No.B48

LAAN-A-TM035
B48
No.
Accurate Glycan Analyzerを用いたエリスロポエチン-αの
N-結合型糖鎖解析
Analysis of N-Glycans from Erythropoietin-α Using a Glycan Identification System
“Accurate Glycan Analyzer”.
近年の糖鎖構造解析には質量分析計が多く用いられてい
異なり，MSn（n≧2）
スペクトルを用い且つプロダクトイオン
ます。しかしながら，糖鎖のように構成単糖の質量が同一
の相対強度情報もあわせた検索を行うことで，目的とする
のものが多く且つ多分岐している鎖状分子の場合，質量分
糖鎖の分岐情報を含めた構造を推定することが可能です。
析法を用いてどの分岐にどのような糖が結合しているのかと
これは，MSn測定で得られるプロダクトイオンの相対強度
いう情報を得ることは容易ではありません。特に，タンパク
が糖鎖構造の違い，つまり分岐や結合様式の違いによって
質同定のようにMS/MS を利用したデータベース検索によっ
異なるという事実を利用したものです1）
。
て糖鎖構造を推定するという方法の場合，多くのソフトウェ
そこで，今回は市販のエリスロポエチンに結合しているN-
アがプロダクトイオンのm/z値のみによるマッチングを行って
型糖鎖の構造解析を，MSn測定が可能なAXIMA Resonance
おり，それぞれの構造異性体が持つ分岐構造の情報まで
と糖鎖解析ソフト「Accurate Glycan Analyzer」
を用いて試
を得ることは極めて難しいものとなります。
みた事例をご紹介します。
本稿で用いる糖鎖解析ソフトは，従来のソフトウェアとは
S. Nakaya
分析試料には市販のリコンビナントエリスロポエチン-αを
用いました（Code. 329871, Carbiochem）
。エリスロポエチ
ンは腎臓や肝臓で生合成される糖タンパク質ホルモンで，
その造血作用から，慢性貧血の治療薬などとして広く利用
されています。このエリスロポエチンには様々な構造を持っ
た糖鎖が結合しており，一般に3箇所のN-型糖鎖(N-glycan)
結合サイトと1箇所のO - 型糖 鎖(O-glycan) 結合サイトが存
在し，各サイトには様々なバリエーションを持った糖鎖が結
合しています（Fig. 1）
。エリスロポエチンが造血ホルモンと
して機能するためには，この糖鎖修飾がきわめて重要であ
ることが知られています。
この試料5 µgを用いてSDS-PAGEを行ない，得られたバ
ンドを 切り出してゲル 内トリプシン 消 化を実 施した後，
N-glycanの切り出しとシアル酸の脱離を行なったものをPA
化標識しました。標識後に精製して得られたPA化N-glycan
混 合 物に対して，MS測 定，nanoLCによる分 離，MSn測
定とデータベース検索を実施し，エリスロポエチン-αに結合
しているN-glycanの構造推定を試みました（Fig. 2）
。
はじめにPA化N glycan混 合 物をAXIMA Resonanceを
：N型糖鎖結合サイト
：O型糖鎖結合サイト
Fig. 1　エリスロポエチンの立体構造
出典：PDB Protein Data Bank (http://www.pdb.org)
NMR Structure of the Human Erythropoietin
The source: PDB Protein Data Bank (http://www.pdb.org)
PDB ID: 1BUY.
Cheetham, J.C., Smith, D.M., Aoki, K.H., Stevenson, J.L., Hoeffel,
T.J., Syed, R.S., Egrie, J., Harvey, T.S. NMR structure of human
erythropoietin and a comparison with its receptor bound conformation.
Nat Struct Biol. 1998 Oct;5(10):861-6.
No.B48
用いてMS測定したところ，複数のシグナルが観測されまし
・SDS-PAGE
た（Fig. 3）
。 この マス スペ クトル デ ータか ら「Accurate
Glycan Analyzer」
を用いてPA化N-glycan由来イオンの抽出
を行なった結果，11個のシグナルがPA化N-glycan由来イオ
・Glycopeptidase-F によるN-glycanの切り出し∗
ンであると提示されました。
「Accurate Glycan Analyzer」はAXIMA Resonanceとリ
・BlotGlyco Kit によるN-glycanのPA標識・精製∗
アルタイムで連携することで，MSデータからの糖鎖由来イ
オンの抽出や糖鎖の構造推定に有用なMSnプリカーサイオ
・100 mM TFA によるシアル酸脱離
ン候補の提示，MSnデータを用いたデータベース検索によ
る構造推定を行なうためのソフトウェアです（Fig. 4）
。
・PA化N-glycan混合物のMS分析
糖鎖由来シグナルの特定
（Fig. 3）
・nanoLCによる糖鎖の分離
・MALDIプレートへのスポッティング
糖鎖の相対定量
（Fig. 5）
糖鎖解析ソフトにより提示されたPA化N - glycan由来イオ
ンの糖鎖構造を推定するには，混合物中に存在する同質量
異性体を事前に分離する必要があります。そこで，カーボン
グラファイトキャピラリーカラムを装着したnanoLC-AccuSpot
を用いて上記PA化N-glycan混 合 物の分 離とMALDIター
・MSn 分析
ゲットプレートへのスポッティングを行ないました（Fig. 5）
。
尚，nanoLCの溶媒には，その後の質量分析への影響を最
糖鎖構造推定
（Table 1）
Fig. 2　糖鎖構造解析のワークフロー
Workflow of the Glycan Structure Analysis
小限にするため，揮発性成分であるアセトニトリルとギ酸水
＊Glycopeptidase-F (Code. No. 4450) およびBlotGlyco Kit (Code.
BS-45063) はそれぞれタカラバイオ，住友ベークライトの製品です。
%Int.
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
2617.9
2400
m/z
2600
2800
3000
3200
3400
3713.2
3348.0
0
2983.0
20
2836.9
40
2106.7
1741.6
60
：N-glycan 由来イオン
([M+Na]+)
2471.8
2252.8
849.3
80
1887.7
100
3600
3800
Fig. 3　エリスロポエチン-αから切り出した糖鎖（脱シアル酸化，PA化（ピリジルアミノ化）済み）のマススペクトル。
Mass Spectra of PA Labeled and Desialylated N-glycans from the Erythropoietin-α.
Result Window
GUI
Glycan candidates
based on the molecular
ions in the MS
Search result of
MS2 spectral search
Both candidates are remained
Search result of
MS3 spectral search
Major glycan structure is identified
Reference MSn spectra
of the identified glycan
Fig. 4　「Accurate Glycan Analyzer」を用いたMSnスペクトルによる糖鎖構造推定イメージ
Structure Identification Image Using MSn Spectra by the Accurate Glycan Analyzer Software
MALDI機能による自動MS測定を行ないました。得られた
208個のMSデータに対し，これもAXIMAオプション機能で
あ るIntensity Mapping 機 能 を 用 い て， 上 述 し たPA化
N-glycan混合物のMS測定で得られた11個のシグナルが存
在するウェルの追跡を試みました（Fig 6）
。まず，自動分析
で得られたMSデータをMass Spectrum Windowに表示さ
27.5
せ， そこにIntensity Mapping 機 能 に よりMALDI Plate
30.0
32.5
35.0
37.5
40.0
42.5
45.371 min
44.461 min
⑦ ⑧ ⑨ ⑩⑪ ⑫ ⑬ ⑭
41.598 min
43.076 min
43.323 min
⑥
41.024 min
⑤
40.185 min
④
39.252 min
③
38.178 min
個のウェルに対して，AXIMAオプション機 能であるLC-
②
35.536 min
30.619 min
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
34.588 min
①
mV
nanoLC-AccuSpotにより分離・スポッティングされた208
33.500 min
溶液のみの単純な溶媒を用いました。
32.040 min
No.B48
45.0 min
nanoLC condition
Column: Hypercarb KAPPA Capillary column (Lengh: 100 mm, ID 180 um)
Total flow: 1 μL/min
Sol A: 0.1 % formic acid
Sol B: 0.1 % formic acid, 90% CH3CN
Gradient (B conc) : 5 % (0‐5 min), 5‐35 % (5‐50 min), 35‐100 % (50‐55 min),
100 % (55‐65 min), 5 % (65‐70 min)
Detector: ZETALIF 2000 He/Cd Laser, Excitation: 325 nm, Emission: 420 nm
(Picometrics 社)
Info 画面を追加表示させます。次いで，Intensity Mapping
Windowのm/z入力欄に追跡したいm/z値を入力します。する
と指 定したm/zのシグナル 強 度に対 応してMALDI Plate
Info 画面のウェルが色分け表示されます。色分けされた各
ウェルをクリックする事でそのウェルに対応したマススペク
トル が 連 動 して 表 示 され ま す。 こうして 上 述 のPA化
AccuSpot condition
Matrix: 2.5 mg/mL DHB in 80 % EtOH, containing 5 mM NaCl
Matrix flow: 4 μL/min
Spotting rate: 1 spot/15 sec
N-glycan 由来イオンとして提示された11個のシグナルのm/z
値を個々に入力し，対象イオンが存在するウェルを追跡した
結果，14個のウェルに，PA化N-glycan由来イオンが存在
する事が分かりました（Fig. 7）
。
こうして得られた各ウェルに存在するPA化由来N-glycan
について，AXIMA Resonanceと「Accurate Glycan Analyzer」
を用いたMSn測定による糖鎖構造推定を行なった結果，14
種類の糖鎖構造を推定する事ができました（Table 1）
。
今回の糖鎖構造推定では，カーボングラファイトキャピラ
Fig. 5　エリスロポエチン由来N-グリカン（脱シアル酸化，PA化（ピリジ
ルアミノ化）済み）のnanoLCクロマトグラム
nanoLC Chromatogram of N-glycans (delialylated and PA
labeled) from the Erythropoietin-α
Intensity Mapping Window
800
3713.2
2252.8
2617.9
2983.0
3348.0
0
2836.9
20
2471.8
40
2106.7
1741.6
60
追跡したいイオンの
m/z を入力。
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600 3800
m/z
Mass Spectrum Window
%Int.
100
MALDI plate Info
Mass data: 1887.9000
1887.7
80
849.3
%Int.
100
1887.7
PA化N-glycan混合物のマススペクトル
60
55
各ウェルと
マススペクトルは
Linkしている。
80
60
指定したm/zのイオン強度により
各ウェルが色分けされる。
50
45
40
35
30
40
25
20
20
0
15
1400
1600
1800
2000
m/z
2200
2400
2600
10
5
10
15
20
25
30
35 40 45
X / mm
Fig. 6　Intensity Mapping 機能によるサンプル搭載ウェルの追跡
Chase of the Sample Loaded Well Using“Intensity Mapping”Function
50
55
60
65
70
No.B48
Table 1　推定糖鎖構造
Identified Structures of PA Labeled N-glycans
リーカラムを使用することにより複数の同質量異性体を単
純な溶媒組成での1次元nanoLCのみで分離し，さらにMS
n
スペクトルのm/zと相対強度を活用したデータベース検索ソフ
トウェアを用いることで，それぞれの異性体構造を容易に
推定することができました。このような異性体構造の情報
は，従来のデータベース検索ソフトウェアでは容易には得ら
れなかった情報で，本報告の手法が様々な分岐構造を持つ
糖鎖の構造推定に有用であることが示唆されました。
60
60
60
40
40
40
20
20
20
0
0
1700
1750
m/z
35.536 min
%Int.
100
⑤
1800
1850
0
%Int.
100
80
80
80
60
60
60
40
40
40
20
20
20
0
0
⑦
⑴
2252.9
%Int.
100
2200
2400
39.252 min
%Int.
100
⑦
⑵
m/z
2600
2800
0
%Int.
100
80
80
80
60
60
60
40
40
40
20
20
20
0
2000
43.323 min
⑨
2400
0
2700
2800
44.461 min
2983.0
%Int.
100
2200
m/z
%Int.
100
2900
m/z
3000
⑩
%Int.
100
60
40
40
40
20
20
20
0
0
2400 2600 2800 3000 3200
m/z
%Int.
100
⑬
3713.1
⑫
%Int.
100
80
80
60
60
40
40
40
20
20
20
0
0
3400
m/z
3500
2800
2700
3000
m/z
⑪
3600
3700
m/z
3800
2800
3000
m/z
33.500 min
60
3300
2600
m/z
⑧
0
80
3200
2500
3200
60
32.040 min
3348.2
%Int.
100
3200
32.040
1741.7
③
33.500
2252.8
④
34.588
1887.7
⑤
35.536
2471.8
⑥
38.178
2617.7
⑦⑴
39.252
2252.9
⑦⑵
39.252
2837.1
＊
⑧
40.185
2983.0
＊
⑨
41.024
2983.0
＊
⑩
41.598
2836.9
＊
⑪
43.076
2983.1
＊
⑫
43.323
3348.2
＊
⑬
44.461
3713.1
＊
⑭
45.371
3713.1
＊
80
2836.9
80
3000
m/z
⑥
45.371 min
60
2800
2100 2200 2300 2400
m/z
0
80
30.619 min
②
40.185 min
2837.1
1700 1800 1900 2000 2100
m/z
39.252 min
849.3
38.178 min
2617.7
1650
2471.8
④
950
1887.7
%Int.
100
850 900
m/z
③
2252.8
%Int.
100
80
800
30.619
2983.0
②
80
750
①
33.500 min
80
34.588 min
Predicted structure
2983.1
%Int.
100
Peak
Elution Precursor ion m/z
No. Time (min)
[M+Na]+
0
⑭
3600
3200
3713.1
①
849.3
%Int.
100
32.040 min
1741.7
30.619 min
＊を付した構造は、13Cラベル化糖鎖のMSnスペクトルのプロダクトイオ
ン相対強度データから予想した構造 2）
。
3700
m/z
3800
Fig. 7　サンプル搭載ウェルのマススペクトル
Mass Spectra of Sample Loaded Wells
[Reference]
1) A. Kameyama et.al. Anal. Chem, 2005, 77, 4719-4725.
2) A. Kameyama et.al. J. Proteome. Res, 2006, 5, 808-814.
2011年7月
島津コールセンター
0120-131691
TEL:075-813-1691
3100-07101-570-IK
2011.7