糖タンパク質構造解析技術開発

開発した技術の展開
公開
糖鎖医工学研究センター
「健康エンジニアリング
ﾌﾟﾛｼﾞｪｸﾄ」（事後評価）分科会
資料６-１-１
配
分
具体的に開発した技術
出 口
展 開
位置付け
糖タンパク質のタンパク同定と糖
鎖結合位置の大規模解析法
マウス糖タンパク質、糖
鎖結合位置の大規模ＤＢ
ＣａｂｏｓＤＢに組み込み近日中に公
開予定
結合型糖鎖情報が今後
のポイント
糖鎖自動迅速糖鎖切り出し技術
「ＡＧＣ－２」として製品化
（株）島津製作所にて注文生産
結合型糖鎖を切断でき
るのは本システムのみ
ソフト的アプローチ、糖鎖構造の
インテリジェント構造解析技術
糖鎖微量迅速解析シス
テムとして技術を確立
（株）島津製作所より来年度発売
さらに次期プロジェクトにて癌その
他の診断システムへ継続して展開
実用性で優位
IRレーザーによるソフトにイオン
化技術
IRレーザーは（IR OPO
レーザー）は、サイバー
レーザー（株）にて製品化
検討中。
ソフトイオン化レーザー装備質量分
析機は、試作品により、性能を確
認
MALDI-QIT-TOF では
はじめて
自動化ＦＡＣと糖鎖／レクチンの
ヘクトバイヘクトＤＢ
フロンタルアフィニティー
クロマトグラフィー（ＦＡ
Ｃ）・FAC-Tを完成
（株）島津製作所より注文生産
競合製品無し
レクチンアレイによる糖鎖プロ
ファイリング技術
糖鎖ﾌﾟﾛﾌｧｲﾗｰ
SC-ProfilerTM として成１８年１０月
より（株）モリテックスが販売。次期
プロジェクトでも展開
洗浄不要で優位
糖鎖統合データベース構築
ＣａｂｏｓＤＢとしてデータ
ベース構築
知的基盤として近日一般公開予定
データの一部は、質量分析、レクチ
ンアレイの解析に利用
世界標準を目指す
4%
糖鎖迅速自動合成技術開発
「GolgiTM」として完成。
（株）日立ハイテクノロジーズ社に
て注文生産。
次期プロジェクトでさらに展開中
競合製品はない
16%
ヒトの糖転移酵素大量発現技術
試薬として事業化検討
次期プロジェクトにて酵素大量調整
に展開利用
発現遺伝子資源で優位
6%
12%
37%
13%
事業原簿 P２４
糖鎖医工学研究センター
「糖鎖」研究3大ツールの開発 （2005．10．プレスリリース）
エンザイムキュー合成法
糖鎖ライブラリ
多種類の糖転移酵素
２．糖鎖ライブラリ合成ロボット
１．糖鎖遺伝子
３．糖鎖微量迅速解析システム
ヒトゲノム
糖鎖MSn
スペクトルDB
多段階タンデム質量分析(MSn)
分析試料
質量分析計
糖鎖構造
1
事業原簿 P２４
糖鎖医工学研究センター
～糖 鎖遺伝子ライブラリー（可溶型酵素発現用）
糖転移酵素遺伝子
TM
L1
L2
Glyco Gene
～
トランスメンブレンドメインを除いた領域を
PCR で 増幅し、エントリーベクター
(Invitrogen )
に クローニングした。
LR 反応により様々なデスティネーションベクターへの移し替
えが可能であり、最適な精製用
Tag や発現システムを選択でき
る。また、変換カセットを用いることで、様々なベクターをデ
スティネーションベクター化することもできる。
Entry Clone
糖転移酵素エントリークローンリスト　(141 遺伝子 )
Ver.2
Fuc -T (11)
Fuc -T1, -T2, -T3, -T4, -T5, -T6, -T7, -T8, -T9, POFUT1, POFUT2
Gal-T (16)
β3Gal-T1, -T2, -T4, -T5, -T6, β4Gal-T1, -T2, -T3, -T4, -T5, -T6, -T7
core1Gal-T1, COSMC, B(ABO), α4Gal-T
GlcNAc -T (23)
iGnT , β3Gn-T2, -T3, -T4, -T5, -T6, -T7, -T8, MGAT-1, -2, -3, -4A, -4B, -5
MFNG, RFNG, core2GnT1, 2, 3, IGnT1, 2, 3,
α4Gn-T
GalNAc -T (21)
pp- GalNAc -T1, -T2, -T3, -T4, -T5, -T6, -T7, -T8, -T9, -T10, -T12, -T13, -T14, -T15
β3GalNAc-T1, -T2, GALGT, GALGT2,
β4GalNAc-T3, β4GalNAc-T4, A(ABO)
Sia -T (19)
ST3Gal I, II, III, IV, V, VI, ST6Gal I, II, ST6GalNAc I, II, III, IV, V, VI
ST8Sia I, II, III, IV, V, VI
GlcA -T (3)
Glc -T (1)
GlcAT -S, GlcAT -P, GlcAT -I (PG linkage)
β3Glc-T
Heparin/ Chondroitin (11)
EXT1, 2, EXTL1, 2, 3, ChSy , ChPF /CSS2, CSS3, CSGlcA -T, CSGalNAc -T1, -T2
Xyl -T (2)
Xly -TI, -TII
Sulfo -T (34)
HS3ST1, 2, 3A1, 3B1, 4, 5, NDST1, 2, 3, 4, HS2ST1, CHST1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13
HS6ST1, 2, 3, UST, D4ST, GAL3ST1, 2, 3, 4, GALNAC4S-6ST
事業原簿 P２４
糖鎖医工学研究センター
Glycosyltransferase Expression System
Glyco Gene
HISx6 Tag
Glyco Gene
FLAG Tag
Glyco Gene
HA Tag
Glyco Gene
myc Tag
L1
Glyco Gene
L2
pFLAG-CMV1-DEST
pFLAG-CMV3-DEST
pFLAG-CMV4-DEST
pHIS6-CMV3-DEST
pHA-CMV3-DEST
pMyc-CMV3-DEST etc.
Mammalian cells
HEK293T
CHO
COS1
Glyco Gene
GG Entry Clone
FLAG Tag
Glyco Gene
HISx6 Tag
Glyco Gene
S2 cell / FLAG Tag
Baculo virus
pFBIF, pFBIH
Drosophila S2
pMT/BiP/FLAG-DEST
Insect cells
SF21
Hi5
Drosophila S2
etc.
Glyco Gene
HISx6 Tag
pColdII-DEST
pColdIII-DEST
pET20-HIS/FLAG-DEST
E. coli
2
事業原簿 P２４
糖鎖医工学研究センター
ST6GalNAcII
ST6GalNAcIII
ST6GalNAcIV
ST6GalNAcV
ST6GalNAcVI
β4Gal-T1
β4Gal-T2
β4Gal-T3
β4Gal-T4
β4Gal-T5
β4Gal-T6
β4Gal-T7
FUT6
β3Gn-T2
β3Gn-T4
β3Gn-T5
β3Gn-T6
β3Gn-T7
GalNAc4ST-1
GalNAc4ST-2
β3Gn-T8
ST3GalV
ST3GalVI
iGnT
MGAT2
FUT4
POFUT1
POFUT2
Glycosyltransferase Expression in HEK293T Cells
75
50
37
Anti-FLAG
Western Blot
25
糖鎖合成を計画してからおよそ１週間で合成反応開始が可能
問題点
・発現しない
→
他の発現系を検討
・活性が弱い
→
下等生物のオーソログを利用
・量が必要
→
Baculo発現系を使用
およそ100種類の
活性型糖転移酵素を作製
事業原簿 P２９
H.15.4 - 18.3
糖鎖構造解析技術開発プロジェクト
糖鎖医工学研究センター
目的： 糖鎖・糖タンパク質構造解析手法の開発
レクチンを活用した方法
質量分析装置を活用した方法
9
9
9
9
‡
‡
‡
MALDI-QIT-TOF MSによる糖鎖構造解析
IRレーザーによるソフトイオン化法の開発
波長可変赤外レーザーによる選択的断片化法
断片化プロセスの計算化学
MALDI-MSによる糖鎖のネガティブモード解析
グリコサミノグリカン（GAG）関連糖鎖の解析
ピレン標識によるヒトミルクオリゴ糖の構造解析
‡
9
9
9
9
グライコーム型戦略
糖タンパク質大規模解析（IGOT）
糖鎖自動切り出し装置（ＡＧＣ）
FAC自動化装置
エバネッセント励起型糖鎖プロファイラー
支援技術
‡ レクチンライブラリ
‡ 植物改変レクチン
‡ 糖鎖ライブラリ
‡ 糖転移酵素のクローニングと発現
糖鎖データベース
‡ レクチンDB
‡ 糖タンパク質DB ‡ MSスペクトルDB
‡ レクチン相互作用DB
‡ オリゴ糖DB
‡ インテリジェント解析システム ‡ 糖鎖構造推定アルゴリズム
3
事業原簿 P５５
糖鎖医工学研究センター
効率的な糖鎖ライブラリの合成 （エンザイムキュー合成法）
Enzyme Cue
未反応物
生成物
生
未
未
生
特長１
特長２
試験管に2nの糖鎖が生成
分子量タグ-ライブラリ
事業原簿 P５５
糖鎖医工学研究センター
An Example of Preparation of MW-Tagged Glycopeptide Library
Galβ1-4GlcNAcβ1
β4Gal-Core2
6
Galβ1-3GalNAcα1
ST3GalIV (37 ºC 20h)
FAM-AHGVTSAPDTR
GalNAc
Gal
GlcNAc
Fuc
β3GnT2 (37 ºC 2h)
Neu5Ac
FUT6 (25 ºC 0.5h)
β4GalT1 (25 ºC 2h)
1
2
3
X
1
4
X
2
3
5
6
7
8
7
4
6
5
8
4
事業原簿 P５５
糖鎖医工学研究センター
糖鎖ライブラリ自動合成ロボット
反応管ホルダー
薬液
反応槽（37℃）
酵素
精製用チップ
分注用チップ
事業原簿 P５４
糖鎖医工学研究センター
5
事業原簿 P５４
糖鎖医工学研究センター
Releasing of Oligosaccharides from Glycoprotein
PNGase
Hydrazinolysis
6Galβ1
4GlcNAcβ1
Neu5Acα2
6Galβ1
4GlcNAcβ1
Neu5Acα2
6Galβ1
4GlcNAcβ1
6
Manα1
2
N-Glycan
6
Manβ1
3
4GlcNAcβ1
Neu5Acα2
Amino acid
Asn
4GlcNAcβ1
2Manα1
Amino acid
Neu5Acα2
3Galβ1
O-Glycan
3GalNAcα1
Amino acid
Ser/Thr
Amino acid
O-Glycanase
Alkaline reduction
事業原簿 P６１
糖鎖医工学研究センター
実用化、事業化の見通しについて
研究項目①糖鎖構造解析
６．全自動糖鎖切り出し装置・AutoGlycoCutter-2（島津製作所・近畿大学）
利用分野：糖鎖研究
事業化時期：注文生産
AutoGlycoCutter-2
6
事業原簿 P５４
糖鎖医工学研究センター
AGC
AutoGlycoCutter (AGC) for O-Glycan Releasing
The 2nd model
The 1st model
Injector
Sample tray
Injector
Sample tray
Reactor
Cation-exchange
cartridge
degasser
Cationexchange
cartridge
UV Detector
Reactor
Pump
1
事業原簿 P５４
糖鎖医工学研究センター
質量分析計を用いた糖鎖の構造解析技術開発に関する成果
„ MALDI-QIT-TOF MSによる糖鎖構造解析
¾ 糖鎖微量迅速解析システムの開発（AIST, Shimadzu, MKI）
¾ 糖鎖のMS/MSスペクトルシミュレーション手法の開発
（AIST, Shimadzu, MKI, 野口研）
¾ 膜上グライコプロテオミクス(AIST, Shimadzu)
„ MALDI-MSによる糖鎖のネガティブモード解析 (東大理)
„ MALDI-QIT-TOF MSによる糖脂質・糖ペプチドの構造解析 (理研)
„ グリコサミノグリカン（GAG）関連糖鎖の解析 (AIST, 生化学工業)
„ ピレン標識によるヒトミルクオリゴ糖の構造解析 (野口研)
7
事業原簿 P５４
糖鎖医工学研究センター
糖鎖の構造は非常に複雑である
結合位置
（手が5本ある）
Galβ1-4GlcNAc
Galβ1-3GlcNAc
分枝構造
（枝分れする）
研究の進歩が遅い
合成も分析も難しい
O-GalNAc
O-GlcNAc
立体異性
（手の向きの違い）
Core1(Galβ1-3GalNAc)
Core8(Galα1-3GalNAc)
事業原簿 P５４
糖鎖医工学研究センター
Multi-Stage Tandem Mass Spectrometry (MSn)
OH
O
O HO
HO OH
OH
O
O
NHAc
HO
O
HO
HO
OOH
O HO
HO
O
O
HO
OH
O
HO
HO OH
NHAc
O HO
O
O
O
HO
OH
OH
HO
MS
NHAc
O
HO
O
OH
OH
OH H
N
NHAc
Exact Mass: 5075.9878
N
衝突誘起解離（CID）
OH
O
O HO
HO OH
OH
O
O
NHAc
HO
O
HO
HO
OOH
O HO
HO
O
O
HO
HO
O
HO
HO
MS2
OH
NHAc
OH
OH H
HO
O
O
HO
N
O
O HO
OH
NHAc
NHAc
N
HO
O
HO
HO
OOH
O
HO
O
N
HO
OH
HO
O
HO
OH H
HO
N
HO
HO OH
NHAc
O HO
NHAc
O
O
N
O
HO
OH
OH
OH
O
O HO
HO OH
Exact Mass: 299.1481
HO
NHAc
O
HO
O
OH
OH
OH H
N
NHAc
Exact Mass: 502.2275
Exact Mass: 1337.5233
Exact Mass: 1218.4385
衝突誘起解離（CID)
MS3
HO
OH
O
O HO
HO OH
OH
O
NHAc
OH
O
O
NHAc
HO
O
HO
HO
OOH
O
HO
O
HO
HO
O
HO
HO
OH
HO
HO
HO
HO
O
HO
HO
HO
Exact Mass: 367.1478
OH
O
O HO
HO OH
OH
O
O HO
HO OH
HO
O
OH
O
O
NHAc
HO
O
HO
HO
OOH
O HO
HO
O
O
HO
HO
O
HO
Exact Mass: 837.3114
Exact Mass: 1040.3908
O
OOH
O HO
O
Exact Mass: 972.3911
NHAc
O
OH
NHAc
O
HO
O
OH
OH
OH H
N
NHAc
N
8
糖鎖医工学研究センター
実用化・事業化の見通しについて
糖鎖微量迅速解析システム
AXIMA-QIT (Shimadzu)
Local network
Operation Software
Sample
ＤＢ
Search Server
Internet
Interface Software
Shimadzu
MKI
特許出願済：特願2004-080611 （日本の他、台湾、米国、カナダ、中国、ドイツにも出願済）
㈱島津製作所より、2008年3月リリース予定
事業原簿 P５５
糖鎖医工学研究センター
糖鎖のソフトイオン化・ＩＲ－レーザーの開発
AXIMA-QITのIR-MALDI化
AXIMA-QITTM
9
事業原簿 P５５
糖鎖医工学研究センター
中赤外波長可変超短パルスレーザーによ
る糖ペプチド断片化
ｆｓ－ＤＦＧ 光学系
事業原簿 P５５
糖鎖医工学研究センター
グリコサミノグリカン（GAG）関連糖鎖のMSnn解析
（産総研、生化学工業）
GAG鎖
特異的分解酵素
GAGオリゴマー
直接イオン化
不可
二糖組成データ
FACデータ
ESI-MS
MSn データ
MALDI-MS
構造情報の統合
※ 硫酸基一ヶまで
・既存データ照合
・フラグメンテーション一般則
DB
10
事業原簿 P５５
糖鎖医工学研究センター
MALDI-MSによる糖鎖のネガティブモード解析 (東大理)
１）負イオンMALDI-MSによるラクトオリゴ糖鎖の構造解析
および、断片化メカニズムの研究
Yamagaki, T.; Suzuki, H.; Tachibana, K.
A comparative study of the fragmentation of neutral lactooligosaccharides in negative-ion mode by UV-MALDI-TOF and
UV-MALDI ion-trap/TOF mass spectrometry.
Journal of the American Society for Mass Spectrometry, in press.
２）負イオンMALDI-MSにおける添加剤とマトリクスの関係
Suzuki, H.; Yamagaki, T.; Tachibana, K.
Optimization of matrix and amount of ammonium chloride additive
for effective ionization of neutral oligosaccharides as chloride ion
adducts in negative-mode MALDI-TOF mass spectrometry
Journal of the Mass Spectrometry Society of Japan, 2005, 53, 227-229.
事業原簿 P５５
糖鎖医工学研究センター
ピレン標識糖鎖のnegative-ion MALDI-QIT-TOFMSの特徴 (野口研)
1.
ピレン基導入によってイオン化効率が増加し、 MSnに十分な
プリカーサーイオンが生成し、高感度化が達成される。
２． マトリクスとしてDHBAを使用し、酸性イオンなどを添加する必要がないので
、同一試料でpostive ionおよびnegative ionの測定が可能である。
３． フコースの脱離が抑制され、フコースを含むプロダクトイオンが多数生成さ
れるため、フコース結合情報が得られる。
４． 分岐構造の側鎖特異的なプロダクトイオンが生成されるため、側鎖構造の
識別ができる。
５． 構造特異的なプロダクトイオンを検出定量することによって、異性体混合物
の分離定量ができる。
11
事業原簿 P５６，６１
糖鎖医工学研究センター
実用化、事業化の見通しについて
研究項目①糖鎖構造解析
５．全自動フロンタルアフィニティ装置（島津製作所・産総研）
利用分野：糖鎖研究
事業化時期：注文生産
事業原簿 P５６，６１
糖鎖医工学研究センター
実用化、事業化の見通しについて
研究項目①糖鎖構造解析
４．レクチンチップを用いた糖鎖プロファィラー
（モリテックス・産総研・Ｊ－オイルミルズ）
利用分野：糖鎖研究、糖鎖製品の品質管理、バイオマーカー検出、診断
事業化時期：SC-ProfilerTM として販売中
12
事業原簿 P５６
糖鎖医工学研究センター
CabosDB
グライコプロテオームデータベース
レクチンDB
・レクチン分子情報
・相互作用分析結果
オリゴ糖DB
・糖鎖構造（ＸＭＬ形式）
・質量分析結果
糖タンパク質DB
・糖鎖付加位置情報
・アミノ酸配列
Internet
Internet
アプリケーション
データベース登録・検索
インターフェイス
糖鎖構造エディタ・
ビューワ
糖鎖構造解析ソフト
ウエア
公共DB
公共DB
公共DB
事業原簿 P５６，６２
糖鎖医工学研究センター
実用化、事業化の見通しについて
（知的基盤の開発）
研究項目①糖鎖構造解析
７．糖鎖統合データベースの開発・ＣａｂｏｓＤＢ（三井情報開発・産総研）
利用分野：糖鎖研究
公開時期：近日中
図1
糖タンパク質検索結果一覧
「生物種=マウス AND 器官=肝臓 AND アミノ酸配列長≧1000」を検索条件とした
例
13
事業原簿 P５６，６２
糖鎖医工学研究センター
実用化、事業化の見通しについて
（知的基盤の開発）
研究項目①糖鎖構造解析
７．糖鎖統合データベースの開発・ＳＧＣＡＬ（富士通・産総研）
利用分野：糖鎖分子構造研究
公開時期：公開済み
分子計算によるグリコシド結合の
断片化情報を提供
キーワード
検索や糖鎖選択画面から
糖鎖絞込み
質量
糖の数
測定したピークリストとの自動照合
糖の種類
分岐
分子式
計算手法
断片化イオン
PDB
計算結果を可視化
グリコシド結合パラメータ＋Na付加位置の
スコア検定による断片化リスト自動作成
測定データから断片イオンへのリンク
計算結果DB
（3～14糖のN結合型
糖鎖構造 3700＋
AXIMAデータ 67）
MSスペクトル表示
コンタクトマップ表示
質量表示
詳細計算結果表示
３D構造表示
糖鎖構造作成ツール
計算結果自動登録
図2 SGCAL トップページ
図3 SGCAL の機能
14