n i n e ) 上 で ス ク リ ー ニ ン グ し ，形 質 転 換 体 B J 2 1 6 8 C V 5 H GWT 及 び
B Y 4 7 4 1 p r c1 ΔC V 5 H G WT を 得 た ． そ れ ぞ れ の 形 質 転 換 体 を Y P D 液 体 培 地
( 2 % p o l yp e p to n e ， 1 % ye a s t e x t ra c t ， 2 % gl u co s e ) 内 で O D 6 0 0 >1 に な る ま
で 28 °C で 振 と う 培 養 し ， そ の 後 0.5 M NaCl を 添 加 し 20 °C で 3 日 間 培
養し，目的タンパク質を誘導発現させた．
誘 導 培 養 後 の B J 2 1 6 8 C V 5 H G WT は ， 等 量 の 5 0 mM s o d i u m p h o s p h a t e
b u f f e r, 3 0 0 m M N a C l (p H7 . 0 ) に 懸 濁 さ せ ， ビ ー ド ビ ー タ ー ( 和 研 薬 社 製 )
を 用 い て 0.5 mm ビ ー ズ で 菌 体 を 破 砕 し た (破 砕 30 秒 ， 休 止 1 分 を 4 セ ッ
ト 行 っ た )． 遠 心 分 離 後 の 上 清 に 対 し て 硫 安 分 画 を 行 い ， 40-70%の 画 分 の
沈 殿 を 回 収 し た ． 3 ml / g p p t の 5 0 mM s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r, 3 0 0 mM
N a C l （ p H 7 . 0 ） に 沈 殿 を 再 懸 濁 さ せ ， H i s - ta g ア フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ ト グ
ラ フ ィ ー を 行 っ た ． 1 ml の レ ジ ン に 対 し て 10 倍 量 の 平 衡 化 ／ 洗 浄
b u f f e r (5 0 m M s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r, 3 0 0 m M N a C l , p H 7 . 0 ) で レ ジ ン
を 平 衡 化 し た の ち ，同 b u f f e r で さ ら に 5 倍 希 釈 し た タ ン パ ク 質 溶 液 を 通 し
た ．洗 浄 し ，平 衡 化 ／ 洗 浄 b u f f e r に 3 0 mM i m i d a zo l e を 添 加 し た 溶 出 b u f f e r
を レ ジ ン の 5 倍 量 流 し て 溶 出 液 を 回 収 し た ． 続 い て 溶 出 液 を 5 倍 量 の 10
mM s o d i u m p h o s p h a t e b u f fe r ，2 M a m m o n i u m s u l f a t e ( p H 7 . 0 ) と 混 合 し ，
18
同 b u f f e r で 十 分 に 平 衡 化 さ せ た T O Y OP E A R L B u t yl - 6 5 0 M カ ラ ム ( 1 . 5 × 5
c m ) に 通 し た ． 1 0 m M s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r, 0 . 1 M a m m o n i u m s u l f a te
(p H 7 . 0 ) で レ ジ ン を 洗 い ， 1 0 m M s o d i u m p h o s p h a te b u f f e r (p H 7 . 0 ) で
p r o -C P Y を 溶 出 さ せ た ．
誘 導 培 養 後 の B Y 4 7 4 1 p rc 1 ΔC V 5 H GW T か ら の C P Y の 精 製 は 過 去 の 論 文
の 手 順 を 参 考 に し た (21)． 回 収 し た 菌 体 を 0.2 ml/g wet cell の ク ロ ロ ホ ル
ム 及 び 0 . 4 m l / g we t c e l l の ミ リ Q 水 に 懸 濁 さ せ ， p H 7 . 0 を 保 ち 室 温 で 1 6
時間撹拌させながら自己溶菌させた．遠心分離後の上清に対して硫安分画
を 行 い ， 2 0 -9 0 % の 画 分 の 沈 殿 を 回 収 し た ． 3 m l / g p p t の 5 0 mM s o d i u m
a c e t a te b u f f e r ( p H 5 . 0 ) で 沈 殿 を 再 溶 解 さ せ ， p H 5 .0 を 保 ち な が ら 室 温 で
1 8 時 間 放 置 さ せ る こ と で ，p r o - C P Y を 成 熟 化 さ せ た ．遠 心 分 離 後 の 上 清 を
5 倍 量 の 1 0 mM s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r ， 2 M a m mo n i u m s u l f a te ( p H
7 .0 ) と 混 合 し ， 同 b u f f e r で 十 分 に 平 衡 化 さ せ た T O Y OP E A R L B u t y l -6 5 0 M
カ ラ ム ( 1 . 5 × 5 c m ) に 通 し た ． 1 0 m M s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r, 0 . 1 M
a m m o n i u m s u l fa t e ( p H 7 . 0 ) で レ ジ ン を 洗 い ， 1 0 m M s o d i u m p h o s p h a t e
b u f f e r (p H 7 .0 ) で
CPY を 溶 出 さ せ た ． 溶 出 液 は
c e n tr i c o n Y M - 1 0
( Mi l l i p o r e 社 製 ) を 用 い て 2 倍 に 濃 縮 さ せ ，5 0 ° C で 1 0 分 間 熱 処 理 さ せ た ．
遠心分離後の上清を精製酵素液とした．
2 .2 . 2 . 6 . 様 々 な シ グ ナ ル ペ プ チ ド に ス ワ ッ ピ ン グ し た C P Y の 酵 母 発 現 ベ
クターの作製
全 長 型 C P Y の コ ー ド 領 域 の う ち シ グ ナ ル ペ プ チ ド を 欠 い た DN A 断 片 を
P C R 法 に て 増 幅 さ せ た ． 2 . 2 . 2 . 4 . で 作 製 し た p LT C V 5 H G W T を テ ン プ レ ー
19
ト と し ， オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド プ ラ イ マ ー S m a I - p r c 1 ( -s p ) - F
及 び
p r c1 - X h o I -R を 用 い る こ と で ， プ ロ ペ プ チ ド 領 域 の 直 前 に S ma I サ イ ト ，
終 止 コ ド ン の 直 前 に Xh o I サ イ ト が そ れ ぞ れ 挿 入 さ れ る よ う に し た ． P C R
産 物 は ク ロ ー ニ ン グ ベ ク タ ー p GE M - T E a s y Ve c to r に 導 入 し ，p GC H WTs p Δ
を 作 製 し た ． p G C H WTs p Δ を 制 限 酵 素 S ma I 及 び X ho I で 切 断 し た の ち ，
ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 に て prc1 配 列 を 含 む イ ン サ ー ト 部 分 を 分 離 し ，
ゲ ル を 切 り 出 し U l t r a fr e e - DA で DN A 断 片 を 精 製 し た ．同 様 に 制 限 酵 素 で
処理し精製した，酵母由来の様々なタンパク質のシグナルペプチド配列を
含 む 酵 母 低 温 誘 導 発 現 ベ ク タ ー p LTe x3 2 1 s α 2 V 5 H ， p LTe x 3 2 1 s C P R 5 V 5 H ，
p LTe x3 2 1 s C WP 2 V 5 H ， p LTe x3 2 1 s E U G 1 V 5 H ， p LTe x3 2 1 s P H O 8 9 V 5 H と ，
イ ン サ ー ト 断 片 を T 4 DN A L i g a s e で 各 々 ラ イ ゲ ー シ ョ ン し ，酵 母 発 現 用 プ
ラ ス ミ ド ベ ク タ ー p LT α 2 C V 5 H WT ，p LT C P R C V 5 H WT ，p LT C W P C V 5 H WT ，
p LT E U GC V 5 H WT ，p LT P H OC V 5 H WT を 作 製 し た ( F i g . 2 - 3 ) ．DN A シ ー ク
エンス解析をファスマック社に依頼し，プラスミドベクターのインサート
部 位 の DNA 配 列 を 確 認 し た ．
2 .2 . 2 . 7 . 様 々 な シ グ ナ ル ペ プ チ ド に ス ワ ッ ピ ン グ さ せ た C P Y の 酵 母 を 用
いた発現
2 . 2 . 2 . 6 . で 作 製 し た プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー を 用 い ，酵 母 B J 2 1 6 8 株 を 酢 酸 リ
チ ウ ム 法 で 形 質 転 換 し た ． S D ( - u r a ) プ レ ー ト 培 地 ( 0 . 6 7 % Ye a s t N i t ro g e n
B a s e wi t h o u t A m i n o A c i d s ， 2 % gl u c o s e ， 2 % a ga r ， 3 0 μ g / m l L - l e u c i n e ，
2 0 μ g / m l h i s t i d i n e mo n o h yd ro c h l o ri d e mo n o h yd ra t e ， 3 0 μ g / ml a d e n i n e
h e mi s u l fa t e d e h yd r a te ， 2 0 μ g / ml L - m e th i o n i n e ) 上 で ス ク リ ー ニ ン グ し ，
20
形 質 転 換 体
B J α 2 C V 5 H W T ， B J C P R C V 5 H W T ， B J C WP C V 5 HW T ，
B J E U GC V 5 H WT ， B J P H OC V 5 H WT を 得 た ． 形 質 転 換 体 を Y P D 液 体 培 地
( 2 % p o l yp e p to n e ， 1 % ye a s t e x t ra c t ， 2 % gl u co s e ) 内 で O D 6 0 0 >1 に な る ま
で 28 °C で 振 と う 培 養 し ， そ の 後 0.5 M NaCl を 添 加 し 20 °C で 3 日 間 培
養し，目的タンパク質を誘導発現させた．誘導培養後の各細胞は，等量の
5 0 m M s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r, 3 0 0 m M N a C l (p H 7 . 0 ) に 懸 濁 さ せ ， ビ
ー ド ビ ー タ ー を 用 い て 0.5 mm ビ ー ズ で 破 砕 し た (破 砕 30 秒 ， 休 止 1 分 を
4 セ ッ ト 行 っ た )． 遠 心 分 離 後 の 上 清 を 回 収 し ， 粗 酵 素 液 と し た ．
2 .2 . 2 . 8 . タ ン パ ク 質 定 量
溶 液 内 の タ ン パ ク 質 量 は ， b o vi n e s e ru m a l b u m i n を 標 準 タ ン パ ク 質 と
し て Q u i c k S t a r t B r a d f o r d P ro t e i n A s s a y K i t を 用 い て 定 量 し た ． 実 際 の
手順はキットの取扱説明書の記述に従った．
2 .2 . 2 . 9 . S D S - PA GE 及 び We s te r n b l o t ti n g
各 発 現 系 に お い て ， 組 換 え 体 C P Y の 発 現 及 び 精 製 段 階 は S D S -PA GE 及
び We s t e r n b l o t t i n g に よ り 確 認 し た ． S D S を 0 . 1 % 含 む 1 0 % ポ リ ア ク リ ル
ア ミ ド ゲ ル を 用 い て S D S -PA GE を 行 い ， そ の 後 ゲ ル は 0 . 1 % ( w / v ) C B B
R - 2 5 0 を 含 む 色 素 液 で 染 色 し た ( 以 下 ， C B B 染 色 法 と 略 す ) ． We s te r n
b l o t ti n g で は ， S D S -PA GE 後 の ゲ ル 上 の タ ン パ ク 質 を Tra n s -B l o t S D
S e m i - D r y E l e c tr o p h o r e t i c Tra n s f e r C e l l ( B i o -R a d 社 製 ) を 用 い て C A P S
b u f f e r (p H 11 ) 存 在 下 で P V DF メ ン ブ レ ン へ 転 写 さ せ た ． ス キ ム ミ ル ク に
よ り 室 温 で 1 時 間 ブ ロ ッ キ ン グ さ せ た の ち ，メ ン ブ レ ン 上 の タ ン パ ク 質 を
21
各 種 抗 体 と 反 応 さ せ た ．宿 主 に B L 2 1 ( DE 3 ) 株 及 び B J 2 1 6 8 株 を 用 い た 発 現
系 に お け る 実 験 内 で は ， 抗 体 は
A n ti - Hi s (C - t e rm ) - H R P a n t i b o d y
( I n vi t r o g e n 社 製 ) を 1 0 , 0 0 0 倍 希 釈 で 用 い ， 宿 主 に B Y 4 7 4 1 p r c 1 Δ 株 を 用 い
た 発 現 系 の 実 験 で は ，一 次 抗 体 に 1 0 , 0 0 0 倍 希 釈 し た A n t i -C P Y a n t i s e ru m
(本 研 究 室 保 有 品 )， 二 次 抗 体 に
p e ro x i d a s e - c o n j u ga t e d
100,000 倍 希 釈 し た
a n ti - r a b b i t
IgG
secondary
horseradish
a n ti b o d y
(GE
H e a l th c a r e 社 製 ) を 用 い た ． 化 学 発 光 試 薬 に I m mu n o S t a r L D ( 和 光 純 薬 社
製 ) を 用 い ， 免 疫 陽 性 タ ン パ ク 質 を E C L Mi n i - ca m e ra ( G E H e a l th c a r e 社
製 )に よ り イ ン ス タ ン ト フ ィ ル ム に 投 影 さ せ た ．
2 .2 . 2 . 1 0 . ア ニ リ ダ ー ゼ 活 性 測 定
精 製 し た 成 熟 型 C P Y の 酵 素 活 性 は ，ア ニ リ ド 基 質 B T p N A を 用 い て 評 価
し た ( 2 1 , 4 1 ) ． 0 .1 M s o d i u m p h o s p h a te b u f f e r (p H 7 . 0 ) 内 で 酵 素 液 と D M F
に 溶 解 し た BTpNA 溶 液 を 混 合 さ せ ， U-2000A 分 光 光 度 計 (日 立 社 製 )に よ
り室温で
5 分間
A410 を モ ニ タ リ ン グ し た ． 加 水 分 解 産 物 で あ る
p-nirtoaniline の 生 成 量 か ら 組 換 え 体 CPY の ア ニ リ ダ ー ゼ 活 性 を 算 出 し た ．
22
2 .3 . 結 果
2 .3 . 1 . 大 腸 菌 を 宿 主 と し た 組 換 え 体 C P Y の 発 現 ・ 精 製
CPY を コ ー ド す る 遺 伝 子 prc1 配 列 を 挿 入 し た 大 腸 菌 発 現 ベ ク タ ー
p C o l d C HW T を 大 腸 菌 B L 2 1 ( DE 3 ) へ 導 入 し ，形 質 転 換 体 B L C o l d C H WT を
得た．誘導培養後，菌体を超音波破砕し，可溶画分及び不溶画分に分離し
た ． そ れ ぞ れ を S D S -PA GE に よ り 解 析 し た 結 果 ， 組 換 え 体 C P Y は 不 溶 画
分 内 に 発 現 し て い る こ と が 確 認 さ れ た ．8 M で 可 溶 化 し ，H i s - t a g ア フ ィ ニ
テ ィ ー ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を 行 っ た 結 果 ，変 性 状 態 の 組 換 え 体 C P Y が 高 純
度 で 精 製 さ れ た ( F i g . 2 -4 ) ．大 腸 菌 内 で 発 現 さ せ て い る た め 糖 鎖 修 飾 さ れ て
おらず脱糖鎖型であり，且つ，成熟化のプロセスを受けていないため全長
型 の 前 駆 体 CPY が 得 ら れ た ．
2 .3 . 2 . 酵 母 を 宿 主 と し た 組 換 え 体 C P Y の 発 現 ・ 精 製
作 製 し た 酵 母 発 現 ベ ク タ ー p LT C V 5 H G WT を 用 い て 酵 母 B J 2 1 6 8 株 を 形
質転換し，得られた形質転換体を誘導培養した．その後，細胞をビーズ破
砕 し 上 清 に 対 し て 硫 安 沈 殿 を 行 い 4 0 ~ 7 0 % 飽 和 の 画 分 を 回 収 し た ．TA L ON
Me t a l A f fi n i t y R e s i n を 用 い た H i s - t a g ア フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ ト グ ラ フ ィ
ー ，続 い て T O Y OP E A R L B u t y l -6 5 0 M を 用 い た 疎 水 性 相 互 作 用 ク ロ マ ト グ
ラ フ ィ ー を 行 い ， 溶 出 液 を S D S - PA GE 及 び We s t e rn b l o t 解 析 し た 結 果 ，
約 69 kDa の CPY の 高 精 製 が 確 認 さ れ た (Fig. 2-5)． 1 l ス ケ ー ル の 培 養 か
ら 約 1 m g の C P Y が 回 収 さ れ た ( Ta b l e 2 - 4 ) ． C P Y ， P rA 及 び P rB 遺 伝 子
欠 損 株 内 で 発 現 さ せ た た め ，得 ら れ た C P Y は プ ロ 領 域 を 保 持 し た ま ま の 不
23
活性型の前駆体タンパク質であった．
次 に ， p LT C V 5 H G WT を C P Y 遺 伝 子 欠 損 株 で あ る B Y 4 7 4 1 p r c1 Δ 株 に 導
入 し ，同 様 に 組 換 え 体 C P Y を 誘 導 発 現 さ せ た ．菌 体 を ク ロ ロ ホ ル ム で 処 理
す る こ と で 自 己 溶 菌 さ せ ， 上 清 に 対 し て 硫 安 分 画 を 行 い 20~90%の 画 分 を
回 収 し た ．そ の 後 p H 5 . 0 条 件 下 で 活 性 化 さ せ ，T O Y OP E A R L B u ty l - 6 5 0 M
を 用 い た 疎 水 性 相 互 作 用 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を 行 い ，溶 出 液 を 5 0 ° C で 1 0
分 間 処 理 し た ． 熱 処 理 後 の 溶 液 を 解 析 し た 結 果 ， 成 熟 体 で あ る 約 6 1 k Da
の CPY の 精 製 が 確 認 さ れ た (Fig. 2-6)． 各 精 製 段 階 の タ ン パ ク 質 溶 液 に つ
い て ア ニ リ ド 基 質 BTpNA に 対 す る ア ニ リ ダ ー ゼ 活 性 を 測 定 し た 結 果 ， 最
終 的 に 約 1 0 0 倍 の 精 製 度 で あ っ た ( Ta b l e 2 -5 ) ．
2 .3 . 3 . 様 々 な シ グ ナ ル ペ プ チ ド に ス ワ ッ ピ ン グ さ せ た C P Y の 酵 母 を 用 い
た発現
シグナルペプチドを様々な種類のタンパク質のものにスワッピングした
C P Y を 酵 母 B J 2 1 6 8 株 内 で 誘 導 発 現 さ せ ，ビ ー ズ 破 砕 後 の 上 清 を We s te r n
b l o t ti n g に よ り 解 析 し た ． そ の 結 果 ， M F α 2 ， C P R 5 ， E U G1 ， P H O 8 9 シ グ
ナルペプチドについてはオリジナルと同様にプロセシングされているのに
対 し ， C P W2 の シ グ ナ ル ペ プ チ ド は プ ロ セ シ ン グ さ れ ず に 残 存 し て い る こ
と が 判 明 し た ( F i g . 2 - 7 ) ． こ れ は ， C wp 2 p が G P I ア ン カ ー 型 の 細 胞 壁 タ ン
パク質であることからシグナルペプチド配列は切断されないタイプのもの
で あ る か ら で あ ろ う と 思 わ れ る (42-44)． そ し て ， い ず れ の CPY に お い て
も可溶性タンパク質として発現していることから，シグナルペプチドの残
存に関わらずプロ領域内の分子内シャペロンにより正しくフォールディン
24
グが行われることが示唆された．
25
2 .4 . 考 察
序 論 で 述 べ た よ う に ，C P Y は 酵 母 内 に お い て ，リ ボ ソ ー ム で 翻 訳 さ れ た
状 態 の 全 長 型 構 造 か ら ， 小 胞 体 で の p 1 -C P Y ， ゴ ル ジ 体 で の p 2 -C P Y の 前
駆体構造を経て，最終目的地である液胞内で活性型の成熟体構造となり，
様 々 な 形 態 の 構 造 を と っ て い る ．そ れ ぞ れ の 状 態 の C P Y 分 子 の 研 究 を 行 う
ためには，それぞれの組換え体タンパク質を大量に作製する必要がある．
大腸菌を宿主に用いた場合，糖鎖修飾は行われず，さらにプロセシング
さ れ な い た め 脱 糖 鎖 状 態 の 全 長 型 C P Y が 得 ら れ る ．糖 タ ン パ ク 質 を 結 晶 化
させるとき，糖鎖を除くことで結晶化されやすくなることから酵素による
脱糖鎖処理を行うことがあるが，本発現系ではその工程を省略することが
でき，さらに結果に示したように十分な発現量が得られるため，全長型
CPY の 結 晶 化 に 適 し て い る ． 本 研 究 で は 変 性 状 態 で の 全 長 型 CPY が 得 ら
れ た が ， C P Y は 分 子 内 シ ャ ペ ロ ン を プ ロ 領 域 に 有 し て い る た め ， i n v i r to
で の リ フ ォ ー ル デ ィ ン グ が 可 能 で あ る ( 6 ) ．再 生 条 件 が 最 適 化 で き れ ば ，本
発 現 系 を 用 い て 立 体 構 造 を 形 成 し た 全 長 型 C P Y の 獲 得・結 晶 化 が 期 待 で き
る．
酵 母 を 宿 主 と し た 場 合 ，C P Y は 同 種 タ ン パ ク 質 で あ る こ と か ら 可 溶 性 タ
ンパク質として獲得されやすくなることが予想され，本研究の結果では期
待 通 り に 可 溶 性 タ ン パ ク 質 が 高 収 量 で 得 ら れ る こ と が 示 さ れ た ． BJ2168
株 内 で 発 現 さ せ る と C P Y は プ ロ 領 域 の 切 断 除 去 が 行 わ れ な い た め ，成 熟 化
前 の p 1 - C P Y も し く は p 2 -C P Y が 得 ら れ た ．前 駆 体 C P Y は 不 安 定 で あ る た
め未だ結晶構造が解かれていない．しかし，本研究での発現系では前駆体
26
C P Y が 安 定 的 に 高 精 製 さ れ る た め ，結 晶 化 に 用 い る こ と が で き る と 考 え る ．
一 方 ， BY4741prc1Δ 株 を 宿 主 と し た 系 で は ， CPY の 成 熟 化 に 関 与 す る プ
ロテアーゼ群が存在しているため，従来の精製法を用いることにより活性
型 C P Y が 高 精 製 さ れ た ．変 異 導 入 に よ る 酵 素 活 性 の 影 響 な ど 酵 素 学 的 研 究
においては活性型酵素が必要であるため，本発現系は有用であると思われ
る．
シグナルペプチドは，分泌性タンパク質を細胞質から小胞体やミトコン
ド リ ア な ど の 最 終 目 的 地 へ 確 実 に 輸 送 さ せ る 重 要 な 断 片 で あ る (45)． CPY
は細胞質外でフォールディングが行われるため，輸送力の高いシグナルペ
プ チ ド を 用 い る こ と で 組 換 え 体 CPY を 可 溶 性 タ ン パ ク 質 と し て 高 発 現 さ
せることが可能となると思われる．今回の実験で用いたシグナルペプチド
の由来タンパク質はいずれも局在性の高いものであり，実際に組換え体
C P Y は 高 発 現 し た こ と か ら そ の 実 用 性 が 示 さ れ た ．一 方 ，興 味 深 い こ と に ，
CPY の オ リ ジ ナ ル の シ グ ナ ル ペ プ チ ド で も 組 換 え 体 CPY は 高 発 現 し て お
り ，C P Y 由 来 の シ グ ナ ル ペ プ チ ド も 同 様 に 組 換 え 体 の 可 溶 性 タ ン パ ク 質 の
発現系に利用可能であると言えるかもしれない．
以 上 の よ う に ，本 章 で 構 築 し た 発 現 系 は そ れ ぞ れ さ ま ざ ま な 形 態 の C P Y
を 得 る こ と が で き る た め ，結 晶 化 や 変 異 体 タ ン パ ク 質 作 製 な ど 多 様 な C P Y
分子の研究への貢献が期待される．
27
Ta b l e 2 - 1 D e s c r i p t i o n s o f d e ri v e d p r o t e i n s o f e a c h s i gn a l p e p t i d e co n ta i n e d e xp r e s s i o n v e c to r s
I n f o rm a ti o n o f e a c h p r o te i n w a s ci t e d b y S a cc ha r o m yc e s Ge n o m e D a t a b a s e ( h t tp : / / w w w. y e a s t g e n o m e . o r g / ) .
Signal peptides
D e r i v e d p r o te i n s
A m o u n t o f a mi n o a c i d r e s i d u e
MFα2
M a t i n g p h e r o mo n e a l p h a - fa c t o r ma d e b y a l p h a c e l l s
89
P e p t i d yl - p r o l y l ci s - t ra n s i s o m e r a s e ( c y cl o p h i l i n )
CPR5
50
o f th e e n d o p l a s mi c r e ti cu l u m
C WP 2
C o va l e n tl y l i n k e d ce l l w a l l ma n n o p r o te i n
71
P r o te i n d i s u l fi d e i s o me r a s e o f t h e e n d o p l a s m i c
EUG1
50
r e t i cu l u m l u me n
PHO89
N a + / P i c o t ra n s p o r te r
41
28
Ta b l e 2 - 2 E . c o li a n d S . c e r e vi si a e s t r a i n s u s e d i n t h i s s t u d y
S t ra i n
G e n o t yp e
Sourse
E . c o li
re cA 1 , en d A 1 , g y r A 96 , t h i - 1 , hs d R 1 7 ( r K - m K + ) , e 1 4 - ( m crA - ) ,
JM109
Ta k a r a B i o
sup E 44 , r e lA 1 , Δ ( l a c -p r oA B ) / F ' [ t r a D 36 ,
F － , o mp T, h sd S B ( r B －
p r oA B + ,
l ac
Iq,
l a cZ Δ M 1 5 ]
m B － ) , g a l ( λ c I 8 5 7 , i nd 1 , S a m 7 , n in 5 ,
B L 2 1 ( DE 3 )
N o va g e n
la cUV 5 -T 7 ge n e 1 ) , d c m ( DE 3 )
S . c e re v is ia e
BJ2168
MATa , p rb 1 - 11 2 2 , p r c1 - 4 07 , p ep 4 - 3 , u ra 3 - 52 , l eu 2 , t rp 1
NBRP
B Y 4 7 4 1 p r c1 Δ
MATa , h is 3 Δ1 , l eu 2 Δ0 , m e t 1 5Δ 0 , u ra 3 Δ 0 , p r c1 Δ : : k a nM X4
T h e r m o F i s h e r S c i e n t i fi c
29
Table 2-3 Oligonucleotide primers using for preparation of prc1 fragment, construction
of each plasmid vectors of wild-type CPY, and insertion of His-tag encoding fragment
Primers
Sequences
prc1-Left-2
5’-TTCTTTTCGTCTTCCCTCCT-3’
prc1-Right-3
5’-CGTATATATTTCGATCGTAGCTGAT-3’
prc1-HistagQC4-F
prc1-HistagQC4-R
5’-CCACGGTGGTTTCTCCTTACATCATCATC
ATCATCATTAAAGCGTGTATGTGTAGGC-3’
5’-GCCTACACATACACGCTTTAATGATGATG
ATGATGATGTAAGGAGAAACCACCGTGG-3’
SacI-prc1-F
5’-TACGACGAGCTCATGAAAGCATTC -3’
prc1-HindIII-R
5’-GCAGACCAAGCTTTTAATGATGATG-3’
SmaI-prc1-F
5’-ACACCCGGGATGAAAGCATTC-3’
prc1-XhoI-R
5’-ACGCTCGAGTAAGGAGAAACC-3’
SmaI-prc1(-sp)-F
5’-CACCCGGGATCTCATTGCAAAG-3’
Primer pair, prc1-Left-2 and prc1-Right-3, was used for amplifying prc1 fragment.
His-tag encoding fragment was inserted into the 3’- termini of prc1 by site-directed
mutagenesis using prc1-HistagQC4-F and prc1-HistagQC4-R primers.
His-tag region
is shown with a gray background. Primer pair, SacI-prc1-F and prc1-HindIII-R, was
used for introduction of restriction sites to the 5’- and 3’- termini of prc1+Histag
fragment.
SacI restriction site and HindIII restriction site are underlined. Primer
pair, SmaI-prc1-F and prc1-XhoI-R, was used for introduction of restriction sites to the
5’- and 3’- termini of prc1 fragment.
underlined.
SmaI restriction site and XhoI restriction site are
SmaI-prc1(-sp)-F and prc1-XhoI-R primers were used for introduction of
restriction sites to the 5’- and 3’- termini of signal peptide region deleted prc1 fragment.
SmaI restriction site and XhoI restriction site are underlined.
30
cspA 3 ’ U T R
M1 3 I G
H i nd I I I
Hi s-ta g
Amp
PRC1
pColdCHWT
Col E1 ori
SacI
Hi s-ta g
T EE
cspA 5 ’ U T R
cspA
Fig.
2 -1
S c h e ma t i c
diagram
lac opera tor
lac I
promoter
of
co n s t ru c t e d
th e
p C o l d C HW T
31
p l a s mi d
v e c to r
2-micron ori
leu2 -d
CYC1
t ermi na tor
URA3
V5 -H ta g
pLTCV5HGWT
X ho I
Amp r
PRC1
pUC ori
SmaI
Fig.
2 -2
S c h e ma t i c
diagram
HSP 1 2
promoter
of
th e
p LT C V 5 H GW T
32
co n s t ru c t e d
p l a s mi d
v e c to r
2-micron ori
leu2 -d
CYC1
t ermi na tor
URA3
V5 -H ta g
pLTspCV5HWT
X ho I
PRC1
Amp r
(signal peptide deleted)
pUC ori
SmaI
HSP 1 2
promoter
Si g nal pepti de
F i g . 2 - 3 S c h e m a ti c d i a g r a m o f t h e c o n s t ru c t e d p l a s mi d v e c t o r o f s i g n a l
p e p t i d e r e p l a c e d w i l d - t yp e C P Y
E a ch
s i gn a l
p e p ti d e
fragment
is
inserted
p r o m o t e r r e g i o n i n e a c h t e mp l a t e v e c t o r.
d o wn s tr e a m
of
H SP 1 2
O r i g i n a l s i gn a l p e p ti d e
d e l e t e d p r c 1 f r a gm e n t w a s i n t ro d u ce d d o w n s t r e a m o f e a c h s i gn a l
peptide region.
33
(A)
(B)
(kDa)
97.4
66.2
45.0
31.0
1
2
3
4
5
5
F i g . 2 - 4 S D S -PA G E (A ) a n d We s t e r n b l o t ti n g ( B ) o f re c o mb i n a n t
fu l l - l e n g th w i l d - t yp e C P Y a t p u r i fi c a ti o n s t e p s
E . c o l i c e l l s i n wh i c h r e c o m b i n a n t f u l l - l e n g th WT i s e xp r e s s e d w e r e
d i s ru p t e d b y s o n i c a t i o n a n d t h e p r e ci p i t a te s we r e s o l u b i l i ze d wi t h 8 M
urea for 1 h at 25 °C.
D e n a t u re d W T w a s p u r i fi e d b y H i s - t a g a f fi n i t y
ch r o m a t o gr a p h y o n TA L ON M e ta l A f f i n i t y R e s i n .
I n We s t e rn b l o t t i n g ,
A n ti - Hi s (C - t e r m ) - H R P a n t i b o d y ( 1 : 1 0 , 0 0 0 ) w a s u s e d .
(A ) ( B ) L a n e 1 , m o l e c u l a r m a r ke r ; l a n e 2 , s u p e r n a t a n t a f t e r s o n i ca t i o n ;
lane
3,
p r e c i p i t a te s
after
s o n i c a ti o n ;
lane
4,
the
s o l u ti o n
after
s o l u b i l i z a ti o n ; l a n e 5 , th e e l u a te f r o m TA L O N M e t a l A f fi n i t y c o l u m n .
34
(A)
(B)
(kDa)
97.4
66.2
45.0
31.0
1
2
3
4
4
F i g . 2 - 5 S D S -PA G E (A ) a n d We s t e r n b l o t ti n g ( B ) o f re c o mb i n a n t
wi l d - t yp e p r o -C P Y a t p u r i f i c a t i o n s t e p s
Ye a s t c e l l s i n wh i c h r e c o mb i n a n t p r o -C P Y i s e xp re s s e d w e r e d i s ru p t e d
using
bead
beater
and
th e
s u p e rn a t a n t
was
corrected.
After
a m m o n i u m s u l f a te p r e c i p i t a ti o n , p r o - C P Y w a s p u ri f i e d b y H i s - t a g
a f fi n i t y
c h r o m a to g r a p h y
on
TA L ON
M e ta l
Affinity
Resin
and
h y d r o p h o b i c i n te r a c ti o n c h r o m a t o gr a p h y o n T O Y OP E A R L B u t y l -6 5 0 M .
I n We s te r n b l o t ti n g , A n t i - Hi s (C - t e r m ) - HR P a n t i b o d y ( 1 : 1 0 ,0 0 0 ) w a s
used.
(A ) ( B ) L a n e 1 , m o l e c u l a r m a r k e r ; l a n e 2 , t h e s o l u ti o n a f t e r a m m o n i u m
s u l f a t e p r e c i p i t a ti o n ; l a n e 3 , t h e e l u a t e fr o m TA L ON M e t a l A f f i n i t y
co l u mn ; l a n e 4 , t h e e l u a t e f r o m T O Y OP E A R L B u t yl - 6 5 0 M c o l u m n .
35
Ta b l e 2 - 4 S u m m a r y o f p u r i fi c a ti o n o f r e co m b i n a n t wi l d - t yp e p r o - C P Y
B e ca u s e p r o -C P Y i s a n i n a c ti v e f o r m , t h e re c o v e r y v a l u e s a r e ca l cu l a t e d b a s e d o n th e a m o u n t o f t o t a l p r o t e i n .
To t a l p r o t e i n
Recovery
(mg)
(%)
C e l l d i s r u p ti o n
310
100
A m mo n i u m s u l f a te p r e c i p i ta t i o n
230
74
Steps
Hi s - ta g a f f i n i t y c h r o m a t o gr a p h y
8.7
2.8
H yd r o p h o b i c i n te r a c ti o n ch ro m a to g r a p h y
1.2
0.39
36
(A)
(B)
(kDa
)97.4
66.2
45.0
31.0
1
2
3
4
4
F i g . 2 - 6 S D S -PA G E (A ) a n d We s t e r n b l o t ti n g ( B ) o f re c o mb i n a n t
wi l d - t yp e C P Y a t p u r i f i c a t i o n s t e p s
Ye a s t c e l l s i n wh i c h r e c o mb i n a n t W T i s e xp re s s e d w e re l ys e d b y
ch l o r o f o r m a n d th e s u p e r n a t a n t w a s t r e a t e d w i th a m m o n i u m s u l f a te .
P r o -C P Y i n th e p r e c i p i t a te s wa s a c t i v a te d a t p H 5 . 0 a n d a c ti v a te d
ma t u re C P Y w a s p u r i f i e d b y h yd r o p h o b i c i n t e ra c t i o n ch r o ma t o g ra p h y
o n T OY OP E A R L B u t yl - 6 5 0 M a n d h e a t t re a t me n t a s d e s c r i b e d i n th e
text.
I n We s t e r n b l o t ti n g , r a b b i t p o l y cl o n a l a n t i -C P Y a n ti s e r u m
(1:10,000)
and
horseradish
p e r o x i d a s e - co n j u ga t e d
a n t i -r a b b i t
IgG
s e c o n d a r y a n ti b o d i e s (1 : 1 0 0 , 0 0 0 ) w e r e u s e d .
(A ) ( B ) L a n e 1 , m o l e c u l a r m a r ke r ; l a n e 2 , t h e s o l u t i o n a f t e r a c t i va t i o n ;
l a n e 3 , th e e l u a te f r o m T O Y OP E A R L B u t y l -6 5 0 M co l u m n ; l a n e 4 , th e
s u p e r n a t a n t a f t e r h e a t t r e a tm e n t .
37
Ta b l e 2 - 5 S u m m a r y o f p u r i fi c a ti o n o f r e co m b i n a n t wi l d - t yp e C P Y
E a ch p a r a m e te r w a s c a l c u l a t e d b a s e d o n t h e a n i l i d a s e a c ti v i t y t o wa rd B T p N A .
Steps
A c ti v a ti o n
To t a l p r o t e i n
(mg)
70
To t a l a c ti v i t y
(n m o l / m i n )
Sp e ci f i c a c t i vi t y
(n m o l / m i n / m g )
360
5 .1
Recovery
(%)
P u r i f i c a ti o n
100
1
H yd ro p h o b i c
i n t e r a c ti o n
ch r o m a t o gr a p h y
1 .4
430
310
120
61
Heat treatment
0 .6 4
350
550
97
11 0
38
(kDa)
94.6
51.6
1
2
3
4
5
6
7
F i g . 2 - 7 We s te r n b l o t ti n g o f p re c u r s o r wi l d - t yp e C P Y e xp r e s s e d w i t h
s i gn a l p e p ti d e d e r i v e d f r o m v a ri o u s p r o t e i n s
Ye a s t c e l l s i n wh i c h r e c o m b i n a n t p re c u r s o r WT i s e xp r e s s e d w e r e
d i s ru p t e d u s i n g b e a d b e a te r a n d th e s u p e rn a ta n t wa s a n a l y z e d b y
We s t e rn
blotting.
A n ti - H i s
( C - t e r m ) - HR P
a n ti b o d y
(1:10,000)
( I n vi t r o g e n ) w a s u s e d i n We s t e rn b l o t t i n g .
L a n e 1 , m o l e c u l a r ma r k e r ; l a n e 2 , W T e xp r e s s e d w i t h o ri gi n a l s i g n a l
p e p t i d e ; l a n e 3 , W T e x p r e s s e d w i th M F α 2 s i gn a l p e p ti d e ; l a n e 4 , W T
e xp re s s e d w i th C P R 5 s i gn a l p e p ti d e ; l a n e 5 , W T e xp r e s s e d wi t h C W P 2
s i gn a l p e p t i d e ; l a n e 6 , W T e xp r e s s e d w i t h E U G1 s i gn a l p e p t i d e ; l a n e 7 ,
WT e xp r e s s e d w i t h P H O 8 9 s i g n a l p e p t i d e .
39
第 3章
ジ ス ル フ ィ ド 結 合 の 破 壊 が CP Y の 構 造 安 定 性 及 び 酵 素 活
性に及ぼす影響
3 .1 . 緒 論
C P Y の 分 子 内 に は ジ ス ル フ ィ ド 結 合 が 5 箇 所 で 形 成 さ れ て い る が ，そ の
う ち 4 つ が V 字 ヘ リ ッ ク ス に 関 係 し て い る ( F i g . 3 - 1 ) (1 2 ) ．2 つ の ジ ス ル フ
ィ ド 結 合 ， C ys 1 9 3 -C ys 2 0 7 及 び C ys 2 6 2 - C y s 2 6 8 は ， V 字 ヘ リ ッ ク ス を 構
成 す る 2 本 の α ヘ リ ッ ク ス の 上 流 及 び 下 流 で 形 成 さ れ て い る ．立 体 構 造 を
検討すると，V 字ヘリックスは酵素本体から突出して位置しているが，こ
の 2 つのジスルフィド結合が蝶番様に作用し V 字ヘリックスを安定的につ
な い で い る よ う に 見 え る ． 一 方 ， 他 の
2 つ の ジ ス ル フ ィ ド 結 合
(C y s 2 1 7 - C ys 2 4 0 及 び C ys 2 2 4 -C y s 2 3 3 ) は V 字 ヘ リ ッ ク ス の 2 本 の α ヘ リ
ッ ク ス を 架 橋 す る よ う に 形 成 さ れ て お り ，‘ d i s u l f i d e z i p p e r ’ と 呼 ば れ て
い る (12)． 以 前 の 研 究 に お い て ， こ の 2 つ の 結 合 の 破 壊 が タ ン パ ク 質 の ミ
スフォールディングを引き起こしプロテオリシスに対する感受性が上がる
こ と が 判 明 し ，ジ ス ル フ ィ ド 結 合 に よ る V 字 構 造 の 形 成 が 立 体 構 造 維 持 に
関 与 す る こ と が 示 唆 さ れ る (46)．
そ こ で 本 章 で は ，C P Y に お け る V 字 ヘ リ ッ ク ス の 構 造 維 持 の 必 要 性 を さ
ら に 検 証 す る た め に ，先 に 述 べ た 蝶 番 様 ジ ス ル フ ィ ド 結 合 ( C ys 1 9 3 -C y s 2 0 7
及 び C y s 2 6 2 -C ys 2 6 8 ) を 形 成 し て い る 各 C ys 残 基 を A l a に 置 換 す る こ と で
結合を破壊しその影響を調べた．
40
3 .2 . 実 験 材 料 及 び 実 験 方 法
3 .2 . 1 . 実 験 材 料
E . c ol i J M 1 0 9 株 は タ カ ラ バ イ オ 社 か ら 購 入 し ， S . c e r e vi si ae
B Y 4 7 4 1 p r c1 Δ 株 は T h e r mo F i s h e r S ci e n t i fi c 社 か ら 購 入 し た ．そ れ ぞ れ の
菌 体 の 遺 伝 子 型 は Ta b l e 3 - 1 に 示 し た ． ク ロ ー ニ ン グ ベ ク タ ー p GE M -T
E a s y Ve c t o r は P r o m e g a 社 か ら 購 入 し ， Q u i kC h a n g e Si t e - Di r e ct e d
Mu t a g e n e s i s Ki t は A g i l e n t Te ch n o l o gi e s 社 か ら 購 入 し た ． B l e n d Ta q 及
び Taq D N A P o l y m e r a s e は そ れ ぞ れ 東 洋 紡 社 及 び N e w E n g l a n d B i o l a b s
社 か ら 購 入 し た ． T 4 DN A l i g a s e は タ カ ラ バ イ オ 社 製 を 使 用 し ， 各 種 制 限
酵 素 は Roche 社 ，タ カ ラ バ イ オ 社 ，東 洋 紡 社 製 の も の を 使 用 し た ．疎 水 性
相 互 作 用 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に 使 用 し た T O Y OP E A R L B u t yl - 6 5 0 M は 東 ソ
ー 社 か ら 購 入 し た ． Qu i c k S t a r t B ra d fo r d P r o t e i n A s s a y K i t は B i o - R a d
社 か ら 購 入 し た ． 合 成 基 質 で あ る N - b e n z o y l -L - t y ro s i n e p - n i t ro a n i l i d e
(B T p N A )
は
S i g ma -A l d ri c h
社
製
を
使
用
し
，
b e n z yl o x yc a r b o n y l -L -p h e n i l a l a n yl - L -l e u c i n e ( Z -P h e - L e u - O H ) は B a ch e m
社製を使用した．本実験で使用したオリゴヌクレオチドプライマーは日本
バイオサービス社及びオペロンバイオテクノロジー社に合成を依頼した．
その他の試薬においては，特に記載のない限り和光純薬社及びナカライテ
スク社の特級試薬を用いた．
41
3 .2 . 2 . 実 験 方 法
3 .2 . 2 . 1 . 変 異 体 C P Y (C 1 9 3 A ， C 2 0 7 A ， C 2 6 2 A ， C 2 6 8 A ) の 作 製
4 種 類 の 変 異 体 CPY (C193A， C207A， C262A， C268A)の 発 現 用 ベ ク タ
ー の 構 築 は そ れ ぞ れ 同 じ 手 順 で 行 っ た ． 第 2 章 に て 構 築 し た 野 生 型 CPY
発 現 用 ベ ク タ ー p LT C V 5 H GW T を テ ン プ レ ー ト と し ， 目 的 の 変 異 配 列 を 含
む オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を F o r w a rd p ri m e r に 用 い ， P C R 法 に て 目 的 の 変 異
配 列 を 含 む DNA 断 片 を 増 幅 し た ． ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 に て 分 離 さ れ
た P C R 産 物 は ， ゲ ル か ら 切 り 出 し ， 精 製 し た ． こ の 精 製 し た DN A 断 片 を
メ ガ プ ラ イ マ ー と し ， Q u i kC h a n ge S i te - d i r e c t e d M u ta g e n e s i s K i t を 用 い
て テ ン プ レ ー ト プ ラ ス ミ ド p LT C V 5 H GW T か ら 変 異 体 C P Y 発 現 用 ベ ク タ
ー ， p LT C V 5 H G C 1 9 3 A ， p LT C V 5 H G C 2 0 7 A ， p LT C V 5 H GC 2 6 2 A ，
p LT C V 5 H GC 2 6 8 A を そ れ ぞ れ 合 成 し た ． 作 製 し た プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー を
B Y 4 7 4 1 p r c1 Δ 株 へ 酢 酸 リ チ ウ ム 法 に て 導 入 し ，S D ( - u r a ) プ レ ー ト 培 地 上 で
形 質 転 換 体 を ス ク リ ー ニ ン グ し た ． 形 質 転 換 体 を YPD 液 体 培 地 で
OD600>1.0 に な る ま で 28 °C で 振 と う 培 養 し ， そ の 後 0.5 M NaCl を 添 加
し ， 2 0 °C で 3 日 間 誘 導 培 養 し た ． 菌 体 を 回 収 し ， 0 . 2 m l / g w e t c e l l の ク
ロ ロ ホ ル ム 及 び 0 . 4 ml / g w e t c e l l の ミ リ Q 水 を 加 え ， p H 7 . 0 を 保 ち 室 温
で 16 時 間 撹 拌 さ せ な が ら 自 己 溶 菌 さ せ た ． 遠 心 分 離 後 の 上 清 に 対 し て 硫
安 分 画 を 行 い ， 2 0 - 9 0 % の 画 分 の 沈 殿 を 回 収 し た ． 3 m l / g p p t の 5 0 mM
sodium acetate buffer (pH 5.0)で 沈 殿 を 再 溶 解 さ せ ， pH 5.0 を 保 ち な が
ら 室 温 で 1 8 時 間 放 置 さ せ る こ と で ， p r o -C P Y を 成 熟 化 さ せ た ． 遠 心 分 離
後 の 上 清 を 5 倍 量 の 1 0 m M s o d i u m p h o s p h a t e b u f fe r ， 2 M a m m o n i u m
42
s u l f a t e (p H 7 . 0 ) と 混 合 し ， 同 b u f f e r で 十 分 に 平 衡 化 さ せ た T O Y OP E A R L
B u ty l - 6 5 0 M カ ラ ム ( 1 .5 × 5 c m ) に 通 し た ．1 0 mM s o d i u m p h o s p h a t e b u f fe r,
0 .1 M a m m o n i u m s u l f a t e (p H 7 . 0 ) で レ ジ ン を 洗 い ， 1 0 mM s o d i u m
phosphate buffer (pH 7.0) で CPY を 溶 出 さ せ た ． 溶 出 液 は centricon
YM-10 を 用 い て 2 倍 に 濃 縮 さ せ ， 50 °C で 10 分 間 熱 処 理 さ せ た ． 遠 心 分
離後の上清を精製酵素液とした．
3 .2 . 2 . 2 . タ ン パ ク 質 定 量
溶 液 内 の タ ン パ ク 質 量 は ， b o vi n e s e ru m a l b u m i n を 標 準 タ ン パ ク 質 と
し て Q u i c k S t a r t B r a d f o r d P ro t e i n A s s a y K i t を 用 い て 定 量 し た ． 実 際 の
手順はキットの取扱説明書の記述に従った．
3 .2 . 2 . 3 . S D S - PA GE 及 び We s te r n b l o t ti n g
変 異 体 C P Y の 発 現 及 び 精 製 段 階 は S D S - PA GE 及 び We s t e rn b l o t ti n g に
よ り 確 認 し た ． 実 際 の 手 順 は 2.2.2.9.に 記 載 の 通 り で あ る ． 抗 体 に は ， 一
次 抗 体 に 1 0 , 0 0 0 倍 希 釈 し た A n ti - C P Y a n t i s e ru m ( 本 研 究 室 保 有 品 ) ，二 次
抗 体 に
100,000
倍 希 釈 し た
horseradish
p e r o xi d a s e - c o n j u g a te d
a n ti - r a b b i t I g G s e c o n d a r y a n ti b o d y (I n vi t r o g e n 社 製 ) を 用 い た ． 化 学 発
光 試 薬 は ImmunoStar LD（ 和 光 純 薬 社 製 ） を 用 い た ．
3 .2 . 2 . 4 . 酵 素 活 性 測 定
各 変 異 体 C P Y に 対 し て ，ペ プ チ ダ ー ゼ 活 性 及 び ア ニ リ ダ ー ゼ 活 性 を 測 定
し た ．ペ プ チ ダ ー ゼ 活 性 は ペ プ チ ド 基 質 Z - P h e -L e u - O H に 対 す る 加 水 分 解
43
活 性 か ら 評 価 し た ． 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)内 で 精 製 酵
素 3 ~4 μ g / ml を 1 m M の Z -P h e -L e u - O H と 混 合 さ せ ，室 温 で 5 分 間 放 置 し ，
そ の 後 60 % PCA を 加 え て 反 応 を 停 止 さ せ た ． 遠 心 分 離 後 の 上 清 を
4 -F l u o r o - 7 -n i tr o - 2 , 1 , 3 - b e n zo x a d i a z o l e ( N - B D F ) と 6 0 ° C で 1 分 間 反 応 さ
せ る こ と で 誘 導 体 化 さ せ ， L a C h r o mU l tr a U - H P L C s ys t e m ( 日 立 ハ イ テ ク
社 製 ) を 用 い て ア ミ ノ 酸 分 析 を 行 っ た ．H 型 ア ミ ノ 酸 標 準 液 分 析 結 果 を 基 準
に し て Z-Phe-Leu-OH の 加 水 分 解 産 物 で あ る L-Leu の 生 成 量 か ら 各 変 異 体
酵素のペプチダーゼ活性を算出した．アニリダーゼ活性は，アニリド基質
BTpNA を 用 い て 評 価 し た (21,41)． 0.1 M sodium phosphate buffer (pH
7 .0 ) 内 で 1 0 ~2 0 μ g / m l 酵 素 液 と D M F に 溶 解 し た 0 . 3 m M B T p N A 溶 液 を 混
合 さ せ ，U - 2 0 0 0 A 分 光 光 度 計 ( 日 立 社 製 ) に よ り 室 温 で 5 分 間 A 4 1 0 を モ ニ タ
リ ン グ し た ． 加 水 分 解 産 物 で あ る p -n i r t o a n i l i n e の 生 成 量 か ら 組 換 え 体
CPY の ア ニ リ ダ ー ゼ 活 性 を 算 出 し た ．
3 .2 . 2 . 5 . 分 子 モ デ リ ン グ ソ フ ト ウ ェ ア を 用 い た 構 造 安 定 性 の 評 価
各 変 異 体 に つ い て ，変 異 の 導 入 に よ る 構 造 へ の 影 響 を in si li co で 検 討 し
た ． ソ フ ト ウ ェ ア は Di s c o v e r y S tu d i o ® 2 . 5 .5 ( A c c e l r ys 社 製 ) を 用 い ， 野 生
型 C P Y （ P DB I D : 1 Y SC ） を 初 期 構 造 に 用 い た ． 初 め に 初 期 構 造 の 極 小 化
を ソ フ ト ウ ェ ア 内 の ‘ M i n i mi z a ti o n ’ プ ロ ト コ ル で 行 っ た ． そ の 際 ， 力 場
に は C HA R M m を 使 用 し ， R M S G ra d i e n t が 0 . 1 k c a l / m o l Å 未 満 と な る と
こ ろ を 計 算 終 了 条 件 と し プ ロ ト コ ル を 繰 り 返 し た (47)． 極 小 化 し た 初 期 構
造 を 用 い て ‘ Build Mutants ’ プ ロ ト コ ル を 実 行 し ， 目 的 箇 所 の ア ミ ノ 酸
を 置 換 し た ． そ の 後 ， 得 ら れ た ア ミ ノ 酸 置 換 体 に つ い て ‘ M i n i mi z a ti o n ’
44
プ ロ ト コ ル に て さ ら に 極 小 化 を 行 い ， R M S G r a d i e n t が 0 . 1 k ca l / mo l Å 未
満となったところで計算を終了し，変異体タンパク質とした．極小化され
た そ れ ぞ れ の 変 異 体 タ ン パ ク 質 の 立 体 構 造 に お い て ， W T と の P o te n ti a l
e n e rg y ， v a n d e r Wa a l s e n e r g y ， E l e c t r o s t a t i c e n e r g y の 差 を 算 出 し ， 分
子全体のエネルギー変化を調べた．
45
3 .3 . 結 果
3 .3 . 1 . 蝶 番 様 ジ ス ル フ ィ ド 結 合 を 形 成 す る C y s の A l a 置 換 体 の 発 現・精 製
メ ガ プ ラ イ マ ー を 用 い 部 位 特 異 的 に p r c1 配 列 の 目 的 箇 所 に DN A 変 異 を
導 入 し ，各 変 異 体 の 発 現 ベ ク タ ー を 構 築 し た ．D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 結 果
から，変異の導入を確認した．作製した各発現ベクターをそれぞれ酵母
B Y 4 7 4 1 p r c1 Δ 株 に 導 入 し ，変 異 体 タ ン パ ク 質 を 誘 導 発 現 さ せ た ．回 収 し た
菌 体 を S D S - PA GE 及 び We s t e rn b l o t に よ り 解 析 し た 結 果 ， い ず れ の 変 異
体 CPY も 細 胞 内 に 発 現 し て い る こ と が 確 認 さ れ た (Fig. 3-2 (A))． 実 験 方
法 に 記 載 の 通 り に 精 製 を 行 っ た 結 果 ， C193A 及 び C207A に つ い て は 精 製
段 階 で 凝 集 す る こ と が 判 明 し た ( F i g . 3 - 2 (B ) ) ． こ の 結 果 か ら ， こ の 2 つ の
変異体は正しくフォールディングされていないことが示唆された．一方，
C262A 及 び C268A に つ い て は 精 製 の 最 終 段 階 ま で 可 溶 性 タ ン パ ク 質 と し
て 回 収 さ れ た ． こ の 結 果 か ら ， ジ ス ル フ ィ ド 結 合 C y s 2 6 2 -C y s 2 6 8 の 開 裂
は酵素全体の立体構造保持に顕著な影響は及ぼさないことが示唆された．
3 .3 . 2 . C 2 6 2 A 及 び C 2 6 8 A の 酵 素 活 性
可 溶 性 タ ン パ ク 質 と し て 精 製 さ れ た C262A 及 び C268A に つ い て ，
Z - P h e -L e u - O H に 対 す る ペ プ チ ダ ー ゼ 活 性 及 び B T p N A に 対 す る ア ニ リ ダ
ー ゼ 活 性 を 測 定 し た ．そ の 結 果 ，C262A 及 び C268A の 両 方 に お い て ，WT
と 比 較 し て い ず れ の 活 性 も 著 し く 低 下 し た (Ta b l e 3 - 2 ) ．C ys 2 6 2 -C ys 2 6 8 の
開裂により構造の自由度が増し V 字ヘリックスに揺らぎが生じることが考
46
え ら れ る ．し た が っ て ，こ の こ と が C P Y の 触 媒 活 性 に 影 響 を 及 ぼ す こ と が
示唆される．
3 .3 . 3 . 各 変 異 体 の 構 造 安 定 性
各 変 異 体 (C193A， C207A， C262A， C268A)に お い て ， 変 異 に よ る 立 体
構 造 へ の 影 響 を 調 べ る た め ， D i s c o v e r y S tu d i o 2 .5 . 5 を 用 い ， 力 場
C HA R M m に 基 づ き そ れ ぞ れ の 変 異 体 C P Y の P o t e n ti a l e n e r g y ， v a n d e r
Wa a l s e n e r g y ， E l e c t r o s ta t i c e n e rg y を 算 出 し た ． そ の 結 果 ， い ず れ の エ
ネ ル ギ ー も W T と 比 較 し て 上 昇 し て い る こ と が わ か っ た ( Ta b l e 3 - 3 ) ． こ の
こ と よ り ， そ れ ぞ れ の Cys を Ala に 置 換 す る こ と で ， WT と 比 較 し て 立 体
構造が不安定化することが示唆された．
47
3 .4 . 考 察
タンパク質はさまざまな結合や相互作用によりその立体構造が安定な状
態に保たれているため，そのうち共有結合性であるジスルフィド結合を開
裂させると立体構造は自由度が増し，揺らぎが生じる．ジスルフィド結合
形成時の天然状態が熱力学的に最安定であるならば，結合の開裂により安
定 性 は 低 下 す る こ と が 予 想 さ れ る ．C P Y に お い て ，蝶 番 様 ジ ス ル フ ィ ド 結
合 ( C ys 1 9 3 -C ys 2 0 7 及 び C ys 2 6 2 -C y s 2 6 8 ) の 開 裂 に よ っ て 構 造 の 揺 ら ぎ が 起
こったとき V 字ヘリックスの構造は直接的にその影響を受けると思われる．
本 章 に お い て ，蝶 番 様 ジ ス ル フ ィ ド 結 合 を 形 成 す る C ys 残 基 を A l a に 置 換
し た 各 変 異 体 の エ ネ ル ギ ー が WT と 比 較 し て 大 き く 上 昇 す る 結 果 を 示 し た ．
つ ま り ，こ れ ら の ジ ス ル フ ィ ド 結 合 の 形 成 が C P Y の 立 体 構 造 の 安 定 性 に 寄
与 し て い る と 言 え る ． 実 際 ， C193A 及 び C207A は フ ォ ー ル デ ィ ン グ に 致
命 的 な 影 響 が 生 じ て い る こ と か ら ，実 験 的 に も 立 証 さ れ た ． こ れ ら は V 字
ヘ リ ッ ク ス が CPY の 立 体 構 造 維 持 に 重 要 な 役 割 を 担 う こ と を 示 す 1 つ の
結果である．
ま た ， C262A 及 び C268A に お い て 触 媒 活 性 が 著 し く 減 少 し た こ と と 合
わ せ る と ，こ の 性 質 は 蝶 番 様 ジ ス ル フ ィ ド 結 合 の 開 裂 に よ る V 字 ヘ リ ッ ク
スの立体構造の揺らぎにより表れたと解釈される．したがって，酵素反応
触 媒 に お い て C y s 2 6 2 -C ys 2 6 8 の 形 成 は 必 須 で あ り ，V 字 ヘ リ ッ ク ス が 触 媒
活性においても大きく関与することが立証された．
48
Cys193
Cys268
Cys262
Cys207
Cys240
Cys217
Cys233
Cys224
F i g . 3 - 1 Di s u l fi d e b o n d s i n C P Y m o l e cu l e
F o u r o u t o f f i v e d i s u l fi d e b o n d s f o r m e d i n C P Y m o l e c u l e a s s o c i a te w i t h
V- s h a p e h e l i x .
‘ Hi n g e ’
d i s u l fi d e
D i s u l f i d e b o n d s a r e s h o wn i n o ra n g e t h i ck s ti c k .
bonds
( C ys 1 9 3 -C ys 2 0 7
and
C ys 2 6 2 - C y s 2 6 8 )
and
‘ d i s u l fi d e z i p p e r ’ (C ys 2 1 7 -C y s 2 4 0 a n d C y s 2 2 4 - C y s 2 3 3 ) a r e f ra m e d i n
b l u e a n d p i n k b o x e s , r e s p e c t i ve l y.
V-s h a p e h e l i x i s c o l o r e d i n g re e n
a n d c a ta l y ti c t r i a d i s s h o w n i n re d s t i ck .
49
Ta b l e 3 - 1 O l i g o n u c l e o t i d e p ri m e r s u s i n g f o r c o n s tr u c ti o n o f p l a s m i d
v e c t o rs o f m u t a n t s ( C 1 9 3 A , C 2 0 7 A , C 2 6 2 A , a n d C 2 6 8 A ) b y s i t e -d i re c t e d
mu t a ge n e s i s m e th o d
P r i m e rs
S e q u e n ce s
C 1 9 3 A -F
5 ’ - G A A C C A AT G GC C GC T G G T GA A G GT G - 3 ’
C 2 0 7 A -F
5 ’ - C C C T C G GA G G A A GC C T C T GC TAT G GA A - 3 ’
C 2 6 2 A -F
5 ’ - C A G GA A G GAT GC T GA A G GT G GC A A - 3 ’
C 2 6 8 A -F
5 ’ - G G T G GC A AT T T G GC C TA C C C A A C GT- 3 ’
p r c1 - i n s i d e -R
5 ’ - C C T T C A C A AT C C T T C C T GATAT C -3 ’
C Y C 1 Te r mi n a t i o n
5 ’ - A G GT T G T C TA A C T C C T T C C - 3 ’
E a ch p r i m e r wa s u s e d a s th e f o r w a rd p r i m e rs f o r m u ta g e n e s i s o f C ys t o
Ala.
T h e s e q u e n c e o f e a c h f o r w a rd p r i m e r i s o n l y s h o w n .
s i t e s a r e i n d i c a te d b y d o u b l e - u n d e rl i n e s .
50
M u t a ti o n
(A)
1
2
3
4
1
2
3
4
(B)
F i g . 3 - 2 We s t e r n b l o t ti n g o f mu t a n t s e xp r e s s e d i n y e a s t c e l l s (A ) a n d
a c t i va t e d a n d p u r i fi e d ma t u re m u ta n ts ( B )
Ye a s t c e l l s a f te r i n d u c i b l e c u l ti v a ti o n w e r e l y s e d i n S D S -PA GE s a mp l e
buffer and boiled.
T h e s u p e r n a t a n t w a s a n a l y z e d b y We s t e rn b l o t t i n g .
C e l l l y s a t e o f ye a s t e xp r e s s i n g mu t a n t s w a s f r a c t i o n a t e d b y a m m o n i u m
s u l f a t e a n d w a s s u b j e c t e d t o T O Y OP E A R L B u t y l -6 5 0 M c o l u mn .
e a ch e l u a t e wa s a n a l y z e d b y We s t e r n b l o t ti n g .
The
R a b b i t p o l y cl o n a l
a n ti - C P Y a n ti s e r u m ( 1 : 1 0 , 0 0 0 ) a n d h o r s e r a d i s h p e r o xi d a s e - co n j u g a te d
a n ti - r a b b i t I g G s e c o n d a r y a n ti b o d y ( 1 : 1 0 0 , 0 0 0 ) w e re u s e d i n We s t e rn
b l o t ti n g .
(A ) ( B ) L a n e 1 , C 1 9 3 A ; l a n e 2 , C 2 0 7 A ; l a n e 3 , C 2 6 2 A ; l a n e 4 , C 2 6 8 A
51
Ta b l e 3 -2 R e l a t i ve s p e c i f i c a c ti v i t y o f wi l d - t yp e a n d m u t a n t C P Y s
t o wa rd Z -P h e - L e u - O H a n d B T p N A
CPY
Z - P h e -L e u - O H a
BTpNAb
WT
(100)
(100)
C262A
C268A
a
8.5
16
1.8
1.9
E n z y m e r e a c ti o n w a s p e r f o rm e d w i th 1 mM Z -P h e - L e u - O H a t p H 7 . 0 a t
ro o m t e mp e r a t u r e a n d t h e a m o u n t o f r e l e a s e d L -L e u w a s d e t e c t e d b y
U - HP L C .
b
E n z y me r e a c t i o n w a s p e r fo r m e d wi t h 0 . 3 m M B T p N A a t p H 7 .0 a t ro o m
t e m p e r a tu r e a n d A 4 1 0 w a s mo n i t o re d s p e c t ro p h o t o m e tr i ca l l y.
52
Ta b l e 3 - 3 T h e p o te n ti a l e n e r g y, v a n d e r Wa a l s e n e r g y, a n d e l e c t ro s ta t i c e n e r g y o f w i l d - t yp e a n d mu t a n t C P Y s
P DB m o d e l o f W T (P D B I D : 1 Y SC ) w a s o p t i mi z e d u s i n g ‘ Mi n i mi z a t i o n ’ p r o t o c o l w i th C HA R M m f o r c e f i e l d .
C o n f o r ma t i o n o f e a c h mu t a n t w a s co n s t r u c t e d b a s e d o n t h e mi n i m i ze d W T mo d e l a n d w a s o p t i mi z e d .
Each
e n e rg y p a r a me t e r w a s c a l c u l a t e d b a s e d o n C HA R M m f o rc e f i e l d .
Potential energy (kcal/mol)
v a n d e r Wa a l s e n e r g y ( k ca l / m o l )
E l e c t r o s t a ti c e n e r g y ( k c a l / m o l )
Va l u e
Di f f e r e n c e
Va l u e
Di f f e r e n c e
Va l u e
Di f f e r e n c e
WT
-28483.8
―
-2838.3
―
-29477.5
―
C193A
-27967.0
5 1 6 .8
-2812.4
25.9
-29056.3
421.2
C207A
-27982.0
5 0 1 .8
-2821.3
17.0
-29053.3
424.2
C262A
-27976.5
5 0 7 .3
-2818.8
19.5
-29052.1
425.4
C268A
-28001.3
4 8 2 .5
-2824.6
13.7
-29066.4
441.1
53
第 4 章
V 字ヘリックスの先端付近のアミノ酸置換が立体構造及
び基質特異性に及ぼす影響
4 .1 . 緒 論
結晶構造を観察すると，V 字ヘリックスは活性中心ポケットを覆うよう
に 位 置 し て い る こ と が わ か る ( F i g . 1 - 2 ) ．基 質 が 活 性 中 心 へ 進 入 す る た め に
は，V 字ヘリックスは結晶時の状態から動く必要があると思われる．第 3
章 の 結 果 よ り ， 蝶 番 様 ジ ス ル フ ィ ド 結 合 (C ys 1 9 3 - C y s 2 0 7
及 び
Cys262-Cys268)の 固 定 が CPY の フ ォ ー ル デ ィ ン グ 及 び 触 媒 活 性 に 重 要 で
あ る こ と が 示 さ れ た こ と か ら ，こ れ ら の 結 合 を 基 点 と し て V 字 ヘ リ ッ ク ス
は 動 く こ と が 予 想 さ れ る ． C P Y の 属 す る α / β h yd r o l a s e 型 の フ ォ ー ル デ ィ
ングパターンを示す多くのリパーゼにおいて，インサートドメインの一部
で あ る lid 構 造 が 活 性 中 心 へ の 基 質 の 接 触 を 調 節 す る こ と が 報 告 さ れ て い
る ( 4 8 -5 1 ) ． し か し ， C P Y に 関 し て 基 質 の 取 り 込 み 時 の V 字 ヘ リ ッ ク ス の
挙 動 に つ い て は こ れ ま で 注 目 さ れ て お ら ず ，実 際 に 動 く の か ど う か ，ま た ，
動く際はどのような挙動をするのかなど不明な点は多い．また，推定され
て い る 基 質 認 識 部 位 (S1’， S1~S5 サ ブ サ イ ト )の う ち ， V 字 ヘ リ ッ ク ス の 一
部 の ア ミ ノ 酸 残 基 が S3 及 び S5 サ ブ サ イ ト に 含 ま れ る こ と が わ か っ た (Fig.
4 -1 ) ( 3 6 ) ． こ の こ と か ら ， V 字 ヘ リ ッ ク ス は 酵 素 反 応 時 に は 活 性 中 心 に 接
近し基質認識に関与すると考えられる．
そこで，V 字ヘリックスが基質を取り込む際に何らかの挙動を示すもの
と仮定し，V 字の先端と活性中心のあるコアドメインとを新規のジスルフ
54
ィ ド 結 合 を 形 成 さ せ る こ と で V 字 ヘ リ ッ ク ス の 固 定 化 を 計 画 し た ．ジ ス ル
フ ィ ド 結 合 を 形 成 さ せ る た め に は 両 者 の ア ミ ノ 酸 を Cys に 置 換 す る 必 要 が
ある．結晶時の立体構造をもとに，両者間で距離の近いアミノ酸残基の組
み 合 わ せ を D i s c o v e r y S tu d i o ® 2 .5 . 5 上 で 検 討 し た 結 果 ， Ty r2 2 5 及 び
P r o 3 1 5 ， ま た ， G l n 2 2 4 及 び Ly s 3 1 4 の 2 組 に つ い て C ys へ の 置 換 を 行 う
こ と と し た ． 本 章 で は ， 部 位 特 異 的 変 異 導 入 法 に よ り 実 際 の Cys 置 換 体
( Y 2 2 5 C ， P 3 1 5 C ， Y 2 2 5 C / P 3 1 5 C ， Q 2 2 4 C ， K 3 1 4 C ， Q 2 2 4 C / K3 1 4 C ) の 作 製
を 試 み た ． ま た ， 置 換 導 入 に 選 択 し た 部 位 に つ い て C ys 以 外 の ア ミ ノ 酸 に
置 換 し た 変 異 体 CPY (Y225A， Y225F， P315S， P315G)を 作 製 し ， 置 換 部
位の影響について検討した．
55
4 .2 . 実 験 材 料 及 び 実 験 方 法
4 .2 . 1 . 実 験 材 料
E . c ol i J M 1 0 9 株 は タ カ ラ バ イ オ 社 か ら 購 入 し ， S . c e r e vi si ae
B Y 4 7 4 1 p r c1 Δ 株 は T h e r mo F i s h e r S ci e n t i fi c 社 か ら 購 入 し た ．そ れ ぞ れ の
菌 体 の 遺 伝 子 型 は Ta b l e 2 . 2 に 示 し た ． ク ロ ー ニ ン グ ベ ク タ ー p GE M -T
E a s y Ve c t o r は P r o m e g a 社 か ら 購 入 し ， Q u i kC h a n g e Si t e - Di r e ct e d
Mu t a g e n e s i s Ki t は A g i l e n t Te ch n o l o gi e s 社 か ら 購 入 し た ． B l e n d Ta q 及
び Taq D N A P o l y m e r a s e は そ れ ぞ れ 東 洋 紡 社 及 び N e w E n g l a n d B i o l a b s
社 か ら 購 入 し た ． 各 種 制 限 酵 素 は R o ch e 社 ， タ カ ラ バ イ オ 社 ， 東 洋 紡 社 製
のものを使用した．疎水性相互作用クロマトグラフィーに使用した
T O Y OP E A R L B u t y l - 6 5 0 M は 東 ソ ー 社 か ら 購 入 し た ． Q u i ck S t a r t
B r a d fo r d P r o te i n A s s a y K i t は B i o - R a d 社 か ら 購 入 し た ． 合 成 基 質 で あ る
N - b e n z o yl - L - t yr o s i n e p - n i t r o a n i l i d e ( B T p N A ) は Si g m a -A l d r i ch 社 製 を 使
用 し ， b e n z y l o x y c a r b o n y l -L -p h e n i l a l a n yl -L - l e u ci n e ( Z -P h e - L e u - O H ) 及 び
b e n z yl o x yc a r b o n y l -L -p h e n i l a l a n yl - L -p ro l i n e ( Z -P h e - P r o - O H ) は B a ch e m
社 製 を ， ま た ， N - a c e t yl -L - t y r o s i n e e th y l e s t e r ( A c - Ty r- OE t ) は ペ プ チ ド
研究所製を使用した．本実験で使用したオリゴヌクレオチドプライマーは
日本バイオサービス社及びオペロンバイオテクノロジー社に合成を依頼し
た．その他の試薬においては，特に記載のない限り，和光純薬社及びナカ
ライテスク社の特級試薬を用いた．
56
4 .2 . 2 . 実 験 方 法
4 .2 . 2 . 1 . 分 子 モ デ リ ン グ ソ フ ト ウ ェ ア を 用 い た 変 異 導 入 箇 所 の 検 討
分 子 モ デ リ ン グ は A c c e l r ys 社 の D i s c o v e r y S t u d i o ® 2 . 2 .5 を 用 い て 行 っ
た ．活 性 中 心 を 含 む コ ア ド メ イ ン と V 字 ヘ リ ッ ク ス 間 で 新 た に ジ ス ル フ ィ
ド結合を形成させることで V 字ヘリックスを固定化させることを計画した．
両 者 間 で ジ ス ル フ ィ ド 結 合 を 形 成 さ せ る た め に ， Cys へ の 置 換 残 基 を
Di s co v e r y S tu d i o ® 2 . 5 .5 上 で 検 討 し た ．成 熟 型 C P Y の 立 体 構 造（ P DB I D :
1 Y SC ） を 表 示 さ せ ， 活 性 中 心 を 含 む コ ア ド メ イ ン と V 字 ヘ リ ッ ク ス を 構
成 す る ア ミ ノ 酸 残 基 の C β の 距 離 を モ ニ タ リ ン グ し た ．2 残 基 間 に お い て ア
ミ ノ 酸 残 基 の 側 鎖 が 互 い に 向 き 合 い ， 且 つ 距 離 の 近 い (お よ そ 6 Å ま で )組
み合わせを抽出した．
4 .2 . 2 . 2 . C ys 置 換 体 の 作 製
4 . 2 . 2 . 1 . で の 検 討 に よ り ，Ty r 2 2 5 及 び P r o 3 1 5 ，ま た ，G l n 2 2 4 及 び Lys 3 1 4
の 2 組 に つ い て Cys へ の 置 換 を 行 う こ と と し た ． 野 生 型 CPY の 発 現 ベ ク
タ ー p LT C V 5 H G WT を テ ン プ レ ー ト ， Ta b l e 4 - 1 に 示 す オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ
ド プ ラ イ マ ー を 用 い ， Qu i kC h a n g e Si t e - Di r e c te d Mu t a g e n e s i s ki t に 従 っ
て 目 的 箇 所 に D N A 変 異 を 導 入 し ，各 変 異 体 ( Y 2 2 5 C ，P 3 1 5 C ，Y 2 2 5 C /P 3 1 5 C ，
Q 2 2 4 C ， K3 1 4 C ， Q 2 2 4 C / K 3 1 4 C ) の 発 現 ベ ク タ ー を 作 製 し た ． 目 的 箇 所 の
DN A 変 異 の 導 入 は D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 に よ り 確 認 し た ．
作 製 し た プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー を B Y 4 7 4 1 p r c1 Δ 株 へ 酢 酸 リ チ ウ ム 法 に て
導 入 し ， SD(-ura)プ レ ー ト 培 地 上 で 形 質 転 換 体 を ス ク リ ー ニ ン グ し た ． 形
57
質 転 換 体 を YPD 液 体 培 地 で OD600>1 に な る ま で 28 °C で 振 と う 培 養 し ，
そ の 後 0 . 5 M N a C l を 添 加 し ， 2 0 °C で 3 日 間 誘 導 培 養 し た ． 菌 体 を 回 収
し ， 0 . 2 m l / g w e t c e l l の ク ロ ロ ホ ル ム 及 び 0 . 4 ml / g w e t c e l l の ミ リ Q 水 を
加 え ， pH 7.0 を 保 ち 室 温 で 16 時 間 撹 拌 さ せ な が ら 自 己 溶 菌 さ せ た ． 遠 心
分 離 後 の 上 清 に 対 し て 硫 安 分 画 を 行 い ， 20-90%の 画 分 の 沈 殿 を 回 収 し た ．
3 ml / g p p t の 5 0 mM s o d i u m a c e ta t e b u f f e r ( p H 5 . 0 ) で 沈 殿 を 再 溶 解 さ せ ，
p H 5 . 0 を 保 ち な が ら 室 温 で 1 8 時 間 放 置 さ せ る こ と で ， p ro - C P Y を 成 熟 化
さ せ た ． 遠 心 分 離 後 の 上 清 を 5 倍 量 の 1 0 mM s o d i u m p h o s p h a te b u f f e r ，
2 M a m mo n i u m s u l f a te ( p H 7 .0 ) と 混 合 し ， 同 b u f f e r で 十 分 に 平 衡 化 さ せ
た T OY OP E A R L B u t yl - 6 5 0 M カ ラ ム ( 1 . 5 × 5 c m ) に 通 し た ． 1 0 mM s o d i u m
p h o s p h a t e b u f f e r, 0 . 1 M a m m o n i u m s u l f a te ( p H 7 .0 ) で レ ジ ン を 洗 い ， 1 0
mM s o d i u m p h o s p h a te b u f f e r ( p H 7 . 0 ) で C P Y を 溶 出 さ せ た ． 溶 出 液 は
ce n t ri c o n Y M - 1 0 を 用 い て 2 倍 に 濃 縮 さ せ ，5 0 ° C で 1 0 分 間 熱 処 理 さ せ た ．
遠心分離後の上清を精製酵素液とした．
4 .2 . 2 . 3 . Ty r 2 2 5 及 び P r o 3 1 5 の 置 換 体 の 作 製
Ty r2 2 5 及 び P r o 3 1 5 の 置 換 が C P Y に ど の よ う な 影 響 を 及 ぼ す か を 検 証
す る た め に ， 別 の 置 換 体 (Y225A ， Y225F ， P315S ， P315G) の 作 製 を 試 み
た ． 各 変 異 体
C P Y に 対 す る 発 現 用 ベ ク タ ー p LT C V 5 H G Y 2 2 5 A ，
p LT C V 5 H GY 2 2 5 F ， p LT C V 5 H GP 3 1 5 S ， p LT C V 5 H GP 3 1 5 G の 構 築 及 び 発
現・精 製 は 前 項 に 示 し た も の と 同 様 の 方 法 で 行 っ た ．D N A 変 異 の 導 入 の 際
に 用 い た オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド プ ラ イ マ ー は Ta b l e 4 - 1 の 通 り で あ る ．
58
4 .2 . 2 . 4 . タ ン パ ク 質 定 量
溶 液 内 の タ ン パ ク 質 量 は ， b o vi n e s e ru m a l b u m i n を 標 準 タ ン パ ク 質 と
し て Q u i c k S t a r t B r a d f o r d P ro t e i n A s s a y K i t を 用 い て 定 量 し た ． 実 際 の
手順はキットの取扱説明書の記述に従った．
4 .2 . 2 . 5 . S D S - PA GE 及 び We s te r n b l o t ti n g
変 異 体 C P Y の 発 現 及 び 精 製 段 階 は S D S - PA GE 及 び We s t e rn b l o t ti n g に
よ り 確 認 し た ． 実 際 の 手 順 は 2.2.2.9.に 記 載 の 通 り で あ る ． 抗 体 に は ， 一
次 抗 体 に 1 0 , 0 0 0 倍 希 釈 し た A n ti - C P Y a n t i s e ru m ( 本 研 究 室 保 有 品 ) ，二 次
抗 体 に
100,000
倍 希 釈 し た
horseradish
p e r o xi d a s e - c o n j u g a te d
a n ti - r a b b i t I g G s e c o n d a r y a n ti b o d y ( G E H e a l t h c a re 社 製 ) を 用 い た ． 化
学 発 光 試 薬 は I m m u n o S ta r L D ( 和 光 純 薬 社 製 ) を 用 い た ．
4 .2 . 2 . 6 . 酵 素 活 性 の 測 定
可 溶 性 タ ン パ ク 質 と し て 精 製 さ れ た 変 異 体 C P Y に 対 し て ，ペ プ チ ダ ー ゼ
活 性 及 び ア ニ リ ダ ー ゼ 活 性 を 測 定 し た ． 10 mM sodium phosphate buffer
(p H 7 .0 ) 内 で 精 製 酵 素 3 . 5 μ g を 1 m M の Z - P h e -L e u - O H と 混 合 さ せ ，室 温
で 5 分 間 放 置 し ， そ の 後 60 % PCA を 加 え て 反 応 を 停 止 さ せ た ． 遠 心 分 離
後 の 上 清 を 4 - F l u o r o - 7 -n i tr o - 2 , 1 ,3 - b e n z o x a d i a z o l e ( N -B DF ) と 6 0 ° C で 1
分 間 反 応 さ せ る こ と で 誘 導 体 化 さ せ ， L a C h r o mU l t r a U - HP L C s y s te m ( 日
立 ハ イ テ ク 社 製 ) を 用 い て ア ミ ノ 酸 分 析 を 行 っ た ．H 型 ア ミ ノ 酸 標 準 液 を 基
準 に し て Z - P h e -L e u - OH の 加 水 分 解 産 物 で あ る L -L e u の 生 成 量 を 算 出 し ，
各変異体酵素のペプチダーゼ活性を求めた．アニリダーゼ活性は，アニリ
59
ド 基 質 B T p N A を 用 い て 評 価 し た ( 2 1 , 4 1 ) ．0 . 1 M s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r
(p H 7 . 0 ) 内 で 1 0 ~ 2 0 μ g / m l 酵 素 液 と D M F に 溶 解 し た 0 . 3 m M B T p N A 溶 液
を 混 合 さ せ ，U -2 0 0 0 A 分 光 光 度 計 ( 日 立 社 製 ) に よ り 室 温 で 5 分 間 A 4 1 0 を モ
ニ タ リ ン グ し た ． 加 水 分 解 産 物 で あ る p - n i r to a n i l i n e の 生 成 量 か ら 組 換 え
体 CPY の ア ニ リ ダ ー ゼ 活 性 を 算 出 し た ．
4 .2 . 2 . 7 . P 3 1 5 G に 対 す る 酵 素 反 応 速 度 論 的 解 析
P 3 1 5 G に つ い て 触 媒 活 性 を 検 証 す る た め に ，ペ プ チ ド 基 質 ，ア ニ リ ド 基
質 ，エ ス テ ル 基 質 に 対 す る 酵 素 反 応 速 度 論 的 解 析 を 行 っ た ( 1 9 , 2 1 ) ．ペ プ チ
ド 基 質 に は Z -P h e - L e u - O H 及 び Z -P h e - P r o - OH を 用 い ， 5 0 m M s o d i u m
p h o s p h a t e b u f fe r
(pH
7.0) 環 境 下 ， 室 温 で 酵 素 反 応 を 行 っ た ．
L a C h r o mU l t r a U - H P L C s ys t e m ( 日 立 ハ イ テ ク 社 製 ) を 用 い て N - B DF に よ
る誘導体化後の反応液中のアミノ酸を分析し，H 型アミノ酸標準液の分析
結 果 を 基 準 に し て 酵 素 反 応 生 成 物 で あ る L-Leu 及 び L-Pro の 生 成 量 を 算 出
し た ．ア ニ リ ド 基 質 に は B T p N A を 用 い ，1 0 0 m M s o d i u m p h o s p h a t e b u f fe r
(p H 7 .0 ) 環 境 下 ， 室 温 で 酵 素 反 応 を 行 っ た ． 分 光 光 度 計 に よ り A 4 1 0 を モ ニ
タ リ ン グ し ， 反 応 生 成 物 p -n i t ro a n i l i n e の 生 成 量 を 算 出 し た ． エ ス テ ル 基
質 に は A c - Ty r- OE t を 用 い ， 5 0 mM s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r (p H 8 . 0 ) 環
境 下 ，室 温 で 酵 素 反 応 を 行 っ た ．分 光 光 度 計 に よ り A 2 3 7 を モ ニ タ リ ン グ し ，
A c - Ty r- OE t の 分 解 量 を 算 出 し た ．各 基 質 に 対 す る 速 度 パ ラ メ ー タ ( k c a t 値 ，
K m 値 ， k c a t / K m 値 ) は M i c h a e l i s - Me n t e n 式 及 び H a n e s - Wo o l f p l o t を 用 い
てそれぞれ算出した．
60
4 .3 . 結 果
4 .3 . 1 . 分 子 モ デ リ ン グ ソ フ ト ウ ェ ア を 用 い た 変 異 導 入 箇 所 の 検 討
V 字 ヘ リ ッ ク ス 及 び コ ア ド メ イ ン の ア ミ ノ 酸 残 基 間 の Cβ の 距 離 を
Di s co v e r y S tu d i o ® 2 . 5 .5 上 で 算 出 し た 結 果 ，Ty r 2 2 5 及 び P ro 3 1 5 間 に お い
て 4 . 5 Å と 最 短 で あ り ，次 い で ，G l n 2 2 8 及 び Lys 3 1 4 間 が 近 距 離 で あ り 5 . 8
Å で あ っ た (Fig. 4-2)． よ っ て ， こ の 2 つ の ア ミ ノ 酸 残 基 の 組 み 合 わ せ で
C ys の 導 入 を 実 施 す る こ と と し た ．
4 .3 . 2 . C ys 置 換 体 の 発 現 ・ 精 製 及 び 酵 素 活 性
4 . 3 . 1 . で 検 討 し た ア ミ ノ 酸 残 基 の C ys 置 換 体 の 作 製 を 計 画 し た ． 新 規 の
ジスルフィド結合の形成を目指すため，それぞれの残基の組み合わせにつ
い て C ys の 二 重 変 異 体 ( Y 2 2 5 C / P 3 1 5 C 及 び Q 2 2 8 C / K 3 1 4 C ) ， ま た ， 各 残 基
の C ys 導 入 に よ る 影 響 を 評 価 す る た め に 単 一 変 異 体 ( Y 2 2 5 C ， P 3 1 5 C ，
Q 2 2 8 C ，K 3 1 4 C ) も 同 様 に 作 製 す る こ と に し た ．そ れ ぞ れ の 変 異 体 に 対 す る
発 現 ベ ク タ ー を 部 位 特 異 的 変 異 導 入 法 に よ り 構 築 し た ．D N A シ ー ク エ ン ス
解 析 に よ り ， 目 的 部 位 の DNA 変 異 が そ れ ぞ れ 確 認 さ れ た ． こ れ ら の 発 現
ベクターを用いて酵母を形質転換し，誘導培養を行った結果，いずれの変
異 体 CPY も 細 胞 内 に 発 現 し て い る こ と が 確 認 さ れ た (Fig. 4-3 (A))． し か
し ， 精 製 の 結 果 ， Q228C 及 び K314C に つ い て は 可 溶 性 タ ン パ ク 質 と し て
精 製 さ れ た の に 対 し ， 二 重 変 異 体 (Y225C/P315C 及 び Q228C/K314C ) ，
Y 2 2 5 C ， P 3 1 5 C に つ い て は 精 製 過 程 で 凝 集 し た ( F i g . 4 -3 (B ) ) ． こ の 結 果 か
ら ，凝 集 し た 変 異 体 C P Y で は フ ォ ー ル デ ィ ン グ が 正 し く 行 わ れ て い な か っ
61
たことが示唆された．いずれの二重変異体においても凝集したことから，
V 字 ヘ リ ッ ク ス 上 あ る い は 周 辺 で の 過 剰 な Cys の 存 在 が フ ォ ー ル デ ィ ン グ
に影響を及ぼすことが示唆される．つまり，V 字ヘリックス及びコアドメ
イン間で自主的に新規のジスルフィド結合を形成させることは困難であろ
うと考えられる．
一 方 ， Q228C 及 び K314C に つ い て は 可 溶 性 タ ン パ ク 質 と し て 精 製 さ れ
た こ と か ら ，G l n 2 2 8 及 び Lys 3 1 4 を C y s に 置 換 す る こ と そ の も の が フ ォ ー
ル デ ィ ン グ に 影 響 す る わ け で は な い こ と が 考 え ら れ る ．対 し て ， Y 2 2 5 C 及
び P 3 1 5 C は い ず れ も 二 重 変 異 体 と 同 様 に 凝 集 し た こ と か ら ， Tyr 2 2 5 及 び
Pro315 の ア ミ ノ 酸 置 換 が 立 体 構 造 を 変 化 さ せ る こ と が 示 唆 さ れ る ．
4 .3 . 3 . Q 2 2 8 C 及 び K 3 1 4 C の 酵 素 活 性
可 溶 性 タ ン パ ク 質 と し て 精 製 さ れ た Q 2 2 8 C 及 び K3 1 4 C に つ い て ，
Z - P h e -L e u - O H に 対 す る ペ プ チ ダ ー ゼ 活 性 及 び B T p N A に 対 す る ア ニ リ ダ
ー ゼ 活 性 を 測 定 し た ． そ の 結 果 ， 両 変 異 体 と も ， い ず れ の 活 性 も WT と 比
較 し て ほ ぼ 半 減 す る こ と が 判 明 し た ( Ta b l e 4 - 2 ) ． こ の 結 果 か ら ， G l n 2 2 8
及 び Lys 3 1 4 の C y s へ の 置 換 は 酵 素 活 性 に 影 響 を 及 ぼ す こ と が 示 唆 さ れ た ．
4 .3 . 4 . Ty r 2 2 5 及 び P r o 3 1 5 の ア ミ ノ 酸 置 換 の 影 響
4 . 3 . 2 . に て ， Ty r 2 2 5 及 び P ro 3 1 5 の C y s 置 換 体 は い ず れ も 凝 集 す る こ と
が判明した．この結果がこれらのアミノ酸が変化したことによるものであ
る の か ，あ る い は Cys の 導 入 に よ る も の で あ る の か を 調 べ る た め に ，こ の
2 つ の 残 基 に つ い て 他 の ア ミ ノ 酸 置 換 体 ( Y 2 2 5 A ，Y 2 2 5 F ，P 3 1 5 S ，P 3 1 5 G )
62
を作製し，影響を検討した．その結果，すべての置換体が酵母内で誘導発
現 し て い る こ と が 確 認 さ れ た が ，Y 2 2 5 A 及 び Y 2 2 5 F は Y 2 2 5 C と 同 様 に 凝
集 す る こ と が 判 明 し た ( F i g . 4 - 4 ) ． こ の こ と か ら ， 2 2 5 番 の ア ミ ノ 酸 が Ty r
であることが正しいフォールディングにおいて重要であることが示唆され
た ． 一 方 ， P315S 及 び P315G は 可 溶 性 タ ン パ ク 質 と し て 精 製 さ れ た こ と
か ら ，P 3 1 5 C の 凝 集 の 原 因 は C y s の 導 入 に よ る も の で あ る こ と が 示 唆 さ れ
た．
4 .3 . 5 . P 3 1 5 S 及 び P 3 1 5 G の 酵 素 活 性
可 溶 性 タ ン パ ク 質 と し て 精 製 さ れ た P315S 及 び P315G に つ い て ，
Z - P h e -L e u - O H に 対 す る ペ プ チ ダ ー ゼ 活 性 及 び B T p N A に 対 す る ア ニ リ ダ
ー ゼ 活 性 を 測 定 し た ． そ の 結 果 ， P315S に お い て は ， WT と 比 較 し て い ず
れ の 活 性 も 半 減 し た ．一 方 ，P315G で は ，ペ プ チ ダ ー ゼ 活 性 は 半 減 す る の
に 対 し ， ア ニ リ ダ ー ゼ 活 性 の 上 昇 が 認 め ら れ た ( Ta b l e 4 - 3 ) ． こ れ ら の 結 果
か ら ， Pro315 の 置 換 が 酵 素 活 性 に 影 響 し ， さ ら に ， P315G に お い て 基 質
特異性が変化することが示唆された．
4 .3 . 6 . P 3 1 5 G の 酵 素 反 応 速 度 論 的 解 析
4 . 3 . 5 . の 結 果 か ら ，P 3 1 5 G に お い て 基 質 特 異 性 の 変 化 が 示 唆 さ れ た た め ，
ペ プ チ ド 基 質 ( Z - P h e - L e u - O H 及 び Z - P h e - P r o - O H ) ，ア ニ リ ド 基 質 ( B T p N A ) ，
エ ス テ ル 基 質 ( A c - Ty r- OE t ) に 対 す る P 3 1 5 G の 酵 素 反 応 速 度 論 的 解 析 を 行
っ た ． そ の 結 果 ， ア ニ リ ド 基 質 に 対 し て は WT と 比 較 し て 基 質 と の 親 和 性
及び触媒活性について大きな差は見られなかった．一方，ペプチド基質に
63
対 し て は ，触 媒 活 性 (kcat/Km)の 明 ら か な 低 下 が 認 め ら れ た ． こ れ は ， 分 子
活 性 ( k c a t ) の 低 下 に よ る も の で あ っ た ．ま た ，エ ス テ ル 基 質 に 対 し て も ，ペ
プチド基質と同様に分子活性の低下により，触媒活性が低下した．これら
の 結 果 か ら ，P 3 1 5 G に お い て ，ア ニ リ ド 基 質 に 対 す る 触 媒 活 性 の み 保 持 さ
れ る こ と が 示 唆 さ れ た (Ta b l e 4 -4 ) ．
64
4 .4 . 考 察
R N a s e A を 用 い た C . B . A n f i n s e n ら の 研 究 か ら ，活 性 を も つ 天 然 状 態 の
構造が熱力学的に最安定であることからタンパク質はアンフォールド状態
からただ 1 通りの組み合わせの適切なジスルフィド結合を形成し正しくフ
ォ ー ル デ ィ ン グ す る こ と が で き る こ と が 示 さ れ た (52)． ま た ， CPY に お い
て も ，変 性 状 態 か ら 活 性 を 保 持 し た C P Y の 再 生 が 可 能 で あ る こ と が 報 告 さ
れ て お り ， リ フ ォ ー ル デ ィ ン グ 過 程 で の 律 速 段 階 で あ る が 成 熟 領 域 に 11
個 存 在 す る C ys 残 基 の う ち 適 切 な 組 み 合 わ せ で 5 つ の ジ ス ル フ ィ ド 結 合 が
形 成 さ れ る (6)．し か し ，本 章 の 結 果 か ら ，V 字 ヘ リ ッ ク ス 上 も し く は そ の
近 傍 に た っ た 1 つ Cys が 増 え た だ け で ミ ス フ ォ ー ル デ ィ ン グ が 引 き 起 こ さ
れ る こ と が 判 明 し た ． さ ら に ， V 字 ヘ リ ッ ク ス 上 の ア ミ ノ 酸 残 基 ( Ty r 2 2 5 )
に 対 し て C ys 以 外 の ア ミ ノ 酸 へ の 置 換 ( Ty r → A l a も し く は P h e ) に よ っ て も
同 様 に フ ォ ー ル デ ィ ン グ の 致 命 的 な 影 響 が 見 ら れ た ． つ ま り ， Cys に よ ら
ず V 字 ヘ リ ッ ク ス 上 の ア ミ ノ 酸 残 基 が CPY の 立 体 構 造 形 成 に 関 与 す る こ
と が 示 さ れ ， こ れ は CPY の フ ォ ー ル デ ィ ン グ に お け る V 字 ヘ リ ッ ク ス 部
位の重要性を立証するものである．
C P Y の 触 媒 活 性 に 関 わ る 残 基 つ い て ，部 位 特 異 的 変 異 導 入 法 を 用 い た 研
究 か ら こ れ ま で 数 多 く 報 告 さ れ て い る が ，い ず れ も c a t a l y ti c t ri a d 付 近 や
S1’，S1 サ ブ サ イ ト 付 近 に 関 す る 研 究 が 主 で あ っ た ．一 方 ，本 章 で は ，V 字
構造の先端もしくは近傍という，活性中心とは直接関係しないと思われる
残 基 ( G l n 2 2 8 及 び Lys 3 1 4 ) が 加 水 分 解 能 に 関 わ る こ と を 明 ら か に し た ． V
字 ヘ リ ッ ク ス が 活 性 中 心 を 覆 う よ う に 位 置 し て い る こ と ， Gln228 が 触 媒
65
活 性 に 関 与 し て い る こ と ， そ し て 基 質 認 識 部 位 で あ る S3 及 び S5 サ ブ サ イ
ト が V 字 構 造 の 一 部 で あ る こ と と 合 わ せ ，V 字 ヘ リ ッ ク ス の 開 閉 及 び 触 媒
反応への関与についての推測が確からしいものとなったと考える．
タ ン パ ク 質 を 構 成 す る ア ミ ノ 酸 に つ い て ， Pro や Gly は 二 次 構 造 を 壊 す
傾 向 の 強 い 残 基 ( s e c o n d a r y s t ru c tu r e b re a k e r ) と し て 知 ら れ て お り ， P r o
は 主 鎖 構 造 の 形 成 を 制 限 し ， Gly は 側 鎖 が 極 小 で あ る た め 主 鎖 構 造 を 柔 軟
に す る ( 5 3 - 5 6 ) ．こ の こ と を 利 用 し て ，不 安 定 な タ ン パ ク 質 に お い て G l y を
P r o に 置 換 す る こ と で 安 定 化 さ せ る こ と が よ く 試 み ら れ る ( 5 7 - 5 9 ) ．本 章 で
は ，P r o 3 1 5 の 置 換 に よ る 主 鎖 構 造 の 揺 ら ぎ が フ ォ ー ル デ ィ ン グ ，酵 素 活 性 ，
基 質 特 異 性 に つ い て CPY 分 子 に さ ま ざ ま な 影 響 を 及 ぼ す こ と が 明 ら か と
な っ た ．こ の 置 換 に よ り 生 じ た 揺 ら ぎ は ，接 近 す る V 字 ヘ リ ッ ク ス に も 何
らかの影響を及ぼしていることが推測される．本章で得られた結果を通し
て，V 字ヘリックス上，もしくは近傍の環境変化がフォールディングや触
媒 活 性 な ど に 影 響 し て お り ，C P Y の 機 能 に つ い て V 字 ヘ リ ッ ク ス が 重 大 な
関わりをもつことが示された．
66
Hydrogen bond
network
S1’
S1
S3
S2
S4
S5
F i g . 4 - 1 Su b s t r a te b i n d i n g s i t e s o f C P Y mo l e c u l e
Su b s t r a t e s a r e r e c o gn i z e d b y h yd r o ge n b o n d n e t w o r k t h a t i n te r a c t s
wi t h th e C - t e r m i n a l c a r b o x y l a t e g ro u p , S 1 ’ a n d S 1 s u b s i te s th o s e
a c c o mm o d a t e a m i n o a c i d s i d e ch a i n s o f t h e s u b s tr a t e , P 1 ’ a n d P 1 , a n d
additional subsites, S 2~S5.
C o l o r e d s u r fa c e o f r e s i d u e s t h a t c o mp ri s e
h y d r o g e n b o n d n e t w o r k a n d e a ch s u b s i t e a r e s h o wn .
67
(A)
(B)
Lys314
Tyr225
Pro315
Gln228
F i g . 4 - 2 P o s i ti o n o f r e s i d u e s r e p l a c e d b y C y s
Tw o p a i r s o f r e s i d u e s ( Ty r 2 2 5 a n d P r o 3 1 5 (A ) , a n d G l n 2 2 8 a n d Lys 3 1 4 ( B ) ) w e r e s e l e c t e d f o r r e p l a c e me n t b y C ys .
T h e d i s t a n c e o f C β a to ms o f Tyr 2 2 5 a n d P r o 3 1 5 w a s 4 . 5 Å a n d th a t o f G l n 2 2 8 a n d Ly s 3 1 4 w a s 5 . 8 Å .
helix was colored in green.
68
V-s h a p e
Ta b l e 4 - 1 O l i g o n u c l e o t i d e p ri m e r s u s i n g f o r c o n s tr u c ti o n o f p l a s m i d
v e c t o rs o f C y s s u b s t i tu t i n g m u ta n ts ( Y 2 2 5 C , P 3 1 5 C , Y 2 2 5 C /P 3 1 5 C ,
Q 2 2 8 C , K 3 1 4 C , a n d Q 2 2 8 C / K 3 1 4 C ) a n d Ty r2 2 5 a n d P r o 3 1 5 re p l a c e d
mu t a n t s
(Y 2 2 5 A ,
Y 2 2 5 F,
P315S,
and
P315G)
by
s i t e -d i r e c te d
mu t a ge n e s i s m e th o d
P r i m e rs
S e q u e n ce s
Y225C-F
5 ’ - T C GA GT C G T GC T GT GA C T C GC A AT C - 3 ’
P315C-F
5 ’ - G AT T G G AT GA A G T G T TA C C A C A C C GC - 3 ’
Q 2 2 8 C -F
5 ’ - G T GC TAT GA C T C G T GC T C C GT C T G G T C C -3 ’
K 3 1 4 C -F
5 ’ - G G G T GAT T G GAT G T G T C C T TA C C A C A C C G - 3 ’
Y225A-F
5 ’ - T C GA GT C G T GC G C T G A C T C GC A AT C - 3 ’
Y 2 2 5 F -F
5 ’ - T C GA GT C G T GC T T T GA C T C GC A AT C - 3 ’
P315S-F
5 ’ - G AT T G G AT GA A G T C T TA C C A C A C C GC - 3 ’
P315G-F
5 ’ - G AT T G G AT GA A G G GT TA C C A C A C C G C - 3 ’
E a ch p r i m e r w a s u s e d a s f o r w a r d p r i me rs f o r D N A m u ta g e n e s i s .
s e q u e n c e o f e a c h f o r wa r d p ri m e r i s o n l y s h o w n .
indicated by double -underlines.
69
The
M u t a ti o n s i te s a r e
(A)
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
6
7
(B)
6
7
F i g . 4 -3 We s t e r n b l o t ti n g o f m u ta n t C P Y s e xp re s s e d i n y e a s t c e l l s ( A )
a n d a c ti v a t e d a n d p u r i fi e d m a tu r e mu t a n t C P Y s ( B )
Ye a s t c e l l s a f te r i n d u c i b l e c u l ti v a ti o n w e r e l y s e d i n S D S -PA GE s a mp l e
buffer and boiled.
T h e s u p e r n a t a n t w a s a n a l y z e d b y We s t e rn b l o t t i n g .
C e l l l y s a t e o f y e a s t i n wh i c h mu t a n t s w e r e e xp r e s s e d w a s f ra c t i o n a t e d
b y a mm o n i u m s u l f a t e a n d w a s s u b j e c te d t o T OY OP E A R L B u t y l -6 5 0 M
co l u mn .
T h e e a c h e l u a t e w a s a n a l y ze d b y We s te rn b l o t ti n g .
polyclonal
a n t i -C P Y
a n ti s e ru m
( 1 :1 0 , 0 0 0 )
and
Rabbit
h o rs e ra d i s h
p e ro x i d a s e - c o n j u ga t e d a n ti - r a b b i t I g G s e c o n d a ry a n t i b o d y ( 1 : 1 0 0 , 0 0 0 )
w e r e u s e d i n We s te r n b l o t t i n g .
(A ) (B ) L a n e 1 , WT ; l a n e 2 , Y 2 2 5 C ; l a n e 3 , P 3 1 5 C ; l a n e 4 , Y 2 2 5 C /P 3 1 5 C ;
lane 5, Q228C; lane 6, K314C; lane 7, Q228C/K314C
70
Ta b l e 4 - 2 R e l a ti v e s p e c i f i c a c t i vi t y o f W T a n d s o l u b l e m u t a n ts ( Q 2 2 8 C ,
K 3 1 4 C ) t o w a r d Z - P h e -L e u - O H a n d B T p N A
CPY
Z - P h e -L e u - O H a
BTpNAb
WT
(100)
(100)
Q228C
57
65
K314C
33
41
T h e a c ti vi t i e s o f r e c o m b i n a n t W T fo r e a ch s u b s t ra t e we r e s e t a s 1 0 0 %
a c t i ve .
a
E n z y m e r e a c ti o n w a s p e r f o rm e d w i th 1 mM Z -P h e - L e u - O H a t p H 7 . 0 a t
ro o m t e mp e r a t u r e a n d t h e a m o u n t o f r e l e a s e d L -L e u w a s d e t e c t e d b y
U - HP L C .
b
E n z y me r e a c t i o n w a s p e r fo r m e d wi t h 0 . 3 m M B T p N A a t p H 7 .0 a t ro o m
t e m p e r a tu r e a n d A 4 1 0 w a s mo n i t o re d s p e c t ro p h o t o m e tr i ca l l y.
71
(A)
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
(B)
F i g . 4 - 4 We s t e r n b l o t t i n g o f Ty r 2 2 5 r e p l a ce d mu t a n t s a n d P r o 3 1 5
re p l a ce d m u t a n ts e xp r e s s e d i n y e a s t c e l l s ( A ) a n d a c t i v a t e d a n d
p u r i fi e d m u ta n ts ( B )
Ye a s t c e l l s a f te r i n d u c i b l e c u l ti v a ti o n w e r e l y s e d i n S D S -PA GE s a mp l e
buffer and boiled.
T h e s u p e r n a t a n t w a s a n a l y z e d b y We s t e rn b l o t t i n g .
A u to - l ys a te o f c e l l s e xp r e s s i n g m u ta n ts w a s f r a c ti o n a t e d b y a m m o n i u m
s u l f a t e a n d w a s s u b j e c t e d t o T O Y OP E A R L B u t y l -6 5 0 M c o l u mn .
e a ch e l u a t e wa s a n a l y z e d b y We s t e r n b l o t ti n g .
The
R a b b i t p o l y cl o n a l
a n ti - C P Y a n ti s e r u m ( 1 : 1 0 , 0 0 0 ) a n d h o r s e r a d i s h p e r o xi d a s e - co n j u g a te d
a n ti - r a b b i t I g G s e c o n d a r y a n ti b o d y ( 1 : 1 0 0 , 0 0 0 ) w e re u s e d i n We s t e rn
b l o t ti n g .
(A ) (B ) L a n e 1 , WT ; l a n e 2 , Y 2 2 5 A ; l a n e 3 , Y 2 2 5 F ; l a n e 4 , P 3 1 5 S ; l a n e 5 ,
P315G
72
Ta b l e 4 - 3 R e l a t i ve s p e c i f i c a c t i vi t i e s o f WT a n d s o l u b l e P r o 3 1 5 r e p l a c e d
mu t a n t s (P 3 1 5 S a n d P 3 1 5 G ) t o w a rd Z -P h e -L e u - OH a n d B T p N A
CPY
Z - P h e -L e u - O H a
BTpNAb
WT
(100)
(100)
P315S
51
61
P315G
55
170
T h e a c ti vi t i e s o f r e c o m b i n a n t W T fo r e a ch s u b s t ra t e we r e s e t a s 1 0 0 %
a c t i ve .
a
E n z y m e r e a c ti o n w a s p e r f o rm e d w i th 1 mM Z -P h e - L e u - O H a t p H 7 . 0 a t
ro o m t e mp e r a t u r e a n d t h e a m o u n t o f r e l e a s e d L -L e u w a s d e t e c t e d b y
U - HP L C .
b
E n z y me r e a c t i o n w a s p e r fo r m e d wi t h 0 . 3 m M B T p N A a t p H 7 .0 a t ro o m
t e m p e r a tu r e a n d A 4 1 0 w a s mo n i t o re d s p e c t ro p h o t o m e tr i ca l l y.
73
Ta b l e 4 - 4 K i n e ti c p a r a me t e rs o f r e c o m b i n a n t w i l d - t y p e C P Y a n d P 3 1 5 G i n t h e h yd r o l y s i s o f t h e d i p e p t i d e
s u b s t ra t e s ( A ) , a n i l i d e s u b s t ra t e ( B ) , a n d e s te r s u b s t r a te ( C ) a t r o o m t e mp e r a tu r e
E a ch p a r a m e te r i s e xp r e s s e d a s me a n ± S D c a l cu l a t e d f r o m th e d a t a o f mu l ti p l e e xp e r i me n ts .
(A )
CPY
WT
P315G
Z - P h e -L e u - O H
Z - P h e -P r o - O H
k c a t (s - 1 )
K m ( mM )
k c a t / K m ( mM - 1 ･ s - 1 )
15±1
0 .0 6 7 ±0 . 0 11
2 3 0 ±2 1
2.0±0.5
0 .0 1 9 ±0 . 0 0 5
1 0 0 ±2
K m ( mM )
k c a t / K m ( mM - 1 ･ s - 1 )
0 .5 4 ± 0 . 11
0 .1 2 ± 0 .0 8
6 .9 ± 3 . 8
0 .2 1 ± 0 .0 7
0 .2 7 ± 0 .2 3
2 .0 ± 1 . 5
k c a t (s - 1 )
(B )
BTpNA
CPY
k c a t (s - 1 )
K m ( mM )
k c a t / K m ( mM - 1 ･ s - 1 )
WT
0 .5 7 ± 0 .0 4
0 .0 3 8 ±0 . 0 0 2
15±0
P315G
0 .4 0 ± 0 .0 5
0 .0 3 1 ±0 . 0 0 4
13±2
(C )
CPY
A c - Ty r- OE t
k c a t (s - 1 )
K m ( mM )
k c a t / K m ( mM - 1 ･ s - 1 )
WT
1 6 0 ±3 3
1 .8 ± 0 . 2
90±8
P315G
7.8±5.7
0 .3 9 ± 0 .3 5
74
3 6 ±1 7
第 5 章
総括
CPY を 含 め た α/β hydrolase fold 型 の タ ン パ ク 質 の 立 体 構 造 は ， 活 性 中
心を含むコアドメインとインサートドメインに分けられるが，分類されて
いるタンパク質間において，コアドメインの類似性は高いのに対し，V 字
ヘリックスも含まれるインサートドメインについては構造の形態が多様で
あ る ． つ ま り ， 多 彩 な 基 質 特 異 性 を 示 す hydrolase 群 で あ る の に も 関 わ ら
ず ， 酵 素 の 真 髄 は 類 似 し て お り ， 一 方 で CPY， PPCA， CPWII は 同 じ セ リ
ン カ ル ボ キ シ ペ プ チ ダ ー ゼ で あ る に も 関 わ ら ず ，C P Y の V 字 構 造 は 他 の 2
つに比 べて巨 大な α ヘリッ クスで 構成さ れて お り相同 性が著 しく低 い．リ
パーゼについてはインサートドメインに関する研究がなされており，基質
の接触を調節する機能が提示されているが，そのトリガーについては，溶
媒 の 種 類 や 温 度 な ど さ ま ざ ま で あ る ( 4 8 , 6 0 ,6 1 ) ． と こ ろ が ， C P Y を 含 め た
セリンカルボキシペプチダーゼのインサートドメインについての理解は乏
し い ．本 研 究 に よ り ，V 字 ヘ リ ッ ク ス に 関 わ る ア ミ ノ 酸 の 置 換 が C P Y の 触
媒活性や構造安定性，フォールディングに影響を及ぼすことが明らかとな
り ，酵 素 の 根 幹 で は な い イ ン サ ー ト ド メ イ ン が 機 能 的 な C P Y の 構 築・維 持
に 関 わ る こ と が 示 さ れ た ． こ の 研 究 を 通 し て ， イ ン サ ー ト ド メ イ ン と α/β
hydrolase fold 型 の タ ン パ ク 質 に お け る フ ォ ー ル デ ィ ン グ 機 構 や 基 質 認 識
機構の多様性に対する新たな洞察が得られることが期待される．
75
参考文献
1.
Ha y a s h i ,
R.,
C a rb o x yp e p ti d a s e
Moore,
from
S.,
yeast.
and
Large
Stein,
scale
W.
H.
p r e p a r a ti o n
(1973)
and
th e
a p p l i ca t i o n t o C O O H - t e r m i n a l a n a l y s i s o f p e p t i d e s a n d p ro t e i n s . J . B i o l .
C he m . 2 4 8 , 2 2 9 6 - 2 3 0 2
2.
th e
S t e ve n s , T. , E s mo n , B . , a n d S ch e km a n , R . ( 1 9 8 2 ) E a rl y s t a g e s i n
yeast
secretory
p a th w a y
are
required
for
transport
of
ca r b o x y p e p t i d a s e Y t o th e v a cu o l e . C e ll 3 0 , 4 3 9 -4 4 8
3.
K a i s e r, C . A . , G i m e n o , R . E . , a n d S h a y wi t z , D . A . ( 1 9 9 7 ) P r o t e i n
s e c re t i o n , m e m b r a n e b i o g e n e s i s , a n d e n d o c y to s i s . i n Th e m o le cu la r a nd
ce ll ul a r b i ol o g y o f t he y ea s t Sa c ch a ro m y ce s : c el l c y c le an d ce ll b io lo g y
(P r i n gl e , J . R . , B r o a c h , J . R . , a n d J o n e s , E . W. e d s . ) , C o l d Sp r i n g Ha r b o r
L a b o r a to r y P r e s s , P l a i n vi e w, N Y. p p 9 1 - 2 2 7
4.
R.
H o l s t , B . , B r u u n , A . W. , K i e l l a n d -B ra n d t , M . C . , a n d Wi n th e r, J .
(1996)
C o mp e ti ti o n
b e t we e n
folding
and
glycosylation
in
the
e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . E MB O J . 1 5 , 3 5 3 8 - 3 5 4 6
5.
R a m o s , C . , Wi n t h e r, J . R . , a n d Ki e l l a n d -B r a n d t , M . C . ( 1 9 9 4 )
R e q u i r e me n t o f t h e p r o p e p ti d e f o r i n vi v o f o rm a ti o n o f a c ti v e y e a s t
ca r b o x y p e p t i d a s e Y. J . B io l . C h em . 2 6 9 , 7 0 0 6 - 7 0 1 2
6.
Wi n t h e r,
J.
R.,
and
S ø re n s e n ,
P.
(1991)
Propeptide
of
ca r b o x y p e p t i d a s e Y p r o vi d e s a ch a p e r o n e -l i ke f u n c ti o n a s w e l l a s
i n h i b i ti o n o f t h e e n z y m a ti c a c t i vi t y. Pr o c . N a tl . A cad . S ci . U SA 8 8 ,
76
9330-9334
7.
Ballou, L., Hernandez, L. M., Alvarado, E., and Ballou, C. E.
(1990)
Revision
of
th e
o l i go s a c ch a r i d e
s t ru c t u r e s
of
yeast
ca r b o x y p e p t i d a s e Y. Pr o c . N a tl . A c ad . S c i . U SA 8 7 , 3 3 6 8 -3 3 7 2
8.
Va l l s , L . A . , Wi n th e r, J . R . , a n d S te v e n s , T. H . ( 1 9 9 0 ) Ye a s t
ca r b o x y p e p t i d a s e
Y
vacuolar
t a r ge t i n g
s i gn a l
is
defined
by
four
p r o p e p ti d e a mi n o a c i d s . J . C el l . B io l . 111 , 3 6 1 - 3 6 8
9.
Ye a s t
Wi n t h e r, J . R . , S t e v e n s , T. H . , a n d K i e l l a n d -B r a n d t , M . C . ( 1 9 9 1 )
c a r b o x yp e p t i d a s e
Y
re q u i re s
gl y c o s y l a t i o n
for
e f f i ci e n t
i n t ra c e l l u l a r t r a n s p o r t , b u t n o t f o r v a c u o l a r s o r ti n g , i n vi v o s t a b i l i t y,
o r a c t i vi t y. E u r. J . B io ch e m . 1 9 7 , 6 8 1 -6 8 9
10.
K a k i n u m a , Y. , O h s u mi , Y. , a n d A n r a ku , Y. ( 1 9 8 1 ) P ro p e r t i e s o f
H + - t r a n s l o c a ti n g a d e n o s i n e tr i p h o s p h a t a s e i n v a cu o l a r m e mb r a n e s o f
S ac c ha r om y c es c e re vi si a e . J . B i ol . C h e m . 2 5 6 , 1 0 8 5 9 -1 0 8 6 3
11 .
and
S ø r e n s e n , S . O . , v a n d e n Ha z e l , H . B . , K i e l l a n d -B r a n d t , M . C . ,
Wi n th e r,
J.
R.
(1994)
p H -d e p e n d e n t
p ro c e s s i n g
of
yeast
p r o c a rb o x yp e p t i d a s e Y b y p ro t e i n a s e A i n vi v o a n d i n v i t ro . E ur. J .
B io ch e m . 2 2 0 , 1 9 - 2 7
12.
E n d r i z z i , J . A . , B r e d d a m , K . , a n d R e mi n g t o n , S . J . ( 1 9 9 4 ) 2 . 8 -Å
structure
of
yeast
serine
carboxypeptidase.
B i o ch e mi s tr y
33,
111 0 6 - 111 2 0
13.
L i a o , D . I . , B r e d d a m , K . , S w e e t , R . M . , B u l l o c k , T. , a n d
R e mi n g t o n ,
S.
J.
(1992)
R e fi n e d
77
a t o mi c
model
of
wheat
s e ri n e
ca r b o x y p e p t i d a s e I I a t 2 . 2 - Å re s o l u t i o n . B io ch e mi s t r y 3 1 , 9 7 9 6 - 9 8 1 2
14.
Ol l i s , D . L . , C h e a h , E . , C y g l e r, M . , D i j k s tr a , B . , F r o l o w, F. ,
F r a n k e n , S . M . , H a r e l , M . , R e mi n g to n , S . J . , S i l m a n , I . , S c h r a g , J . , a n d
e t a l . ( 1 9 9 2 ) T h e α / β h yd r o l a s e f o l d . P ro t ei n E n g . 5 , 1 9 7 -2 11
15.
Liao, D. I., and Remington, S. J. (1990) Structure of wheat
s e ri n e c a r b o x yp e p ti d a s e I I a t 3 . 5 -Å r e s o l u ti o n . A n e w c l a s s o f s e ri n e
p r o te i n a s e . J . B i ol . C he m . 2 6 5 , 6 5 2 8 - 6 5 3 1
16.
Sh i mi z u ,
H.,
Ueno,
H.,
and
Ha y a s h i ,
R.
(1999)
Role
of
ca r b o h yd r a t e m o i e t y i n c a r b o x yp e p t i d a s e Y: s t r u c t u ra l s tu d y o f m u ta n t
e n z y me l a c ki n g c a r b o h yd r a t e m o i e t y. B io sc i . B i o t ec hn ol . B i oc h em . 6 3 ,
1045-1050
17.
Du m o u l i n , M . , U e n o , H . , H a ya s h i , R . , a n d B a l n y, C . ( 1 9 9 9 )
C o n t ri b u t i o n o f th e c a r b o h yd ra t e m o i e t y t o co n f o r m a ti o n a l s t a b i l i t y o f
th e c a r b o x yp e p ti d a s e Y h i gh p r e s s u r e s tu d y. E u r. J . B i o ch e m . 2 6 2 ,
4 7 5 -4 8 3
18.
Ha y a s h i , R . , a n d Ha t a , T. ( 1 9 7 2 ) A c t i o n o f ye a s t p r o t e i n a s e C o n
s y n th e ti c p e p t i d e s a n d p o l y - α ,L - a mi n o a c i d s . B i o ch im . B i o p h ys . A c t a
263, 673-679
19.
Ha y a s h i , R . , B a i , Y. , a n d H a ta , T. ( 1 9 7 5 ) K i n e ti c s tu d i e s o f
ca r b o x y p e p t i d a s e
Y.
I.
K i n e ti c
p a r a me t e rs
for
the
hydrolysis
of
s y n th e ti c s u b s t r a te s . J . B i o ch e m . 7 7 , 6 9 - 7 9
20.
B a i , Y. , H a y a s h i , R . , a n d H a ta , T. ( 1 9 7 5 ) K i n e t i c s t u d i e s o f
ca r b o x y p e p t i d a s e Y. I I I . A c ti o n o n e s te r, a mi d e , a n d a n i l i d e s u b s t ra t e s
78
a n d t h e e f f e c ts o f s o me e n vi r o n me n ta l f a c t o rs . J . B io ch e m . 7 8 , 6 1 7 -6 2 6
21.
Ha y a s h i , R . ( 1 9 7 6 ) C a rb o x yp e p ti d a s e Y. M e th . E n z y mo l . X LV,
5 6 8 -5 8 7
22.
Ha y a s h i , R . , M o o r e , S . , a n d S t e i n , W. H . ( 1 9 7 3 ) S e r i n e a t t h e
a c t i ve c e n te r o f y e a s t c a r b o x yp e p t i d a s e . J . B i ol . C h e m . 2 4 8 , 8 3 6 6 -8 3 6 9
23.
Ha y a s h i , R . , B a i , Y. , a n d H a t a , T. ( 1 9 7 5 ) E v i d e n c e f o r a n
e s s e n ti a l
h i s ti d i n e
in
c a rb o x yp e p ti d a s e
Y.
R e a c ti o n
wi t h
the
ch l o r o me t h yl ke t o n e d e r i v a t i v e o f b e n z y l o x y ca r b o n yl - L -p h e n yl a l a n i n e .
J . B io l . C h em . 2 5 0 , 5 2 2 1 - 5 2 2 6
24.
Bech,
L.
M.,
and
B re d d a m ,
K.
(1989)
I n a c t i va t i o n
of
ca r b o x y p e p t i d a s e Y b y m u t a ti o n a l r e m o va l o f t h e p u t a ti v e e s s e n ti a l
h i s t i d yl r e s i d u e . C a rl sb e r g R es . C om mu n . 5 4 , 1 6 5 - 1 7 1
25.
M o r t e n s e n , U . H . , R e mi n g t o n , S . J . , a n d B r e d d a m , K . ( 1 9 9 4 )
S i te -d i r e c t e d mu t a g e n e s i s o n (s e ri n e ) c a r b o x yp e p ti d a s e Y. A h y d r o g e n
b o n d n e t w o r k s t a b i l i z e s th e t ra n s i ti o n s t a t e b y i n t e r a c ti o n w i th th e
C - t e rm i n a l
carboxylate
group
of
the
s u b s t ra t e .
B i oc he mi s tr y
33,
5 0 8 -5 1 7
26.
Sørensen,
S.
B.,
R a a s ch o u -N i e l s e n ,
M.,
Mo r t e n s e n ,
U.
H.,
R e mi n g t o n , S . J . , a n d B r e d d a m , K . ( 1 9 9 5 ) S i t e -d i r e c te d mu t a g e n e s i s o n
( s e ri n e ) c a r b o x yp e p ti d a s e Y f r o m y e a s t . T h e s i gn i fi c a n c e o f T h r6 0 a n d
Me t 3 9 8 i n h yd r o l y s i s a n d a mi n o l ys i s r e a c t i o n s . J . A m . C he m . S o c . 11 7 ,
5944-5950
27.
B r e d d a m , K . , a n d K a n s t r u p , A . ( 1 9 8 7 ) C y a n yl a ti o n o f t h e s i n g l e
79
s u l f h yd r yl
group
in
c a r b o x yp e p ti d a s e
Y
w i th
c ya n o g e n
b r o mi d e .
C a rls b e rg R es . C o m mu n . 5 2 , 6 5 - 7 1
28.
Ol e s e n ,
K.,
M o r te n s e n ,
U.
H.,
A a s mu l - O l s e n ,
S.,
Ki e l l a n d - B r a n d t , M . C . , R e m i n g t o n , S . J . , a n d B r e d d a m , K . ( 1 9 9 4 ) T h e
a c t i vi t y o f c a r b o x yp e p ti d a s e Y t o w a r d s u b s t r a te s w i th b a s i c P 1 a m i n o
a c i d r e s i d u e s i s d r a s t i c a l l y i n c re a s e d b y mu t a ti o n a l r e p l a c e m e n t o f
l e u c i n e 1 7 8 . B i o ch e mi s tr y 3 3 , 111 2 1 - 111 2 6
29.
Ol e s e n ,
K.,
and
Ki e l l a n d - B r a n d t ,
M.
C.
(1 9 9 3 )
Altering
s u b s t ra t e p r e f e r e n c e o f c a r b o x yp e p t i d a s e Y b y a n o v e l s t r a te g y o f
mu t a ge n e s i s e l i mi n a ti n g w i l d t y p e b a c k g ro u n d . P r o t ei n E n g . 6 , 4 0 9 - 4 1 5
30.
Ol e s e n , K . , a n d B r e d d a m , K . ( 1 9 9 5 ) I n c re a s e o f t h e P 1 Lys / L e u
s u b s t ra t e p r e f e r e n c e o f c a r b o x yp e p t i d a s e Y b y r a t i o n a l d e s i gn b a s e d o n
kn o wn p r i m a r y a n d t e r t i a r y s t ru c tu r e s o f s e ri n e c a r b o x yp e p ti d a s e s .
B io ch e mi s t r y 3 4 , 1 5 6 8 9 -1 5 6 9 9
31.
Bai,
Y. ,
and
Hayashi,
R.
(1979)
Properties
of
the
single
s u l f h yd r yl g r o u p o f c a r b o x y p e p t i d a s e Y. E f f e c t s o f a l k yl a n d a r o ma t i c
me r cu r i a l s o n a c t i v i t i e s t o w a r d va r i o u s s yn t h e ti c s u b s t ra t e s . J . B i o l .
C he m . 2 5 4 , 8 4 7 3 - 8 4 7 9
32.
B r e d d a m , K . , a n d S v e n d s e n , I . B . ( 1 9 8 4 ) I d e n t i fi c a ti o n o f
me t h i o n y l a n d c y s t e i n yl r e s i d u e s i n t h e s u b s t r a te b i n d i n g s i te o f
ca r b o x y p e p t i d a s e Y. C a rls b e rg R es . C o m mu n . 4 9 , 6 3 9 -6 4 5
33.
B r e d d a m , K . ( 1 9 8 3 ) Mo d i fi c a ti o n o f t h e s i n g l e s u l f h yd r yl g r o u p
o f ca r b o x y p e p t i d a s e Y wi t h me r cu r i a l s . I n f l u e n c e o n e n z ym e s p e c i fi ci t y.
80
C a rls b e rg R es . C o m mu n . 4 8 , 9 - 1 9
34.
Ol e s e n , K . , M e l d a l , M . , a n d B r e d d a m , K . ( 1 9 9 6 ) E x t e n d e d
s u b s i t e c h a r a c te r i za ti o n o f ca r b o x y p e p t i d a s e Y u s i n g s u b s t r a te s b a s e d
o n i n t r a mo l e c u l a r l y q u e n c h e d f l u o r e s c e n ce . P r o t ei n P ep t . L e t t . 3 , 6 7 - 7 4
35.
N a ka s e , H . , J u n g , G . , U e n o , H . , H a y a s h i , R . , a n d Ha r a d a , Y.
( 2 0 0 0 ) I n t e r a c t i o n mo d e o f H 3 9 7 A m u t a n t ca r b o x yp e p t i d a s e Y wi th
p r o te i n s u b s t r a te s a n a l y z e d b y th e s u r fa c e p l a s mo n re s o n a n c e . B ul l .
C he m . S o c . Jp n . 7 3 , 2 5 8 7 -2 5 9 0
36.
N a ka s e , H . , M u r a t a , S . , U e n o , H . , a n d H a ya s h i , R . ( 2 0 0 1 )
Su b s t r a t e
r e c o gn i t i o n
me c h a n i s m
of
c a r b o x yp e p ti d a s e
B i os c i .
Y.
B io t e ch no l . B i oc he m . 6 5 , 2 4 6 5 -2 4 7 1
37.
R u d e n ko , G . , B o n t e n , E . , d ' A z zo , A . , a n d H o l , W. G . ( 1 9 9 5 )
T h r e e -d i m e n s i o n a l
structure
of
the
structure
precursor
of
th e
f o rm
hum an
s u g g e s ts
' p r o te c t i v e
a
complex
p ro t e i n ' :
a c ti v a ti o n
me c h a n i s m . S t r u c tu re 3 , 1 2 4 9 - 1 2 5 9
38.
S a h a r a , T. , G o d a , T. , a n d Oh g i ya , S . ( 2 0 0 2 ) C o mp r e h e n s i v e
e xp re s s i o n a n a l y s i s o f t i m e -d e p e n d e n t g e n e ti c r e s p o n s e s i n y e a s t c e l l s
t o l o w t e mp e r a tu r e . J . B io l . C h em . 2 7 7 , 5 0 0 1 5 - 5 0 0 2 1
39.
R o s e , M . D . , Wi n s t o n , F. , a n d Hi e t e r, P. ( 1 9 9 0 ) M e t hod s in Yea s t
G en e ti cs , A L a bo r a t or y C ou rs e M anu a l , C o l d Sp r i n g H a rb o r L a b o r a to r y,
C o l d Sp r i n g Ha r b o r, N Y
40.
I to ,
H.,
F u ku d a ,
Y. ,
Murata,
K.,
and
Ki mu r a ,
A.
(1983)
Tra n s f o r m a ti o n o f i n t a c t ye a s t c e l l s t r e a t e d w i th a l k a l i c a ti o n s . J .
81
B a c te ri o l . 1 5 3 , 1 6 3 - 1 6 8
41.
A i b a r a , S . , H a y a s h i , R . , a n d H a ta , T. ( 1 9 7 1 ) P h ys i c a l a n d
ch e mi ca l p r o p e r t i e s o f y e a s t p ro t e i n a s e C . A gr. B i ol . C h e m . 3 5 , 6 5 8 - 6 6 6
42.
v a n d e r Va a r t , J . M . , C a ro , L . H . , C h a p ma n , J . W. , K l i s , F. M . ,
a n d Ve r r i p s , C . T. ( 1 9 9 5 ) I d e n ti f i ca t i o n o f t h r e e m a n n o p r o t e i n s i n t h e
ce l l w a l l o f S a c ch a r om y c es c e re v is ia e . J . B a c t er i ol . 1 7 7 , 3 1 0 4 -3 11 0
43.
S k r z yp e k ,
M.,
L e s t e r,
R.
L.,
and
Di c k s o n ,
R.
C.
(1997)
Su p p r e s s o r g e n e a n a l ys i s r e v e a l s a n e s s e n ti a l r o l e f o r s p h i n g o l i p i d s i n
t ra n s p o r t
of
g l y c o s yl p h o s p h a t i d yl i n o s i to l -a n ch o re d
p r o te i n s
in
S ac c ha r om y c es c e re vi si a e . J . B a c te r io l . 1 7 9 , 1 5 1 3 -1 5 2 0
44.
F r i e m a n , M . B . , a n d C o rm a c k , B . P. ( 2 0 0 3 ) T h e ω - s i t e s e q u e n c e o f
gl y c o s y l p h o s p h a ti d y l i n o s i t o l - a n ch o r e d
proteins
in
S a c ch ar o m yc e s
ce r e vi si a e c a n d e te r mi n e d i s t ri b u t i o n b e t we e n t h e m e m b ra n e a n d t h e
ce l l w a l l . M o l . Mi c r ob io l . 5 0 , 8 8 3 - 8 9 6
45.
B l o b e l , G . ( 1 9 8 0 ) I n t ra c e l l u l a r p ro t e i n t o p o g e n e s i s . P ro c . Na tl .
A c ad . S c i . U SA 7 7 , 1 4 9 6 - 1 5 0 0
46.
M a ki , T. , K o z a wa , H . , Mi m a , J . , U e n o , H . , a n d H a ya s h i , R . ( 2 0 0 2 )
I n c re a s e d p r o t e o l y t i c s u s c e p t i b i l i t y o f ca r b o x y p e p t i d a s e Y c a u s e d b y
mo d i f i c a t i o n o f th e d i s u l f i d e z i p p e r. B i os ci . B io t e ch no l . B i oc h em . 6 6 ,
1393-1395
47.
M o m a n y, F. A . , a n d R o n e , R . ( 1 9 9 2 ) Va l i d a ti o n o f th e ge n e r a l
p u r p o s e Q U A N TA ® 3 .2 / C HA R M m ® f o rc e f i e l d . J . C o mp u t . C h em . 1 3 ,
8 8 8 -9 0 0
82
48.
S c h r a g , J . D . , a n d C y g l e r, M . ( 1 9 9 7 ) L i p a s e s a n d α / β h yd ro l a s e
f o l d . M e t h . E n z ym ol . 2 8 4 , 8 5 - 1 0 7
49.
N a r d i n i , M . , a n d Di j k s tr a , B . W. ( 1 9 9 9 ) α / β h yd r o l a s e f o l d
e n z y me s : t h e f a mi l y ke e p s g ro w i n g . C u rr. O p in . S t r u c t . B io l . 9 , 7 3 2 -7 3 7
50.
B r z o zo w s ki , A . M . , D e r e w e n d a , U . , D e r e we n d a , Z . S . , D o d s o n , G .
G . , L a w s o n , D . M . , Tu r k e n b u r g , J . P. , B j o r k l i n g , F. , H u g e - J e n s e n , B . ,
P a t ka r, S . A . , a n d T h i m , L . ( 1 9 9 1 ) A m o d e l f o r i n te r f a c i a l a c ti v a ti o n i n
l i p a s e s f r o m th e s t r u c t u r e o f a f u n g a l l i p a s e -i n h i b i t o r c o mp l e x . Na t ur e
351, 491-494
51.
Schrag,
J.
D.,
Li,
Y.
G.,
Wu ,
S.,
and
C y gl e r,
M.
(1991)
S e r- Hi s - Gl u tr i a d f o r ms th e ca t a l y t i c s i t e o f t h e l i p a s e f r o m G eo t r ic h um
ca nd i d u m . Na t ur e 3 5 1 , 7 6 1 -7 6 4
52.
Ha b e r, E . , a n d A n fi n s e n , C . B . ( 1 9 6 2 ) S i d e - c h a i n i n t e ra c t i o n s
g o ve rn i n g t h e p a i r i n g o f h a l f - cy s ti n e r e s i d u e s i n r i b o n u cl e a s e . J . B i ol .
C he m . 2 3 7 , 1 8 3 9 - 1 8 4 4
53.
L e vi t t , M . ( 1 9 7 8 ) C o n f o rm a ti o n a l p r e f e re n ce s o f a mi n o a c i d s i n
gl o b u l a r p r o t e i n s . B io ch e mi s tr y 1 7 , 4 2 7 7 - 4 2 8 5
54.
C h o u , P. Y. , a n d F a s m a n , G . D . ( 1 9 7 8 ) P r e d i ct i o n o f t h e
s e c o n d a r y s t r u c tu r e o f p r o te i n s f r o m t h e i r a mi n o a ci d s e q u e n c e . A d v.
E n zy m ol . R el a t . A r e as . M ol . B i o l . 4 7 , 4 5 - 1 4 8
55.
A u r o r a , R . , a n d R o s e , G . D . ( 1 9 9 8 ) H e l i x ca p p i n g . P ro t e in S c i . 7 ,
21-38
56.
C o l l o c ' h , N . , a n d C o h e n , F. E . ( 1 9 9 1 ) β - b r e a k e rs : a n a p e r i o d i c
83
s e c o n d a r y s t r u c t u r e . J . M ol . B i o l . 2 2 1 , 6 0 3 - 6 1 3
57.
P r a j a p a ti , R . S . , D a s , M . , S r e e r a mu l u , S . , S i r a j u d d i n , M . ,
S ri n i v a s a n , S . , K r i s h n a m u r t h y, V. , R a n j a n i , R . , R a ma k ri s h n a n , C . , a n d
Va r a d a r a j a n , R . ( 2 0 0 7 ) T h e r mo d yn a m i c e f f e c ts o f p r o l i n e i n t r o d u c t i o n
o n p r o t e i n s t a b i l i t y. Pr o t ei ns 6 6 , 4 8 0 -4 9 1
58.
Ti a n , J . , Wa n g , P. , G a o , S . , C h u , X . , Wu , N . , a n d F a n , Y. ( 2 0 1 0 )
Enhanced
thermostability
of
methyl
p a ra t h i o n
h yd r o l a s e
from
O ch r ob a c tr u m s p . M 2 3 1 b y r a t i o n a l e n g i n e e ri n g o f a g l y ci n e t o p r o l i n e
mu t a ti o n . FE B S J . 2 7 7 , 4 9 0 1 - 4 9 0 8
59.
Ya s u k a wa , K . , a n d I n o u y e , K . ( 2 0 0 7 ) I m p r o vi n g t h e a c ti v i t y a n d
s t a b i l i t y o f th e r mo l y s i n b y s i t e -d i r e c te d mu t a ge n e s i s . B io c hi m . B io p h ys .
Acta 1774, 1281-1288
60.
Barbe,
S.,
L a fa q u i e r e ,
V. ,
Guieysse,
D.,
Monsan,
P. ,
R e ma u d - Si m e o n , M . , a n d A n d r e , I . ( 2 0 0 9 ) I n s i gh t s i n t o l i d mo v e me n ts
o f B u r kh ol d e r ia c e p a ci a
l i p a s e i n f e r r e d f ro m m o l e c u l a r d yn a mi cs
s i mu l a t i o n s . P ro t e in s 7 7 , 5 0 9 - 5 2 3
61.
Abdul Rahman, M. Z., Salleh, A. B., Abdul Rahman, R. N., Abdul
R a h ma n , M . B . , B a s r i , M . , a n d L e o w, T. C . ( 2 0 1 2 ) U n l o c ki n g t h e m y s t e r y
b e h i n d th e a c ti v a ti o n p h e n o me n o n o f T 1 l i p a s e : a m o l e c u l a r d y n a m i c s
s i mu l a t i o n s a p p r o a c h . P r o te in S c i . 2 1 , 1 2 1 0 -1 2 2 1
84
研究業績
I. 原 著 論 文
1 . Ma i M a ki n o ， Ta k e h i k o S a h a ra ， N a o k i M o ri t a ， H i r o s h i U e n o
「 A m i n o a c i d s u b s t i tu t i o n r e ve a l s th e r o l e o f V- s h a p e h e l i x o n
c o n s t r u c ti o n o f y e a s t c a rb o x yp e p t i d a s e Y 」
Jo ur na l o f B i ol o gi c a l M a cr o m ol e cul e s ( 査 読 有 り ) ( i n p r e s s )
2 . Ma i M a ki n o ， Ta k e h i k o S a h a ra ， N a o k i M o ri t a ， H i r o s h i U e n o
「 E x p r e s s i o n o f c a r b o x yp e p t i d a s e Y w i t h va ri o u s s i gn a l p e p ti d e
in yeast」
( M a n u s c r i p t i n p r e p a r a ti o n )
3 . Ma i M a ki n o ， Ta k e h i k o S a h a ra ， N a o k i M o ri t a ， H i r o s h i U e n o
「 E f fe c t o f d i s r u p ti o n o f h i n g e d i s u l fi d e b o n d s o n fu n c ti o n o f
carboxypeptidase Y 」
( M a n u s c r i p t i n p r e p a r a ti o n )
II. 参 考 論 文
1. 新 田 陽 子 ， 寺 畑 吏 得 子 ， 松 葉 直 子 ， 永 廣 美 代 子 ， 牧 野 舞 ，
吉村 美紀，佐野 元昭，尾関健二，植野洋志
「麹菌グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の発現様式の検討」
ビタミン
8 6 ( 9 ) : 5 0 8 -5 1 4 ( 2 0 1 2 )
85
III. 国 内 外 学 会 発 表
1. 牧 野 舞 ， 李 藤 栄 子 ， 中 岡 寛 子 ， 佐 々 木 智 子 ， 新 田 陽 子 ， 植 野 洋 志
「酵母カルボキシペプチダーゼ Y に関する酵素学的研究」
日 本 生 物 高 分 子 学 会 2 0 0 8 年 度 大 会 ， 京 都 ， 2 0 0 8 年 11 月
2. 牧 野 舞 ， 李 藤 栄 子 ， 佐 々 木 智 子 ， 新 田 陽 子 ， 植 野 洋 志
「組み換え体酵母カルボキシペプチダーゼの発現系の検討」
日 本 生 物 高 分 子 学 会 2 0 0 9 年 度 大 会 ， 広 島 ， 2 0 0 9 年 11 月
3. 牧 野 舞 ， 佐 々 木 智 子 ， 李 藤 栄 子 ， 新 田 陽 子 ， 赤 桐 里 美 ， 植 野 洋 志
「酵母カルボキシペプチダーゼ Y の基質取り込み機構の検討」
日 本 生 物 高 分 子 学 会 2010 年 度 大 会 ， 兵 庫 ， 2010 年 9 月
4. 牧 野 舞 ， 佐 々 木 智 子 ， 李 藤 栄 子 ， 新 田 陽 子 ， 植 野 洋 志
「酵母カルボキシペプチダーゼ Y の基質取り込み機構の検討」
第 83 回 日 本 生 化 学 会 大 会 ， 兵 庫 ， 2010 年 12 月
5. 牧 野 舞 ， 佐 々 木 智 子 ， 李 藤 栄 子 ， 佐 原 健 彦 ， 森 田 直 樹 ， 新 田 陽 子 ，
赤桐里美，植野洋志
「 酵 母 CPY の V 形 ヘ リ ッ ク ス の 固 定 に よ る 構 造 と 機 能 の 関 係 の 検 討 」
日 本 生 物 高 分 子 学 会 2 0 11 年 度 大 会 ， 石 川 ， 2 0 11 年 9 月
6. 牧 野 舞 ， 佐 々 木 智 子 ， 李 藤 栄 子 ， 佐 原 健 彦 ， 森 田 直 樹 ， 新 田 陽 子 ，
赤桐里美，植野洋志
「酵母カルボキシペプチダーゼ Y の立体構造変化による
基質特異性への影響の検討」
第 8 4 回 日 本 生 化 学 会 大 会 ， 京 都 ， 2 0 11 年 9 月
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7. 牧 野 舞 ， 佐 々 木 智 子 ， 佐 原 健 彦 ， 森 田 直 樹 ， 新 田 陽 子 ， 植 野 洋 志
「 酵 母 CPY の ア ミ ノ 酸 置 換 に よ る V 形 ヘ リ ッ ク ス 固 定 化 の 検 討 」
日 本 生 物 高 分 子 学 会 2012 年 度 大 会 ， 秋 田 ， 2012 年 9 月
8. 牧 野 舞 ， 佐 原 健 彦 ， 森 田 直 樹 ， 植 野 洋 志
「酵母カルボキシペプチダーゼ Y の V 形ヘリックスの固定化の検討」
2012 年 度 日 本 農 芸 化 学 会 関 西 支 部 大 会 ， 京 都 ， 2012 年 9 月
9. 牧 野 舞 ， 佐 原 健 彦 ， 森 田 直 樹 ， 植 野 洋 志
「酵母カルボキシペプチダーゼ Y のアミノ酸置換による基質特異性
改変の検討」
第 85 回 日 本 生 化 学 会 大 会 ， 福 岡 ， 2012 年 12 月
1 0 . M a i M a ki n o ， Ta ke h i k o S a h a ra ， N a o ki M o ri t a ， Hi r o s h i U e n o
「 A m i n o a c i d s u b s t i tu t i o n r e ve a l s th e r o l e o f V- s h a p e h e l i x
o n s u b s t r a te s p e c i f i c i t y o f y e a s t c a rb o x yp e p ti d a s e Y 」
T h e 2 7 th A n n u a l S y mp o s i u m o f T h e P ro t e i n S o c i e t y,
B o s t o n , M S , U SA , J u l y, 2 0 1 3
11 . 植 野 洋 志 ，中 村 友 美 ，久 木 久 美 子 ，高 橋 昌 子 ，伊 藤 美 奈 ，赤 松 香 奈 子 ，
岩堀みね子，牧野舞
「 GABA 合 成 酵 素 グ ル タ ミ ン 酸 デ カ ル ボ キ シ ラ ー ゼ（ GAD）と 食 と の
関係を語る」
食 品 酵 素 化 学 研 究 会 第 13 回 学 術 講 演 会 ， 大 阪 ， 2013 年 9 月
12. 牧 野 舞 ， 佐 原 健 彦 ， 森 田 直 樹 ， 植 野 洋 志
「 酵 母 CPY に お け る V 字 ヘ リ ッ ク ス と 基 質 特 異 性 の 関 連 を 探 る 」
第 86 回 日 本 生 化 学 会 大 会 ， 神 奈 川 ， 2013 年 9 月
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13. 鈴 木 理 紗 ， 藤 田 星 海 ， 伊 藤 美 奈 ， 牧 野 舞 ， 植 野 洋 志
「 ラ ッ ト 脳 由 来 全 長 型 GA D 6 5 の 酵 母 発 現 系 に お け る 精 製 の 簡 便 化 」
日 本 生 物 高 分 子 学 会 2013 年 度 大 会 ， 大 阪 ， 2013 年 10 月
14. 牧 野 舞 ， 佐 原 健 彦 ， 森 田 直 樹 ， 植 野 洋 志
「 CPY の lid 近 傍 の ア ミ ノ 酸 置 換 が 基 質 特 異 性 に 与 え る 影 響 」
日 本 生 物 高 分 子 学 会 2013 年 度 大 会 ， 大 阪 ， 2013 年 10 月
優秀発表賞
I V. 受 賞 歴
1. 社 団 法 人 佐 保 会 奨 学 金
2. 奈 良 女 子 大 学 廣 部 奨 学 金
(平 成 22 年 12 月 )
(平 成 24 年 6 月 )
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謝辞
稿を終えるにあたり，研究の遂行や論文の執筆などの研究全般に加え研
究 者 と し て の ノ ウ ハ ウ を 一 か ら ご 教 授 く だ さ り ，学 部 4 回 生 の と き か ら の
6 年間，終始温かく懇切にご指導及びご鞭撻くださいました奈良女子大学
生 活 環 境 学 部 植 野 洋 志 教 授 に 深 甚 な る 感 謝 と 尊 敬 の 意 を 表 し ま す ．そ し て ，
副指導教員として温かく叱咤激励くださいました奈良女子大学生活環境学
部の塚本幾代教授，高村仁知准教授，また，学位論文予備審査において貴
重なご助言を頂きました奈良女子大学生活環境学部の小倉裕範教授に心よ
り感謝申し上げます．
本研究を大きく進展させるきっかけとなった，貴重な酵母発現ベクター
pLex321sV5H 及 び シ グ ナ ル ペ プ チ ド 挿 入 ベ ク タ ー 5 種 を ご 提 供 く だ さ い
ました，独立行政法人産業技術総合研究所生物プロセス研究部門バイオデ
ザイン研究グループ佐原健彦先生，分子生物工学研究グループ森田直樹先
生に心より感謝申し上げます．
また，多くのご助言を与えてくださいました，奈良女子大学赤桐里美助
教，岡山県立大学新田陽子准教授を始め日本生物高分子学会に所属されて
おられる先生方，酵素クラブの先生方，奈良県立医科大学生化学教室高沢
伸教授に厚く御礼申し上げます．さらに，学位申請のために共に頑張って
きた奈良女子大学植野研究室の久木久美子さんを始め，共に支え合い切磋
琢磨してきた同研究室の大学院生，学部生，卒業生の皆様に厚く御礼申し
上げます．
最後に，私に研究者の道を勧め常にいろいろな助言をくれた父，私を気
遣い励まし温かく見守ってくれた母，優しく応援してくれた姉に感謝致し
ます．
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