Kobe University Repository : Thesis

Kobe University Repository : Thesis
学位論文題目
Title
インスリン依存型糖尿病（IDDM）の発症予防に関する
研究 : 抗接着分子抗体を用いたNODマウス自己免疫
性IDDMの阻止(Studies on the prevention of insulindependent diabetes mellitus : prevention of autoimmune
insulin-depent diabetes mekkitus in NOD mice by
monoclonal antibodies against adhesion molecules)
氏名
Author
長谷川, 裕
専攻分野
Degree
博士（医学）
学位授与の日付
Date of Degree
1994-04-27
資源タイプ
Resource Type
Thesis or Dissertation / 学位論文
報告番号
Report Number
乙1846
URL
http://www.lib.kobe-u.ac.jp/handle_kernel/D2001846
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Create Date: 2017-03-29
インスリン依存型糖尿病(IDDM)の発症予防に関する研究
一抗接着分子抗体を用いた NODマウス自己免疫性 IDDM
の阻止一
神戸大学医学部内科学第二講座(指導:春日雅人教授)
長谷川
神戸大学医学部紀要第 5
4
巻 第 2 ・3 ・4号 別 刷
平成 6年 3月
裕
インスリン依存型糖尿病 (IDDM)の発症予防に関する研究
←抗接着分子抗体を用いた NODマウス自己免疫性IDDMの回止一
神戸大学医学部内科学第二講座(指導・春日雅人教授)
長谷川
裕
(平成 6年 1月2
1日)
要約
緒言
接着分子は数多くの重要な免疫応答を担っているこ
NODマウスは勝ラ島への単核細胞浸潤(勝ラ島炎)
とから，種々の自己免疫疾患の病因にも関与している
とそれに号￨き続いて起こる豚 β細胞の破壊による顕性
ことが窺われる。しかしながら，自己免疫疾患である
糖尿病発症を特徴とし，臓器特異的自己免疫疾患のー
インスリン依存型糖尿病 (IDDM)の発症機構におけ
っと考えられているヒト IDDMの優れたモデル動物
るその役割はよく分かっていない。我々は接着分子の
である 0.2九本モデルにおける勝ラ島炎の進展及び糖
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) とその c
adhesion m
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1CICAM-l)がヒト IDDMの
onobese d
i
a
b
e
t
i
c(NOD)マウ
モデル動物である n
尿病発症には T細胞が重要な役割を果たしていること
が明らかになっているが (4.5 ぺ 直 接 の 勝 S細胞破壊の
機序については未だに不明である。
T細胞による抗原認識機構は T細胞受容体. MHC
スの自己免疫性糖尿病の進展に関与していること示唆
分子，特異抗原の古典的三分子複合体によって形成さ
する幾つかの知見を得た。免疫組織学的検索において，
れる。それに加えて，幾つかの抗原非特異的アクセサ
リ一分子が T細胞の標的への接着や T細胞への制御シ
NODマウス勝のラ島浸潤単核細胞および血管内皮細
胞に ICAM-1分子の高発現を認めた。 I
nv
i
v
oにお
いて抗 LF
A-1(CDlla)あるいは抗 ICAM-1抗体
0
週齢(あるいは 1
2週齢)まで投与する
を 5週齢より 3
示細胞による抗原提示，炎症部位への白血球遊走，
グナルの変換を促進する。 LFA-1と ICAM-1分子
は接着分子の重要な一組でへその相互作用は抗原提
と，単独あるいは両者同時投与の如何にかかわらず，
キラー細胞による標的細胞破壊などに関与してい
勝ラ島炎及び糖尿病発症を著明に抑制したが，サイク
る(8，
9
，川。今回，ヒト IDDMや NODマウス勝におい
(Cy) 誘発糖尿病は抑制し得な
て ICAM-1分子の発現が認められたとの報告がある
ロフォスファマイド
両分子の NODマウス自己免疫性糖
かった。糖尿病発症 NODマウス勝ラ島由来単核細胞
ことより
を用いた若齢 NODマウスへの勝ラ島炎及び糖尿病の
尿病の病因における役割を検討した。これらの接着分
，
(
1
11
2
)
e
c
i
p
i
e
n
tに投与することに
受け身移入は，両抗体を r
子が NODマウス糖尿病発症機構のどの時期に重要な
より完全に阻止された。更に，勝ラ島にリンパ球浸潤
役割を担っているかを調べる為，まず各週齢 NODマ
が始まる以前の 2-4週齢の NODマウスに両抗体を
ウス勝の両分子の発現を免疫組織学的に検索し，次い
少量短期間投与することにより，勝ラ島炎及び糖尿病
で抗 LFA-1及び抗 ICAM-1抗体を用いて自然発症
の発症を完全に抑制し得た。以上の結果は. LFA-1
及び CY誘発糖尿病の阻止を試みた。更に. LFA-1
/ICAM-1 pathwayは勝ラ島炎形成の早期に重要
な免疫学的役割を果たしており，更に LFA-1/ICA
M寸分子間作用を阻止することは NODマウス自己
免疫性糖尿病の発症を強力に予防する効果があること
/ICAM-1 pathwayの勝ラ島特異的単核締胞の勝
ラ島への m
lgratlOnにおける関与を検討するため，
糖尿病発症 NODマウス勝ラ島由来単核細胞を若齢
NODマウスへ移入し，この時 r
eClp
i
e
n
tに両抗体を
を示唆している。
投与して受け身移入の阻止実験を試みた。
Keywords目インスリン依存型糖尿病 (IDDM)，接着分子，勝ラ島炎，モノクローナル抗体療法，受け身移入
に用いた。なお得られた単核細胞のほとんどは T細胞
実験材料と方法
でそのうち 1
0-30%は CD4陽性. 70-90%は CD8陽
[
1JNODマウス・塩野義油日ラボラトリーより供
与され，神戸大学医学部附属動物実験施設において維
持されたコロニーを使用した叩。当コロニーにおい
て勝ラ島炎は 6-8週齢頃より認められ，加齢ととも
5週齢以降に見られ，累積
に増強した。糖尿病発症は 1
糖尿病発症率は 3
0週齢において雄で 5%.雌で 65%で
あった(14)。
[2Jモノクローナル抗体 LFA-lの αサブユニッ
a
)に対する単一クローン性抗体である KB
ト(CD11
A[
r
a
t IgG2aJぺ
( ICAM-1に対する抗体である
Y.Nl/1
.7[
r
a
t IgG2bJ1
(
6
.17). L
FA-lの β サブユ
性 T リンパ球であった。
[6J抗接着分子抗体による NODマウス糖尿病阻止
実験:
(1
)P
r
o
t
o
c
o
l 1 自然発症糖尿病の阻止実験(1)・
5週齢・ 9
0匹の雌性 NODマウスを 7群 (A-G群)
に分け，抗体を 5週齢から 3
0週齢までの投与群と 1
2週
0
週齢迄観察した群を糖尿病と勝ラ
齢迄投与後中止し 3
島炎にて比較検討した。 A群は無処置コントロール群，
B.D及び F群はそれぞれ抗 CD11
a抗体 (500μg).
抗 ICAM-1抗体 (
500μg)及び NRG(500μg)を
5週齢から 3
0週齢まで，又 C.E及びG群はそれぞれ抗
CD11
a抗体 (500μg).抗 ICAM-1抗体 (500μg)
)に対する抗体である M18/2[
r
a
tIgG
ニット (CD18
2
a
J(削(この抗体は m v
l
t
r
oでの細胞傷害性をブロッ
及び NRG (
500μg) を 5週齢から 1
2週齢まで週 2回
クしな L、)を分泌するハイブリドーマを維持培養し，
腹腔内投与した。
そ し て コ ン ト ロ ー ル 抗 体 と し て 正 常 ラ ッ ト IgG
(
I
I
) Protocol 2 ・サイクロフォスファマイド (CY)
(NRG)を用いて解析を進めた。これらのハイブリドー
誘発糖尿病の阻止実験・
マをヌードマウスに腹腔内投与し腹水採取し，各単一
0
週齢雄性 NODマウ
既に勝ラ島炎の始まっている 1
クローン性抗体は硫安塩析後プロテイン Gにて精製後
スを 4群 (H-K
群)にわけ. CY(
Asta，Frankfurt，
p
h
o
s
p
h
a
t
e
b
u
f
f
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ds
a
l
i
n巴 (PBS. PH7.4)にて透
Germany社製) 200mg/kgを day0および day14
析し免疫組織学及び m
V1VO投与における阻止実験
に腹腔内投与した。これらのマウスは同時に. (H)
に使用した。 NRGはラット血清を用い同様に精製後
抗 CD18
抗体 (
5
0
0
μ
g
)
. (I)抗 CD11
a抗体 (
5
0
0
μ
g
)
.
使用した。
(J) 抗 ICAM-1抗体 (
5
0
0
μ
g
)
. (K)抗 CD11
a及び
[3Jフローサイトメトリー
牌細胞及び末梢血リン
抗 ICAM-l両抗体(各 500μg) を d
ay-1より 2
5ま
パ球の CD4，CD8，CDlla，CD18，ICAM-l，Mac-l
で 週 2回腹腔内投与し， day28(
14
週齢)まで尿糖と
陽性細胞の比率を各標識単一クローン性抗体を用いて
血糖をチェックした。尚，コントロール抗体として，
FACS4
4
0(
B
e
c
t
o
n Dickinson社)にて測定した。
[4J 免疫組織学的検索 :NODマウス勝組織の凍結
前述のごとく m v
l
t
r
oでの細胞傷害性をブロックし
切片を作製し，豚ラ島浸潤単核細胞，内分泌細胞，血
(
i
l
l
) Protocol 3
:NODマウス棒ラ島由来単核細胞
抗体を使用した。
ない抗 CD18
CD11
a
)
. CD18
及び
管内皮細胞上の CD4，LFA-1(
による移入糖尿病の阻止実験・
ICAM-lの発現を各単一クローン性抗体を用いた酵
2
4匹の若齢雌性 NODマウスを 3群 (L.M.N群)に
素抗体法により検討した。勝ラ島炎の同定のため
7日齢時に勝ラ島由来単核細胞を 1匹あたり
3X 1
05個腹腔内投与し . L群回無処置 M群 . 抗
CDlla抗体および抗 ICAM-1抗体(各々 100μg).
N群・抗 CD18
抗体 (
200μg) を 6日齢より 1
0日齢ま
4日齢で糖尿
で連日とその後は週 2回腹腔内投与し. 3
NODマウス枠組織をプアン固定後パラフィン切片を
作製し，へマトキシリンーエオジン染色にて勝ラ島炎
の程度を観察した。勝ラ島炎は C
harltonらの s
c
o
r
-
0J一[IVJ に分類し.I
n
s
u
l
i
mg分類に準じ Grade [
t
i
ss
c
o
r
eを [OJ は豚ラ島炎を全く認めない場合で
分け
病・持ラ島炎を比較観察した。
0%. [1]は勝ラ島辺縁に勝ラ島炎を認めるもその
(
I
V
)P
rotocol4・自然発症糖尿病の阻止実験 :(2)・
面積が 1/4を越えない場合で 25%. [
I
I
J は 1/4
次に，抗体の少量短期投与を勝ラ島炎の始まる 5週
以上 1/2以下の場合で 5
0%. [
i
l
l
J は 1/2以上 3
齢迄の期間で行った。雌性 NODマウスを 8群 (
a
h
/4以下の場合で 75%. [
IVJ は 3/4以上勝ラ島が
破壊されている場合を 100%とした。
群)に分け，抗 LFA-1(
CDlla)と抗 ICAM-1抗体
[5J勝ラ島由来単核細胞の分離目 1
6
1
9週齢の糖尿
病発症直後の雌性 NODマウスよりコラゲナーゼ法に
OU/mlのrIL
-2存在下で
て勝ラ島を単離し. l
7-
1
0日間培養し増殖してきた単核細胞を受け身移入実験
-2
00μg. 6日間連日投与を (
a
)0
1，(
b
)0
.
5
を各々 1
l
.5，(
c
)1
2，(
d
)2
3，(
e
)3
4，c
f
)4
5，(
g
)5
6週
齢の期間に行ない，又 (h) は1
6日齢から 3
3日齢まで
各々の抗体を 500μg. 6回投与を行った。それぞ
れの群のコントロールとして. PBSあるいは NRG
(200μg又は 1mg) を同様の方法で投与した群をお
て CD4陽性 T細胞と少数の CD8陽性 T細胞であっ
ig.lに糖尿病発症直後の 2
0週齢 NODマウス
た
。 F
いた。
各マウスは尿糖を T
e
s
-Tape(
E
l
i
L
i
l
l
y社製)に
勝の免疫組織学的染色を示す。勝ラ島浸潤単核細胞
てチ&ツクし，陽性を示したものについて g
l
u
c
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s
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o
x
i
d
a
s
e法により血糖を測定して， 300mg/dl以上
i
g
.1D) は LFA-1 (CD
(主に CD4陽性T細胞， F
ではなしつのみならず (
F
i
g
.1B)， ICA
l
l
aで CDl8
を示したものを糖尿病と判定した。糖尿病発症マウス
M-lも強く発現していたが (
F
i
g
.1C)，一方，勝ラ
島内分泌細胞上に ICAM-lの発現は認められなかった。
それに対し，血管内皮細胞上の ICAM-1の発現は著
は発症時に，未発症マウスは 3
0
週齢時に頚椎脱臼にて
屠殺し，
w
革の組織学的検索を行なった。
[
7J統計学的解析.結果は平均値±標準偏差にて示
F
i
g
.1C)。通常.休止期 T細胞と
しく増強していた (
n
s
u
l
i
t
i
ss
c
o
r
e
すとともに糖尿病発症率はど検定， I
血管内皮細胞上の ICAM-lの発現は低いことより，
は Mann-whitneyU検定，その他は S
t
u
d
e
n
tT検
これらの所見は注目すべきであると考えられた。
定により統計学的に解析した。
[2]末梢白血球の LFA-l発現.フローサイトメト
リーによる解析では，抗 LFA-l及び抗 ICAM-1抗
結 果
体投与により末梢白血球ならびに牌細胞の細胞数や
勝の凍結切片において LFA-1 (CDll
a，CDl8
)及
CD4，CD8，Mac-1陽性細胞数及びこれらの比率
に変化はなかった。 F
i
g
.
2 に抗体非投与 A群 (A，B
.
0週齢まで抗 CDlla抗体投与 B群
C)， 5週齢より 3
(D，E，F) 及び 5週齢より 1
2週齢まで抗 CDlla抗
び ICAM-lの発現は認めなかった。勝ラ島炎の経過
G
.H.I)の 1
5週齢時の末梢白血球にお
体投与C群 (
n
革ラ島浸潤単核細胞の大部分は T細胞で，主とし
0
週齢まで抗
ける LFA-lの発現を示す。 5週齢より 3
[
1JNOD勝における LFA-l及び ICAM-1の発
現・勝ラ島炎の起こっていない 5週齢以前の NOD
中
，
F
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g
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rr
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tsi
sshown.
ー
3-
体投与中の B群マウスの 1
5週齢時の末梢白血球におい
G群 (5/12，41%) に対して，抗 CDll
a抗体を投与
0/12，
0%，P<0.005)，C群 (
0
/
1
2，
0%、
された B群 (
P<0.005)，あるいは抗 ICAM-l抗体投与の D群 (
0
F
i
g
.
2
F
)。
ては LFA-l分子の発現は低下していた (
この時に二次抗体単独でも同程度の発現が認められた
ことより (
F
i
g
.
2
E
)，抗 CDlla抗体は白血球上の LF
/12，
0%，P<0.005)，E群(1/1
0，
10%，P<0.05) で
A-l分子に結合しこの分子の downmodulationを
誘導することが示唆された。しかしながら 5週齢よ
糖尿病の自然発症はほぼ完全に阻止されていた。更に，
2週齢まで抗体投与の C群マウスの 1
5週齢時末梢白
り1
B群: 5:
1
:7%
， C群
投与群 (
血球ではこれらの影響が見られなかったことより (
F
i
抗 ICAM-l抗体投与群(D群
組織学的検索にて I
n
s
u
l
i
t
i
ss
c
o
r
eは抗 CDlla抗体
1
6:
1
:1
7%)，あるいは
7:
1
:12%，E群 3
2土
20%) で，コントロール群 (A群 :6
2:
1
:29%， F群.
5
0土 48%，G群:5
8士25%) に対し有意に抑制されて
g.2H，0，その効果は抗体持続投与終了後 3週間以内
に消失することが推察された。
[3]糖尿病自然発症の阻止・ Protocollの結果は
いた。以上より 3
0
週齢までの抗体投与 (B，D群)のみ
Tabl巴 1
1こ示す様に無処置 A群(糖尿病発症率・ 12/
2
1，57%) 及 び NRGを投与した F群 (5/11，45%)，
ならず， 1
2週齢で抗体投与を中止した群 (C，E群)に
おいても各抗体単独投与によりほぼ完全に自然発症糖
y
t
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f age from group A
Figure 2
. Flow c
(
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:
A，B，C
)，groupB (
a
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C
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3
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)，andgroupC C
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)m
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.
C
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1
2wk;G，H，1
A
川
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ωaEコZ =υ
D
B
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時
、
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1
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、
、
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J
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'山仰げ
1
ぴ
UNド!
胤叫
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4
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c
t
so
fanti-LFA-l(CD11a) and
a
n
tト ICAM-1 mAbsonspontaneous
d
i
a
b
e
t
e
sandi
n
s
u
l
i
t
i
si
nNODmice
T
r
e
a
t
m
e
n
t
Group
Ab
i
n
L
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r
v
a
l(
w
k
)
I
n
c
i
d
e
n
c
eo
fd
i
a
b
e
t
e
s
5
1
2
J
/
I
O
1
0
*ヰ
5
3
0
5
1
1
1
45
NRG
5
1
2
5
1
1
2
4
1
内，&
a
n
t
i
I
C
A
M
I
NRG
F
i
v
ew
l
←oldfemaleNODmicewereassigned
t
os
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v
e
ng
r
o
u
p
s
. Eachgroup was i
n
j
e
c
t
e
di
p
w
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t
ho
rw
i
t
h
o
u
tAbt
w
i
c
eaweeke
i
t
h
e
rfrom5
t
o3
0wko
fageo
r5t
o1
2wko
fa
g
e
. Forh
i
s
t
o
l
o
g
i
c
a
l examination，n
o
n
d
i
a
b
e
t
i
c mice were
k
i
l
l
e
da
t3
0wko
fage，whiled
i
a
b
e
t
i
cmicewere
k
i
l
l
e
dond巴v
e
l
o
p
i
n
gd
i
a
b
e
t
e
s
. 唱P<0.005
・
，'P<
0
.
0
5and'P<0.01v
sgroupA，ForG mice，r
e
s
p
e
c
t
i
v
e
l
y
尿病を限止し得た。
[
4JCY誘発糖尿病の阻止
Protocol 2の結果は
Table 2
'こ示す様に糖尿病発症率は H群(コントロー
ル抗体投与) :1
8/31，58%， 1
群(抗 CDlla抗体投
/18，67%， K群(抗 CDlla及び抗 ICAM-1抗体投
は全く糖尿病の抑制は起こらなかった。
ている可能性が考えられた。
[5J移入糖尿病の阻止
P
r
o
t
o
c
o
l 3の結果は
Table 3に示す様に糖尿病発症率は L群(未処置):
4/8 (50%)，M群(抗 CDlla及び抗 ICAM-1抗
体投与)・ 0/9 (0%
)
， N群(コントロール抗体投
与):2/7 (29%) と若齢 NODマウスへの NOD
勝ラ島由来単核細胞移入により，早期に糖尿病が誘発
されたが， これに両抗体を投与した M群では糖尿病は
完全に抑制されていた。勝ラ島炎は L'N群には著明
に認められたが (
Fig.3A
)
， M群にては 9匹中 4匹
には全く認められず (
F
i
g
.3B)，残り 5匹には極く
軽度に見られるのみであった。一方， この日齢の無処
置NOD マウスには豚ラ島炎は全く存在しなかった。
以上のことより両分子は抗原認識 T細胞の homing
に関与している可能性が示唆された。
1
2
1
1
8
antI-CDlla+a
n
t
i
I
C
A
M
l
9
/
1
5
Table m
. Effectofant卜 LFA-1(CDll自) and
anti-ICAM-1 mAbs on a
d
o
p
t
i
v
e
t
r
a
n
s
f
e
ro
fi
n
s
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tNODmice
口同 d
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(
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)
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e
n
c
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fD
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b
c
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c
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G
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l
l
p
1
1
1
mAb d
i
a
b
e
t
i
c
l
t
o
t
a
l(
%
)
I
V
4/8 50
2
6土2127
土1
4
1
9
土1
2
16
:
1
:
2112
土1
240
土1
9
M
a
n
t
i
C
D
l
l
a
+
a
n
t
i
I
C
A
ル1
1
α9
0
'
9
3
:
!
:
8 4
士5 1
士2 1
土1
N
a
n
L
i
C
D
I
8
2
1
7
2
9
2
8
士1
625
土82
0
土1
9
1
4
土1
31
1士8 3
8
土1
6
L
以上の結果より LF
A-1(CDlla)/ICAM-1p
a
t
h
-
m
t
l
a
tlOnに重要な役割を果たし
wayは勝ラ島炎の l
anli-ICAM-l
Ten-wk-oldmaleNODmicewerei
n
j
e
c
t
e
di
p
withcyclophosphamideonday0and1
4
. These
mlc巴 wereassignedt
of
o
u
rgroupsandt
h
emice
i
n each group were administered e
i
t
h
e
r with
anti-CD18mAb，a
n
t
i
CD11
a mAb，anti-ICAM
1mAb，orbothmAbst
w
i
c
eaweekfrom day
-1t
o2
5
. l
n
c
i
d
e
n
c
eo
fd
i
a
b
e
t巴swase
v
a
l
u
a
t
e
d
14wko
fa
g
e
)
. Nos
i
g
n
i
f
i
c
a
n
td
i
f
f
e
onday2
8(
r
e
n
c
e
s w巴r
e observed between group H and
group1
，J，K.
与):11/15，73%，J群(抗 ICAM-1抗体投与・ 1
2
与):9/15，60%と，勝ラ島炎形成以後の抗体投与で
1
8
1
3
1
1
1
1
1
5
ω
。
市
anti-CDl8
a
n
t
i
C
D
l
l
a
乃間山
α12
d
i
a
b
e
t
i
c
/
t
o
t
a
l (%)
日
A
5
3
0
HIJK
a
n
t
i
I
C
A
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I
*本
0
情
明日市打計却特お
0
1
J
0
1
1
2
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0
1
1
2
5
1
2
今
，
5
3
0
a
n
t
i
C
D
l
l
a
土 7 士 l
土土土
土 Z08
6 5土167 3
53
a
n
t
i
C
D
1
1
a
mAbadminist田 Hon
Group
%
bq
Lnu'A
2'i1 1
11
11
ABCDEFG
57
l
n
c
i
d
e
n
c
eo
fd
i
a
b
e
t
e
s
I
n
s
u
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a
b
e
t
i
c
l
l
o
t
a
l
(
%
)
1
2
1
2
1
Tablen
. Effectsofanti-LFA-1(CDlla) and
anti-ICAM-1 mAbsoncyclophosph
a
m
i
d
e
i
n
d
u
c
e
dd
i
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t
e
si
nNODm
i
c
e
.
土2
'事
S
e
v
e
n
d
a
y
o
l
d NOD mice were i
n
j
e
c
t
e
di
p
with 3X 1
0
'i
s
l
e
t
d
e
r
i
v
e
d mononuclear c
e
l
l
s
from newly d
i
a
b
e
t
i
c NOD donor
. Group L
micewereobservedu
n
t
i
l3
4dayso
fagewithout
any treatment，wher巴a
sboth anti-CDl
1a and
anti-ICAM-1 mAbs f
o
r group M mice，and
anti-CD18mAbf
o
rgroupN micewereadminis
t
e
r
e
di
peverydayfrom6t
o1
0dayso
fageand
t
w
i
c
eaw巴巴 kt
h
e
r
e
a
f
t
e
r，r
e
s
p
e
c
t
iv
e
l
y
. Cumu
l
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t
i
v
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n
c
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c
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i
a
b
e
t
e
sandi
n
s
u
l
i
t
i
ss
c
o
r
ei
n
bothgroupswere巴xamineda
t3
4dayso
fage
Thegradeo
fi
n
s
u
l
i
t
i
s (1IV) was c
a
l
c
u
l
a
t
e
d
so
fi
s
l巴t
s showing each
a
sf
o
l
l
o
w
s
; numb巴r
grade/ numbers o
ft
o
t
a
li
s
l
e
t
s examined i
n
eachmouseX 1
0
0，andt
h
e
nc
a
l
c
u
l
a
t
e
dt
h
ea
v
e
ragev
a
l
u
eo
fgroupL mice (n 8，t
o
t
a
li
s
l
e
t
s
examined i
n each mouse: 3
5:
t21)， group M
mice (n=9，3
9:
t1
1
) andgroupN mice (n=7，
2
8:
t1
8
)
.'P<0.05，and '<0.005v
sgroupL and
groupN
二
市
目
-5-
Figure 3. Histology o
f NOD i
s
l
e
t
s showing p
r
v
e
n
t
i
n
ge
f
f
e
c
t o
f anti-LFA-1 and anti-ICAM-1
mAbsona
d
o
p
t
i
v
et
r
a
n
s
f
e
ro
fi
n
s
u
l
i
t
i
s
.
Transfusi
ono
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s
l
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t
d
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r
i
v
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dmononuc
Je
arc
e
l
l
sfromnewlyd
i
a
b
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t
i
cNODdonorsi
n
t
oyoungNOD
r
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c
i
p
i
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n
t
s induced advanced i
n
t
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ai
s
l
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ti
n
f
i
l
t
r
a
t
i
o
no
f mononuc
Je
ar c
e
l
l
s (A). Howe
v
er，mAbst
r
e
a
t
e
dr
e
c
i
p
i
e
n
t
ss
howedcompletelyi
n
t
a
c
ti
sl
e
ts(
B
)
とにより，糖尿病発症のみならず牌ラ島炎も完全に抑
[6]少量短期抗体投与による自然発症糖尿病の阻止.
制し得た。
Protocol 1-3 の実験結果より. LFA-1/ICA
M-l pathwayは糖尿病発症以前とりわけ勝ラ島炎
考 察
発現にかかわる i
n
i
t
i
a
t
i
o
nphaseに大きく関与して
いると考えられる。そこで，勝ラ島炎が出現する 5週
齢以前の各期間に CDlla及 び ICAM-1，こ対する抗
今回の研究で. NODマウスの糖尿病発症における
0週齢時の糖尿病発症率と
体を少量短期間投与して 3
LFA-l/I
CAM-1 pathwayの重要性を明らかに
i
n
s
u
l
i
t
i
ss
c
o
r
eを検討した。 Protocol 4の結果は
し，加えて本 pathwayを抑制することにより. IDD
Table 4に示す様に (
a
)ベ
h
)群で3
0
週齢までの糖尿病
M 発症予防が可能であることを示した。
発症率と i
n
s
u
l
i
t
i
ss
c
o
r
eは. (
a
) 0/11;
l6:
t1
5%.
a
)分子はほぼ全ての末梢
一般に. LFA-1(CDll
t15%. (
c
)1
/1
1
;
5:
t12%. (
d
) 0/12;
(
b
)1
/9;1
0:
白血球上に認められ， この分子の接着の増加はその親
4
:
t
l
.
l
%
.(
e
) 0/11;18:
t20%. (
f
) 0/1
O;
3
2:
t3
3
0.
和性の増加に基づくものであり，その発現量は変化し
%. (
g
) 2/10;38:
t37%. (
h
) 0/7
;
0:
t0%. であっ
ないといわれている 〔
吐則。一方. ICAM-l分子は休
た。未処置コントロール群は A
.F，G，群と同様の傾
が
，
止期の T細胞を含む末梢白血球において発現は弱 L、
6士8%.i
n
s
u
l
i
t
i
ss
c
o
r
e
;
向(糖尿病発症率;n=52，5
I
L
-1，TNF. IFN-rなどのサイトカインに反応し
n=52，
5
5:
t46%) を示した。このように勝ラ島炎形成
てその発現量は増加する〈
ω
.2
1 制。今回の結果では.
以前(特に 2-3週齢〉に少量短期抗体を投与するこ
8
革ラ島浸潤単核細胞(主として CD4陽性 T細胞)上
6
Table I
V
. E
f
f
e
c
to
fs
h
o
r
t
t
e
r
mt
r
e
a
t
m
e
n
twi
t
h
anti-LFA-1
(CDlla) andanti-ICAM
-1 mAbs b
e
f
o
r
eo
n
s
e
to
fi
n
s
u
l
i
t
i
s
onspontaneousd
i
a
b
e
t
e
s and i
n
s
u
l
i
t
i
si
nNODmice
mAbA
d
m
l
n
l
s
l
r
a
t
l
o
n
Group
I
n
C
l
d
c
n
c
c0
'
1D M
m
t
e
r
v
a
J(
w
k
)
唆している。我々の免疫組織の結果においては勝ラ島
上に ICAM-lを検出できなかったが，免疫組織学的
染色法の感受性の問題(11) により上記の可能性は否定
できない。しかしながら，抗 LFA-lおよび抗 ICA
JLISS
c
o
r
e
I
n
s
u!
も
9
害性T細胞の LFA-lが牒 β細胞上の ICAM-1と反
応することにより標的細胞破壊を増強する可能性を示
%
nVIVO投与が CY誘導による糖尿病を阻
M-l抗体の l
(
a
)
0
1
O
!
l
l
O
I
I
1
6
:
t1
5
止できなかった結果より考えると直接的な豚 β細胞破
(
b
)
0.
5
-1
.
5
1
I
9
I
I
8
1
0. 1
5事 事
壊における LF
A-1/ICAM-1 pathwayの関与は
(
じ
)
1
2
1
I1
1
9
1
0
f
:1
2車率
5:
2
3
。
1
1
2
。
少ないと考えられる。言い換えると，週齢が進んでか
(
d
)
1
2
0.1
明
ら，すなわち自己反応性T細胞が勝ラ島へ浸潤してか
I
c
)
3
4
(
ν
I
I
O
I
I
1
8
土 2
0
(
1
)
4
5
0
/
1
0
。
1
0
32
土 3
3
(
副
5
.
6
2
1
1
0
(
h
)
2
4
じ7
2
0
京本
本
8
38~
7
Q土 叫
ら以降の時期においては，少量・短期間の両抗体の投
与を行っても糖尿病発症を阻止することができないこ
37
とを意味している。
i
次に勝ラ島特異的自己反応性 T細胞の m
igration
Eachgroup (
a
)ー(
g
)wast
r
e
a
t
e
dwith100μg
mAbsa
g
a
i
n
s
tCDllaandICAM-1 f
o
r6conse
c
u
t
i
v
ed
a
y
s
. Group (h) was t
r
e
a
t
e
d 6 tim巴S
e
v
e
r
y2
3dayswith500μgmAbsa
g
a
i
n
s
tCDlla
andICAM-1between1
6
3
3dayso
l
d
. Asac
o
n
t
h
e
rr
e
c
i
p
i
e
n
tmic
巴 w
ere
t
r
o
1f
o
reachgroup，o
administerednorma1r
a
tIgG(200μg) witht
h
e
samep
r
o
t
o
c
o
1a
s mention巴da
b
o
v
e
. The i
n
c
i
d
e
n
c
eo
fd
i
a
b
e
t
e
sandi
n
s
u
1
i
t
i
si
nc
o
n
t
r
o
1mice
showedt
h
esamet
e
n
d
e
n
c
y(
t
h
et
o
t
a
1i
n
c
i
d
e
n
c
e
o
fd
i
a
b
e
t
e
s 29/52，56%，i
n
s
u
1
i
t
i
ss
c
o
r
e
:n= 5
2，
5
5:
t46%) asTab1e 1
. 唱P<0.001， P<0.005
and'P<0.05v
sc
o
n
t
r
o
lgroup.
目
.繍
における LF
A-1/ICAM-1 pathwayの関与を糖
尿病発症直後の豚ラ島由来単核細胞の受身移入の実験
系を用いて検討した。移入細胞は CD8陽性細胞が
CD4陽性細胞より有意に多く，コントロール抗体投
与群で r
e
c
l
p
l
e
n
tの50%に糖尿病が発症し，未発症の
ものも著明な勝ラ島炎を呈していた。一方， LFA-1
/ICAM-1抗体投与群においては糖尿病・勝ラ島炎
3
H
J サイミジン標識した
も完全に抑制されていた。 [
糖尿病 BBラット牌細胞(コンカナパリン Aで活性化)
を新生児 BBラットに受身移入したところ移入 1週後
に標識・非標識の両者の単核細胞浸潤が勝ラ島内にみ
には LFA-lばかりではなく， ICAM-1の発現の冗
られた〔加。故に，抗体の投与が移入した勝ラ島由来
進も認められた。この現象は抗原提示細胞 (APC)
igrationを阻止し，その
の単核細胞の勝ラ島への m
とT細胞や T-T細胞間の接着や活性化に関与している
結果，梓 S細胞を破壊して顕性糖尿病へと加速させる
と考えられる。また NOD勝 の 血 管 内 皮 細 胞 の
r
e
c
i
p
i
e
n
t由来のリンパ球や単球の勝ラ島への浸潤を
ICAM-lの高発現は白血球の接着を増加させ，内皮
抑制する可能性が考えられた。
を経ての m
igration，勝ラ島への浸潤を助長するこ
n VIVO 投 与 に よ る 接 着 分 子 の down抗体の l
とが示唆される。これらの免疫組織学的結果を踏まえ
modulationの動態や勝ラ島炎出現前の少量短期の
て LFA-1/ICAM-1 pathwayのより詳細な役割
抗体投与による糖尿病発症阻止より考察すると， NO
を知るために，両分子に対する抗体を用いて発症予防
D マウスにおいては生後から自己反応性T細胞(特に
この場合は勝ラ島特異的)が胸腺に存在し
の実験を行った。
2-4週齢
まず勝ラ島炎の起こり始める 5週齢からの両抗体の
において最大でその後急速に減少していくと考えられ
投与を行った。 3
0
逓齢迄の投与のみならず 1
2週齢迄の
る
。 Bachらは NODマウスにおいては T細胞依存性
投与においても糖尿病，勝ラ島炎の発症の低下を見た。
自己免疫性糖尿病は胸腺摘除を新生児期に行うと発症
種々の機構が考えられるが， FACS解析の結果，抗
が低下し，離乳期に行うと発症が促進される事を示し
体投与は LFA-1を有する細胞数を減少させるのでは
た〔問。故に，発症に関与する胸腺由来の自己反応性
なく，個々の細胞における LFA-1分子の発現量の低
T細胞の分化や臓器への移住は非常に限られた新生児
下つまり downmodu1ationを導くと考えられ，そ
期におこり，そして末梢にとどまり最終的に勝ラ島へ
の現象が両分子関の結合等を阻害したことによると考
浸潤すべく増殖をしていくと考えられる。実験結果と
えられた。最近，単離勝ラ島の ICAM-lの発現が
併せて考えると LFA-1と ICAM-1分子は棒ラ島特
mv
l
t
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oの実験においてある種のサイトカインで誘
異的自己反応性 T細胞の胸腺での分化や末梢への移住
導されることが報告された(日制。このことは細胞傷
に重要な役割を果たしていると恩われる。
-7-
Banks，B
. A.，Gregory，A.K
.，Fathmann，
接着分子抗体投与によるサプレッサー細胞の誘導に
関する点などまだ多くの研究が必要であるが，我々の
G.G.: Immunotherapy f
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今回の研究は NODマウスの糖尿病発症機構において
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により重要な役割を果たし，後期，すなわち浸潤細胞
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. Exp.Immunol
による豚 β細胞破壊にはあまり関与してない可能性を
示唆している。最近の報告においても LFA-1/ICA
7) Marlin，S
.D.，and Springer，T，
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非常に効果的である事が示された。
今回の結果は同様の抗体の投与が NODマウスの
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8) Makgoba，M，W.，Sanders，M，日， G
自然発症自己免疫性糖尿病に強力な予防的効果を示し
た最初の報告である。今後， この予防機構のさらなる
Luce，G，E
.，Gugel，E，A.，Dustin，M，L
.
，
解明や他の接着分子の関与の有無等の研究は，人の I
Springer，T，A.，and Shaw，S
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DDMの新しい免疫学的治療法の端緒になると期待さ
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稿を終えるにあたり，終始御指導，御校闘を賜りま
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fICAM-
した第二内科学講座春日雅人教授に深謝致します。
また直接御指導いただきました横野浩一博士，天野
1and HLA-DR r
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和彦博士ならびに御協力頂いた第二内科学講座の先生
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方に深く感謝致します。
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